Summary

הפרוטוקולים המאפשר הדמיה איברים Steroidogenic ואורגנים אינטראקטיבית שלהם עם Immunostaining ב זבוב הפירות<em> תסיסנית</em

Published: April 14, 2017
doi:

Summary

אנו מתארים פרוטוקול לנתיחה, קיבעון, ו immunostaining של איברי steroidogenic אצל נשי זחלים בוגרים דרוזופילה ללמוד ביוסינתזה הורמון סטרואידים ואת מנגנון הרגולציה שלה. בנוסף לאיברים steroidogenic, אנו לדמיין את העצבוב של איברים steroidogenic כמו גם תאי היעד steroidogenic כגון תאי גזע germline.

Abstract

בשנת יצורים רב-תאיים, קבוצה קטנה של תאים הוא ניחן פונקציה מיוחדת בפעילות שלהם ביוגני, גרימת תגובה מערכתית כדי גידול ורבייה. בשנת חרקים, בלוטת prothoracic הזחל (PG) ואת התפקידים החיוניים השחלה משחק הנקבה הבוגרת ב biosynthesizing ההורמונים הסטרואידים העיקרי שנקרא ecdysteroids. אברי ecdysteroidogenic אלה מעוצבבים ממערכת העצבים, שדרכו עיתוי ביוסינתזה מושפעת לגירויים סביבתיים. כאן אנו מתארים פרוטוקול המאפשר הדמית איברי ecdysteroidogenic והאיברים האינטרקטיוויים שלהם זחלים ומבוגרים של זבוב הפרות תסיסנית, אשר מספקת מערכת מודל מתאימה ללימוד ביוסינתזה הורמון סטרואידים ואת מנגנון הרגולציה שלה. דיסקציה מיומנת מאפשרת לנו לשמור על העמדות של איברי ecdysteroidogenic והאיברים האינטרקטיוויים שלהם כולל המוח, חוט עצב הגחון, ורקמות אחרות. Immunostaining עםntibodies נגד אנזימי ecdysteroidogenic, יחד עם חלבוני קרינה מהונדסים מונעים על ידי יזמי רקמות ספציפיות, זמינה לתייג תאי ecdysteroidogenic. יתר על כן, innervations של איברי ecdysteroidogenic יכול גם להיות מתויג על ידי נוגדנים ספציפיים או אוסף של נהגי GAL4 בסוגים שונים של נוירונים. לכן, איברי ecdysteroidogenic והקשרים העצביים שלהם ניתן דמיינו בו זמנית על ידי immunostaining וטכניקות מהונדסות. לבסוף, אנו מתארים כיצד לחזות תאי גזע germline, אשר התפשטות ותחזוקה נשלטים על ידי ecdysteroids. שיטה זו תורמת להבנה מקיפה של ביוסינתזה הורמון סטרואידים ואת מנגנון הרגולטורים העצבי שלו.

Introduction

בשנת יצורים רב-תאיים, קבוצת תאים הוא ניחן פונקציה מיוחדת בפעילות שלהם ביוגני כי הוא חיוני לגוף כולו. כדי למלא את משימותיהם, בכל רקמה או איבר מבטא שורה של גנים הקשורים לתפקידם ומתקשרת עם רקמות אחרות לתזמר את פעילותם בהקשר של פיתוח. כדי לאפיין פונקציות הסלולר מיוחדות כגון ואינטראקציות בין-איבר, אנו צריכים לציין קבוצת התאים יחד עם סוגים אחרים של תאי אצלינו שלמים בארכיטקטורה הרבה-התאית.

דוגמא אחת של איברים מיוחדים כגון היא איבר steroidogenic, שבו אנזימי biosynthetic רבים לתווך שלבי ההמרה מכולסטרול להורמוני סטרואידים פעילים 1. רוב גני אנזימים אלה באים לידי ביטוי במיוחד איברי steroidogenic, ואת המסלול ביוסינתזה מוסדר בחוזקה על ידי גירויים חיצוניים רבים באמצעות תשומות לחות ואת תשומות עצביות. פַּעַםהורמונים מסונתזים, סטרואידים מופרשים לתוך hemolymph ו ממוקדים רבות רקמות ואיברים להסדרת הביטוי במגוון של גנים 2. לכן, הפעולה של הורמון סטרואידים גורמת לתגובה מערכתית לשמור על הומאוסטזיס, צמיחה, רבייה.

כדי לחקור את הפונקציות של ביוסינתזה הורמון סטרואידי והפעולות pleiotropic של הורמונים סטרואידים, תסיסנית יכול להיות מנוצל כמערכת מודל מתאים. במהלך שלבי הזחל, הורמון סטרואידי חרקים, ecdysteroid, הוא biosynthesized באיבר האנדוקרינית מיוחד הנקרא בלוטת prothoracic (PG) 3. בשנות ה PG, מספר אנזימים ecdysteroidogenic במיוחד לזרז את הצעדים המרה מרובות מכולסטרול כדי ecdysone, השולטת השרה ואת המטמורפוזה בשלבים התפתחותיים המתאים 4. לכן, שינוי דינמי כייל ecdysteroid מוסדרעל ידי מסלולי איתות רבים בתגובה לגירויים סביבתיים. מצד שני, בשלב הבוגר, ecdysteroid ממלא תפקידים חיוניים פיזיולוגיה, כולל רבייה, שינה, זיכרון, ואת תוחלת החיים 5, 6, 7, 8. זה ידוע כי ecdysteroid הוא biosynthesized פעיל בשחלה, המסדיר את התקדמות oogenesis 6, 7, 8, 9, 10, 11. לאחרונה דיווחנו כי מספר תאי גזע germline (GSCs) מושפע איתות פפטיד ecdysteroid ומין בתגובה ההזדווגות לגירויים 12.

כלי רב עצמה של ד melanogaster גנטיקה וביולוגיה תאית, כולל מידע הגנום היטב מבואר, גן בינארימערכות ביטוי, וטכניקות RNAi מהונדסות, אפשרו לנו לזהות גנים חיוניים ecdysteroid ביוסינתזה של PG ואת 13 השחלה, 14, 15. לאחר גני ecdysteroidogenic מזוהים, רגולצית התעתיק של גנים אלה ואת localizations הדינמית של מוצרי גן יכולה להיבחן במסלול ביוסינתזה 16. לשם כך, כמוני-הפוך שעתוק-PCR, RNA כלאה באתרו, וניתוח immunohistological מתנהלת. היישום של טכניקות אלה כולל משימה מאתגרת; לנתיחה המשוכללת של PG או השחלה. בפרט, PG של זבוב הפירות הוא קטן יחסית לזה של חרקים אחרים (למשל תולעי משי ואת הזבוב מכה), כך אחד צריך לתרגל את מיומנות חיונית של זבוב הפירות דיסקציה לדגימה. יתר על כן, איברי ecdysteroidogenic שניהם מקבלים עצבובים ממערכת העצבים המרכזית (CNS) 17, 18, 19, 20. לפיכך, עבור ניתוחים אנטומיים מדויקים, איברי ecdysteroidogenic צריכים להישמר ללא פגע יחד עם CNS ואיברים אחרים, לא לשבש קשרים העצביים שלהם.

כאן אנו מספקים פרוטוקולים לנתיחה ו להדמיה של איברים steroidogenic ברה. melanogaster. לימוד הטכניקה לנתיחה הוא נקודת מוצא המפתח עבור ניסויים אלה. בנוסף, אפשר לסמן את איברי steroidogenic בהצלחה, כמו גם האיברים האינטרקטיוויים שלהם עם מספר נוגדנים וקווי נהג GAL4. ניצול טכניקות אלה, החומרים, ואת הגנטיקה, אחד יכול ללמוד את המנגנונים המקיפים של ביוסינתזה הורמון סטרואידים.

Protocol

הערה: התכנית הכוללת של פרוטוקולים מוצגת באיור 1. 1. דיסקציה של בלוטת טבעת הזחל (RG) הערה: D. melanogaster, השייכת Diptera cyclorrhaphous, האחריות ההורית היא שבתוך איבר האנדוקרינית מורכב הנ…

Representative Results

השתמשנו בפרוטוקולים לעיל כדי להמחיש איברי steroidogenic ואיברים האינטרקטיוויים שלהם אצל נשי זחלי melanogaster ד ו בוגרת. בראייה הכוללת של פרוטוקולים מוצגת באיור 1. RG, כולל PG (איור 2 ד), הוא קטן יותר ושקוף יותר במוח והוא ממוקם בצד-הגבה הקדמי של ה…

Discussion

למדנו ביוסינתזה ecdysteroid מנגנון הרגולציה שלה ב ד melanogaster, ועבדתי פרוטוקול לנתיחת immunostaining. התזמון של ביוסינתזה ecdysteroid מושפע לגירויים סביבתיים באמצעות תשומות עצביות 33, כך שחיוני לשמר את העצבוב של איברי ecdysteroidogenic יחד עם המוח, VNC, ורקמות אחרות במהלך לנתיחה. …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים רייקו כסא ו Tomotsune Ameku לתמיכה הטכנית שלהם עבור עבודה זו. אנחנו גם מודה Kei איטו, אולגה Alekseyenko, אקיקו קוטו, מסאיוקי מיורה, מרכז במלאי Bloomington תסיסנית, קיוטו לניירות מרכז (DGRC), והבנק התפתחותית מחקרים Hybridoma עבור מניות ריאגנטים. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים YSN מן JSPs KAKENHI גרנט מספר 16K20945, קרן נאיטו, ו Inoue מדע ומחקר פרס; ועל ידי מענק RN מ MEXT KAKENHI גרנט מספר 16H04792.

Materials

egg collection
tissue culture dish (55 mm) AS ONE 1-8549-02  for grape-juice agar plates
collection cup HIKARI KAGAKU
yeast paste Oriental dry yeast, Tokyo
100% grape juice Welch Food Inc.
rearing larvae
small vials (12ml, 40×23.5 mm, PS) SARSTEDT 58.487
disposable loop AS ONE 6-488-01
standard fly food  the recepi us on the website of Blooington stock center.
dissection
dissecting microscope Carl Zeiss Stemi 2000-C
dissecting microscope Leica S8 AP0
tissue culture dish (35 x 10 mm, non-treated) IWAKI 1000-035
Sylgard TORAY coarting silicon inside dishes
Terumo needle (27G, 0.40 x 19 mm)  TERUMO NN-2719S A "knife" to cut the tissue
Terumo syringe, 1ml TERUMO SS-01T
forceps, Inox, #5 Dumont, Switzerland
insect pin (0.18 mm in diameter) Shiga Brand for fillet dissection
micro scissors NATSUME SEISAKUSHO CO LTD.  MB-50-10
fixation
ultrapure water Merck Millipore
phosphate buffered saline (PBS)
Formaldehyde Nacalai tesque 16222-65
Paraformaldehyde Nacalai tesque 02890-45
Triton-X100 Nacalai tesque 35501-15
microtubes (1.5 ml) INA OPTIKA CF-0150
Incubation
As one swist mixer TM-300 (rocker) As one TM-300 rocker
Bovine Serum Albumin SIGMA 9048-46-8
primary antibody
anti-Sro (guinea pig), 1:1000
anti-GFP (rabbit), 1:1000 Molecular Probes A6455 Shimada-Niwa ans Niwa, 2014
anti-GFP (mouse mAb, GF200), 1:100 Nakarai tesque 04363-66
anti-5HT (rabbit), 1:500 SIGMA S5545
anti-Hts 1B1 (mouse) Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) 1B1
anti-DE-cadherin (rat), 1:20 DSHB DCAD2
anti-nc82 (mouse), 1:50 DSHB nc82
secondary antibody
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Life Technologies A-11008
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Life Technologies A-11001
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate Life Technologies A-11081
Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate Life Technologies A-21435
Alexa Fluor 546 dye-conjugated phalloidin Life Technologies A-22283
Mounting reagents
Micro slide glass Matsunami Glass Ind.,Ltd. SS7213
Square microscope cover glass Matsunami Glass Ind.,Ltd. C218181
FluorSave reagent (Mounting reagent) Calbiochem 345789
Transfer pipette 1 ml (Disposable dropper) WATSON 5660-222-1S
imaging
LSM700 laser scanning microscope system Carl Zeiss inverted Axio Observer. Z1 SP left
image processing
LSM700 ZEN Carl Zeiss It is a special user interface based on the 64 bit Microsoft Windows7 operating system
ImageJ
Fly stocks
w; GMR45C06-GAL4  from Bloomington Drosophila Stock Center. (#46260)
UAS–GFP; UAS–mCD8::GFP gifts from K. Ito, The University of Tokyo.
w[1118]
w; phantom-GAL4#22/UAS-turboRFP
w; UAS-mCD8::GFP; TRH-GAL4 see in Ref29, Alekseyenko, O. V, Lee, C. & Kravitz, E. A.(2010)
w; UAS-mCD8::GFP  from Bloomington Drosophila Stock Center. (#32188)
yw;; nSyb-GAL4  from Bloomington Drosophila Stock Center. (#51941)

References

  1. Miller, W. L., Auchus, R. J. The Molecular Biology, Biochemistry, and Physiology of Human Steroidogenesis and Its Disorders. Endocr. Rev. 32 (1), 81-151 (2011).
  2. Rousseau, G. G. Fifty years ago: The quest for steroid hormone receptors. Mol. Cell. Endocrinol. 375 (1), 10-13 (2013).
  3. Gilbert, L. I., Rybczynski, R., Warren, J. T. Control and biochemical nature of the ecdysteroidogenic pathway. Annu. Rev. Entomol. 47, 883-916 (2002).
  4. Niwa, R., Niwa, Y. S. Enzymes for ecdysteroid biosynthesis: their biological functions in insects and beyond. Biosci. Biotechnol. Biochem. 78 (8), 1283-1292 (2014).
  5. Kozlova, T., Thummel, C. S. Steroid regulation of postembryonic development and reproduction in drosophila. Trends Endocrinol. Metab. 11 (7), 276-280 (2000).
  6. Ishimoto, H., Kitamoto, T. Beyond molting-roles of the steroid molting hormone ecdysone in regulation of memory and sleep in adult Drosophila. Fly. 5 (3), 215-220 (2011).
  7. Ishimoto, H., Sakai, T., Kitamoto, T. Ecdysone signaling regulates the formation of long-term courtship memory in adult Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106 (15), 6381-6386 (2009).
  8. Simon, A. F., Shih, C., Mack, A., Benzer, S. Steroid control of longevity in Drosophila melanogaster. Science. 299 (5611), 1407-1410 (2003).
  9. Buszczak, M., Freeman, M. R., Carlson, J. R., Bender, M., Cooley, L., Segraves, W. a Ecdysone response genes govern egg chamber development during mid-oogenesis in Drosophila. Development. 126 (20), 4581-4589 (1999).
  10. Carney, G. E., Bender, M. The drosophila ecdysone receptor (EcR) gene is required maternally for normal oogenesis. Genetics. 154 (3), 1203-1211 (2000).
  11. Uryu, O., Ameku, T., Niwa, R. Recent progress in understanding the role of ecdysteroids in adult insects: Germline development and circadian clock in the fruit fly Drosophila melanogaster. Zoological Lett. 1, 32 (2015).
  12. Ameku, T., Niwa, R. Mating-Induced Increase in Germline Stem Cells via the Neuroendocrine System in Female Drosophila. PLOS Genet. 12 (6), e1006123 (2016).
  13. Danielsen, E. T., et al. A Drosophila Genome-Wide Screen Identifies Regulators of Steroid Hormone Production and Developmental Timing. Dev. Cell. 37 (6), 558-570 (2016).
  14. Ou, Q., Zeng, J., Yamanaka, N., Brakken-Thal, C., O’Connor, M. B., King-Jones, K. The Insect Prothoracic Gland as a Model for Steroid Hormone Biosynthesis and Regulation. Cell Rep. , (2016).
  15. Yamanaka, N., Rewitz, K. F., O’Connor, M. B. Ecdysone control of developmental transitions: lessons from Drosophila research. Annu. Rev. Entomol. 58, 497-516 (2013).
  16. Niwa, Y. S., Niwa, R. Transcriptional regulation of insect steroid hormone biosynthesis and its role in controlling timing of molting and metamorphosis. Dev. Growth Differ. 58, 94-105 (2015).
  17. Monastirioti, M. Distinct octopamine cell population residing in the CNS abdominal ganglion controls ovulation in Drosophila melanogaster. Dev. Biol. 264 (1), 38-49 (2003).
  18. Siegmund, T., Korge, G. Innervation of the ring gland of Drosophila melanogaster. J. Comp. Neurol. 431 (4), 481-491 (2001).
  19. McBrayer, Z., et al. Prothoracicotropic Hormone Regulates Developmental Timing and Body Size in Drosophila. Dev. Cell. 13 (6), 857-871 (1979).
  20. Shimada-Niwa, Y., Niwa, R. Serotonergic neurons respond to nutrients and regulate the timing of steroid hormone biosynthesis in Drosophila. Nat. Commun. 5, 5778 (2014).
  21. Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bull World Health Organ. 32 (1), 143-144 (1965).
  22. Abramoff, M. D., Magalhães, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics Int. 11 (7), 36-42 (2004).
  23. Ohhara, Y., et al. Autocrine regulation of ecdysone synthesis by β3-octopamine receptor in the prothoracic gland is essential for Drosophila metamorphosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112 (5), 1452-1457 (2015).
  24. Gibbens, Y. Y., Warren, J. T., Gilbert, L. I., O’Connor, M. B. Neuroendocrine regulation of Drosophila metamorphosis requires TGFbeta/Activin signaling. Development. 138 (13), 2693-2703 (2011).
  25. Parvy, J. P., et al. A role for βFTZ-F1 in regulating ecdysteroid titers during post-embryonic development in Drosophila melanogaster. Dev. Biol. 282 (1), 84-94 (2005).
  26. Parvy, J. -. P., et al. Forward and feedback regulation of cyclic steroid production in Drosophila melanogaster. Development. 141 (20), 3955-3965 (2014).
  27. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  28. Rewitz, K. F., Yamanaka, N., Gilbert, L. I., O’Connor, M. B. The Insect Neuropeptide PTTH Activates Receptor Tyrosine Kinase Torso to Initiate Metamorphosis. Science. 326 (5958), 1403-1405 (2009).
  29. Li, H. -. H., et al. A GAL4 driver resource for developmental and behavioral studies on the larval CNS of Drosophila. Cell Rep. 8 (3), 897-908 (2014).
  30. Alekseyenko, O. V., Lee, C., Kravitz, E. A. Targeted manipulation of serotonergic neurotransmission affects the escalation of aggression in adult male Drosophila melanogaster. PLOS One. 5 (5), e10806 (2010).
  31. Domanitskaya, E., Anllo, L., Schüpbach, T. Phantom, a cytochrome P450 enzyme essential for ecdysone biosynthesis, plays a critical role in the control of border cell migration in in Drosophila. Dev. Biol. 386 (2), 408-418 (2014).
  32. Song, X., Zhu, C. -. H., Doan, C., Xie, T. Germline stem cells anchored by adherens junctions in the Drosophila ovary niches. Science. 296 (5574), 1855-1857 (2002).
  33. Niwa, Y. S., Niwa, R. Neural control of steroid hormone biosynthesis during development in the fruit fly Drosophila melanogaster. Genes Genet. Syst. 89 (1), 27-34 (2014).
  34. Yoshiyama-Yanagawa, T., et al. The conserved Rieske oxygenase DAF-36/Neverland is a novel cholesterol-metabolizing enzyme. J. Biol. Chem. 286 (29), 25756-25762 (2011).
  35. Niwa, R., et al. Non-molting glossy/shroud encodes a short-chain dehydrogenase/reductase that functions in the "Black Box" of the ecdysteroid biosynthesis pathway. Development. 137 (12), 1991-1999 (2010).
  36. Komura-Kawa, T., et al. The Drosophila Zinc Finger Transcription Factor Ouija Board Controls Ecdysteroid Biosynthesis through Specific Regulation of spookier. PLOS Genet. 11 (12), e1005712 (2015).
  37. Yamanaka, N., Marqués, G., O’Connor, M. B. Vesicle-Mediated Steroid Hormone Secretion in Drosophila melanogaster. Cell. 163 (4), 907-919 (2015).
  38. Riemensperger, T., Pech, U., Dipt, S., Fiala, A. Optical calcium imaging in the nervous system of Drosophila melanogaster. BBA-Gen. Subjects. 1820 (8), 1169-1178 (2012).
  39. Owald, D., Lin, S., Waddell, S. Light, heat, action: neural control of fruit fly behavior. Phil. T. Roy. Soc. B. 370 (1677), 20140211 (2015).

Play Video

Cite This Article
Imura, E., Yoshinari, Y., Shimada-Niwa, Y., Niwa, R. Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fruit Fly Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (122), e55519, doi:10.3791/55519 (2017).

View Video