Protocoles pour Visualizing stéroïdogénique organes et leurs organes interactifs avec Immunostaining dans le Fruit Fly<em> Drosophila melanogaster</em

Summary

Nous décrivons un protocole pour la dissection, la fixation et immunomarquage des organes stéroïdogenèse chez les larves de drosophile et les femelles adultes pour étudier la biosynthèse des hormones stéroïdes et son mécanisme de régulation. En plus des organes stéroïdogenèse, nous visualisons l'innervation des organes stéroïdogenèse ainsi que les cellules cibles stéroïdogenèse telles que les cellules souches germinales.

Abstract

Dans les organismes multicellulaires, un petit groupe de cellules est doté d'une fonction spécialisée dans leur activité biogénique, ce qui induit une réponse systémique à la croissance et la reproduction. Chez les insectes, la glande prothoracique des larves (PG) et les femmes jouent un rôle essentiel de l'ovaire adulte dans les hormones stéroïdes biosynthèse principales appelées ecdysteroids. Ces organes sont innervés ecdysteroidogenic du système nerveux, à travers lequel le moment de la biosynthèse est affectée par des facteurs environnementaux. Nous décrivons ici un protocole pour visualiser les organes ecdysteroidogenic et leurs organes interactifs chez les larves et les adultes de la mouche Drosophila melanogaster, qui fournit un système modèle approprié pour étudier la biosynthèse des hormones stéroïdes et son mécanisme de régulation. dissection adroite nous permet de maintenir les positions des organes ecdysteroidogenic et leurs organes interactifs, y compris le cerveau, le cordon nerveux ventral, et d'autres tissus. Immunocoloration avec unntibodies contre enzymes ecdysteroidogenic, ainsi que des protéines de fluorescence transgéniques commandés par des promoteurs spécifiques d'un tissu, sont disponibles pour marquer des cellules ecdysteroidogenic. De plus, l'innervation des organes ecdysteroidogenic peuvent également être marqués par des anticorps spécifiques ou une collection de pilotes GAL4 dans divers types de neurones. Par conséquent, les organes ecdysteroidogenic et leurs connexions neuronales peuvent être visualisées simultanément par immunocoloration et techniques transgéniques. Enfin, nous décrivons comment visualiser les cellules souches de la lignée germinale, dont la prolifération et de maintenance sont contrôlés par ecdysteroids. Cette méthode contribue à la compréhension globale de la biosynthèse des hormones stéroïdes et son mécanisme de régulation neuronale.

Introduction

Dans les organismes multicellulaires, un groupe de cellules est doté d'une fonction spécialisée dans leur activité biogénique qui est essentiel pour le corps entier. Pour remplir leurs missions, chaque tissu ou organe exprime une série de gènes liés à leurs fonctions et communique avec d'autres tissus pour orchestrer leurs activités dans le cadre du développement. Pour caractériser ces fonctions cellulaires spécialisées et les interactions entre les organes, nous avons besoin de spécifier un groupe de cellules ainsi que d'autres types de cellules étant conservées intactes dans l'architecture multicellulaire.

Un exemple de ces organes spécialisés est un organe stéroïdogénique, où de nombreuses enzymes biosynthétiques les étapes de médiatisent conversion du cholestérol aux hormones stéroïdes actifs ^1. La plupart de ces gènes d'enzymes sont exprimés spécifiquement dans les organes stéroïdogenèse, et la voie de biosynthèse est étroitement régulée par de nombreux stimuli externes via des entrées humorale et entrées neuronales. Une fois quesynthétisés, les hormones stéroïdes sont sécrétés dans l'hémolymphe et sont destinés à de nombreux tissus et organes de régulation de l'expression d'une variété de gènes ^2. Par conséquent, l'action d'une hormone stéroïde induit une réponse systémique à maintenir l'homéostasie, la croissance et la reproduction.

Pour étudier les fonctions de la biosynthèse des hormones stéroïdes et les actions pléiotropiques des hormones stéroïdes, Drosophila melanogaster peut être utilisé comme système modèle approprié. Au cours des stades larvaires, dans un organe endocrine spécialisé l'hormone stéroïde insecte, ecdystéroïde, biosynthesized appelée la glande prothoracique (PG) ^3. Dans le PG, plusieurs enzymes catalysent spécifiquement ecdysteroidogenic les multiples étapes de conversion du cholestérol à l' ecdysone, qui contrôle la mue et de la métamorphose à des stades de développement appropriés ^4. Par conséquent, un changement dynamique du titre ecdystéroïde est réglementépar de nombreuses voies de signalisation en réponse aux signaux environnementaux. D'autre part, dans le stade adulte, ecdystéroïde joue un rôle essentiel dans la physiologie, y compris la reproduction, le sommeil, la mémoire et la durée de vie ^{5, 6, 7, 8.} Il est connu que ecdystéroïde est synthétisée activement dans l'ovaire, la régulation de la progression de l' ovogenèse ^{6, 7, 8, 9, 10, 11.} Récemment , nous avons rapporté que le nombre de cellules souches germinales (CSS) est affectée par ecdystéroïde et le sexe de signalisation peptidique en réponse à l' accouplement des stimuli ^12.

Des outils puissants de D. melanogaster la génétique et la biologie cellulaire, y compris l' information du génome bien annoté, gène binairesystèmes d'expression, et des techniques transgéniques ARNi, nous ont permis d'identifier des gènes essentiels à la biosynthèse ecdystéroïde dans la PG et l'ovaire ^{13, 14, 15.} Une fois que les gènes ecdysteroidogenic sont identifiés, la régulation de la transcription de ces gènes et les dynamiques de produits Localisations de gènes peuvent être examinés dans la voie de biosynthèse ^16. A cet effet, la transcription-PCR quantitative en sens inverse, l' ARN par hybridation in situ, et l' analyse immunohistologique sont effectuées. L'application de ces techniques comprend une tâche difficile; la dissection élaborée du PG ou de l'ovaire. En particulier, le PG de la mouche des fruits est relativement plus faible que celle d'autres insectes (par exemple , le ver à soie et la mouche de coup), donc on a besoin de pratiquer la compétence essentielle de la mouche des fruits dissection pour l' échantillonnage. En outre, les deux organes ecdysteroidogenic reçoivent innervations du système nerveux central (SNC) ^{17, 18, 19, 20.} Ainsi, pour les analyses anatomiques précises, les organes ecdysteroidogenic doivent être conservés intacts ainsi que le système nerveux central et d'autres organes, de ne pas perturber leurs connexions neuronales.

Ici , nous fournissons des protocoles pour la dissection et la visualisation des organes stéroïdogenèse dans D. melanogaster. L'apprentissage de la technique de dissection est la clé point de départ de ces expériences. De plus, on peut étiqueter avec succès les organes stéroïdogenèse ainsi que leurs organes interactifs avec plusieurs anticorps et des lignes de pilote GAL4. Profitant de ces techniques, les matériaux et la génétique, on peut étudier les mécanismes complets de biosynthèse des hormones stéroïdes.

Protocol

NOTE: Le schéma d' ensemble des protocoles est illustré à la figure 1. 1. La Dissection du larvaire Anneau Gland (RG) NOTE: Dans D. melanogaster, qui appartient à cyclorrhaphous Diptera, le PG est dans un organe endocrine composite appelé le presse – étoupe annulaire (RG, figure 2D). Comme il est impossible que le PG est chirurgicalement séparé des autres types de cellules (vo…

Representative Results

Nous avons utilisé les protocoles ci – dessus pour visualiser les organes stéroïdogenèse et leurs organes interactifs larves de D. melanogaster et les femelles adultes. Le schéma d' ensemble des protocoles est illustré à la figure 1. Le RG, y compris le PG (Figure 2D), est plus petit et plus transparent que le cerveau et est situé au niveau du côté antérieur-dorsale du cerveau (figure 2A-C et 3A-E). Pour marquer les cellules PG, plusieurs gro…

Discussion

Nous avons étudié la biosynthèse ecdystéroïde et son mécanisme de réglementation D. melanogaster, et a élaboré un protocole de dissection et immunomarquage. Le moment de la biosynthèse ecdystéroïde est affectée par des facteurs environnementaux à travers les entrées de neurones ^33, il est donc essentiel de maintenir l'innervation des organes ecdysteroidogenic ainsi que le cerveau, VNC, et d' autres tissus lors de la dissection.

Comme d?…

Materials

egg collection
tissue culture dish (55 mm)	AS ONE	1-8549-02	for grape-juice agar plates
collection cup	HIKARI KAGAKU
yeast paste	Oriental dry yeast, Tokyo
100% grape juice	Welch Food Inc.
rearing larvae
small vials (12ml, 40×23.5 mm, PS)	SARSTEDT	58.487
disposable loop	AS ONE	6-488-01
standard fly food			the recepi us on the website of Blooington stock center.
dissection
dissecting microscope	Carl Zeiss	Stemi 2000-C
dissecting microscope	Leica	S8 AP0
tissue culture dish (35 x 10 mm, non-treated)	IWAKI	1000-035
Sylgard	TORAY		coarting silicon inside dishes
Terumo needle (27G, 0.40 x 19 mm)	TERUMO	NN-2719S	A "knife" to cut the tissue
Terumo syringe,　1ml	TERUMO	SS-01T
forceps, Inox, #5	Dumont, Switzerland
insect pin (0.18 mm in diameter)	Shiga Brand		for fillet dissection
micro scissors	NATSUME SEISAKUSHO CO LTD.	MB-50-10
fixation
ultrapure water	Merck Millipore
phosphate buffered saline (PBS)
Formaldehyde	Nacalai tesque	16222-65
Paraformaldehyde	Nacalai tesque	02890-45
Triton-X100	Nacalai tesque	35501-15
microtubes (1.5 ml)	INA OPTIKA	CF-0150
Incubation
As one swist mixer TM-300 (rocker)	As one	TM-300	rocker
Bovine Serum Albumin	SIGMA	9048-46-8
primary antibody
anti-Sro (guinea pig), 1:1000
anti-GFP (rabbit), 1:1000	Molecular Probes	A6455	Shimada-Niwa ans Niwa, 2014
anti-GFP (mouse mAb, GF200), 1:100	Nakarai tesque	04363-66
anti-5HT (rabbit), 1:500	SIGMA	S5545
anti-Hts 1B1 (mouse)	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	1B1
anti-DE-cadherin (rat), 1:20	DSHB	DCAD2
anti-nc82 (mouse), 1:50	DSHB	nc82
secondary antibody
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate	Life Technologies	A-11008
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate	Life Technologies	A-11001
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate	Life Technologies	A-11081
Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate	Life Technologies	A-21435
Alexa Fluor 546 dye-conjugated phalloidin	Life Technologies	A-22283
Mounting reagents
Micro slide glass	Matsunami Glass Ind.,Ltd.	SS7213
Square microscope cover glass	Matsunami Glass Ind.,Ltd.	C218181
FluorSave reagent (Mounting reagent)	Calbiochem	345789
Transfer pipette 1 ml (Disposable dropper)	WATSON	5660-222-1S
imaging
LSM700 laser scanning microscope system	Carl Zeiss		inverted Axio Observer. Z1 SP left
image processing
LSM700 ZEN	Carl Zeiss		It is a special user interface based on the 64 bit Microsoft Windows7 operating system
ImageJ
Fly stocks
w; GMR45C06-GAL4			from Bloomington Drosophila Stock Center. (#46260)
UAS–GFP; UAS–mCD8::GFP			gifts from K. Ito, The University of Tokyo.
w[1118]
w; phantom-GAL4#22/UAS-turboRFP
w; UAS-mCD8::GFP; TRH-GAL4			see in Ref29, Alekseyenko, O. V, Lee, C. & Kravitz, E. A.(2010)
w; UAS-mCD8::GFP			from Bloomington Drosophila Stock Center. (#32188)
yw;; nSyb-GAL4			from Bloomington Drosophila Stock Center. (#51941)