Summary
Vi beskriver en protokoll for disseksjon, fiksering og immunofarging av steroidogenic organer i Drosophila-larver og voksne kvinner for å studere steroid hormon biosyntese og dens reguleringsmekanisme. I tillegg til steroidogenic organer, visual vi innervasjon av steroidogenic organer samt steroidogenic målceller slik som kimlinje-stamceller.
Abstract
I flercellede organismer, er en liten gruppe av celler utstyrt med et spesialisert funksjon i sin biogene aktivitet som induserer en systemisk respons til vekst og reproduksjon. I insekter, larve prothoracic kjertel (PG) og den voksne kvinnelige eggstokk spille viktige roller i biosynthesizing de viktigste steroidhormoner som kalles ekdysteroider. Disse ecdysteroidogenic organene er innervert fra nervesystemet, gjennom hvilken tidspunktet for biosyntese påvirkes av miljø signaler. Her beskriver vi en protokoll for å visualisere ecdysteroidogenic organer og deres interaktive organer i larver og voksne av bananflue Drosophila melanogaster, som gir en passende modellsystem for å studere steroid hormon biosyntese og dens reguleringsmekanisme. Dyktige disseksjon tillater oss å opprettholde posisjonene til ecdysteroidogenic organer og deres interaktive organer, inkludert hjernen, det ventrale nervesystemet og andre vev. Farging med enntibodies mot ecdysteroidogenic enzymene, sammen med transgene fluorescens proteiner som drives av vevs-spesifikke promotorer er tilgjengelige for å merke ecdysteroidogenic celler. Videre kan innervations av ecdysteroidogenic organer også bli merket spesifikke antistoffer eller en samling av GAL4 sjåfør forskjellige typer av nerveceller. Derfor kan ecdysteroidogenic organer og deres nevrale forbindelser bli visualisert samtidig av immunfarging og transgene teknikker. Til slutt, vil vi beskrive hvordan å visualisere kimlinje stamceller, hvis spredning og vedlikeholds styres av ekdysteroider. Denne fremgangsmåten bidrar til omfattende forståelse av steroidhormon-biosyntese og dens neuronal reguleringsmekanisme.
Introduction
I flercellede organismer, er en gruppe av celler utstyrt med et spesialisert funksjon i sin biogene aktivitet som er vesentlig for hele kroppen. For å oppfylle sine oppgaver, hvert vev eller organ uttrykker en serie av gener relatert til deres funksjoner og kommuniserer med andre vev for å organisere sin aktivitet i sammenheng med utvikling. For å karakterisere slike spesialiserte cellefunksjoner og inter-organ interaksjoner, trenger vi å angi en gruppe av celler sammen med andre typer av celler kan holdes inntakt i den flercellede arkitekturen.
Et eksempel på slike spesialiserte organer er en steroidogenic organ, hvor flere biosyntetiske enzymer som medierer de konverteringstrinn fra kolesterol til aktive steroidhormoner 1. De fleste av disse enzym gener blir spesielt uttrykt i steroidogenic organer, og den biosyntetiske reaksjonsvei er strengt regulert av mange ytre stimuli via humorale innganger og neuronal innganger. En gangsyntetiserte, steroidhormoner utskilles i hemolymfe og er rettet mot en rekke vev og organer for regulering av ekspresjonen av en rekke gener 2. Derfor, induserer virkningen av et steroidhormon en systemisk respons for å opprettholde homeostase, vekst og reproduksjon.
For å undersøke funksjonene av steroidhormon-biosyntese og de pleiotrope virkninger av steroidhormoner, kan Drosophila melanogaster benyttes som en egnet modell system. I løpet av larvestadiet, insekt steroidhormon, ekdysteroid, biosyntetiseres i en spesialisert endokrint organ som kalles prothoracic kjertel (PG) 3. I PG, flere ecdysteroidogenic enzymer spesifikt katalysere flere konverterings trinn fra kolesterol til ekdyson, som kontrollerer at hamskifte og metamorfose på de hensiktsmessige utviklingsstadier 4. Derfor er en dynamisk endring i ekdysteroid-titer regulertved flere signalveier som respons på miljø signaler. På den annen side, i det voksne stadium, spiller ekdysteroid viktige rolle i fysiologien, inkludert reproduksjon, søvn, hukommelse, og levetiden 5, 6, 7, 8. Det er kjent at ekdysteroid er aktivt biosyntetiseres i eggstokken, som regulerer progresjon av oogenesen 6, 7, 8, 9, 10, 11. Nylig har vi rapportert at antall kimlinje-stamceller (GSCs) påvirkes av ekdysteroid og kjønn peptid signalering som reaksjon på stimuli parring 12.
Kraftige verktøy av D. melanogaster genetikk og cellebiologi, inkludert godt annotert genom informasjon, binær genekspresjonssystemer og transgene RNAi teknikker, har gjort oss i stand til å identifisere gener som er essensielle for ekdysteroid-biosyntese i PG og eggstokk 13, 14, 15. Når ecdysteroidogenic genene er identifisert, kan den transkripsjonelle regulering av disse genene og de dynamiske lokaliseringer av genprodukter bli undersøkt i den biosyntetiske reaksjonsvei 16. For dette formål, kvantitativt-revers transkripsjon-PCR, RNA in situ hybridisering, immunhistokjemi og analyse utføres. Anvendelsen av disse teknikkene omfatter en utfordrende oppgave; forseggjort disseksjon av PG eller eggstokken. Spesielt PG av bananflue er relativt mindre enn for andre insekter (f.eks silkeormen og blåse fly), så man trenger å øve på viktige ferdigheter i bananflue dissekering for prøvetaking. Videre begge ecdysteroidogenic organer motta innervasjons fra sentralnervesystemet (CNS) 17, 18, 19, 20. Således, for nøyaktig anatomiske analyser, de ecdysteroidogenic organer bør holdes intakt sammen med CNS og andre organer, for ikke å forstyrre deres nevrale forbindelser.
Her gir vi protokoller for disseksjon og visualisering av steroidogenic organer i D. melanogaster. Læring disseksjon teknikk er nøkkelen utgangspunktet for disse eksperimentene. I tillegg kan man med hell merke steroidogenic organer så vel som deres interaktive organer med flere antistoffer og GAL4 driverlinjer. Å utnytte disse teknikker, materialer og genetikk, kan man studere omfattende mekanismer for steroidhormon biosyntese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NB: Den generelle ordningen av protokoller er vist i figur 1.
1. Disseksjon av larve Ring Gland (RG)
MERK: I D. melanogaster, som hører til cyclorrhaphous Diptera, er PG innenfor et kompositt endokrint organ som kalles ring kjertel (RG, figur 2D). Siden det er ugjørlig at PG er kirurgisk separeres fra andre celletyper (omtalt senere), er et praktisk mål for å isolere et intakt og uskadet RG ved dissekering.
- Utarbeidelse av larver på de aktuelle utviklingsstadier
MERK: For å synkronisere utviklingsstadier av D. melanogaster larver, er det nødvendig å samle egg innenfor et smalt tidsvindu, og å samle larver på riktig tidspunkt.- Samle egg i 2 timer på et druesaft agar-plate ved 25 ° C.
- Samle nylig klekket 1
- På et passende tidspunkt, samler den trinnvise larver med en engangs plast sløyfe for å unngå uønsket skade. For å minimere en forskjell i utviklings progresjon av 3. larver, samle det 2. instar larver ved 70 hæl (48 hah) og tillate dem å skifte ham i 2 timers intervaller. Deretter samle 3. larver innen to timer etter at L3 ekdyse; denne prosedyren gir 0-2 hAL3E larver.
- Overfør den trinnvise larvene til en skål fylt med fosfatbufret saltvann (PBS).
- Skyll larvene med PBS for å fjerne rester av mat fra kroppen.
- Grov disseksjon av larver under etdissekere mikroskop
- Hold munnen krok av en larve med pinsett. Sever larvelegemet ved den fremre en tredjedel av den kroppslengden ved hjelp av mikro saks.
- Hold den avskårne enden av fremre larvekroppen med en pinsett. Ved hjelp av den andre pinsett forsiktig å skyve spissen av hodet mot innsiden av legemet; denne fremgangsmåten viser seg larve legeme innsiden ut.
MERK: Dette trinnet kan bli hoppet for disseksjon av en st stadium larver. - Gjenta trinn 1.2.1-1.2.2 med ekstra larver i 5-10 min.
MERK: Antallet larver bør være lik eller mindre enn 20 for å spare tid for disseksjon.
- Filet disseksjon av larver
MERK: Denne metoden gjør det mulig å holde posisjonen av vev til å forbli intakt.- La larver i vann bare i 1 time. Larvene er immobilisert på grunn av kvelning.
- Sette en larve ryggsiden opp i en dråpe av PBS på en silisium-belagttallerken, med sin dorsal side opp.
MERK: Den dorsale side har 2 trakealtubers forløper i lengderetningen. - Under et disseksjonsmikroskop, sette inn et insekt tapp inn i den fremre spissen av larven ved hjelp av tang. Strekk larvelegemet til den bakre side og sette en annen tapp inn i den bakre enden av larven.
MERK: I tillegg til insekt pinner, kan en nål laget av en wolframtråd være nyttig 21. En nål kan bygges inn i en pipettespiss ved oppvarming til bruk som en dissekere nål. - Under en dissekere mikroskop, lage et lite snitt nær halen med mikro saks. Fra snittet, skjæres den dorsale kutikula i lengderetningen langs den dorsal midtlinjen mot hodet. Vær forsiktig så du ikke skader vevet under skjellaget.
- Strekk bodywall skjellaget på hver side og plassere 4 pinner i hvert hjørne av den dissekerte bodywall.
- Fjerne en del av fremre fett legeme med tang, for å eksponere den hjerne-RG complex bli eksponert på overflaten. Fjern et par spyttkjertler, hvis det er nødvendig.
- Fiksering og farging av vev med immunhistokjemi
- Sett anterior en tredjedel av larvelegemene (trinn 1.2.2) inn i en 1,5 ml mikrorør fylt med 500 ul av FIX-løsning (4% paraformaldehyd i PBS). Fiks mindre enn 20 prøver på en gang, ellers PBS festet til de faste prøver kan gi en ugunstig fortynning av fiksermiddel. For filet disseksjon, fjernes en dråpe av PBS, og deretter legge til en reduksjon av løsning løsning.
NB: For løsning løsning, kan enten 3,7% formaldehyd eller 4% paraformaldehyd anvendes. - Inkuber dissekerte vev i løsning løsning i 30 minutter ved romtemperatur (RT) eller alternativt i 2 timer ved 4 ° C.
- Erstatte den løsning løsning med 500 ul PBS og raskt å skylle prøvene 3 ganger. Vask prøvene med 500 ul 0,3% PBT (PBS + 0,3% oktylfenoletoksylat) i 15 minutter på en vippe ved RT. For filet disseksjon, fjerne de insekt pinnene og overføre prøvene til et 1,5 ml mikrorør.
NB: For å øke permeabiliteten av antistoffer inn i vev, ble prøvene behandlet med 500 ul 2,0% PBT i 1-2 timer på en vippe ved RT. - Erstatt PBT med 500 ul blokkeringsløsning (2% bovint serumalbumin i PBT). Prøvene inkuberes i 1,5 timer på en vippe ved RT.
- Erstatte den blokkerende oppløsning med 50 ul av primær antistoffløsning, dvs. antistoffer fortynnet i blokkeringsoppløsningen.
- Prøvene inkuberes over natten på en vippe ved 4 ° C.
- Erstatte den primære antistoffløsning med 500 ul 0,3% PBT og raskt å skylle prøvene 5 ganger. Vask prøvene 3 ganger med 500 ul 0,3% PBT, 15 minutter hver på en vippe ved RT.
- Erstatte 0,3% PBT med 50 mL den sekundære antistoffoppløsning (dye-konjugerte antistoffer fortynnet i blokkeringsløsning). For nukleær farging, 0,5 ul 4' , 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI, 0,1 mg / ml stamløsning) blir tilsatt til 50 pl løsning. Prøvene inkuberes på en vippe i 2 timer ved romtemperatur, eller alternativt ved 4 ° C over natten.
MERK: Hold prøvene i mørket. - Sett på antistoffløsning med 500 ul 0,3% PBT og skylles 5 ganger. Vask prøvene 3 ganger med 500 ul 0,3% PBT, 15 minutter hver ved RT.
- Sett anterior en tredjedel av larvelegemene (trinn 1.2.2) inn i en 1,5 ml mikrorør fylt med 500 ul av FIX-løsning (4% paraformaldehyd i PBS). Fiks mindre enn 20 prøver på en gang, ellers PBS festet til de faste prøver kan gi en ugunstig fortynning av fiksermiddel. For filet disseksjon, fjernes en dråpe av PBS, og deretter legge til en reduksjon av løsning løsning.
- Fin disseksjon av hjernen-RG-komplekset som inneholder PG og monterings
- Bruk en engangs pipette for å overføre De immun prøvene til en skål fylt med 0,3% PBT.
MERK: For å unngå brysom bobler under disseksjon og montasje, kan 0,3% PBT erstattes med PBS. - Under et disseksjonsmikroskop, holde hårstråene eller munnen krok med en pinsett. Ved å bruke en 27 G nål festet til en 1 ml sprøyte som en "kniv", skjæres den fremre spissen av spiserøret og øye-plater for å fjerne den hjerne-RG-øye-skiven komplekset fra kroppen hårstråene.
- Separangere spiserøret og tarmen fra hjernen-RG-øye plate kompleks med pinsett. Siden spiserøret passerer gjennom hjernen over det ventrale nervesystemet (VNC), trekke ut tarmen til den bakre side.
MERK: For å fjerne ekstra imaginal plater fra prøvene, kuttet forbindelsen mellom hjernen, øyet plater, og leg-plater med en nål kniv. - Gjenta trinnene 1.5.1-1.5.4 for andre prøver.
MERK: For å forhindre vevsrester kleber seg til prøvene, overfører hver fullført prøve til en annen ren skål fylt med 0,3% PBT eller PBS. - Overføre prøvene til sentrum av en ren glassplate med en mikropipette.
MERK: For 2. og 3. stadium larver, bør enden av en mikropipette spissen bli avkortet med et barberblad. - Under et disseksjonsmikroskop, justere individuelle prøver med sin dorsale side opp ved hjelp av tang.
MERK: RG er plassert på den dorsale side av hjernen (figur 2A). Denne justering muliggjør spesifisering av individuelle prøver under avbildning. - Vipp et glass lysbilde og tørk av så mye overflødig PBT som mulig. Sette en dråpe reagens montering på en side av sleiden. Plasser kanten av et dekkglass fra den andre siden av dråpen og sette dekkglasset på prøvene langsomt med pinsett.
Merk: Denne fremgangsmåte forhindrer prøvene fra å bevege seg utenfor dekkglass. - Oppbevar prøvene ved 4 ° C. Hold prøvene i mørket.
- Bruk en engangs pipette for å overføre De immun prøvene til en skål fylt med 0,3% PBT.
2. Disseksjon av eggstokk i voksne kvinner
- Utarbeidelse av voksne kvinner
- Fôr kvinnelige fluer med standard gjær / cornmeal fly mat for 3-4 dager å fete opp eggstokken. Oppretthold ved 25 ° C.
- Disseksjon av den voksne kvinnelige eggstokk
- Bedøve kvinnelige fluer med CO 2 gass og kuttet hodet.
- Overfør fluelegemer til en 3 cm skålfylt med PBS.
- Under en dissekere mikroskop, holder brystkassen på ryggsiden ved hjelp av tang. Tak i abdominal segmentet A5 eller A6 med de andre tang og skrelle bort mage hårstråene mot den bakre side. Tørk av den klebrige skjellaget fra tuppen av tang.
- Knip en eggleder og ta ut eggstokk fra kroppen.
- Gre og spre tips av eggstokken med pinsett.
MERK: Denne operasjonen forbedrer effektiviteten av immunfarging.
- Disseksjon av voksne kvinnelige hjernen, VNC og reproduktive organer.
MERK: Denne metoden gjør at innervasjon av eggstokk skal holdes intakt.- Bedøve hunnfluer med CO2-gass og overføre dem til et silisiumbelagt skål fylt med PBS.
- Under et disseksjonsmikroskop, holder snabel og skrelle bort hodet skjellaget for å blottlegge hjernen med pinsett. Fjern luftrøret er festet til hjernen.
MERK: brain er et hvit og avrundet struktur. Hjernen kobles til VNC i thorax. - Hold thorax på ryggsiden og kuttet av beina og vinger med en pinsett. Ved hjelp av det andre par av pinsetter, skrelle bort thorax ventral hårstråene fra basene av benene. Når VNC er eksponert, fjerne gjenværende dorsale kutikula og muskler festet til VNC- ved hjelp av tang. Vær forsiktig så du ikke skader forbindelsen mellom hjernen og VNC.
- Bruk pinsett til å skrelle bort abdominal hårstråene og eksponere eggstokk og deres interaktive organer, inkludert neuroner, avlingen, tarmen, egglederen, livmoren, og det accessary kjertel.
- Fjern det gjenværende vev innbefattende luftrøret og fettet kroppen ved hjelp av tang.
- Fiksering og farging av vev med immunhistokjemi
- Overfør ca 8-10 par av eggstokkene til et 1,5 ml mikrorør fylt med 250 pl av løsning løsning (4% paraformaldehyde i PBS) og prøvene inkuberes i 30 minutter ved romtemperatur.
- Erstatte den løsning løsning med 500 ul PBS og raskt å skylle prøvene 3 ganger.
- Vask prøvene 2 ganger med 500 ul 0,1% PBT i 5 minutter hver ved RT.
- Erstatt PBT med 50 ul blokkeringsløsning. Prøvene inkuberes i 1 time på en vippe ved RT.
- Erstatte den blokkerende oppløsning med 50 mL det primære antistoff oppløsning.
- Prøvene inkuberes over natten på en vippe ved 4 ° C.
- Erstatte den primære antistoffløsning med 500 ul 0,1% PBT. Vask prøvene 3 ganger med 500 ul 0,1% PBT, 15 minutter hver på en vippe ved RT.
- Erstatte 0,1% PBT med 50 pl sekundært antistoff oppløsning. For nukleær farging, tilsett 0,5 mL DAPI til 50 ul av løsningen. Prøvene inkuberes i 2 timer på et vippe ved RT.
- Erstatte den sekundære antistoffløsning med 500 ul 0,1% PBT. Vask prøvene 3 ganger med 500 ul 0,1% PBT 15 minutter hver gang på et vippe ved RT.
MERK: Vaskeprosedyren kan gjøres ved 4 ° C over natten. Hold prøvene i mørket.
- Montering av prøvene på glassplater
- Overføre prøvene til et objektglass med 0,1% PBT ved hjelp av en mikropipette.
MERK: For å unngå brysom bobler under disseksjon og montasje, kan 0,1% PBT erstattes med PBS. - For eggstokk, separere strengene i de ovarioles fra hverandre med pinsett under et disseksjonsmikroskop. Ikke skade tips av ovarioles inneholder germaria. For hjerne-VNC-reproduktive organ kompleks, fjerne gjenværende skjellaget og ordne posisjon på et objektglass.
- Tørk av så mye overskytende PBT som mulig og ha en dråpe av monterings reagens i midten av prøvene. Plasser en dekkglass sakte bruke tang.
- Oppbevar prøvene ved 4 ° C. Hold prøvene i mørket.
- Overføre prøvene til et objektglass med 0,1% PBT ved hjelp av en mikropipette.
- Observer prøvene under mikroskopet og bringe steroidogenic organer i synsfeltet. Når visningen er fast, slår det billeddannende system til bildeopptaksmodus.
MERK: 10-20x objektivlinser blir anvendt for å oppnå bilder av hjernen-RG-kompleks eller hele eggstokk. Alternativt er 40-63X objektivlinser (vann eller olje nedsenket) som brukes for å visualisere den subcellulære lokalisering av proteiner i GSCs eller de neuronale innervations av PG og eggstokk. - Sett opp parametere for bildeopptak på vedlagte programvaren. Velge en kombinasjon av fluorescens (f.eks GFP og RFP). Ved rask fremgangsmåte for skanning, justere lasereffekten, følsomheten til detektorene (Gain / forskyvning), og størrelsen på hullet.
MERK: For å skaffe bilder med høy kvalitet, bør den avsøkende lasereffekt og følsomheten av detektoren (Gain) optimaliseres for hver prøve. Å skissere formenav vevet, kan en overførte lys bilde tas i tillegg til en fluoriserende bilde. - Ta Z stabler av bildene. Under en kontinuerlig hurtig skanning, beveger fokalplanet med fokus driv av mikroskopet og angi startstilling og endestilling. Antallet skiver og intervallet avstanden mellom skivene blir justert tilsvarende.
- Velge skannehastighet, skannemetode, og toveis skannemodus.
- "Start reelle skanner" for image oppkjøpet.
- Lagre bildet med formatet på den vedlagte programvaren.
MERK: De originale bildefilene inneholder informasjon om bildetakings parametere og badevekt. Eksporterte bilder kan behandles ved bruk av et bildebehandlingsprogram på datamaskinen 22..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi brukte de ovennevnte protokoller for å visualisere steroidogenic organer og deres interaktive organer i D. melanogaster larver og voksne kvinner. Det totale skjema av protokoller er vist i figur 1.
RG, inkludert PG (figur 2D), er mindre og mer gjennomsiktige enn hjernen og er plassert ved den fremre-ryggsiden av hjernen (figur 2A-C og 3A-E). Å merke PG-celler, har flere grupper generert forskjellige typer av antistoffer mot ecdysteroidogenic enzymer (dvs. Neverland 23, spookier 24, Likkledet 20, Phantom 25, kroppsløs 25 og Skygge 26). Blant disse er anti-Shroud (Sro) antistoff pålitelig måte anvendes til å merke PG ved farging (figur 2C, 2E og 3C). Alternativt kan Binary genekspresjon system, GAL4 / UAS systemet 27, kan brukes til å uttrykke fluorescerende proteingenene i PG-celler. Gjennom promoteren analyse av ecdysteroidogenic genet fantom (phm), kan den PG-spesifikk promoter indusere genekspresjon utelukkende i PG 28. Derfor kan PG cellene spesifikt visualiseres ved uttrykker GFP eller RFP under kontroll av phm-GAL4 # 22 (figur 3D).
For å visualisere den neuronale forbindelsen mellom PG og hjernen, kan en gruppe av neuroner bli merket med mCD8 :: GFP under kontroll av forskjellige GAL4 drivere og antistoffer (figur 2C, 2E, 3D og 3E). Den FlyLight database med GAL4 ledningssamlinger er optimalisert for merking av neuroner 29. Blant dem, GMR45C06-GAL4 etiketter PG-utstikkende neuroner (figur 2C og E). den immunostaining av GFP-uttrykkende larver med anti-GFP-antistoff er effektivt i å forbedre GFP signaler. Videre TRH-GAL4> mCD8 :: GFP larver viser stomatogastric nervesystemet, hvor-serotonergiske neuroner prosjekt til ikke bare PG, men også til den proventriculus (PV, insekt fortarmen) og svelget muskler (PM) (figur 3D, og E) 20, 30. Derfor er det viktig å opprettholde posisjonen til den RG, hjernen, og de andre omgivende vev i løpet av filet dissections (figur 3).
Hos voksne kvinner, det påvirker ovarial ekdysteroid mange aspekter av oogenesen, slik som GSC proliferasjon, differensiering cyste, egg kammer vekst, og stressrespons 11. Som i PG, blir ecdysteroidogenic enzymer i eggstokken også visualisert med de spesifikke antistoffer som er beskrevet ovenfor 12, 31.Som nedstrøms hendelse hvorpå ekdysteroider handling, er antallet GSCs i germarium fokus (figur 4). Selv om germarium er en sammenstilling av flere celletyper, blir GSCs spesifisert av immunfarging med to GSC markør antistoff, 1B1 og D E-cadherin-32. For å visualisere innervasjon av eggstokk, blir eggstokk dissekert sammen med hjernen, VNC, gut, avling, livmor, og spermatheca (figur 5). Nerveceller blir visualisert ved mCD8 :: GFP under kontroll av nSyb-GAL4, en pan-neuronal driver (figur 5B og D). Musklene rundt ovarie, uterus, tarm og er farget med fargestoff-konjugert phalloidin.
Figur 1: Den totale ordningen protokoller. To forskjellige disseksjon metoder er applicstand til larver og voksne kvinner, avhengig av hensikten med forsøkene. Monteringsfremgangsmåter er også utformet i henhold til prøvebetingelser. Fiksering, beising, og avbildningsteknikker er i utgangspunktet felles for alle prøver. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Visualisering av PG og PG-utstikkende neuroner. (A og B) Hjernen-ring kjertel (RG) kompleks av villtype 3. instar larver. I (B), er PG skissert med stiplede linjer. Den trådformede struktur mellom hjernen og RG er luftrøret. (C - E) innervasjon av PG ble visualisert med mCD8 ::GFP drevet av GMR45C06-GAL4 i FlyLight samlingen. PG og GFP-positive neuroner ble merket med anti-Sro-antistoff (magenta) og anti-GFP-antistoff (grønn), henholdsvis. Den fluoriserende bilde blir slått sammen med det transmitterte lys-bilde for å spesifisere omrisset av vev. I (D), PG, svamp allata (CA) og svamp cardiaca (CC) er illustrert. De PG-utstikkende nevroner er mer fremtredende i høyeffekts bilde med 40X objektiv (pilene i E) enn laveffekt bilde med 10X objektiv (C). Skala bar = 100 um. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Stomatogastric Nevrologiske prosjekter til PG, PV, en nd PM. (A og B) Fileten disseksjon av en vill-type 3 rd instar larver. Posisjonene til de PG, hjerne (BR), det ventrale nervesystemet (VNC), øye-plater (ED), vingeskiver (WD), faryngeale muskel (PM), og proventriculus (PV) forblir intakt. (C) Den PG utelukkende ble merket med anti-Sro antistoff (magenta). (D) PG ble merket med turboRFP drives av phm-GAL4 # 22. Serotonergiske neuroner ble merket med anti-5-HT-antistoff (grønn). (E) Den stomatogastric nervesystemet ble visualisert med mCD8 :: GFP drevet av TRH-GAL4. Serotonerge nevroner prosjektet til PG, PM, og PV (piler). Målestokk = 100 um. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
filer / ftp_upload / 55519 / 55519fig4.jpg"/>
Figur 4: Germaria av villtype Fluer inneholdende ett, to eller tre GSCs. (A) En oversikt over den kvinnelige reproduktive organ. En eggstokk er sammensatt av 16-20 ovarioles som er strenger av egg kamre. Den germarium, hvor GSCs befinner seg, er ved spissen av hver enkelt ovariole. (B - D) Én, to, eller tre GSCs er plassert i hvert germarium (hvite stiplede sirkler) av villtype hunner. GSCs er farget med 1B1-antistoff (grønn), hvilke etiketter en sfærisk struktur kalt spectrosome (piler) og en membran cytoskeletal struktur som er kjent som den fusome. Cellegrensene er visualisert med anti-D E-cadherin antistoff (magenta). Den Målestokk = 10 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: De kvinnelige kjønnsorganer og deres interaktive organer. (A) eggstokk (Ov), tarmer (Gut), masse (Cr), hjerne (BR), det ventrale nervesystemet (VNC), og spermatheca (Sp) ble dissekert under mikroskopet. (B - D) innervasjon av eggstokk ble visualisert med mCD8 :: GFP drevet av nSyb-GAL4. GFP-positive neuroner strekker seg fra den VNC (pil), som rager til overflaten av eggstokkene (pilhoder). Ovariene er skissert med stiplede linjer. Prøvene ble farget med anti-GFP-antistoff (grønn) og fargestoff-konjugert phalloidin (magenta). Falloidin forbinder med den filamentøse aktin av musklene rundt eggstokkene (Ov) og livmor (Ut). Illustrasjonen er vist i C. Skala bar = 200 um.rge.jpg" target = '_ blank'> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi studerte ekdysteroid-biosyntese og dens reguleringsmekanisme i D. melanogaster, og utviklet en protokoll for disseksjon og immunofarging. Tidspunktet for ekdysteroid-biosyntese er påvirket av omgivelses signaler gjennom neuronale innganger 33, så det er viktig å opprettholde den innervasjon av ecdysteroidogenic organene sammen med hjernen, VNC, og annet vev under dissekering.
Som beskrevet ovenfor, danner D. melanogaster PG et kompleks endokrint organ som RG med svamp allata (CA), og den svamp cardiaca (CC) (figur 2D). Mens PG produserer ekdysteroider, CA og CC produsere juvenile hormoner og adipokinetic hormon, henholdsvis. Dette anatomiske eiendommen har vært et hinder for forskere som studerer ecdysteroidogenesis i D. melanogaster, i forhold til andre insekter. Men i de siste tiårene, fly genetikk has tillot oss å identifisere mange ecdysteroidogenic gener som er spesielt uttrykt i PG 4. Disse gener er også uttrykt i celler eller sykepleier hårsekkceller i eggstokken 34, 35. Nå kan man bruke et unikt sett av genekspresjonsprofiler i ecdysteroidogenic organer, noe som gjør det mulig å spesifisere ecdysteroidogenic celler etter farging og transgene teknikker.
Under disseksjon, er det viktig å bruke fin pinsett med skarpe kanter. Før disseksjon, kan kantene av tang slipes med en Arkansas slipestein for å bringe kantene sammen uten hull. Under disseksjon, rusk eller de gjenværende vev, slik som fett legeme, tarmen, og imaginal plater, bør fjernes så mye som mulig. Spesielt stykker av fettet kroppen lett feste seg til vevet av interesse. I tillegg bør monteringen av prøvene på glassplater også kan utføreed nøye. Et kompleks av vev kan være i uorden når et dekkglass plasseres på prøvene i klebrig monteringsmedium. Derfor må et tilstrekkelig antall prøver dissekert, og egnede prøver må velges for avbildning, slik som de hvor RG eller eggstokk er på den øverste side og de nevrale forbindelser forblir intakt.
For å utføre vellykket farging og for å oppnå reproduserbare resultater, er det viktig å opprettholde de samme betingelser for prøvetaking og håndteringsprosedyrer. Graden av immunfarging svært avhengig av tilstanden til individuelle dyr på tidspunktet for prøvetaking og fiksering. For eksempel bør en alder av dyrene, stell temperaturer, nærings tilstand, og disseksjon tiden vurderes nøye. For å minimere håndtering feil av fiksering i flere eksperimenter, vi nøye holde nesten like mange prøver å koordinere disseksjon tid og fiksering reaksjonstid. For fiksering solution, er 4% paraformaldehyd eller 3,7% formaldehyd som ble anvendt. Fordi paraformaldehyd blir hurtig nedbrutt over tid, blir dens pulver oppløses vanligvis for å gjøre 10% stamløsning i PBS, og alikvoter lagret ved -20 ° C. Porsjonene er gassform for å gjøre den friske 4% løsning løsning før hver disseksjon. Videre er de omfattende vasketrinnene av prøver reduserer bakgrunnen ikke-spesifikk farging.
I trinnet for bildeopptak, følger vi produsentens protokoll for konfokalmikroskopi. Den mikros Systemet gir et brukervennlig grensesnitt for forskere eller studenter, slik at de optimale sett av eksitasjons- / emisjonsfiltre velges automatisk når de typene fluorofor er angitt. Mens mikroskopi systemet er enkelt å bruke, må man for å optimalisere parameterne for bildeinnsamling på hver prøve eller hvert fokusplan, ved å endre detektoren forsterkning, skannehastighet, scan tall, og det lille hullet størrelse.
36. For å overvinne dette problemet, kan det knock-in teknikk kan også anvendes for å sette inn en HA-kode i gen locus av Ånde kortet med CRISPR / Cas9 system. Ved å bruke slike transgene teknikker i kombinasjon med farging, minst 3-4 proteiner kan samtidig visualiseres i PG eller eggstokken. I motsetning til protein lokalisering, men en metode for å visualisere endogene ekdysteroider ved immunfarging ikke er klarlagt. Når anti-ekdysteroid-antistoff er tilgjengelig for immunofarging, kan de subcellulære lokaliseringer av ekdysteroid-biosyntese og transport av ecdysteroid bli undersøkt i fremtiden. En annen begrensning er at den tids dynamikken i ecdysteroidogenesis ikke kan undersøkes i faste vev. Tatt i betraktning at det for ekdysteroid-titeren er svingt langs utviklingsstadier, bør aktiviteten av ecdysteroidogenic organer og de utstikkende nevroner ha en tids reguleres i respons på forskjellige miljømessige stimuli. En fersk studie overvåket Ca 2 + dynamikken i PG celler ved hjelp av levende bildeteknikker 37. For fremtidige søknader, er vi nå utvikler en protokoll for live avbildning av PG eller kultur eggstokkene sammen med sine utstikk nevroner. Med hensyn til de eksisterende metoder, med mål om ny protokoll for å visualisere aktiviteten av neuroner og deres målorganer samtidig. Når aktiviteten av neuroner kan overvåkes med Ca2 + indikatoren GCaMP eller Came 38, kan det bli manipulert med optogenetic eller thermogenetic metoder ved egnet tids 39. Disse metodene bidra til en omfattende forståelse av steroidhormon-biosyntese og dens neuronal reguleringsmekanisme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Vi takker Reiko Kise og Tomotsune Ameku for deres tekniske støtte til dette arbeidet. Vi er også takknemlige for Kei Ito, Olga Alekseyenko, Akiko Koto, Masayuki Miura, Bloomington Drosophila Stock Center, KYOTO Stock Center (DGRC), og utviklingsstudier Hybridomproduksjon Bank for aksjer og reagenser. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd til YSN fra JSP KAKENHI Grant Antall 16K20945, The Naito Foundation, og Inoue Science Research Award; og ved en bevilgning til RN fra MEXT KAKENHI Grant Number 16H04792.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| egg collection | |||
| tissue culture dish (55 mm) | AS ONE | 1-8549-02 | for grape-juice agar plates |
| collection cup | HIKARI KAGAKU | ||
| yeast paste | Oriental dry yeast, Tokyo | ||
| 100% grape juice | Welch Food Inc. | ||
| rearing larvae | |||
| small vials (12ml, 40×23.5 mm, PS) | SARSTEDT | 58.487 | |
| disposable loop | AS ONE | 6-488-01 | |
| standard fly food | the recepi us on the website of Blooington stock center. | ||
| dissection | |||
| dissecting microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000-C | |
| dissecting microscope | Leica | S8 AP0 | |
| tissue culture dish (35 x 10 mm, non-treated) | IWAKI | 1000-035 | |
| Sylgard | TORAY | coarting silicon inside dishes | |
| Terumo needle (27G, 0.40 x 19 mm) | TERUMO | NN-2719S | A "knife" to cut the tissue |
| forceps, Inox, #5 | Dumont, Switzerland | ||
| insect pin (0.18 mm in diameter) | Shiga Brand | for fillet dissection | |
| micro scissors | NATSUME SEISAKUSHO CO LTD. | MB-50-10 | |
| fixation | |||
| ultrapure water | Merck Millipore | ||
| phosphate buffered saline (PBS) | |||
| Formaldehyde | Nacalai tesque | 16222-65 | |
| Paraformaldehyde | Nacalai tesque | 02890-45 | |
| Triton-X100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
| microtubes (1.5 ml) | INA OPTIKA | CF-0150 | |
| Incubation | |||
| As one swist mixer TM-300 (rocker) | As one | TM-300 | rocker |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | 9048-46-8 | |
| primary antibody | |||
| anti-Sro (guinea pig), 1:1000 | |||
| anti-GFP (rabbit), 1:1000 | Molecular Probes | A6455 | Shimada-Niwa ans Niwa, 2014 |
| anti-GFP (mouse mAb, GF200), 1:100 | Nakarai tesque | 04363-66 | |
| anti-5HT (rabbit), 1:500 | SIGMA | S5545 | |
| anti-Hts 1B1 (mouse) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | 1B1 | |
| anti-DE-cadherin (rat), 1:20 | DSHB | DCAD2 | |
| anti-nc82 (mouse), 1:50 | DSHB | nc82 | |
| secondary antibody | |||
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A-11008 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A-11001 | |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate | Life Technologies | A-11081 | |
| Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate | Life Technologies | A-21435 | |
| Alexa Fluor 546 dye-conjugated phalloidin | Life Technologies | A-22283 | |
| Mounting reagents | |||
| Micro slide glass | Matsunami Glass Ind.,Ltd. | SS7213 | |
| Square microscope cover glass | Matsunami Glass Ind.,Ltd. | C218181 | |
| FluorSave reagent (Mounting reagent) | Calbiochem | 345789 | |
| Transfer pipette 1 ml (Disposable dropper) | WATSON | 5660-222-1S | |
| imaging | |||
| LSM700 laser scanning microscope system | Carl Zeiss | inverted Axio Observer. Z1 SP left | |
| image processing | |||
| LSM700 ZEN | Carl Zeiss | It is a special user interface based on the 64 bit Microsoft Windows7 operating system | |
| ImageJ | |||
| Fly stocks | |||
| w; GMR45C06-GAL4 | from Bloomington Drosophila Stock Center. (#46260) | ||
| UAS–GFP; UAS–mCD8::GFP | gifts from K. Ito, The University of Tokyo. | ||
| w[1118] | |||
| w; phantom-GAL4#22/UAS-turboRFP | |||
| w; UAS-mCD8::GFP; TRH-GAL4 | see in Ref29, Alekseyenko, O. V, Lee, C. & Kravitz, E. A.(2010) | ||
| w; UAS-mCD8::GFP | from Bloomington Drosophila Stock Center. (#32188) | ||
| yw;; nSyb-GAL4 | from Bloomington Drosophila Stock Center. (#51941) |
References
- Miller, W. L., Auchus, R. J. The Molecular Biology, Biochemistry, and Physiology of Human Steroidogenesis and Its Disorders. Endocr. Rev. 32 (1), 81-151 (2011).
- Rousseau, G. G. Fifty years ago: The quest for steroid hormone receptors. Mol. Cell. Endocrinol. 375 (1), 10-13 (2013).
- Gilbert, L. I., Rybczynski, R., Warren, J. T. Control and biochemical nature of the ecdysteroidogenic pathway. Annu. Rev. Entomol. 47, 883-916 (2002).
- Niwa, R., Niwa, Y. S. Enzymes for ecdysteroid biosynthesis: their biological functions in insects and beyond. Biosci. Biotechnol. Biochem. 78 (8), 1283-1292 (2014).
- Kozlova, T., Thummel, C. S. Steroid regulation of postembryonic development and reproduction in drosophila. Trends Endocrinol. Metab. 11 (7), 276-280 (2000).
- Ishimoto, H., Kitamoto, T. Beyond molting-roles of the steroid molting hormone ecdysone in regulation of memory and sleep in adult Drosophila. Fly. 5 (3), 215-220 (2011).
- Ishimoto, H., Sakai, T., Kitamoto, T. Ecdysone signaling regulates the formation of long-term courtship memory in adult Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106 (15), 6381-6386 (2009).
- Simon, A. F., Shih, C., Mack, A., Benzer, S. Steroid control of longevity in Drosophila melanogaster. Science. 299 (5611), 1407-1410 (2003).
- Buszczak, M., Freeman, M. R., Carlson, J. R., Bender, M., Cooley, L., Segraves, W. a Ecdysone response genes govern egg chamber development during mid-oogenesis in Drosophila. Development. 126 (20), 4581-4589 (1999).
- Carney, G. E., Bender, M. The drosophila ecdysone receptor (EcR) gene is required maternally for normal oogenesis. Genetics. 154 (3), 1203-1211 (2000).
- Uryu, O., Ameku, T., Niwa, R. Recent progress in understanding the role of ecdysteroids in adult insects: Germline development and circadian clock in the fruit fly Drosophila melanogaster. Zoological Lett. 1, 32 (2015).
- Ameku, T., Niwa, R. Mating-Induced Increase in Germline Stem Cells via the Neuroendocrine System in Female Drosophila. PLOS Genet. 12 (6), e1006123 (2016).
- Danielsen, E. T., et al. A Drosophila Genome-Wide Screen Identifies Regulators of Steroid Hormone Production and Developmental Timing. Dev. Cell. 37 (6), 558-570 (2016).
- Ou, Q., Zeng, J., Yamanaka, N., Brakken-Thal, C., O'Connor, M. B., King-Jones, K. The Insect Prothoracic Gland as a Model for Steroid Hormone Biosynthesis and Regulation. Cell Rep. , (2016).
- Yamanaka, N., Rewitz, K. F., O'Connor, M. B. Ecdysone control of developmental transitions: lessons from Drosophila research. Annu. Rev. Entomol. 58, 497-516 (2013).
- Niwa, Y. S., Niwa, R. Transcriptional regulation of insect steroid hormone biosynthesis and its role in controlling timing of molting and metamorphosis. Dev. Growth Differ. 58, 94-105 (2015).
- Monastirioti, M. Distinct octopamine cell population residing in the CNS abdominal ganglion controls ovulation in Drosophila melanogaster. Dev. Biol. 264 (1), 38-49 (2003).
- Siegmund, T., Korge, G. Innervation of the ring gland of Drosophila melanogaster. J. Comp. Neurol. 431 (4), 481-491 (2001).
- McBrayer, Z., et al. Prothoracicotropic Hormone Regulates Developmental Timing and Body Size in Drosophila. Dev. Cell. 13 (6), 857-871 (1979).
- Shimada-Niwa, Y., Niwa, R. Serotonergic neurons respond to nutrients and regulate the timing of steroid hormone biosynthesis in Drosophila. Nat. Commun. 5, 5778 (2014).
- Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bull World Health Organ. 32 (1), 143-144 (1965).
- Abramoff, M. D., Magalhães, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics Int. 11 (7), 36-42 (2004).
- Ohhara, Y., et al. Autocrine regulation of ecdysone synthesis by β3-octopamine receptor in the prothoracic gland is essential for Drosophila metamorphosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112 (5), 1452-1457 (2015).
- Gibbens, Y. Y., Warren, J. T., Gilbert, L. I., O'Connor, M. B. Neuroendocrine regulation of Drosophila metamorphosis requires TGFbeta/Activin signaling. Development. 138 (13), 2693-2703 (2011).
- Parvy, J. P., et al. A role for βFTZ-F1 in regulating ecdysteroid titers during post-embryonic development in Drosophila melanogaster. Dev. Biol. 282 (1), 84-94 (2005).
- Parvy, J. -P., et al. Forward and feedback regulation of cyclic steroid production in Drosophila melanogaster. Development. 141 (20), 3955-3965 (2014).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Rewitz, K. F., Yamanaka, N., Gilbert, L. I., O'Connor, M. B. The Insect Neuropeptide PTTH Activates Receptor Tyrosine Kinase Torso to Initiate Metamorphosis. Science. 326 (5958), 1403-1405 (2009).
- Li, H. -H., et al. A GAL4 driver resource for developmental and behavioral studies on the larval CNS of Drosophila. Cell Rep. 8 (3), 897-908 (2014).
- Alekseyenko, O. V., Lee, C., Kravitz, E. A. Targeted manipulation of serotonergic neurotransmission affects the escalation of aggression in adult male Drosophila melanogaster. PLOS One. 5 (5), e10806 (2010).
- Domanitskaya, E., Anllo, L., Schüpbach, T. Phantom, a cytochrome P450 enzyme essential for ecdysone biosynthesis, plays a critical role in the control of border cell migration in in Drosophila. Dev. Biol. 386 (2), 408-418 (2014).
- Song, X., Zhu, C. -H., Doan, C., Xie, T. Germline stem cells anchored by adherens junctions in the Drosophila ovary niches. Science. 296 (5574), 1855-1857 (2002).
- Niwa, Y. S., Niwa, R. Neural control of steroid hormone biosynthesis during development in the fruit fly Drosophila melanogaster. Genes Genet. Syst. 89 (1), 27-34 (2014).
- Yoshiyama-Yanagawa, T., et al. The conserved Rieske oxygenase DAF-36/Neverland is a novel cholesterol-metabolizing enzyme. J. Biol. Chem. 286 (29), 25756-25762 (2011).
- Niwa, R., et al. Non-molting glossy/shroud encodes a short-chain dehydrogenase/reductase that functions in the "Black Box" of the ecdysteroid biosynthesis pathway. Development. 137 (12), 1991-1999 (2010).
- Komura-Kawa, T., et al. The Drosophila Zinc Finger Transcription Factor Ouija Board Controls Ecdysteroid Biosynthesis through Specific Regulation of spookier. PLOS Genet. 11 (12), e1005712 (2015).
- Yamanaka, N., Marqués, G., O'Connor, M. B. Vesicle-Mediated Steroid Hormone Secretion in Drosophila melanogaster. Cell. 163 (4), 907-919 (2015).
- Riemensperger, T., Pech, U., Dipt, S., Fiala, A. Optical calcium imaging in the nervous system of Drosophila melanogaster. BBA-Gen. Subjects. 1820 (8), 1169-1178 (2012).
- Owald, D., Lin, S., Waddell, S. Light, heat, action: neural control of fruit fly behavior. Phil. T. Roy. Soc. B. 370 (1677), 20140211 (2015).
