Summary
פרוטוקול מוצג לייצור tRNA (UUU) וניתוח של tRNA (UUU) במורכבות עם TDAA אנזים ידי מבחני ג 'ל agarose פיגור.
Abstract
אנו מדגימים שיטות הביטוי וטיהור של tRNA (UUU) ב Escherichia coli ואת הניתוח על ידי מבחני ג'ל פיגור של הכריכה של tRNA (UUU) כדי TcdA, N 6- threonylcarbamoyladenosine (לא 6 א) דהידראטאז, אשר cyclizes threonylcarbamoyl בצד שרשרת A37 ב לולאה גזע anticodon (ASL) של tRNAs כדי מחזורי לא 6 A (Ct 6 A). תמלול של גנים סינתטיים קידוד tRNA (UUU) הוא המושרה ב coli עם 1 מ"מ isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) ואת התאים המכילים tRNA נקצרים 24 שעות שלאחר אינדוקציה. חלק RNA הוא מטוהרים באמצעות שיטת חומצה פנול החילוץ. טהור tRNA מתקבל על ידי כרומטוגרפיה סינון ג'ל כי ביעילות מפריד את מולקולות tRNA בגודל קטן מחומצות גרעין שלם שלם או מקוטעת. כדי לנתח TCDA מחייב tRNA (UUU), TcdA מעורבב עם tRNA (UUU) ומופרדים על ג'ל agarose יליד על 4 מעלות צלזיוס.TRNA חופשי (UUU) נודדת מהר יותר, בעוד TCDA-tRNA (UUU) מתחמי עוברים פיגור ניידות כי ניתן לצפות על מכתים של ג 'ל. אנו מראים כי TcdA הוא אנזים tRNA (UUU) מחייב. זה assay פיגור ג'ל ניתן להשתמש כדי ללמוד מוטציות TCDA ואת ההשפעות של תוספים וחלבונים אחרים על הכריכה.
Introduction
Assay ג'ל פיגור 1 (הידוע גם בשם assay ניטור אלקטרופורטי ניידות, EMSA) היא שיטה אלקטרופורטית שנועדה ללמוד ולאפיין אינטראקציות חומצה חלבון-חלבון. זה מאפשר ניתוח של DNA- חלבון כמו גם אינטראקציות חלבון- RNA ובמיוחד, אינטראקציות בין tRNA ו tRNA מחייב חלבונים, תוך שימוש ברכיבים מטוהרים או תערובות מורכבות של חלבונים ( למשל , lysates התא) או חומצות גרעין ( למשל , tRNA בריכות). יש לנו להחיל מבחני פיגור ג'ל לחקר האינטראקציה בין tRNA מטוהרים (UUU) ו TcdA, N 6- threonylcarbamoyladenosine (לא 6 A) dehydratase, אשר cyclizes את שרשרת הצד threonylcarbamoyl המצורפת A37 ב לולאה גזע ליקוד (ASL) של tRNAs למחזורי t 6 (ct 6 A) 2 , 3 . TcdA ידוע גם בשם CsdL 3 ,F.> 4. הגן tcdA / csdL יוצר אשכול עם csdA ו- csdE גנים 5 , אשר לקודד את desulfurase ציסטאין ואת acceptor גופרית של מערכת cystinase desulfinate cystinase (CSD) מערכת והוא נדרש כדי לשמור על פונקציית TCDA ב vivo 3 .
הרציונל מאחורי מבחני הפיגור ג'ל הוא, בעוד מולקולות חומצות גרעין חופשי נודדות במהירות לחזית של ג'ל acrylamide או agarose מכוח המטען השלילי הגדול שלהם, את הניידות האלקטרופורטית של קומפלקסים חלבונים של חומצות גרעין אותו מופחת באופן דרמטי. צמצום הניידות הוא דמיינו כמו "משמרת" של קומפלקס חומצות גרעין, אשר לפתור כמו להקות נפרדות. טעון חיוביים גדול מורכבים חומצה גרעין מורכבים להראות שינוי גדול יותר או ירידה ניידות על ג'ל.
מאז ניטרול המטען של המתחם היא תופעה אוניברסליתעבור מתחמי חומצה גרעין חלבונים, assay פיגור ג'ל ניתן ליישם מגוון רחב של קומפלקסים סוגי חומצה גרעין. השיטה היא פשוטה, זול, והוא יכול להתבצע במעבדות עם ציוד מינימלי. זה דורש רק כמויות קטנות של חלבונים ו tRNA. זהו יתרון על פני טכניקות ביופיסיקליות חלופיות, שבדרך כלל צורכות כמויות גדולות יותר של מדגם.
Assay פיגור ג'ל כבר בשימוש נרחב לחקר גורמי שעתוק. Assay שימש כדי לנתח קינטיקה מחייב, כוח, וספציפיות של גורמי שעתוק עבור רצפי DNA שונים. זה היה באמת בתחום זה כי EMSA פותחה לראשונה 6 , 7 . ג'ל מבחני פיגור עם RNA 8 , 9 , 10 , 11 ו מולקולות tRNA שימשו גם במחקר ריבוזוםוכדי לנתח, כפי שאנו עושים כאן, האנזימים שמשנים נוקליאוזידים tRNA לאחר תעתיק.
פרמטרים שונים רבים משפיעים על התוצאה של assay פיגור ג'ל כגון טמפרטורה, איכות החלבון מדגם tRNA, ואת כוחו של הכריכה. תכנון וביצוע זהיר של הניסוי הוא קריטי עבור הפרשנות של התוצאות של חומצה גרעין חופשי מינים הקשורים חלבון. כאן, השתמשנו גנים סינתטיים קידוד tRNA (UUU) משובטים לתוך וקטור ביטוי אשר יזם חסר האתר Shine-Dalgarno ריבוזום מחייב, המוביל סינתזה של כמויות גדולות של tRNA 2 . פרוטוקול מפורט זה נועד לספק מדריך ברור לביצוע ניסויי tRNA ג'ל פיגור תוך הימנעות טעויות נפוצות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
זהירות: עיין בכל הגיליונות הרלוונטיים של נתוני בטיחות החומרים (MSDS) לפני השימוש. כמה מן הכימיקלים המשמשים בפרוטוקול זה רעילים ומאכל. השתמש בשיטות המתאימות בעת ביצוע החילוץ של tRNA באמצעות פנול, כולל שימוש במכסה אדים ובציוד מגן אישי (משקפי מגן, כפפות, מעיל מעבדה, מכנסיים באורך מלא, נעלי אצבע סגורות וכו ' ). פרוטוקול זה משתמש שאינו רעיל כתם חומצה גרעין. השימוש בכתמים חלופיים עשוי לדרוש אמצעי זהירות נוספים וסילוק מיוחד של סוכן מכתים אם רעילים ו / או מסרטנים ( למשל , ethidium bromide).
1. הכנת ג'ל Agarose
- לשקול 2 גרם של agarose ולהוסיף אותו בקבוק זכוכית להכין 2% w / v agelose ג'ל.
- הוסף 100 מ"ל של 1x tris-borate-ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) (TBE) פועל חיץ בקבוק המכיל agarose. ממיסים על ידי חימום במיקרוגל. במרווחים של 30 שניות, מערבולת את התוכן כדי לערבבגם לחזור על שלב זה עד agarose הוא מומס לחלוטין. אפשר פתרון agarose להתקרר עד כ 50-60 מעלות צלזיוס.
- קלטת את הקצוות הפתוחים של מגש ג'ל כדי ליצור עובש, במקום מסרק מתאים כדי ליצור את הבארות ולטיל את agarose מותכת לתוכו. הימנע היווצרות בועה ולתת לו לחזק בטמפרטורת החדר.
- לאחר מוצק, במקום מגש ג'ל ביחידה אלקטרופורזה ולמלא אותו עם חיץ TBE עד הג 'ל מכוסה לחלוטין.
2. הכנת tRNA
- אקספרס tRNA (UUU) ב E. coli
- בבוקר, השתמש בבקבוקון של E. coli BL21 קפוא (DE3) שהפך עם וקטור הביטוי pET23d-EcUUU 2 (הנמל קידוד גנים E. coli tRNA (UUU)), כדי להקטין את מלח לוריא נמוך מלח (LB) צלחת בתוספת 100 מיקרוגרם / מ"ל ampicillin. להפוך את הצלחת ומניחים אותו לתוך 37 ° C חממה עד מושבות להופיע (מאוחר אחר הצהרייםOon).
- לחסן אחד גדל היטב, מושבה אחת ב 5 מ"ל LB בתוספת 100 מיקרוגרם / mL ampicillin ולגדול לילה בסל"ד 220 ב 37 מעלות צלזיוס.
- למחרת בבוקר, גלולה התאים (6,500 XG במשך 10 דקות ב 4 ° C), להחליף בינוני עם 5 מ"ל טרי LB בתוספת 100 מיקרוגרם / mL ampicillin ו resuspend. השתמש ההשעיה לחסן 200 מ"ל LB בתוספת 100 מיקרוגרם / mL ampicillin. לגדול במשך 5 שעות ב 220 סל"ד ב 37 מעלות צלזיוס.
- כאשר צפיפות אופטית של התרבות ב 590 ננומטר (OD 590 ) הגיע 0.6 - 0.8, להוסיף 1 mM IPTG לתרבות כדי להפעיל את הביטוי של הגן tUNA (UUU). לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 3 שעות.
- קציר התאים על ידי centrifuging את התרבות ב XG 6,500 במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
- תמוגה ומיצוי
- Resuspend תא גלולה במאגר 5 תמוגה מ"ל (0.3 M אצטט אצטט, 10 מ"מ EDTA). מנקודה זו ואילך, מאגרים autoclaved בשימוש ולשמור את כל דגימות המכילות tRNA ב 4 ° C כדי למנוערנ"א השפלה.
- הוסף נפח 1 של פנול חומצה (pH 4.3) כדי גל גלולה resuspended במכסה המנוע קטר. מערבבים במשך 1 דקות על ידי היפוך lyse התאים צנטריפוגות ב XG 10,000 (10 דקות, 4 ° C).
- לאסוף את השלב מימית העליון המכיל את tRNA מסיסים (UUU) (וריכוזים קטנים יותר של בריכות tRNA אחרים) באמצעות פיפטה מקפיד לא לשאוב את השלב האורגני (התחתון). מחק את השכבה התחתונה ואת גלולה, אשר מורכב השלב אורגני פסולת התא, לתוך מיכל הולם.
- לזרז את tRNA על ידי ערבוב יסודי של המסיסים (מימית) שלב עם נפח 2.5% 100 / V אתנול v על ידי היפוך במשך שעה 1 ב 4 ° C. צנטריפוגה התערובת ב XG 15,000 (30 דקות, 4 ° C).
- למזוג את supernatant בזהירות resuspend גלולה עשיר tRNA ב 4 מ"ל חיץ סינון ג'ל (20 מ"מ נתרן פוספט או אשלגן פוספט, pH 7.4, 0.1 מ"מ EDTA). הפעל 5 μL של הבריכה tRNA resuspended על 2% w / v agelose ג'ל.
הערה:איכות טובה tRNA מופיע כלהקה אחת (גודל מולקולרי בין 50-100 bp).
- טיהור של tRNA (UUU)
- לאחר תרגול כרומטוגרפי סטנדרטי 12 , לטעון את tRNA resuspended (UUU) על עמודה סינון ג'ל המכינה ברזולוציה גבוהה (מידות: 16 x 600 מ"מ, נפח המיטה: 120 מ"ל, טווח רזולוציה: 1,000-70,000 דה) בעבר equilibrated ב חיץ סינון ג'ל (שלב נייד). הגדר את קצב הזרימה 1 מ"ל / דקות כדי elute דגימות.
הערה: נקודת השיא של ה- tRNA (UUU) משתרעת על 75.5 מ"ל. בדרך כלל, תשואה של 0.5-1.0 מ"ג / L tRNA של התרבות ניתן להשיג. - לנתח את דגימות בנפחים אלוטי נציג ידי electrophoresing 5-10 μL של כל מדגם על 2% w / v agelose ג'ל.
- לאחר תרגול כרומטוגרפי סטנדרטי 12 , לטעון את tRNA resuspended (UUU) על עמודה סינון ג'ל המכינה ברזולוציה גבוהה (מידות: 16 x 600 מ"מ, נפח המיטה: 120 מ"ל, טווח רזולוציה: 1,000-70,000 דה) בעבר equilibrated ב חיץ סינון ג'ל (שלב נייד). הגדר את קצב הזרימה 1 מ"ל / דקות כדי elute דגימות.
3. הכנת דגימה
- אקספרס ולטהר TcdA על פי López-Estepa et al . 2 .
הערה: עד 250 מיקרומטרTCDA ניתן להשתמש עבור המחקר. - פיפטה את הסכום המקביל של TcdA לפי טבלה 1 לתוך שכותרתו כראוי 1.5 צינורות צנטריפוגה מ"ל. הוסף 1.6 מ"מ טריס (2-carboxyethyl) פוספין (TCEP) (ריכוז סופי) ו לערבב בעדינות באמצעות פיפטה. סגור את המכסה לדגור את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
- הוסף 10 מיקרומטר של טריפוספט אדנוזין (ATP) ו 50 מ"מ MgCl 2 (ריכוז סופי). מערבבים עם פיפטה לדגור את התערובת במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- הוסף מטוהרים tRNA (UUU) (סעיף 2.3) לפי טבלה 1 , לערבב עם פיפטה ו דגירה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
- הוסף פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) עד 100 נפח סופי μL. מערבבים כראוי ולהוסיף גליצרול לריכוז סופי של 10% v / v.
- וורטקס המדגם בקצרה לסובב את תוכן הצינור (10,000 xg, 1 דקות, 4 ° C).
4. ג'ל טוען ופיתוח אלקטרופורזה
- מניחים יחידת אלקטרופורזה לתוך מגש מלא קרח כתוש כדי לשמור על החדר ב 4 מעלות צלזיוס במהלך לרוץ אלקטרופורזה.
- בזהירות, פיפטה 5 μL של כל מדגם לתוך המקביל היטב. הוסף סמן מתאים DNA גודל.
- חבר את האלקטרודות לחריצים המתאימים של יחידת אספקת החשמל. הפעל את יחידת אספקת החשמל ולהגדיר את המתח ל 100 V ולהפעיל את הג 'ל במשך 90 דקות.
5. מכתים ג 'ל כדי לראות אינטראקציה חלבון tRNA
- הכן את הפתרון מכתים על ידי ערבוב 50 מ"ל של TBE עם 1x של כתם ה- DNA מתאים. הימנע חשיפת הפתרון מכתים לאור השמש על ידי כיסוי המכיל מכתים עם רדיד אלומיניום.
הערה: כתמי ה- DNA מאוחסנים בדרך כלל כ -10,000 או 20,000 מניות מרוכזות. - לאחר 90 דקות של אלקטרופורזה, להסיר בזהירות את הג'ל מהמגש ומניחים אותו במיכל עם פתרון מכתים. מניחים אותו על נדנדה במהירות נמוכה נדנדה בטמפרטורת החדרUre עבור 30 דקות.
- הסר את הג 'ל agarose מהמכל מכתים, הקש עליו בזהירות על פיסת תאית או נייר סינון כדי להסיר נוזלים עודפים, ומניחים אותו ישירות על transilluminator. להדליק את האור UV לדמיין להקות המכילות tRNA. צלם תמונה של הג'ל.
- חלבון מכתים (אופציונלי).
- מחק את הפתרון מכתים ה- DNA בבטחה (על פי נהלי הבטיחות) ולהחליף אותו עם 50 מ"ל CoLassie מבריק כחול (CBB) פתרון. מניחים את המגש על נדנדה בטמפרטורת החדר ואת הכתם לילה (> 12 שעות). מחק את הפתרון מכתים CBB ולהחליף אותו עם 50 מ"ל PBS להסיר צבע עודף. Destain עבור 1 שעות על נדנדה.
- לחזות חלבון המכילים מתחמי tRNA תחת transilluminator אור ולקחת תמונות של ג 'ל להשוות עם תמונה tRNA UV ג'ל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כמויות גדולות של tRNA (UUU) ניתן להשיג על ידי להביע את הגן tRNA ב E. coli תחת שליטתו של מקדם T7 חזק inducible. TRNA לידי ביטוי (UUU) מצטבר בציטופלסמה מועשר מעל הבריכה של tRNAs בשפע טבעי. תהליך טיהור דו-שלבי הכולל שלב ללכידה / מיצוי וג'ל סינון / ליטוש צעד נוצל להשיג tRNA בכיתה EMSA. שלב הלכידה / החילוץ משתמש בפנול 4.3 pH כדי להשיג את המשקעים בו-זמנית של חלבון, פסולת התא, DNA, והפקת tRNA (ומולקולות רנ"א אחרות). בשלב זה, כמות הבריכה tRNA הכולל ניתן להעריך על ידי אלקטרופורזה על 2% w / v agelose ג'ל. השלב השני משלב כרומטוגרפיה ג'ל סינון המפריד מינים RNA לפי גודל המולקולרי שלהם. עקבות UV ב 254 ננומטר משמש לפקח על ההפרדה ולזהות את הפסגות elution הראשי ( איור 1)למעלה). נציג aliquots של שברים שיא היו לרוץ על 2% w / v agelose ג'ל לניתוח ( איור 1 תחתית ). רוב המולקולות tRNA שיתוף elute בשיא אחד (באמצע) של לרוץ כרומטוגרפיה (כאן, 75.5 מ"ל בעמודה 120 מ"ל בגודל המיטה). כאשר הפרדת בריכות המכילות מינים יחיד overexpressed, כמו tRNA (UUU), יותר מ 90% של מולקולות tRNA בבריכה שייכים tRNA ספציפי, ואילו מולקולות הנותרים מתאימות tRNAs בשפע טבעי. פסגות משניות נצפות הן לפני והן אחרי השיא המרכזי המכיל tRNA. שיא (ים) לפני להכיל חלקית מושפל יותר מולקולות RNA (שברים 26 ו - 32, ברים באיור 1 ), ואת השיא (ים) בסוף לרוץ טיהור מכילים RNAs קטנים מאוד מזהמים (שברים 45 ו - 51; ברים באיור 1 ). לאחר איגום השברים מתחת לשיא המרכזי (שברים 39-43; ברים באיור 1 ), כמות tRNA מטוהרים ניתן לכמת על ידי ספקטרוסקופיה UV ו / או על ידי השוואה עם סטנדרטים גודל מולקולרי על 2% w / v agelose ג'ל.
TCDA ו tRNA (UUU) דגימות ניתן לערבב ביחסים טוחנת שונים מ 1.0 ל 10.0 באמצעות ערכת הדגימה חצי לוגריתמי ( טבלה 1 ) ומופרדים על 2% w / v ג 'ל agarose ( איור 2 ). בהתאם ליציבות של מתחמי חלבון tRNA ואת stoichiometry של מחייב, אחד או כמה להקות יכול להיות דמיינו על הג'ל. עבור TcdA-tRNA (UUU), מורכב stoichiometric נוצר כי פועל כמו להקה מבודד המכיל גם חלבון ו tRNA. בדרך כלל, tRNA חופשי נודדת מהר יותר וניתן לראות בתחתית הג'ל, בעוד מתחמי חלבון tRNA, אשר טעונים פחות שלילי גדולים יותר, נוטים להגר לאט. איור 2 מציג ייצוג Ative 2% w / v agelose ג'ל של TCDA-tRNA (UUU) מתחמי. באיור 2 , TCDA בלבד ו- tRNA רק להקות לשמש שולטת שלילית. כמו TRCA: tRNA (UUU) יחס טוחנת מגדילה, את כמות TCDA-tRNA (UUU) מתחמים נוצרו על חשבון הלהקה tRNA חופשי, מגביר. שים לב כי עוצמת tRNA חופשי פוחתת כמו כמות של TCDA מגביר. המורכב הראשון להרכיב הוא קומפלקס stoichiometric 2: 1 המכיל מולקולה אחת tRNA לכל dimer TcdA (גלוי בנתיבים עם 10, 20 או 30 מיקרומטר TCDA). ב TCDA רוויה, גדול יותר מולקולרית במשקל TCDA-tRNA (UUU) מורכבות המכילה קומפלקס stoichiometric 2: 2, שבו הן יחידות TcdA קשורות מולקולה אחת tUNA (UUU) כל אחד (גלוי נתיבים עם 30, 50 או 75 מיקרומטר). שני הנתיבים האחרונים עם TcdA (50 או 75 מיקרומטר) יש קשרו את כל tRNA בתגובה וחסר להקה tRNA חינם.
Tp_upload / 55638 / 55638fig1.jpg "/>
איור 1: טיהור של tRNA (UUU) על ידי פילטרציה ג'ל. Chromatogram (העליון) של סינון ג'ל של tRNA (UUU) על גבי ברזולוציה גבוהה הגה פילטר סינון נרשם ב 254 ננומטר. הפסגה הגבוהה ביותר, המכילה את הבריכה tRNA מועשר ב tRNA (UUU) הוא eluted ב ~ 75.5 מ"ל. A 2% w / v agelose ג'ל (התחתון) היה לרוץ עם aliquots מ שברים שונים elution tRNA. M, סולם גודל מולקולרי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: Assay פיגור ג 'ל עם TCDA ו tRNA (UUU). EMSA מספק ראיות מחייב פיזי של tRNA ל TcdA. דוגמאות היו לרוץ על 2% w / v agelose ג'ל ב 4 מעלות צלזיוס למשך 90 דקות. כמות קבועה של tRNA (UUU), 7.5 μM, היה מעורבב עם כמויות משתנות של TcdA (ראה טבלה 1 ), ו-חלבונים tRNA חלבון הופרדו במהלך לרוץ אלקטרופורזה. הג'ל היה מוכתמים דמיינו על transilluminator UV. כל מסלול מכיל 5 μL של המדגם. M, סולם גודל מולקולרי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
החלבון tRNA agarose ג'ל פיגור assay המתואר כאן ניתן לשנות במספר דרכים. ראשית, אחוז agarose בג'ל ניתן לצמצם על מנת לאפשר הפרדה והדמיה של מתחמי חלבון tRNA גדול באופן משמעותי מאשר אחד ניתח כאן (120 kDa). שנית, אם חלבון המטרה הוא thermolabile, יש לנקוט אמצעי זהירות נוספים כדי להבטיח כי הטמפרטורה נשמרת מתחת לטמפרטורה המקסימלית המקובלת על ידי הזזת מנגנון אלקטרופורזה לחדר קר או באמצעות חבילות קרח בתוך החדר אלקטרופורזה מיד להפיג את החום המיוצר במהלך הריצה. חיבורים אחרים חיץ ( למשל , 0.5X TB, tris-borate) ופרמטרים פועל (20 V / cm) ניתן לשנות כדי לקצר את זמן הריצה במידת הצורך או מקובל על דגימות 11 . הציע ריכוז MgCl 2 יכול להיות מופחת אם השפלה RNA הוא ציין במהלך שלב הכנה המדגם, מאז cival divalentOns יכול פוטנציאל catalyze של מחשוף של חומצות גרעין.
המגבלה העיקרית של הטכניקה היא כי הלהקות tRNA חלבון הם בדרך כלל קצת יותר מפוזר מאלה לראות acrylamide מבוססי ג 'ל שיטות פיגור, אשר נוטים להיות חדות וברורות יותר. מגבלה נוספת היא כי ג 'ל רחב יותר, ייתכן שיהיה צורך ניתוח סימולטני של דגימות מרובות ואם מתחמי חלבון tRNA בגדלים שונים תשלום הם להיפתר.
בהשוואה לשיטות הקיימות, assayose חלבון tRNA agarose ג'ל פיגור מעניק הפחתה משמעותית של זמן עבודה מהכנה המדגם לניתוח. Acrylamide ג'לים, מכילים כימיקלים מזיקים, הם מייגעים להכין ולקחת זמן רב יותר כדי לפלמר. לעומת זאת, ג'ל agarose הם פשוטים, מהר כדי להטיל ולהגדיר, ואינם כרוכים כימיקלים רעילים. הניסוי ניתן להשלים 2 שעות. זה כולל 30 דקות עבור ג 'ל להגדיר, 15 דקות להכנת המדגם (אשר יכול להיותנעשה תוך הקירור agarose), 90 דקות עבור אלקטרופורזה להדמיה.
יישומים עתידיים של השיטה עשויה לחדד את שיטות האיתור המשמשות בפרוטוקול זה וליישם אותו לזיהוי של מיני רנ"א פחות בשפע, יציב יותר, או מתחמי חלבון אשר עשוי להתבטא רק בכמויות קטנות מאוד. תיוג ה- RNA או מרכיב החלבון עם fluorophores רגישים מאוד יאפשר זיהוי של כמויות קטנות יותר של חלבונים- RNA קומפלקסים. יתר על כן, באמצעות fluorophores עם פליטה שאינם חופפים / פסגות עירור יכול לאפשר ניסויים multiplexing שבו מינים שונים של חלבון ו / או RNA יכול להיות דמיינו בו זמנית בניסוי אחד.
קיימים שלושה שלבים קריטיים בפרוטוקול זה. הצעד הקריטי הראשון והבולט ביותר הוא הביטוי והטיהור של tRNA (UUU). אם כמות tRNA מטוהרים (UUU) הוא מתחת לגבול מסוים זיהוי מינימלי (בין 25-200 ng tRNA לכל הלהקה), או להפיץ השפעות להתברר כמו נמוך מזהמים גודל מולקולרי, tRNA צריך להיות מושלך מחדש מטוהרים. באמצעות פנול חומצה (pH 4.3) במהלך החילוץ tRNA הוא חיוני שכן הוא משקע באופן סלקטיבי DNA תוך שמירה על RNA מסיס. הצעד הקריטי השני נוגע הכנת דגימות חלבון tRNA לניתוח. כמויות מספיקות של חלבון ו tRNA יש להשתמש כדי לאפשר זיהוי חזק של כל מתחמי נוצר. יחסי חלבון tRNA טוחנת חייב להיות מותאם כדי לעקור את שיווי המשקל לעבר היווצרות מורכבת. הצעד הקריטי השלישי הוא אלקטרופורזה. המאגר TBE יש להשתמש טרי (לא בשימוש חוזר) ויש צורך לשמור על agarose ג'לים בטמפרטורות שבו מתחמי חלבון tRNA יציבים ולא להכחיש (בדרך כלל, 4-10 מעלות צלזיוס). הטיפול חייב להיות מיושם כדי לשמור על agarose ג'ל קר במהלך אלקטרופורזה כולו, למשל, על ידי הסובבים את החדר אלקטרופורזה עם קרח, במידת האפשר, הפעלת הניסוילא בחדר קר ב 4 ° C.
הוכחנו שיטה פשוטה לניתוח, אפיון מתחמי חלבון tRNA באמצעות TCDA-tRNA (UUU) כמערכת מודל, באמצעות אלקטרופורזה agarose ג'ל במקום אלקטרופורזה acrylamide. האחרון לוקח זמן רב יותר כדי להשלים הוא הרבה יותר מייגע. באמצעות שיטה זו, הפרדה אלקטרופורטי על 2% w / v ג'ל agarose (8 ס"מ פורמטים ג'ל) ניתן להשיג פחות מ 90 דקות. זהו כלי נוח לניתוח של אינטראקציות חלבון tRNA ומאפשר ניתוח סימולטני של דגימות מרובות. גרסאות של tRNA ו / או מוטציות חלבון ניתן לבדוק מחייב ויציבות באמצעות שיטה זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
MCV הוא חבר של CIB Intramural תוכנית "מולקולרית מכונות לחיים טובים יותר" (MACBET). המחקר המוביל לתוצאות אלו קיבל מימון מהמוסד הספרדי של סאלוד קרלוס השלישי (PI12 / 01667 ל- MCV), ה- Ministerio de Economía y Competitividad (CTQ2015-66206-C2-2-R ו- SAF2015-72961-EXP ל- MCV ), הממשלה האזורית של מדריד (S2010 / BD-2316 ל MCV), ואת הנציבות האירופית (Framework Program 7 (FP7)) פרויקט ComplexINC (חוזה מס '279039 כדי MCV). למממנים לא היה תפקיד בתכנון המחקר, איסוף הנתונים וניתוחם, ההחלטה לפרסם או הכנת כתב היד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| E. coli BL21(DE3) | Novagen | 70235 | DE3 lysogen contains T7 polymerase upon IPTG induction. |
| pET23d | Novagen | 69748-3 | pET23d confers resistance to ampicillin; T7 promoter. |
| LB Broth, Low Salt (Lennox L Broth), Granulated | Melford | GL1703 | Conventional LB Broth, High Salt, can also be used. |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | 10419313 | |
| Incubator Shaker (Thermostated) | NBS | Excella E24 | Any shaker incubator with temperature control can be used. |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG), >=99% | Acros Organics | BP1755 | |
| Sodium acetate, anhydrous, >99% | Melford | B4017 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), Disodium salt, >99% | Acros Organics | AC327205000 | Harmful if inhaled. |
| Centrifuge (refrigerated) | Eppendorf | 5430 | |
| Centrifuge (refrigerated) rotor | Eppendorf | 5430/5430P | |
| Centrifuge | Sorvall | RC5C | |
| Centrifuge rotor | Sorvall | SLA-3000 | |
| Phenol solution, Saturated with 0.1 M citrate buffer, pH 4.3 ± 0.2 | Sigma-Aldrich | P4682 | Acute toxicity (oral, dermal, inhalation), corrosive |
| Ethanol absolute for analysis, 100% v/v | Merck Millipore | 100983 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate, Na2HPO4, >=99% | Sigma-Aldrich | 71643 | |
| Potassium dihydrogen phosphate, KH2PO4 | Merck | 48,730,250 | |
| HiLoad 16/60 Superdex 75 | GE Healthcare | 28989333 | |
| Agarose | Melford | MB1200 | |
| Tris [Tris(hydroxymethyl) aminomethane HCl] | Melford | T1513 | |
| Boric Acid | Melford | B0503 | |
| Microwave | Haier | HDA-2070M | |
| TCEP [Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride] | Sigma-Aldrich | C4706 | Corrosive to metals and skin. |
| ATP [Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate], Grade I, >=99% | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| Magnesium chloride (MgCl2), anhydrous, >=98% | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Sodium chloride (NaCl), >99% | Fisher Bioreagents | BP358 | |
| Potassium chloride (KCl), >99% | Melford | P0515 | |
| NZYDNA Ladder VI | NZYtech | MB8901 | |
| Power supply | Consort | EV261 | |
| Electrophoresis unit | Real Laboratory | RELSMINI10 | |
| Real Safe nucleic acid staining | Real Laboratory | RBMSAFE | 20,000X stock |
| UV Transilluminator (G:Box/EF) | Syngene | 2216498 | |
| Coomassie Brilliant Blue G | Sigma-Aldrich | B0770 | |
| Rocker (Gyro-Rocker) | Stuart | SSL3 | |
| Mixer Vortex | Fisher brand | 13214789 |
References
- Scott, V., Clark, A. R., Docherty, K.
- López-Estepa, M., et al. The crystal structure and small-angle X-ray analysis of CsdL/TcdA reveal a new tRNA binding motif in the MoeB/E1 superfamily. Plos One. 10 (4), e0118606 (2015).
- Miyauchi, K., Kimura, S., Suzuki, T. A cyclic form of N6-threonylcarbamoyladenosine as a widely distributed tRNA hypermodification. Nat Chem Biol. 9 (2), 105-111 (2013).
- Bolstad, H. M., Botelho, D. J., Wood, M. J. Proteomic analysis of protein-protein interactions within the Cysteine Sulfinate Desulfinase Fe-S cluster biogenesis system. J Proteome Res. 9 (10), 5358-5369 (2010).
- Loiseau, L., Ollagnier-de Choudens, S., Lascoux, D., Forest, E., Fontecave, M., Barras, F. Analysis of the heteromeric CsdA-CsdE cysteine desulfurase, assisting Fe-S cluster biogenesis in Escherichia coli. J Biol Chem. 280 (29), 26760-26769 (2005).
- Fried, M. G., Crothers, D. M. Equilibrium studies of the cyclic AMP receptor protein-DNA interaction. J Mol Biol. 172 (3), 241-262 (1984).
- Garner, M. M., Revzin, A. A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system. Nucleic Acids Res. 9 (13), 3047-3060 (1981).
- Rio, D. C. Electrophoretic mobility shift assays for RNA-protein complexes. Cold Spring Harb Protoc. 2014 (4), 435-440 (2014).
- Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift. Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).
- Yakhnin, A. V., Yakhnin, H., Babitzke, P. Gel mobility shift assays to detect protein-RNA interactions. Methods Mol Biol. 905, 201-211 (2012).
- Ream, J. A., Lewis, L. K., Lewis, K. A. Rapid agarose gel electrophoretic mobility shift assay for quantitating protein: RNA interactions. Anal Biochem. 511, 36-41 (2016).
- Hagel, L.
