Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays for Analyse av Published: June 21, 2017 doi: 10.3791/55638
Automatic Translation
1,2,3, 1, 1, 1, 1
1Department of Physical Chemical Biology, Center for Biological Research (CIB-CSIC), Spanish National Research Council (CSIC), 2Department of Immunology, Complutense University School of Medicine, 3Abvance Biotech srl

Summary

En protokoll presenteres for produksjon av tRNA (UUU) og analysen av tRNA (UUU) i kompleks med enzymet TcdA ved agarosegel-retardasjonsanalyser.

Abstract

Vi demonstrerer metoder for uttrykk og rensing av tRNA (UUU) i Escherichia coli og analysen ved gel-retardasjonsanalyser av bindingen av tRNA (UUU) til TcdA, en N6-treonylkarbamoyladenosin (t6A) dehydratase, som cykliserer treonylkarbamoyl Sidekjede festet til A37 i anticodon stammen loop (ASL) av tRNAs til syklisk t 6 A (ct 6 A). Transkripsjon av det syntetiske genet som koder for tRNA (UUU), induseres i E. coli med 1 mM isopropyl P-D-1-tiogalaktopyranosid (IPTG) og cellene som inneholder tRNA, høstes 24 timer etter induksjon. RNA-fraksjonen renses ved anvendelse av den sure fenol-ekstraksjonsmetoden. Rent tRNA oppnås ved en gelfiltreringskromatografi som effektivt separerer de små tRNA-molekylene fra større intakte eller fragmenterte nukleinsyrer. For å analysere TcdA-binding til tRNA (UUU) blandes TcdA med tRNA (UUU) og separeres på en naturlig agarosegel ved 4 ° C.Det frie tRNA (UUU) migrerer raskere, mens TcdA-tRNA (UUU) -kompleksene gjennomgår en bevegelighetsretardasjon som kan observeres ved farging av gelen. Vi demonstrerer at TcdA er et tRNA (UUU) bindende enzym. Denne gelretardasjonsanalysen kan brukes til å studere TcdA-mutanter og virkningen av tilsetningsstoffer og andre proteiner ved binding.

Introduction

Gel-retardasjonsanalysen 1 (også kjent som elektroforetisk mobilitetsforskyvningsanalyse, EMSA) er en elektroforetisk metode designet for å studere og karakterisere protein-nukleinsyre-interaksjoner. Det muliggjør analyse av protein-DNA samt protein-RNA-interaksjoner og spesielt interaksjoner mellom tRNA og tRNA-bindende proteiner ved bruk av enten rensede komponenter eller komplekse blandinger av proteiner ( f.eks . Cellelysater) eller nukleinsyrer ( f.eks . TRNA pools). Vi har anvendt gel-retardasjonsanalyser til studien av samspillet mellom renset tRNA (UUU) og TcdA, en N6-treonylkarbamoyladenosin (t6A) dehydratase, som cykliserer treonylkarbamoyl-sidekjeden festet til A37 i anticodonstamsløyfen (ASL) Av tRNA til syklisk t6 (ct 6A) 2 , 3 . TcdA er også kjent som CsdL 3 ,F "> 4. TcdA / csdL- genet danner en klynge med csdA- og csdE- genene 5 , som koder for cystein-desulfurasen og svovelacceptoren for cystein-sulfinase desulfinat-systemet (CSD) og er nødvendig for å opprettholde TcdA-funksjonen in vivo 3 .

Begrunnelsen bak gel-retardasjonsanalysene er at mens fri nukleinsyremolekyler migrerer raskt til forsiden av akrylamid- eller agarosegeler på grunn av deres store negative ladning, reduseres den elektroforetiske mobilitet av proteinkomplekser av de samme nukleinsyrer dramatisk. Reduksjonen i mobilitet visualiseres som et "skifte" i nukleinsyre-protein-kompleksene, som løses som diskrete bånd. Positivt ladet og større nukleinsyre-proteinkompleks viser større skift eller reduksjon i mobilitet på en gel.

Siden ladningsnøytralisering av komplekset er et universelt fenomenFor protein-nukleinsyrekomplekser kan gel-retardasjonsanalysen påføres et bredt spekter av komplekser og nukleinsyre-typer. Metoden er enkel, billig og kan utføres i laboratorier med minimum utstyr. Det krever bare små mengder proteiner og tRNA. Dette er en fordel i forhold til alternative biofysiske teknikker, som vanligvis forbruker større mengder prøve.

Gel-retardasjonsanalysen har blitt mye brukt til studiet av transkripsjonsfaktorer. Analysen har blitt brukt til å analysere bindende kinetikk, styrke og spesifisitet av transkripsjonsfaktorer for mange forskjellige DNA-sekvenser. Det var faktisk på dette feltet at EMSA ble først utviklet 6 , 7 . Gel-retardasjonsanalyser med RNA 8 , 9 , 10 , 11 og tRNA-molekyler har også vært anvendt i ribosomforskningOg for å analysere, som vi gjør her, enzymer som modifiserer tRNA nukleosider post-transkriptjonelt.

Mange forskjellige parametere påvirker resultatet av en gelforsinkelsesanalyse, slik som temperatur, kvalitet på proteinet og tRNA-prøven og bindingsstyrken. Forsiktig planlegging og utførelse av forsøket er avgjørende for tolkningen av resultatene av fri nukleinsyre og proteinbundne arter. Her brukte vi det syntetiske gen som koder for tRNA (UUU) klonet i en ekspresjonsvektor hvis promotor mangler Shine-Dalgarno ribosombindingsstedet, hvilket fører til syntese av store mengder av tRNA 2 . Denne detaljerte protokollen er ment å gi en klar veiledning for å utføre tRNA gelretarderingsforsøk samtidig som man unngår vanlige feil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Forsiktig: Kontakt alle relevante sikkerhetsdatablad (MSDS) før bruk. Flere av kjemikaliene som brukes i denne protokollen er giftige og etsende. Bruk hensiktsmessig praksis ved utvinning av tRNA ved bruk av fenol, inkludert bruk av avtrekksdeksel og personlig verneutstyr (sikkerhetsbriller, hansker, laboratoriejakke, bukser i full lengde, lukkede sko, etc. ). Denne protokollen bruker en ikke-giftig nukleinsyre flekk. Bruk av alternative flekker kan kreve ytterligere forholdsregler og spesialavhending av fargemidlet dersom det er toksisk og / eller kreftfremkallende ( f.eks . Etidiumbromid).

1. Fremstilling av agarosegelen

  1. Vekt 2 g agarose og legg den til en glassflaske for å klargjøre en 2% w / v agarosegel.
  2. Tilsett 100 ml 1x tris-borat-etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) (TBE) løpebuffer til den agaroseholdige flasken. Smelter ved oppvarming i mikrobølgeovn. Ved 30 s intervaller, virvler innholdet for å blandeVel og gjenta dette trinnet til agarosen er helt oppløst. La agaroseoppløsningen kjøle ned til ca. 50-60 ° C.
  3. Tape de åpne kantene på en gelskuff for å lage en form, plasser en passende kam for å lage brønnene og støp den smeltede agarosen inn i den. Unngå bobleformasjon og la det størkne ved romtemperatur.
  4. Når du har stivnet, plasser gelskuffen i en elektroforeseenhet og fyll den med TBE-buffer inntil gelen er fullstendig dekket.

2. Fremstilling av tRNA

  1. Express tRNA (UUU) i E. coli
    1. På morgenen bruker du et hetteglass med frosset E. coli BL21 (DE3) transformert med ekspresjonsvektoren pET23d-EcUUU2 (har det genet som koder for E. coli tRNA (UUU)) for å strekke en lavsalt Luria-buljong (LB) Plate supplert med 100 μg / ml ampicillin. Inverter platen og plasser den i en 37 ° C inkubator inntil kolonier vises (sen ettermiddagoon).
    2. Inokulere en velfungerende, enkelt koloni i 5 ml LB pluss 100 μg / ml ampicillin og vokse over natten ved 220 rpm ved 37 ° C.
    3. Neste morgen, pellet cellene (6.500 xg i 10 minutter ved 4 ° C), erstatt medium med 5 ml frisk LB pluss 100 μg / ml ampicillin og resuspender. Bruk denne suspensjonen til å inokulere 200 ml LB pluss 100 μg / ml ampicillin. Vok i 5 timer ved 220 rpm ved 37 ° C.
    4. Når den optiske tettheten av kulturen ved 590 nm (OD 590 ) har nådd 0,6 - 0,8, tilsett 1 mM IPTG til kulturen for å utløse ekspresjonen av tRNA (UUU) -genet. Inkuber ved 37 ° C i 3 timer.
    5. Høst cellene ved å sentrifugere kulturen ved 6.500 xg i 10 minutter ved 4 ° C.
  2. Lysis og ekstraksjon
    1. Resuspender cellepellet i 5 ml lysisbuffer (0,3 M natriumacetat, 10 mM EDTA). Fra dette punktet brukte autoklaverte buffere og behold alle tRNA-holdige prøver ved 4 ° C for å forhindre tRNA nedbrytning.
    2. Tilsett 1 volum syrefenol (pH 4,3) til resuspendert cellepellet i avtrekksskapet. Bland i 1 min ved inversjon for å lysere cellene og sentrifugere ved 10 000 xg (10 min, 4 ° C).
    3. Samle den øvre vandige fasen som inneholder det løselige tRNA (UUU) (og mindre konsentrasjoner av de andre tRNA-bassengene) ved hjelp av en pipette, og pass på å ikke aspirere den organiske (bunn) fasen. Kast bunnlaget og pelleten, som består av organisk fase og celleavfall, inn i en tilstrekkelig beholder.
    4. Nedfell tRNA ved grundig blanding av den oppløselige (vandige) fasen med 2,5 volum 100% volum / volum etanol ved inversjon i 1 time ved 4 ° C. Sentrifuger blandingen ved 15.000 xg (30 min, 4 ° C).
    5. Dekanter supernatanten nøye og resuspender den tRNArike pelleten i 4 ml gelfiltreringsbuffer (20 mM natriumfosfat eller kaliumfosfat, pH 7,4, 0,1 mM EDTA). Kjør 5 ul av det resuspenderte tRNA-bassenget på en 2% vekt / volum-agarosegel.
      MERK:TRNA av god kvalitet vises som et enkelt bånd (molekylær størrelse mellom 50-100 bp).
  3. Rensing av tRNA (UUU)
    1. Ved å følge standard kromatografisk praksis 12 , føres det resuspenderte tRNA (UUU) på en høyoppløselig preparativ gelfiltreringskolonne (dimensjoner: 16 x 600 mm, sengevolum: 120 ml, oppløsningsområde: 1000-70.000 Da) tidligere ekvilibrert i gelfiltreringsbuffer (Mobil fase). Still strømningsraten til 1 ml / min for å eluere prøvene.
      MERK: TRNA-toppen (UUU) eluerer ca. 75,5 ml. Vanligvis kan et utbytte på 0,5-1,0 mg / l tRNA av kultur oppnås.
    2. Analyser prøvene ved representative elueringsvolumer ved å elektroforesere 5-10 μl av hver prøve på en 2% vekt / volum-agarosegel.

3. Prøveforberedelse

  1. Express og rens TcdA i henhold til López-Estepa et al . 2 .
    MERK: Opptil 250 μMTcdA kan brukes til studien.
  2. Pipetter tilsvarende mengde TcdA som i Tabell 1 til riktig merket 1,5 ml sentrifugerør. Tilsett 1,6 mM tris (2-karboksyetyl) fosfin (TCEP) (sluttkonsentrasjon) og bland forsiktig med en pipette. Lukk lokket og inkuber blandingen ved romtemperatur i 5 minutter.
  3. Tilsett 10 μM adenosintrifosfat (ATP) og 50 mM MgCl2 (sluttkonsentrasjoner). Bland med en pipette og inkuber blandingen i 5 minutter ved romtemperatur.
  4. Tilsett renset tRNA (UUU) (kapittel 2.3) i henhold til tabell 1 , bland med en pipette og inkuber ved romtemperatur i 5 minutter.
  5. Tilsett fosfatbuffert saltvann (PBS) opp til 100 μl sluttvolum. Bland riktig og tilsett glyserol til en sluttkonsentrasjon på 10% v / v.
  6. Vortex prøven og kort spinn ned innholdet i røret (10.000 xg, 1 min, 4 ° C).

4. Gelbelastning og elektroforeseutvikling

  1. Plasser elektroforeseenheten i et brett fylt med knust is for å opprettholde kammeret ved 4 ° C under elektroforese-løpet.
  2. Forsiktig pipetter 5 μL av hver prøve inn i den tilsvarende brønnen. Legg til en egnet DNA-størrelsesmarkør.
  3. Plugg elektrodene inn i de tilsvarende sporene på strømforsyningsenheten. Slå på strømforsyningen og sett spenningen til 100 V og kjør gelen i 90 minutter.

5. Gel-farging for å observere tRNA-proteininteraksjon

  1. Forbered fargeløsningen ved å blande 50 ml TBE med 1x av en egnet DNA-flekk. Unngå å utsette fargeløsningen for sollys ved å dekke fargebeholderen med aluminiumsfolie.
    MERK: DNA-flekker lagres vanligvis som 10.000 eller 20.000x konsentrerte aksjer.
  2. Etter 90 min elektroforese, fjern gelen forsiktig fra brettet og legg den i en beholder med fargeløsning. Plasser den på en rocker ved lav svinghastighet ved romtemperaturUre i 30 min.
  3. Fjern agarosegelen fra flekkerbeholderen, trykk den forsiktig på et stykke cellulosevev eller filterpapir for å fjerne overflødig væske og plasser den direkte på en transilluminator. Slå på UV-lyset for å visualisere bånd som inneholder tRNA. Ta et bilde av gelen.
  4. Proteinfarging (valgfritt).
    1. Kast DNA-fargeløsningen på en sikker måte (i henhold til sikkerhetsprosedyrene) og erstatt den med 50 ml Coomassie Brilliant Blue (CBB) -løsning. Legg brettet på en rocker ved romtemperatur og flekk over natten (> 12 timer). Kast CBB-fargeløsningen og erstatt den med 50 ml PBS for å fjerne overflødig fargestoff. Destinere i 1 time på en vippelager.
  5. Visualiser proteinholdige tRNA-komplekser under en lystransilluminator og ta bilder av gelen for å sammenligne med tRNA UV-gelbildet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Store mengder tRNA (UUU) kan oppnås ved å uttrykke tRNA-genet i E. coli under kontroll av en sterk inducerbar T7-promotor. Det uttrykte tRNA (UUU) akkumuleres i cytoplasma og er beriket over bassenget av naturlig rikelig tRNA. En to-trinns renseprosess bestående av et oppfangnings / ekstraksjonstrinn og et gelfiltrerings / poleringstrinn ble benyttet for å oppnå EMSA-klasse tRNA. Fangst / ekstraksjonstrinnet bruker pH 4,3 fenol for å oppnå samtidig utfelling av protein, celleavfall, DNA og ekstraksjon av tRNA (og andre RNA-molekyler). Ved dette trinnet kan mengden av totalt tRNA-basseng vurderes ved elektroforese på en 2% vekt / volum-agarosegel. Det andre trinnet inkorporerer gelfiltreringskromatografi som separerer RNA-arter i henhold til deres molekylære størrelse. UV-sporet ved 254 nm brukes til å overvåke separasjonen og identifisere de viktigste elueringstoppene ( figur 1Toppen). Representative alikvoter av toppfraksjoner ble kjørt på en 2% w / v agarosegel for analyse ( figur 1 bunn ). Flertallet av tRNA-molekylene co-eluerer i en enkelt topp (midten) av kromatografi-løp (her, 75,5 ml i en 120 ml søylekolonne). Ved separering av bassenger som inneholder en enkelt overuttrykt art, som tRNA (UUU), tilhører mer enn 90% av tRNA-molekylene i bassenget det spesifikke tRNA, mens de resterende molekylene tilsvarer de naturlig riklige tRNAene. Sekundære topper observeres både før og etter den tRNA-holdige sentrale topp. Toppene inneholder tidligere delvis nedbrytte, større RNA-molekyler (fraksjoner 26 og 32; stenger i figur 1 ), og toppen (e) ved slutten av rensekjøringen inneholder svært små RNAer og forurensninger (fraksjoner 45 og 51; Barer i figur 1 ). Etter samling av fraksjonene under den sentrale topp (fraksjoner 39-43; Barer i figur 1 ), mengden av renset tRNA kan kvantifiseres ved UV-spektroskopi og / eller ved sammenligning med molekylstørrelsesstandarder på en 2% vekt / volum-agarosegel.

TcdA og tRNA (UUU) prøver kan blandes ved forskjellige molarforhold fra 1,0 til 10,0 ved anvendelse av et semi-logaritmisk prøvetakingsskjema ( tabell 1 ) og separert på 2% vekt / volum agarosegeler ( figur 2 ). Avhengig av stabiliteten av protein-tRNA-kompleksene og støkiometrien for binding kan ett eller flere bånd visualiseres på gelen. For TcdA-tRNA (UUU) dannes et støkiometrisk kompleks som går som et isolert bånd som inneholder både protein og tRNA. Vanligvis migrerer fritt tRNA raskere og kan observeres på bunnen av gelen, mens protein-tRNA-kompleksene, som er mindre negativt ladede og er større i størrelse, har en tendens til å migrere langsommere. Figur 2 viser en representasjon Ativ 2% w / v agarosegel av TcdA-tRNA (UUU) komplekser. I figur 2 tjener TcdA-bare og tRNA-eneste bånd som negative kontroller. Etter hvert som TcdA: tRNA (UUU) molforholdet øker, øker mengden av TcdA-tRNA (UUU) komplekser dannet på bekostning av det frie tRNA-båndet. Merk at intensiteten av gratis tRNA reduseres ettersom mengden TcdA øker. Det første komplekset å danne er et 2: 1 støkiometrisk kompleks som inneholder ett tRNA-molekyl per TcdA-dimer (synlig i banene med 10, 20 eller 30 μM TcdA). Ved TcdA-metning utvikles et større molekylært TcdA-tRNA (UUU) kompleks som inneholder et 2: 2 støkiometrisk kompleks, hvor begge TcdA-underenhetene er bundet til ett tRNA (UUU) molekyl hver (synlig i baner med 30, 50 eller 75 μM). De to siste banene med TcdA (50 eller 75 μM) har bundet alle tRNAene i reaksjonen og mangler et fritt tRNA-bånd.

Tp_upload / 55638 / 55638fig1.jpg "/>
Figur 1: Rensing av tRNA (UUU) ved gelfiltrering. Kromatogram (topp) av gelfiltreringen av tRNA (UUU) over en høyoppløselig preparativ gelfiltreringskolonne registrert ved 254 nm. Den høyeste toppen, som inneholder tRNA-bassenget beriket i tRNA (UUU), elueres ved ~ 75,5 ml. En 2% w / v agarosegel (bunn) ble kjørt med alikvoter fra de forskjellige tRNA-elueringsfraksjonene. M, molekylær stige. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2
Figur 2: Gel Retardasjon Assay med TcdA og tRNA (UUU). EMSA gir bevis for fysisk binding av tRNA til TcdA. Prøver ble kjørt på en 2% vekt / volum-agarosegel ved 4 ° C i 90 minutter. En fast mengde tRNA (UUU), 7,5 μM, ble blandet med variable mengder TcdA (se tabell 1 ), og protein-tRNA-kompleksene ble separert under elektroforese-løpet. Gelen ble farget og visualisert på en UV-transilluminator. Hver bane inneholder 5 μL prøve. M, molekylær stige. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protein-tRNA-agarosegel-retardasjonsanalysen beskrevet heri kan modifiseres på en rekke måter. For det første kan prosentandelen agarose i gelen reduseres for å tillate separasjon og visualisering av protein-tRNA-komplekser betydelig større enn den som analyseres her (120 kDa). For det andre, hvis målproteinet er termolabilt, må det tas ekstra forholdsregler for å sikre at temperaturen holdes under den maksimalt akseptable temperatur ved å flytte elektroforeseapparatet til et kaldrom eller ved å bruke ispakker inne i elektroforese-kammeret for å øyeblikkelig avlede varmeen som produseres Under løp. Andre bufferkomposisjoner ( f.eks . 0,5X TB, tris-borat) og løpeparametere (> 20 V / cm) kan modifiseres for å forkorte kjøretiden om nødvendig eller akseptabelt for prøvene 11 . Den foreslåtte MgCl2-konsentrasjonen kan reduseres dersom RNA-nedbrytning observeres under prøveforberedelsestrinnet, siden divalent catiOns kan potensielt katalysere spaltningen av nukleinsyrer.

Hovedbegrensningen av teknikken er at protein-tRNA-båndene vanligvis er litt mer diffuse enn de som er sett i akrylamidbaserte gelretarderingsmetoder, som har en tendens til å være skarpere og klarere. En annen begrensning er at bredere, lengre geler kan være nødvendige for samtidig analyse av flere prøver, og hvis protein-tRNA-komplekser av forskjellige størrelser og ladninger skal løses.

I sammenligning med eksisterende metoder gir protein-tRNA-agarosegel-retardasjonsanalysen en signifikant reduksjon i arbeidskraft og tid fra prøvefremstilling til analyse. Akrylamidgeler, inneholder skadelige kjemikalier, er arbeidskrevende å forberede og tar lengre tid å polymerisere. I motsetning er agarose geler enkle, raske til å kaste og sette, og ikke involvere giftige kjemikalier. Forsøket kan fullføres om 2 timer. Dette inkluderer 30 min for gelen som skal settes, 15 min for prøveberedning (som kan væreGjort under avkjøling av agarosen), 90 min for elektroforese og visualisering.

Fremtidige anvendelser av fremgangsmåten kan forfine deteksjonsmetodene som anvendes i denne protokollen og anvende den til påvisning av mindre rikelig, mer ustabil RNA-arter eller til proteinkomplekser som kun kan uttrykkes i svært små mengder. Etikettering av RNA eller proteinkomponenten med svært følsomme fluoroforer vil tillate deteksjon av mindre mengder protein-RNA-komplekser. Videre kan bruk av fluorophorer med ikke-overlappende utslipps- / eksitasjonstoppe muliggjøre multipleksjonsforsøk hvor forskjellige protein- og / eller RNA-arter kunne visualiseres samtidig i et enkelt eksperiment.

Det er tre kritiske trinn i denne protokollen. Det første og mest åpenbare kritiske trinnet er uttrykk og rensing av tRNA (UUU). Hvis mengden renset tRNA (UUU) er under en viss minimumspåvisningsgrense (mellom 25-200 ng tRNA per bånd), Eller nedbrytningsbånd blir tydelige som forurensninger med lav molekylær størrelse, bør tRNA kastes og re-renses. Bruk av syrefenol (pH 4,3) under tRNA-ekstraksjon er essensielt siden det selektivt utfelles DNA mens RNA-løselig opprettholdes. Det andre kritiske trinnet gjelder fremstilling av protein-tRNA-prøvene for analyse. Tilstrekkelig mengder protein og tRNA må brukes for å muliggjøre en robust deteksjon av alle komplekser som dannes. Protein-tRNA-molforholdene må justeres for å forskyve likevekten mot kompleks dannelse. Det tredje kritiske trinnet er elektroforeseen. TBE-bufferen må brukes frisk (ikke gjenbruk), og det er nødvendig å holde agarosegelene ved temperaturer der protein-tRNA-kompleksene er stabile og ikke denaturerer (typisk 4-10 ° C). Det må utvises forsiktighet for å holde agarosegelen kald under hele elektroforeseen, for eksempel ved å omgjøre elektroforesekammeret med is og, når det er mulig, kjøre forsøketT i et kaldt rom ved 4 ° C.

Vi har vist en enkel metode for analyse, karakterisering av protein-tRNA-komplekser ved bruk av TcdA-tRNA (UUU) som modellsystem, og ved anvendelse av agarosegelelektroforese istedenfor akrylamidelektroforese. Sistnevnte tar lengre tid å fullføre og er betydelig mer arbeidskrevende. Ved hjelp av denne metoden kan elektroforetisk separasjon på 2% w / v agarose geler (8 cm gelformater) oppnås på mindre enn 90 minutter. Dette er et praktisk verktøy for analyse av protein-tRNA-interaksjoner og muliggjør samtidig analyse av flere prøver. Varianter av tRNA og / eller proteinmutanter kan screenes for binding og stabilitet ved anvendelse av denne metoden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

MCV er medlem av CIB Intramural Program "Molecular Machines for Better Life" (MACBET). Forskningen som fører til disse resultatene har mottatt midler fra det spanske instituttet de Salud Carlos III (PI12 / 01667 til MCV), den spanske Ministerio de Economía y Competitividad (CTQ2015-66206-C2-2-R og SAF2015-72961-EXP til MCV ), Den regionale regjeringen i Madrid (S2010 / BD-2316 til MCV) og EU-kommisjonen (rammeprogram 7 (RP7)) prosjektet ComplexINC (kontrakt nr. 279039 til MCV). Funders hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere eller utarbeide manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
E. coli BL21(DE3) Novagen 70235 DE3 lysogen contains T7 polymerase upon IPTG induction.
pET23d Novagen 69748-3 pET23d confers resistance to ampicillin; T7 promoter.
LB Broth, Low Salt (Lennox L Broth), Granulated Melford GL1703 Conventional LB Broth, High Salt, can also be used.
Ampicillin Sigma-Aldrich 10419313
Incubator Shaker (Thermostated) NBS Excella E24  Any shaker incubator with temperature control can be used.
Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG), >=99% Acros Organics BP1755
Sodium acetate, anhydrous, >99% Melford B4017
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), Disodium salt, >99% Acros Organics AC327205000 Harmful if inhaled.
Centrifuge (refrigerated) Eppendorf 5430
Centrifuge (refrigerated) rotor Eppendorf 5430/5430P
Centrifuge Sorvall RC5C
Centrifuge rotor Sorvall SLA-3000
Phenol solution, Saturated with 0.1 M citrate buffer, pH 4.3 ± 0.2 Sigma-Aldrich P4682 Acute toxicity (oral, dermal, inhalation), corrosive
Ethanol absolute for analysis, 100% v/v Merck Millipore 100983
Sodium phosphate dibasic dihydrate, Na2HPO4, >=99% Sigma-Aldrich 71643
Potassium dihydrogen phosphate, KH2PO4 Merck 48,730,250
HiLoad 16/60 Superdex 75  GE Healthcare 28989333
Agarose Melford MB1200
Tris [Tris(hydroxymethyl) aminomethane HCl] Melford T1513
Boric Acid Melford B0503
Microwave Haier HDA-2070M
TCEP [Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride] Sigma-Aldrich C4706 Corrosive to metals and skin.
ATP [Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate], Grade I, >=99% Sigma-Aldrich A2383
Magnesium chloride (MgCl2), anhydrous, >=98% Sigma-Aldrich M8266
Sodium chloride (NaCl), >99% Fisher Bioreagents BP358
Potassium chloride (KCl), >99% Melford P0515
NZYDNA Ladder VI NZYtech MB8901
Power supply Consort EV261
Electrophoresis unit Real Laboratory RELSMINI10
Real Safe nucleic acid staining Real Laboratory RBMSAFE 20,000X stock
UV Transilluminator (G:Box/EF) Syngene 2216498
Coomassie Brilliant Blue G Sigma-Aldrich B0770
Rocker (Gyro-Rocker) Stuart SSL3
Mixer Vortex  Fisher brand 13214789

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Scott, V., Clark, A. R., Docherty, K. The gel retardation assay. Methods Mol Biol. 31, 339-347 (1994).
  2. López-Estepa, M., et al. The crystal structure and small-angle X-ray analysis of CsdL/TcdA reveal a new tRNA binding motif in the MoeB/E1 superfamily. Plos One. 10 (4), e0118606 (2015).
  3. Miyauchi, K., Kimura, S., Suzuki, T. A cyclic form of N6-threonylcarbamoyladenosine as a widely distributed tRNA hypermodification. Nat Chem Biol. 9 (2), 105-111 (2013).
  4. Bolstad, H. M., Botelho, D. J., Wood, M. J. Proteomic analysis of protein-protein interactions within the Cysteine Sulfinate Desulfinase Fe-S cluster biogenesis system. J Proteome Res. 9 (10), 5358-5369 (2010).
  5. Loiseau, L., Ollagnier-de Choudens, S., Lascoux, D., Forest, E., Fontecave, M., Barras, F. Analysis of the heteromeric CsdA-CsdE cysteine desulfurase, assisting Fe-S cluster biogenesis in Escherichia coli. J Biol Chem. 280 (29), 26760-26769 (2005).
  6. Fried, M. G., Crothers, D. M. Equilibrium studies of the cyclic AMP receptor protein-DNA interaction. J Mol Biol. 172 (3), 241-262 (1984).
  7. Garner, M. M., Revzin, A. A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system. Nucleic Acids Res. 9 (13), 3047-3060 (1981).
  8. Rio, D. C. Electrophoretic mobility shift assays for RNA-protein complexes. Cold Spring Harb Protoc. 2014 (4), 435-440 (2014).
  9. Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift. Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).
  10. Yakhnin, A. V., Yakhnin, H., Babitzke, P. Gel mobility shift assays to detect protein-RNA interactions. Methods Mol Biol. 905, 201-211 (2012).
  11. Ream, J. A., Lewis, L. K., Lewis, K. A. Rapid agarose gel electrophoretic mobility shift assay for quantitating protein: RNA interactions. Anal Biochem. 511, 36-41 (2016).
  12. Hagel, L. Gel-filtration chromatography. Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 10, Unit 10.9 (2001).

Tags

Biochemistry CsdL cyclic t cysteinsulfinat-desulfinase (CSD) gel-retardasjonsanalyse, TcdA Transfer RNA (tRNA) tRNA-hypermodifisering
Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays for Analyse av<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -treonylkarbamoyladenosin TcdA-funksjon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fernández, F. J., Gómez,… More

Fernández, F. J., Gómez, S., Navas-Yuste, S., López-Estepa, M., Vega, M. C. Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays for the Analysis of the N6-threonylcarbamoyladenosine TcdA Function. J. Vis. Exp. (124), e55638, doi:10.3791/55638 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter