Protokoll för Visualisering steroidogena organ och deras interaktiva organ med immunfärgning i fruktflugan<em> Drosophila melanogaster</em
Summary
Vi beskriver ett protokoll för dissektion, fixering och immunfärgning av steroidogena organ i Drosophila larver och vuxna kvinnor att studera steroid biosyntes hormon och dess regleringsmekanism. Förutom steroidogena organ, visualisera vi innervation av steroidogena organ samt steroidogena målceller såsom groddlinje stamceller.
Abstract
I flercelliga organismer, är en liten grupp av celler utrustad med en specialiserad funktion i sin biogena aktiviteten inducerar en systemisk reaktion på tillväxt och reproduktion. I insekter, larver prothoracic körteln (PG) och den vuxna kvinnliga äggstocken spela viktiga roller i biosyntes de viktigaste steroidhormoner som kallas ecdysteroids. Dessa ecdysteroidogenic organ innerveras från nervsystemet, genom vilka tidpunkten för biosyntes påverkas av miljöfaktorer. Här beskriver vi ett protokoll för att visualisera ecdysteroidogenic organ och deras interaktiva organ i larver och vuxna i bananflugan Drosophila melanogaster, vilket ger en lämplig modellsystem för att studera steroidhormoner biosyntesen och dess regleringsmekanism. Skicklig dissektion ger oss möjlighet att behålla positionerna för ecdysteroidogenic organ och deras interaktiva organ, inklusive hjärnan, den ventrala nerv sladd, och andra vävnader. Immunfärgning med enntibodies mot ecdysteroidogenic enzymer, tillsammans med transgena fluorescensproteiner drivna av vävnadsspecifika promotorer, är tillgängliga för att märka ecdysteroidogenic celler. Dessutom kan de innervationer av ecdysteroidogenic organ också märkas genom specifika antikroppar eller en samling av GAL4 förare i olika typer av neuroner. Därför kan ecdysteroidogenic organ och deras neuronala anslutningar visualiseras samtidigt av immunfärgning och transgena tekniker. Slutligen beskriver vi hur man visualisera könsceller stamceller, vars spridning och underhåll styrs av ecdysteroids. Denna metod bidrar till övergripande förståelse av steroid biosyntes hormon och dess neuronal regleringsmekanism.
Introduction
I flercelliga organismer, är en grupp av celler utrustad med en specialiserad funktion i sin biogena aktivitet som är viktigt för hela kroppen. Att fullgöra sina uppgifter, varje vävnad eller organ uttrycker en rad gener relaterade till deras funktioner och kommunicerar med andra vävnader att iscensätta sin verksamhet i samband med utveckling. För att karakterisera sådana specialiserade cellulära funktioner och interaktioner mellan organ behöver vi ange en grupp celler tillsammans med andra typer av celler hålls intakt i flercelliga arkitekturen.
Ett exempel på sådana specialiserade organ är en steroidogen organ, där många biosyntetiska enzymer medierar stegen omvandlings från kolesterol till aktiva steroidhormoner 1. De flesta av dessa enzymgener är specifikt uttryckt i steroidogena organ och biosyntesvägen är hårt reglerad av många externa stimuli via humorala ingångar och neuronala ingångar. En gångsyntetiserade, steroidhormoner utsöndras i hemolymfa och är riktade till många vävnader och organ för reglering av uttryck av en mängd gener 2. Därför effekten av en steroid hormon framkallar ett systemiskt svar för att upprätthålla homeostas, tillväxt och reproduktion.
Att undersöka funktionerna hos steroidhormon-biosyntes och de pleiotropa åtgärder av steroidhormoner, kan Drosophila melanogaster användas som ett lämpligt modellsystem. Under larvstadier, insektsteroidhormon, ecdysteroid, biosyntetiseras i en specialiserad endokrina organ som kallas prothoracic körteln (PG) 3. I PG, flera ecdysteroidogenic enzymer specifikt katalyserar de multipla omvandlingssteg från kolesterol till ekdyson, som styr ömsat och metamorfos vid de lämpliga utvecklingsstadier 4. Därför är en dynamisk förändring i ecdysteroid titer reglerasav många signalvägar som svar på miljösignaler. Å andra sidan, i sitt vuxna stadium, spelar ecdysteroid väsentliga roller i fysiologi, inklusive reproduktion, sömn, minne, och livslängd 5, 6, 7, 8. Det är känt att ecdysteroid aktivt biosyntetiseras i äggstocken, reglerar progressionen av oogenes 6, 7, 8, 9, 10, 11. Nyligen har vi rapporterat att antalet nedärvda stamceller (GSCs) påverkas vid ecdysteroid och kön peptidsignalering som svar på parning stimuli 12.
Kraftfulla verktyg i D. melanogaster genetik och cellbiologi, inklusive väl kommenterad genominformationen, binär genexpressionssystem, och transgena RNAi tekniker, har gjort det möjligt för oss att identifiera gener som är väsentliga för ecdysteroid biosyntes i PG och äggstocken 13, 14, 15. När väl de ecdysteroidogenic generna har identifierats, kan den transkriptionella regleringen av dessa gener och de dynamiska lokaliseringar av genprodukter att undersökas i biosyntesvägen 16. För detta ändamål, kvantitativt-omvänd transkription-PCR, RNA in situ hybridisering, och immunhistologisk analys utförs. Tillämpningen av dessa tekniker innefattar en utmanande uppgift; genomarbetade dissektion av PG eller äggstocken. I synnerhet är PG av bananfluga relativt mindre än den för andra insekter (t.ex. för silkesodling och blås fly), så måste man utöva den vitala skicklighet bananfluga dissektion för provtagning. Dessutom, båda ecdysteroidogenic organ mottar innervations från det centrala nervsystemet (CNS) 17, 18, 19, 20. Således för noggranna anatomiska analyser de ecdysteroidogenic organ bör hållas intakt tillsammans med CNS och andra organ, för att inte störa deras neuronala anslutningar.
Här ger vi protokoll för dissekering och visualisering av steroidogena organ i D. melanogaster. Att lära sig dissektion tekniken är nyckeln utgångspunkten för dessa experiment. Dessutom kan man med framgång märka steroidogena organ samt deras interaktiva organ med flera antikroppar och GAL4 föraren linjer. Med utnyttjande av dessa tekniker, material och genetik kan man studera de omfattande mekanismer av steroidhormon biosyntes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi studerade ecdysteroid biosyntesen och dess regleringsmekanism i D. melanogaster, och utarbetat ett protokoll för dissekering och immunfärgning. Tidpunkten för ecdysteroid biosyntes påverkas av miljöfaktorer genom neuronala ingångar 33, så det är viktigt att bibehålla innervation av de ecdysteroidogenic organ tillsammans med hjärnan, VNC, och andra vävnader under dissekering.
Såsom beskrivits ovan, D. melanogaster PG bildar ett komplex …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Reiko Kise och Tomotsune Ameku för deras tekniska stöd för detta arbete. Vi är också tacksamma mot Kei Ito, Olga Alekseyenko, Akiko Koto, Masayuki Miura, Bloomington Drosophila Lager Center, KYOTO Stock Center (DGRC) och utvecklingsstudier Hybridoma Bank för aktier och reagens. Detta arbete har finansierats med bidrag till YSN från JSPS KAKENHI Grant Number 16K20945, The Naito Foundation och Inoue Science Research Award; och genom ett bidrag till RN från MEXT KAKENHI Grant Number 16H04792.
Materials
| egg collection | |||
| tissue culture dish (55 mm) | AS ONE | 1-8549-02 | for grape-juice agar plates |
| collection cup | HIKARI KAGAKU | ||
| yeast paste | Oriental dry yeast, Tokyo | ||
| 100% grape juice | Welch Food Inc. | ||
| rearing larvae | |||
| small vials (12ml, 40×23.5 mm, PS) | SARSTEDT | 58.487 | |
| disposable loop | AS ONE | 6-488-01 | |
| standard fly food | the recepi us on the website of Blooington stock center. | ||
| dissection | |||
| dissecting microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000-C | |
| dissecting microscope | Leica | S8 AP0 | |
| tissue culture dish (35 x 10 mm, non-treated) | IWAKI | 1000-035 | |
| Sylgard | TORAY | coarting silicon inside dishes | |
| Terumo needle (27G, 0.40 x 19 mm) | TERUMO | NN-2719S | A "knife" to cut the tissue |
| Terumo syringe, 1ml | TERUMO | SS-01T | |
| forceps, Inox, #5 | Dumont, Switzerland | ||
| insect pin (0.18 mm in diameter) | Shiga Brand | for fillet dissection | |
| micro scissors | NATSUME SEISAKUSHO CO LTD. | MB-50-10 | |
| fixation | |||
| ultrapure water | Merck Millipore | ||
| phosphate buffered saline (PBS) | |||
| Formaldehyde | Nacalai tesque | 16222-65 | |
| Paraformaldehyde | Nacalai tesque | 02890-45 | |
| Triton-X100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
| microtubes (1.5 ml) | INA OPTIKA | CF-0150 | |
| Incubation | |||
| As one swist mixer TM-300 (rocker) | As one | TM-300 | rocker |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | 9048-46-8 | |
| primary antibody | |||
| anti-Sro (guinea pig), 1:1000 | |||
| anti-GFP (rabbit), 1:1000 | Molecular Probes | A6455 | Shimada-Niwa ans Niwa, 2014 |
| anti-GFP (mouse mAb, GF200), 1:100 | Nakarai tesque | 04363-66 | |
| anti-5HT (rabbit), 1:500 | SIGMA | S5545 | |
| anti-Hts 1B1 (mouse) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | 1B1 | |
| anti-DE-cadherin (rat), 1:20 | DSHB | DCAD2 | |
| anti-nc82 (mouse), 1:50 | DSHB | nc82 | |
| secondary antibody | |||
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A-11008 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A-11001 | |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate | Life Technologies | A-11081 | |
| Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate | Life Technologies | A-21435 | |
| Alexa Fluor 546 dye-conjugated phalloidin | Life Technologies | A-22283 | |
| Mounting reagents | |||
| Micro slide glass | Matsunami Glass Ind.,Ltd. | SS7213 | |
| Square microscope cover glass | Matsunami Glass Ind.,Ltd. | C218181 | |
| FluorSave reagent (Mounting reagent) | Calbiochem | 345789 | |
| Transfer pipette 1 ml (Disposable dropper) | WATSON | 5660-222-1S | |
| imaging | |||
| LSM700 laser scanning microscope system | Carl Zeiss | inverted Axio Observer. Z1 SP left | |
| image processing | |||
| LSM700 ZEN | Carl Zeiss | It is a special user interface based on the 64 bit Microsoft Windows7 operating system | |
| ImageJ | |||
| Fly stocks | |||
| w; GMR45C06-GAL4 | from Bloomington Drosophila Stock Center. (#46260) | ||
| UAS–GFP; UAS–mCD8::GFP | gifts from K. Ito, The University of Tokyo. | ||
| w[1118] | |||
| w; phantom-GAL4#22/UAS-turboRFP | |||
| w; UAS-mCD8::GFP; TRH-GAL4 | see in Ref29, Alekseyenko, O. V, Lee, C. & Kravitz, E. A.(2010) | ||
| w; UAS-mCD8::GFP | from Bloomington Drosophila Stock Center. (#32188) | ||
| yw;; nSyb-GAL4 | from Bloomington Drosophila Stock Center. (#51941) |
References
- Miller, W. L., Auchus, R. J. The Molecular Biology, Biochemistry, and Physiology of Human Steroidogenesis and Its Disorders. Endocr. Rev. 32 (1), 81-151 (2011).
- Rousseau, G. G. Fifty years ago: The quest for steroid hormone receptors. Mol. Cell. Endocrinol. 375 (1), 10-13 (2013).
- Gilbert, L. I., Rybczynski, R., Warren, J. T. Control and biochemical nature of the ecdysteroidogenic pathway. Annu. Rev. Entomol. 47, 883-916 (2002).
- Niwa, R., Niwa, Y. S. Enzymes for ecdysteroid biosynthesis: their biological functions in insects and beyond. Biosci. Biotechnol. Biochem. 78 (8), 1283-1292 (2014).
- Kozlova, T., Thummel, C. S. Steroid regulation of postembryonic development and reproduction in drosophila. Trends Endocrinol. Metab. 11 (7), 276-280 (2000).
- Ishimoto, H., Kitamoto, T. Beyond molting-roles of the steroid molting hormone ecdysone in regulation of memory and sleep in adult Drosophila. Fly. 5 (3), 215-220 (2011).
- Ishimoto, H., Sakai, T., Kitamoto, T. Ecdysone signaling regulates the formation of long-term courtship memory in adult Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106 (15), 6381-6386 (2009).
- Simon, A. F., Shih, C., Mack, A., Benzer, S. Steroid control of longevity in Drosophila melanogaster. Science. 299 (5611), 1407-1410 (2003).
- Buszczak, M., Freeman, M. R., Carlson, J. R., Bender, M., Cooley, L., Segraves, W. a Ecdysone response genes govern egg chamber development during mid-oogenesis in Drosophila. Development. 126 (20), 4581-4589 (1999).
- Carney, G. E., Bender, M. The drosophila ecdysone receptor (EcR) gene is required maternally for normal oogenesis. Genetics. 154 (3), 1203-1211 (2000).
- Uryu, O., Ameku, T., Niwa, R. Recent progress in understanding the role of ecdysteroids in adult insects: Germline development and circadian clock in the fruit fly Drosophila melanogaster. Zoological Lett. 1, 32 (2015).
- Ameku, T., Niwa, R. Mating-Induced Increase in Germline Stem Cells via the Neuroendocrine System in Female Drosophila. PLOS Genet. 12 (6), e1006123 (2016).
- Danielsen, E. T., et al. A Drosophila Genome-Wide Screen Identifies Regulators of Steroid Hormone Production and Developmental Timing. Dev. Cell. 37 (6), 558-570 (2016).
- Ou, Q., Zeng, J., Yamanaka, N., Brakken-Thal, C., O’Connor, M. B., King-Jones, K. The Insect Prothoracic Gland as a Model for Steroid Hormone Biosynthesis and Regulation. Cell Rep. , (2016).
- Yamanaka, N., Rewitz, K. F., O’Connor, M. B. Ecdysone control of developmental transitions: lessons from Drosophila research. Annu. Rev. Entomol. 58, 497-516 (2013).
- Niwa, Y. S., Niwa, R. Transcriptional regulation of insect steroid hormone biosynthesis and its role in controlling timing of molting and metamorphosis. Dev. Growth Differ. 58, 94-105 (2015).
- Monastirioti, M. Distinct octopamine cell population residing in the CNS abdominal ganglion controls ovulation in Drosophila melanogaster. Dev. Biol. 264 (1), 38-49 (2003).
- Siegmund, T., Korge, G. Innervation of the ring gland of Drosophila melanogaster. J. Comp. Neurol. 431 (4), 481-491 (2001).
- McBrayer, Z., et al. Prothoracicotropic Hormone Regulates Developmental Timing and Body Size in Drosophila. Dev. Cell. 13 (6), 857-871 (1979).
- Shimada-Niwa, Y., Niwa, R. Serotonergic neurons respond to nutrients and regulate the timing of steroid hormone biosynthesis in Drosophila. Nat. Commun. 5, 5778 (2014).
- Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bull World Health Organ. 32 (1), 143-144 (1965).
- Abramoff, M. D., Magalhães, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics Int. 11 (7), 36-42 (2004).
- Ohhara, Y., et al. Autocrine regulation of ecdysone synthesis by β3-octopamine receptor in the prothoracic gland is essential for Drosophila metamorphosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112 (5), 1452-1457 (2015).
- Gibbens, Y. Y., Warren, J. T., Gilbert, L. I., O’Connor, M. B. Neuroendocrine regulation of Drosophila metamorphosis requires TGFbeta/Activin signaling. Development. 138 (13), 2693-2703 (2011).
- Parvy, J. P., et al. A role for βFTZ-F1 in regulating ecdysteroid titers during post-embryonic development in Drosophila melanogaster. Dev. Biol. 282 (1), 84-94 (2005).
- Parvy, J. -. P., et al. Forward and feedback regulation of cyclic steroid production in Drosophila melanogaster. Development. 141 (20), 3955-3965 (2014).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Rewitz, K. F., Yamanaka, N., Gilbert, L. I., O’Connor, M. B. The Insect Neuropeptide PTTH Activates Receptor Tyrosine Kinase Torso to Initiate Metamorphosis. Science. 326 (5958), 1403-1405 (2009).
- Li, H. -. H., et al. A GAL4 driver resource for developmental and behavioral studies on the larval CNS of Drosophila. Cell Rep. 8 (3), 897-908 (2014).
- Alekseyenko, O. V., Lee, C., Kravitz, E. A. Targeted manipulation of serotonergic neurotransmission affects the escalation of aggression in adult male Drosophila melanogaster. PLOS One. 5 (5), e10806 (2010).
- Domanitskaya, E., Anllo, L., Schüpbach, T. Phantom, a cytochrome P450 enzyme essential for ecdysone biosynthesis, plays a critical role in the control of border cell migration in in Drosophila. Dev. Biol. 386 (2), 408-418 (2014).
- Song, X., Zhu, C. -. H., Doan, C., Xie, T. Germline stem cells anchored by adherens junctions in the Drosophila ovary niches. Science. 296 (5574), 1855-1857 (2002).
- Niwa, Y. S., Niwa, R. Neural control of steroid hormone biosynthesis during development in the fruit fly Drosophila melanogaster. Genes Genet. Syst. 89 (1), 27-34 (2014).
- Yoshiyama-Yanagawa, T., et al. The conserved Rieske oxygenase DAF-36/Neverland is a novel cholesterol-metabolizing enzyme. J. Biol. Chem. 286 (29), 25756-25762 (2011).
- Niwa, R., et al. Non-molting glossy/shroud encodes a short-chain dehydrogenase/reductase that functions in the "Black Box" of the ecdysteroid biosynthesis pathway. Development. 137 (12), 1991-1999 (2010).
- Komura-Kawa, T., et al. The Drosophila Zinc Finger Transcription Factor Ouija Board Controls Ecdysteroid Biosynthesis through Specific Regulation of spookier. PLOS Genet. 11 (12), e1005712 (2015).
- Yamanaka, N., Marqués, G., O’Connor, M. B. Vesicle-Mediated Steroid Hormone Secretion in Drosophila melanogaster. Cell. 163 (4), 907-919 (2015).
- Riemensperger, T., Pech, U., Dipt, S., Fiala, A. Optical calcium imaging in the nervous system of Drosophila melanogaster. BBA-Gen. Subjects. 1820 (8), 1169-1178 (2012).
- Owald, D., Lin, S., Waddell, S. Light, heat, action: neural control of fruit fly behavior. Phil. T. Roy. Soc. B. 370 (1677), 20140211 (2015).
