Summary
TRNA (UUU) üretimi ve agaroz jel geciktirme testleri ile TcdA enzimi ile kompleks içinde tRNA (UUU) analizi için bir protokol sunulmuştur.
Abstract
Escherichia coli'de tRNA'nın (UUU) eksprese edilmesi ve saflaştırılması için yöntemler ve tRNA'nın (UUU) TcdA, bir N6-threonylcarbamoyladenosine (t6A) dehidrataz ile bağlanmasının jel geciktirme deneyleri ile analizi, bu, threonylcarbamoyl TRNA'ların antikodon kök döngüsünde (ASL) A37'ye bağlanmış yan zincirin siklik t6A'ya (ct 6 A) dönüştürülmesi. TRNA (UUU) kodlayan sentetik genin transkripsiyonu E. coli'de 1 mM izopropil β-D-l-tiogalaktopiranozit (IPTG) ile indüklenir ve tRNA içeren hücreler indüksiyonun 24 saat sonra hasat edilir. RNA fraksiyonu asit fenol ekstraksiyon yöntemi kullanılarak saflaştırılır. Saf tRNA, küçük boyutlu tRNA moleküllerini bozulmamış veya parçalanmış nükleik asitlerden verimli bir şekilde ayıran bir jel filtrasyon kromatografisiyle elde edilir. TRNA'ya (UUU) TcdA bağlanmasını analiz etmek için, TcdA tRNA'ya (UUU) karıştırılır ve doğal bir agaroz jelinde 4 ° C'de ayrılır.Serbest tRNA (UUU) daha hızlı göç ederken, TcdA-tRNA (UUU) kompleksleri jel boyama sırasında gözlemlenebilen bir mobilite geriliğine uğrarlar. TcdA'nın bir tRNA (UUU) bağlayıcı enzim olduğunu kanıtlıyoruz. Bu jel gerilik testi, TcdA mutantlarını ve katkı maddelerinin ve diğer proteinlerin bağlanma üzerindeki etkilerini incelemek için kullanılabilir.
Introduction
Jel gerilik testi 1 (elektroforetik mobilite kaydırma deneyi EMSA olarak da bilinir), protein-nükleik asit etkileşimlerini incelemek ve karakterize etmek için tasarlanmış bir elektroforetik yöntemdir. Protein-DNA'nın yanı sıra protein-RNA etkileşimlerinin ve özellikle de tRNA ve tRNA-bağlayıcı proteinler arasındaki etkileşimlerin saflaştırılmış bileşenleri veya kompleks protein karışımları ( örn. , Hücre lizatları) veya nükleik asitler ( örn. , TRNA havuzları). Antikoodon kök döngüsünde (ASL) A37'ye bağlanan threonylcarbamoyl yan zincirini siklize eden saflaştırılmış tRNA (UUU) ile TcdA, bir N6-threonylcarbamoyladenosine (t6A) dehidrataz arasındaki etkileşimin incelenmesine jel geciktirme testleri uyguladık TRNA'ların siklik t6'ya (ct 6 A) 2 , 3'e dönüştürülmesi . TcdA ayrıca CsdL 3 olarak bilinir ,Fc > 4. tcdA / csdL geni sistein desulfurase'ı ve sistein sulfinase desulfinate (CSD) sisteminin sülfür akseptörünü kodlayan csdA ve csdE genleri 5 ile bir küme oluşturur ve canlı ortamda TcdA fonksiyonunu sürdürmek için gereklidir 3 .
Jel retardasyon deneylerinin ardındaki mantık, serbest nükleik asit molekülleri, büyük negatif yüklerinden ötürü akrilamidin veya agaroz jellerinin önüne hızla göç ederken, aynı nükleik asitlerin protein komplekslerinin elektroforetik hareketliliği dramatik bir şekilde azalır. Hareketlilikteki azalma, ayrı bantlar olarak çözümlenen nükleik asit-protein komplekslerinde "kayma" olarak görülebilir. Pozitif yüklü ve daha büyük nükleik asit-protein kompleksi, bir jel üzerinde hareketlilikte daha büyük bir kayma veya azalma gösterir.
Kompleksin yükle nötrleştirilmesi evrensel bir fenomendirProtein-nükleik asit kompleksleri için, jel retardasyon tahlili geniş bir kompleks yelpazesine ve nükleik asit tiplerine uygulanabilir. Yöntem basit, ucuzdur ve minimum ekipmanlarla laboratuvarlarda yürütülebilir. Sadece az miktarda protein ve tRNA gerekir. Bu, genellikle daha büyük miktarlarda numuneyi tüketen alternatif biyofiziksel teknikler üzerinde bir avantajdır.
Jel retardasyon tahlili transkripsiyon faktörlerinin incelenmesi için yaygın olarak kullanılmaktadır. Deney, birçok farklı DNA dizisi için transkripsiyon faktörlerinin bağlanma kinetiği, mukavemeti ve özgünlüğünü analiz etmek için kullanılmıştır. Gerçekten de bu alanda EMSA ilk önce 6 , 7 geliştirildi. RNA 8 , 9 , 10 , 11 ve tRNA molekülleri ile jel geciktirme testleri ribozom araştırmasında da kullanılmıştırVe burada yaptığımız gibi, transkripsiyonel olarak tRNA nükleozidlerini değiştiren enzimleri analiz etmek.
Birçok farklı parametre, sıcaklık, protein kalitesi ve tRNA örneği gibi jel retardasyon tahlilinin sonucunu ve bağlanma kuvvetini etkiler. Deneyin dikkatli planlanması ve uygulanması, serbest nükleik asit ve protein bağlı türlerin sonuçlarının yorumlanması için çok önemlidir. Burada, tRNA'yı (UUU) kodlayan sentetik geni, promotörü Shine-Dalgarno ribozom bağlanma yerinden yoksun bir ifade vektörüne klonlandı ve büyük miktarda tRNA 2 sentezine yol açtı. Bu ayrıntılı protokol, yaygın hatalar önlenirken tRNA jel geciktirme deneyleri gerçekleştirmek için net bir kılavuz sağlamak üzere hazırlanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dikkat: Kullanmadan önce ilgili tüm malzeme güvenlik bilgi formlarına (MSDS) başvurun. Bu protokolde kullanılan kimyasallardan birçoğu toksik ve aşındırıcıdır. Davlumbaz ve kişisel koruyucu ekipmanlar (emniyet gözlükleri, eldivenler, laboratuar önlükleri, tam pantolonlar, kapalı pabuçlar, vb .) Dahil olmak üzere fenol kullanarak tRNA'nın özümlenmesinde uygun uygulamaları kullanın. Bu protokol, toksik olmayan bir nükleik asit lekesi kullanıyor. Alternatif lekelerin kullanılması, toksik ve / veya kanserojen olan durumlarda ek önlemler ve lekelenme ajanının özel olarak imha edilmesini gerektirebilir ( örn ., Etidyum bromür).
1. Agaroz Jelinin Hazırlanması
- 2 g agaroz tartın ve bir% 2 w / v agaroz jel hazırlamak için bir cam şişeye ekleyin.
- Agaroz içeren şişeye 100 mL 1x tris-borat-etilendiamintetraasetik asit (EDTA) (TBE) akan tampon ekleyin. Bir mikrodalga fırında ısıtarak eritin. 30 saniyelik aralıklarla içeriği karıştırıp karıştırınIyi ve agaroz tamamen çözünene kadar bu adımı tekrarlayın. Agaroz çözeltisinin yaklaşık 50-60 ° C'ye soğumasını bekleyin.
- Jel tepsisinin açık kenarlarını bir kalıp oluşturmak için bantlayın, kuyuları oluşturmak için uygun bir tarağı yerleştirin ve eritilmiş agarozu içine dökün. Kabarcık oluşumundan kaçının ve oda sıcaklığında katılaşmasına izin verin.
- Katılaştıktan sonra, jel tepsisini bir elektroforez birimine yerleştirin ve jel tamamen kaplanıncaya kadar TBE tamponuyla doldurun.
2. tRNA'nın hazırlanması
- E coli'de tRNA (UUU)
- Sabah, düşük tuzlu Luria Broth (LB) çizgisi oluşturmak için pET23d-EcUUU 2 ifade geni ( E. coli tRNA'sını (UUU) kodlayan liman) ile dönüştürülen donmuş E. coli BL21'in (DE3) bir şişesini kullanın. 100 ug / mL ampisilin ile desteklenmiş plaka. Plakayı ters çevirin ve koloniler görünene kadar 37 ° C inkübatöre yerleştirin (geç dönem)) Oon.
- İyi yetişmiş tek bir koloni, 5 mL LB artı 100 μg / mL ampisilin içinde inoküle edin ve gece boyunca 37 ° C'de 220 rpm'de büyütün.
- Ertesi sabah, hücreleri peletleyin (4 ° C'de 10 dakika 6,500 xg) orta ile 5 mL taze LB artı 100 μg / mL ampisilin ve tekrar süspansiyon ile değiştirin. 200 mL LB artı 100 μg / mL ampisilin inoküle etmek için bu süspansiyon kullanın. 37 ° C'de 220 rpm'de 5 saat büyütün.
- Kültürün 590 nm'de (OD 590 ) optik yoğunluğu 0.6 - 0.8'e ulaştığında, tRNA (UUU) geninin ekspresyonunu tetiklemek için kültüre 1 mM IPTG ekleyin. 37 ° C'de 3 saat inkübe edin.
- Kültürü 6,500 xg'de 4 ° C'de 10 dakika santrifüj ederek hücreleri hasat edin.
- Lizis ve ekstraksiyon
- Hücre peletini 5 mL liziz tamponu (0.3 M sodyum asetat, 10 mM EDTA) içinde tekrar süspanse edin. Bu noktadan sonra otoklavda kullanılan tamponları kullandı ve tüm tRNA içeren örnekleri 4 ° C'de tutarak tRNA bozunması.
- Davlumbazdaki yeniden asılmış hücre pelletine 1 hacim asit fenol (pH 4.3) ilave edin. Hücreleri çözmek için 1 dakika karıştırın ve 10.000 xg'de (10 dakika, 4 ° C) santrifüjleyin.
- Organik (alt) fazı aspirememek için dikkatli bir pipet kullanarak çözünür tRNA (UUU) (ve diğer tRNA havuzlarının daha küçük konsantrasyonları) içeren üst sulu fazı toplayın. Organik faz ve hücre artıklarından oluşan alt tabaka ve peleti uygun bir kaba atın.
- Çözünür (sulu) fazı, hacimce% 100 v / v etanol ile 1 saat süreyle 4 ° C'de ters çevirerek iyice karıştırarak tRNA'yı çökeltin. Karışımı 15,000 xg'de (30 dakika, 4 ° C) santrifüjleyin.
- Süpernatanı dikkatlice boşaltın ve tRNA zengin pelleti 4 mL jel filtrasyon tamponunda (20 mM sodyum fosfat veya potasyum fosfat, pH 7.4, 0.1 mM EDTA) tekrar süspansiyon haline getirin. % 2 w / v agaroz jeli üzerine 5 μL tekrar süspansiyon haline getirilmiş tRNA havuzunu çalıştırın.
NOT:Kaliteli tRNA, tek bir bant (50-100 bp arasında molekül boyutu) olarak görünür.
- TRNA'nın saflaştırılması (UUU)
- Standart kromatografi uygulamasını 12 takiben, daha önce jel filtrasyon tamponunda dengelenmiş bir yüksek çözünürlüklü hazırlayıcı jel filtrasyon sütununa (boyutlar: 16 x 600 mm, yatak hacmi: 120 mL, çözünürlük aralığı: 1,000-70,000 Da) yeniden askıya alınmış tRNA'yı (UUU) yükleyin (mobil aşama). Numunelerin ayrılması için akış oranını 1 mL / dakika olarak ayarlayın.
NOT: tRNA (UUU) zirvesi yaklaşık 75.5 mL'de elüte edilir. Tipik olarak, 0.5-1.0 mg / L kültür tRNA verimi elde edilebilir. - Örnekleri% 5 w / v agaroz jeli üzerinde her bir örnekten 5 - 10 uL elektroforezleyerek temsil eden elüsyon hacimlerinde analiz edin.
- Standart kromatografi uygulamasını 12 takiben, daha önce jel filtrasyon tamponunda dengelenmiş bir yüksek çözünürlüklü hazırlayıcı jel filtrasyon sütununa (boyutlar: 16 x 600 mm, yatak hacmi: 120 mL, çözünürlük aralığı: 1,000-70,000 Da) yeniden askıya alınmış tRNA'yı (UUU) yükleyin (mobil aşama). Numunelerin ayrılması için akış oranını 1 mL / dakika olarak ayarlayın.
3. Numune Hazırlama
- López-Estepa ve ark.na göre TcdA'yı ifade edin ve arıtın. 2 .
NOT: 250 μm'ye kadarÇalışma için TcdA kullanılabilir. - Tablo 1'e uygun olarak 1.5 mL santrifüj tüplerine uygun etiketli TcdA'yı karşılık gelen miktarda pipetleyin. 1.6 mM tris (2-karboksietil) fosfin (TCEP) (nihai konsantrasyon) ilave edin ve bir pipet kullanarak hafifçe karıştırın. Kapağı kapatın ve karışımı oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
- 10 uM adenosin trifosfat (ATP) ve 50 mM MgCl2 (nihai konsantrasyonlar) ilave edin. Bir pipetle karıştırın ve karışımı oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
- Tablo 1'e göre saflaştırılmış tRNA (UUU) (bölüm 2.3) ekleyin, bir pipet ile karıştırın ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
- 100 μL son hacme kadar fosfat tamponlu tuz (PBS) ekleyin. Doğru şekilde karıştırın ve% 10 v / v son konsantrasyona kadar gliserol ekleyin.
- Numuneyi vorteksleyin ve tüpün içeriğini kısaca boşaltın (10,000 xg, 1 dakika, 4 ° C).
4. Jel Yükleme ve Elektroforez Geliştirme
- Elektroforez ünitesi, elektroforez işlemi sırasında bölmeyi 4 ° C'de tutmak için ezilmiş buz dolu bir tepsi içine yerleştirin.
- Dikkatle, ilgili kuyucuğa her bir örneğin 5 μl'unu pipetleyin. Uygun bir DNA boyutu işaretleyicisi ekleyin.
- Elektrotları güç kaynağı ünitesinin ilgili yuvalarına takın. Güç kaynağı birimini açın ve voltajı 100 V olarak ayarlayın ve jeli 90 dakika boyunca çalıştırın.
5. tRNA-Protein Etkileşimini Gözlemlemek İçin Jel Boyaması
- Boyama solüsyonunu 50 mL TBE'yi 1x uygun bir DNA lekesi ile karıştırarak hazırlayın. Boyama kabını alüminyum folyo ile kaplayarak boyama çözümünü güneş ışığına maruz bırakmayın.
NOT: DNA lekeleri genellikle 10.000 veya 20.000x konsantre stok olarak saklanır. - 90 dakika boyunca elektroforezden sonra jelini tepsiden dikkatlice çıkarın ve boyama solüsyonu içeren bir kaba yerleştirin. Oda sıcaklığında düşük salınan hızda bir rocker üzerine yerleştirin30 dakika bekleyin.
- Agaroz jeli lekelenme kabından çıkarın, fazlalık sıvıyı çıkarmak için bir parça selüloz dokusu veya filtre kağıdına dikkatlice vurun ve doğrudan transilluminator üzerine yerleştirin. TRNA içeren bantları görselleştirmek için UV ışığını açın. Jelin fotoğrafını çekin.
- Protein boyama (isteğe bağlı).
- DNA boyama solüsyonunu güvenli bir şekilde atın (güvenlik prosedürlerine göre) ve 50 mL Coomassie Brilliant Blue (CBB) solüsyonuyla değiştirin. Tepsiyi oda sıcaklığında bir rocker üzerine koyun ve bir gece boyayın (> 12 saat). CBB boyama çözüm atın ve aşırı boya kaldırmak için 50 ml PBS ile değiştirin. Bir rocker üzerinde 1 saat bekleyin.
- Bir ışık transilluminatör altında protein içeren tRNA kompleksleri görselleştirmek ve tRNA UV jel resmi ile karşılaştırmak için jel fotoğraflarını çekin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Büyük miktarda tRNA (UUU), güçlü bir indüklenebilir T7 promotörü kontrolü altında E. coli'de tRNA geninin eksprese edilmesi ile elde edilebilir. İfade edilen tRNA (UUU), sitoplazmada birikir ve doğal olarak bol miktarda bulunan tRNA'ların havuzunda zenginleştirilir. EMSA dereceli tRNA elde etmek için bir yakalama / ekstraksiyon basamağı ve bir jel filtrasyon / parlatma aşaması içeren iki aşamalı bir saflaştırma işlemi kullanılmıştır. Yakalama / ekstraksiyon basamağı protein, hücre döküntüsü, DNA'nın ve tRNA'nın ekstraksiyonunun (ve diğer RNA moleküllerinin) aynı anda çökeltilmesini sağlamak için pH 4.3 fenolü kullanır. Bu aşamada toplam tRNA havuzu miktarı% 2 a / a agaroz jeli üzerinde elektroforez ile değerlendirilebilir. İkinci adım, RNA türlerini moleküler boyutlarına göre ayıran jel filtrasyon kromatografisini içerir. 254 nm'de UV izlemesi ayrımı izlemek ve ana elüsyon zirvelerini belirlemek için kullanılır ( Şekil 1Üst). Tepe fraksiyonlarının temsili alikotları, analiz için bir% 2 a / h agaroz jeli üzerinde çalıştırıldı ( Şekil 1 alt ). TRNA moleküllerinin çoğunluğu, kromatografi uygulamasının tek bir zirvesinde (burada, 120 mL'lik bir yatak-boyut sütununda 75.5 mL) birlikte elüte edilir. TRNA (UUU) gibi tek bir aşırı ekspresyona uğramış tür içeren havuzları ayırırken, havuzdaki tRNA moleküllerinin% 90'ından fazlası o spesifik tRNA'ya aitken geri kalan moleküller doğal olarak bol miktarda tRNA'ya karşılık gelir. İkincil tepe noktaları, tRNA içeren merkezi pikten önce ve sonra gözlenir. Daha önce zirve (ler), kısmen bozunmuş daha büyük RNA moleküllerini (kesirler 26 ve 32, Şekil 1'deki çubuklar) ve saflaştırma işleminin sonunda pik (ler) çok düşük RNA'lar ve kirletici maddeler (kesirler 45 ve 51; Şekil 1'deki çubuklar). Fraksiyonları, merkezi tepe altında birlettikten sonra (fraksiyonlar 39-43; Şekil 1'deki çubuklar) saflaştırılmış tRNA miktarı, UV spektroskopisi ve / veya% 2 w / v agaroz jeli üzerinde moleküler boyut standartlarıyla karşılaştırma ile nicelleştirilebilir.
TcdA ve tRNA (UUU) örnekleri, yarı logaritmik bir örnekleme şeması ( Tablo 1 ) kullanılarak 1.0 ila 10.0 arasında farklı molar oranlarda karıştırılabilir ve% 2 a / h agaroz jelleri üzerinde ayrıştırılabilir ( Şekil 2 ). Protein-tRNA komplekslerinin kararlılığına ve bağlanmanın stokiyometrisine bağlı olarak, jel üzerinde bir veya birkaç bant görüntülenebilir. TcdA-tRNA (UUU) için, hem protein hem de tRNA içeren izole bir bant halinde çalışan bir stoikiometrik kompleks oluşur. Genellikle, serbest tRNA daha hızlı göç eder ve jelin tabanında gözlemlenebilirken, daha az negatif yüklü olan ve daha büyük boyuttaki protein-tRNA kompleksleri daha yavaş migrasyon eğilimi gösterir. Şekil 2 , TcdA-tRNA (UUU) komplekslerinin agaroz jeli a / a% 2 w / v. Şekil 2'de , TcdA-only ve tRNA-only bantları negatif kontroller olarak görev yapmaktadır. TcdA: tRNA (UUU) molar oranı arttıkça, serbest tRNA bandının pahasına oluşturulan TcdA-tRNA (UUU) komplekslerinin miktarı artar. Serbest tRNA yoğunluğunun, TcdA miktarı arttıkça azaldığını unutmayın. Oluşacak ilk kompleks, TcdA dimeri başına bir tRNA molekülü içeren 2: 1 stoikiyometrik bir kompleksdir (10, 20 veya 30 uM TcdA ile şeritlerde görülür). TcdA doygunluğunda, her iki TcdA alt birimi her biri bir tRNA (UUU) molekülüne bağlı olduğu, 2: 2 stoikiyometrik bir kompleks içeren daha büyük bir molekül ağırlığı TcdA-tRNA (UUU) kompleksi oluşur (şeritlerde 30, 50 veya 50'dir) 75 uM). TcdA (50 veya 75 uM) ile son iki şerit, reaksiyondaki tüm tRNA'yı bağladı ve serbest tRNA bandından yoksun.
Tp_upload / 55638 / 55638fig1.jpg "/>
Şekil 1: Jel Filtrasyonuyla tRNA'nın (UUU) Saflaştırılması. Yüksek çözünürlüklü bir hazırlayıcı jel filtrasyon sütunu üzerinde tRNA'nın (UUU) jel filtrelemesinin kromatogramı (üstte) 254 nm'de kaydedildi. TRNA'dan (UUU) zenginleştirilmiş tRNA havuzunu içeren en yüksek zirve ~ 75.5 mL'de elüt edilir. Çeşitli tRNA elüsyon fraksiyonlarından alikotlarla% 2 a / h agaroz jeli (taban) çalıştırıldı. M, moleküler boyut merdiveni. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: TcdA ve tRNA (UUU) ile Jel Retardasyon Testi. EMSA, tRNA'nın TcdA'ya fiziksel olarak bağlanması için kanıt sağlar. Numuneler,% 2 a / h agaroz jeli üzerinde 4 ° C'de 90 dakika süreyle çalıştırıldı. Sabit bir miktarda tRNA (UUU), 7.5 μM, değişken miktarlarda TcdA ile karıştırıldı (bkz. Tablo 1 ) ve protein-tRNA kompleksleri elektroforez çalışması sırasında ayrıldı. Jel lekelenmiş ve bir UV transilluminatör üzerinde görüntülenmiştir. Her şeritte 5 μL numune bulunur. M, moleküler boyut merdiveni. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada tarif edilen protein-tRNA agaroz jel geciktirme deneyi, çeşitli şekillerde modifiye edilebilir. Birincisi, jelin içindeki agaroz yüzdesi, burada analiz edilen protein (120 kDa) 'dan önemli ölçüde daha büyük protein-tRNA komplekslerinin ayrılması ve görselleştirilmesine izin vermek için azaltılabilir. İkincisi, hedef protein termolabilitedeyse, elektroforez cihazını soğuk bir odaya taşıyarak veya üretilen ısıyı derhal dağıtmak için elektroforez haznesi içindeki buz paketlerini kullanarak sıcaklıkların maksimum kabul edilebilir sıcaklığın altında kalmasını sağlamak için ek önlemler alınmalıdır Koşu sırasında. Diğer tampon bileşimleri ( örn. , 0.5X TB, tris-borat) ve çalışma parametreleri (> 20 V / cm), gerekirse çalışma süresini kısaltmak veya örnekler 11 için kabul edilebilir şekilde modifiye edilebilir. Önerilen MgCl2 konsantrasyonu, numune hazırlama aşamasında RNA bozunması gözlemleniyorsa azaltılabilir, çünkü iki değerlikli katiPotansiyel olarak nükleik asitlerin bölünmesini katalize edebilir.
Tekniğin en büyük kısıtlılığı, protein-tRNA bantlarının tipik olarak akrilamid esaslı jel retardasyon yöntemlerinde görülenden biraz daha yaygındır ve daha yavaş ve daha keskin olma eğilimindedir. Bir diğer kısıtlama, çoklu numunelerin eşzamanlı analizi için ve çeşitli boyut ve yükteki protein-tRNA komplekslerinin çözülmesi için daha geniş, daha uzun jellerin gerekli olabilmesidir.
Mevcut metotlara kıyasla, protein-tRNA agaroz jel retardasyon tahlili, numunenin hazırlanmasından analizine kadar emek ve zaman açısından belirgin bir azalmaya yol açar. Zararlı kimyasal maddeler içeren akrilamid jelleri polimerize olmak için daha hazırlanmaları ve daha uzun sürmesi zahmetlidir. Aksine, agaroz jelleri basit, hızlı dökme ve set edilmişlerdir ve toksik kimyasallar içermezler. Deney 2 saat içinde tamamlanabilir. Bu, jelin ayarlanması için 30 dakika, numune hazırlama için 15 dakika (gerektiğindeAgaroz soğutulurken yapılır), elektroforez ve görselleştirme için 90 dakika.
Yöntemin gelecekteki uygulamaları, bu protokolde kullanılan bulgulama yöntemlerini arıtıp daha az bol olan, daha kararsız RNA türlerinin veya yalnızca çok küçük miktarlarda ifade edilebilen protein komplekslerinin tespitine uygulayabilir. RNA veya protein bileşenini son derece hassas flüoroforlarla etiketlemek, daha küçük miktarlarda protein-RNA komplekslerinin saptanmasına izin verecektir. Dahası, örtüşmeyen emisyon / uyarılma zirvelerine sahip floroforların kullanılması, farklı proteinin ve / veya RNA türlerinin tek bir deneyde eşzamanlı olarak görülebildiği çoğullama deneylerine izin verebilir.
Bu protokolde üç önemli adım vardır. İlk ve belirgin kritik adım, tRNA'nın (UUU) ekspresyonu ve saflaştırılmasıdır. Saflaştırılmış tRNA miktarı (UUU) belirli bir minimum algılama sınırının altında ise (bant başına 25-200 ng tRNA arasında)) Veya bozunma bantları düşük moleküler boyutlu kirleticiler olarak görünür hale gelirse, tRNA atılmalı ve yeniden saflaştırılmalıdır. TRNA ekstraksiyonu sırasında asit fenol (pH 4.3) kullanılması, RNA'yı çözünür tutarken DNA'yı seçici olarak çökeltiğinden dolayı önemlidir. İkinci kritik adım, analiz için protein-tRNA örneklerinin hazırlanmasına ilişkindir. Oluşan tüm komplekslerin sağlam tespiti için yeterli miktarda protein ve tRNA kullanılmalıdır. Protein-tRNA molar oranları, dengeyi kompleks oluşumuna bırakmak için ayarlanmalıdır. Üçüncü kritik adım elektroforezdir. TBE tamponu taze kullanılmalıdır (tekrar kullanılmamalıdır) ve agaroz jellerini, protein-tRNA komplekslerinin dengeli ve denatüre edilmediği sıcaklıklarda (tipik olarak 4-10 ° C) tutmak gerekir. Tüm elektroforez esnasında agaroz jelini soğuk tutmak için, örneğin elektroforez haznesini buzla çevreleyerek ve mümkün olduğunda deneyleri çalıştırırken dikkatli olunmalıdır4 ° C soğuk bir odada.
Model-sistemi olarak TcdA-tRNA (UUU) kullanarak protein-tRNA komplekslerini analiz etmek ve akrilamid elektroforezi yerine agaroz jel elektroforezi kullanmak için basit bir yöntem gösterdik. Sonuncusu tamamlanması daha uzun sürer ve oldukça zahmetlidir. Bu yöntemi kullanarak,% 2 w / v agaroz jelleri (8 cm jel formatları) üzerindeki elektroforetik ayırma, 90 dakikadan kısa sürede gerçekleştirilebilir. Bu, protein-tRNA etkileşimlerinin analizi için uygun bir araçtır ve birden çok numunenin eşzamanlı analiz edilmesini sağlar. TRNA ve / veya protein mutantlarının varyantları, bu yöntem kullanılarak bağlanma ve kararlılık açısından taranabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
MCV, CIB İleri Düzey Programı "Daha İyi Yaşam için Moleküler Makineler" (MACBET) üyesidir. Bu sonuçlara götüren araştırmalar, İspanyol Enstitü Salud Carlos III (PI12 / 01667'den MCV'ye), İspanya Ekonomi Bakanlığı Competitividad (CTQ2015-66206-C2-2-R ve SAF2015-72961-EXP'den MCV'ye) tarafından finanse edildi. ), Madrid Bölge Hükümeti (S2010 / BD-2316'dan MCV'ye) ve Avrupa Komisyonu (Çerçeve Programı 7 (FP7)) projesi olan ComplexINC (Sözleşme No. 279039'dan MCV'ye). Fon sağlayanlar, çalışma tasarımı, veri toplama ve analizi, yayın yapma kararı veya el yazmasının hazırlanmasında rol oynamadı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| E. coli BL21(DE3) | Novagen | 70235 | DE3 lysogen contains T7 polymerase upon IPTG induction. |
| pET23d | Novagen | 69748-3 | pET23d confers resistance to ampicillin; T7 promoter. |
| LB Broth, Low Salt (Lennox L Broth), Granulated | Melford | GL1703 | Conventional LB Broth, High Salt, can also be used. |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | 10419313 | |
| Incubator Shaker (Thermostated) | NBS | Excella E24 | Any shaker incubator with temperature control can be used. |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG), >=99% | Acros Organics | BP1755 | |
| Sodium acetate, anhydrous, >99% | Melford | B4017 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), Disodium salt, >99% | Acros Organics | AC327205000 | Harmful if inhaled. |
| Centrifuge (refrigerated) | Eppendorf | 5430 | |
| Centrifuge (refrigerated) rotor | Eppendorf | 5430/5430P | |
| Centrifuge | Sorvall | RC5C | |
| Centrifuge rotor | Sorvall | SLA-3000 | |
| Phenol solution, Saturated with 0.1 M citrate buffer, pH 4.3 ± 0.2 | Sigma-Aldrich | P4682 | Acute toxicity (oral, dermal, inhalation), corrosive |
| Ethanol absolute for analysis, 100% v/v | Merck Millipore | 100983 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate, Na2HPO4, >=99% | Sigma-Aldrich | 71643 | |
| Potassium dihydrogen phosphate, KH2PO4 | Merck | 48,730,250 | |
| HiLoad 16/60 Superdex 75 | GE Healthcare | 28989333 | |
| Agarose | Melford | MB1200 | |
| Tris [Tris(hydroxymethyl) aminomethane HCl] | Melford | T1513 | |
| Boric Acid | Melford | B0503 | |
| Microwave | Haier | HDA-2070M | |
| TCEP [Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride] | Sigma-Aldrich | C4706 | Corrosive to metals and skin. |
| ATP [Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate], Grade I, >=99% | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| Magnesium chloride (MgCl2), anhydrous, >=98% | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Sodium chloride (NaCl), >99% | Fisher Bioreagents | BP358 | |
| Potassium chloride (KCl), >99% | Melford | P0515 | |
| NZYDNA Ladder VI | NZYtech | MB8901 | |
| Power supply | Consort | EV261 | |
| Electrophoresis unit | Real Laboratory | RELSMINI10 | |
| Real Safe nucleic acid staining | Real Laboratory | RBMSAFE | 20,000X stock |
| UV Transilluminator (G:Box/EF) | Syngene | 2216498 | |
| Coomassie Brilliant Blue G | Sigma-Aldrich | B0770 | |
| Rocker (Gyro-Rocker) | Stuart | SSL3 | |
| Mixer Vortex | Fisher brand | 13214789 |
References
- Scott, V., Clark, A. R., Docherty, K. The gel retardation assay. Methods Mol Biol. 31, 339-347 (1994).
- López-Estepa, M., et al. The crystal structure and small-angle X-ray analysis of CsdL/TcdA reveal a new tRNA binding motif in the MoeB/E1 superfamily. Plos One. 10 (4), e0118606 (2015).
- Miyauchi, K., Kimura, S., Suzuki, T. A cyclic form of N6-threonylcarbamoyladenosine as a widely distributed tRNA hypermodification. Nat Chem Biol. 9 (2), 105-111 (2013).
- Bolstad, H. M., Botelho, D. J., Wood, M. J. Proteomic analysis of protein-protein interactions within the Cysteine Sulfinate Desulfinase Fe-S cluster biogenesis system. J Proteome Res. 9 (10), 5358-5369 (2010).
- Loiseau, L., Ollagnier-de Choudens, S., Lascoux, D., Forest, E., Fontecave, M., Barras, F. Analysis of the heteromeric CsdA-CsdE cysteine desulfurase, assisting Fe-S cluster biogenesis in Escherichia coli. J Biol Chem. 280 (29), 26760-26769 (2005).
- Fried, M. G., Crothers, D. M. Equilibrium studies of the cyclic AMP receptor protein-DNA interaction. J Mol Biol. 172 (3), 241-262 (1984).
- Garner, M. M., Revzin, A. A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system. Nucleic Acids Res. 9 (13), 3047-3060 (1981).
- Rio, D. C. Electrophoretic mobility shift assays for RNA-protein complexes. Cold Spring Harb Protoc. 2014 (4), 435-440 (2014).
- Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift. Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).
- Yakhnin, A. V., Yakhnin, H., Babitzke, P. Gel mobility shift assays to detect protein-RNA interactions. Methods Mol Biol. 905, 201-211 (2012).
- Ream, J. A., Lewis, L. K., Lewis, K. A. Rapid agarose gel electrophoretic mobility shift assay for quantitating protein: RNA interactions. Anal Biochem. 511, 36-41 (2016).
- Hagel, L. Gel-filtration chromatography. Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 10, Unit 10.9 (2001).
