Summary
En protokol præsenteres for produktion af tRNA (UUU) og analysen af tRNA (UUU) i kompleks med enzymet TcdA ved agarosegel-retardationsassays.
Abstract
Vi demonstrerer metoder til ekspression og oprensning af tRNA (UUU) i Escherichia coli og analysen ved gel-retardationsassays af bindingen af tRNA (UUU) til TcdA, en N6-threonylcarbamoyladenosin (t6A) dehydratase, som cycliserer threonylcarbamoylen Sidekæde fastgjort til A37 i anticodon stamme loop (ASL) af tRNA'er til cyklisk t 6 A (ct 6 A). Transkription af det syntetiske gen, der koder for tRNA (UUU), induceres i E. coli med 1 mM isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG), og cellerne indeholdende tRNA høstes 24 timer efter induktion. RNA-fraktionen renses ved anvendelse af den sure phenolekstraktionsmetode. Rent tRNA opnås ved en gelfiltreringskromatografi, som effektivt adskiller de små tRNA-molekyler fra større intakte eller fragmenterede nukleinsyrer. For at analysere TcdA-binding til tRNA (UUU) blandes TcdA med tRNA (UUU) og adskilles på en native agarosegel ved 4 ° C.Det frie tRNA (UUU) migrerer hurtigere, mens TcdA-tRNA (UUU) -komplekserne undergår en mobilitetsretardation, som kan observeres ved farvning af gelen. Vi demonstrerer, at TcdA er et tRNA (UUU) bindende enzym. Dette gel-retardationsassay kan anvendes til at studere TcdA-mutanter og virkningerne af additiver og andre proteiner på binding.
Introduction
Gel-retardationsassayet 1 (også kendt som elektroforetisk mobilitetsforskydningsassay, EMSA) er en elektroforetisk metode designet til at studere og karakterisere protein-nukleinsyre-interaktioner. Det muliggør analyse af protein-DNA såvel som protein-RNA-interaktioner og især interaktioner mellem tRNA og tRNA-bindende proteiner ved anvendelse af enten rensede komponenter eller komplekse blandinger af proteiner ( f.eks . Cellelysater) eller nukleinsyrer ( fx tRNA pools). Vi har anvendt gelretarderingsassays til undersøgelsen af interaktionen mellem oprenset tRNA (UUU) og TcdA, en N6-threonylcarbamoyladenosin (t6A) dehydratase, som cycliserer threonylcarbamoyl-sidekæden fastgjort til A37 i anticodon-stamcellen (ASL) Af tRNA'er til cyklisk t6 (ct 6A) 2 , 3 . TcdA er også kendt som CsdL 3 ,F "> 4. TcdA / csdL genet danner en klynge med csdA- og csdE- generne 5 , som koder for cystein-desulfurasen og svovlacceptoren af cysteinsulfinase desulfinat-systemet (CSD) og er påkrævet for at opretholde TcdA-funktion in vivo 3 .
Baggrunden for gel-retardationsanalyserne er, at mens de frie nukleinsyremolekyler hurtigt overføres til forsiden af acrylamid- eller agarosegeler på grund af deres store negative ladning, reduceres den elektroforetiske mobilitet af proteinkomplekser af de samme nukleinsyrer dramatisk. Reduktionen i mobilitet visualiseres som et "skift" i nukleinsyre-protein-komplekserne, som løser som diskrete bånd. Positivt ladet og større nukleinsyre-proteinkompleks viser en større forskydning eller reduktion i mobilitet på en gel.
Da ladningsneutralisering af komplekset er et universelt fænomenFor protein-nukleinsyrekomplekser kan gelretarderingsassayet påføres et bredt spektrum af komplekser og nukleinsyretyper. Metoden er enkel, billig og kan udføres i laboratorier med minimum udstyr. Det kræver kun små mængder proteiner og tRNA. Dette er en fordel i forhold til alternative biofysiske teknikker, som normalt forbruger større mængder prøve.
Gel-retardationsassayet er blevet anvendt i vid udstrækning til undersøgelsen af transkriptionsfaktorer. Assayet er blevet anvendt til at analysere bindende kinetik, styrke og specificitet af transkriptionsfaktorer for mange forskellige DNA-sekvenser. Det var faktisk på dette område, at EMSA blev udviklet 6 , 7 . Gelretarderingsassays med RNA 8 , 9 , 10 , 11 og tRNA-molekyler er også blevet anvendt i ribosomforskningOg at analysere, som vi gør her, de enzymer, der modificerer tRNA nucleosider post-transkriptionelt.
Mange forskellige parametre påvirker resultatet af et gelretarderingsassay, såsom temperatur, kvalitet af proteinet og tRNA-prøven og bindingsstyrken. Omhyggelig planlægning og udførelse af eksperimentet er afgørende for fortolkningen af resultaterne af den frie nukleinsyre og proteinbundne arter. Her anvendte vi det syntetiske gen kodende for tRNA (UUU) klonet i en ekspressionsvektor, hvis promotor mangler Shine-Dalgarno ribosombindingsstedet, hvilket fører til syntese af store mængder af tRNA 2 . Denne detaljerede protokol er beregnet til at give en klar vejledning til udførelse af tRNA gelretardationsforsøg, samtidig med at man undgår almindelige fejl.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forsigtig: Kontakt alle relevante sikkerhedsdatablade (MSDS) inden brug. Flere af de kemikalier, der anvendes i denne protokol, er giftige og ætsende. Brug passende fremgangsmåder ved udtrækning af tRNA ved anvendelse af phenol, herunder brug af dampkoge og personlige værnemidler (sikkerhedsbriller, handsker, laboratoriejakke, bukser i fuld længde, lukkede sko osv .). Denne protokol anvender en ikke-toksisk nukleinsyre plet. Anvendelse af alternative pletter kan kræve yderligere forholdsregler og særlig bortskaffelse af farvemidlet, hvis det er giftigt og / eller kræftfremkaldende ( f.eks . Ethidiumbromid).
1. Fremstilling af agarosegelen
- Væg 2 g agarose og tilsæt den til en glasflaske for at forberede en 2% w / v agarosegel.
- Tilsæt 100 ml 1x tris-borat-ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) (TBE) kørerbuffer til den agaroseholdige flaske. Smelt ved opvarmning i en mikrobølgeovn. Efter 30 s intervaller, hvirvles indholdet til blandingNå og gentag dette trin, indtil agarosen er helt opløst. Lad agaroseopløsningen afkøle til ca. 50-60 ° C.
- Tape de åbne kanter af en gelbakke for at skabe en form, læg en passende kam til at skabe brøndene og kast den smeltede agarose ind i den. Undgå boble dannelse og lad det størkne ved stuetemperatur.
- Når du har størknet, skal du placere gelbakken i en elektroforeseenhed og fylde den med TBE-puffer, indtil gelen er helt dækket.
2. Fremstilling af tRNA
- Express tRNA (UUU) i E. coli
- Om morgenen skal du bruge et hætteglas med frosset E. coli BL21 (DE3) transformeret med ekspressionsvektoren pET23d-EcUUU2 (har genene, der koder for E. coli tRNA (UUU)), for at strikke en lavsalt Luria bouillon (LB) Plade suppleret med 100 μg / ml ampicillin. Inverter pladen og anbring den i en 37 ° C inkubator indtil kolonier vises (sen eftermiddagoon).
- Inokulere en velfungeret enkeltkoloni i 5 ml LB plus 100 μg / ml ampicillin og dyrk natten over ved 220 omdr./min. Ved 37 ° C.
- Næste morgen piller cellerne (6.500 xg i 10 minutter ved 4 ° C), erstatter medium med 5 ml frisk LB plus 100 μg / ml ampicillin og resuspenderes. Brug denne suspension til at inokulere 200 ml LB plus 100 μg / ml ampicillin. Væk i 5 timer ved 220 omdr./min. Ved 37 ° C.
- Når den optiske densitet af kulturen ved 590 nm (OD 590 ) har nået 0,6 til 0,8, tilsættes 1 mM IPTG til kulturen for at udløse ekspressionen af tRNA-genet (UUU). Inkuber ved 37 ° C i 3 timer.
- Høst cellerne ved centrifugering af kulturen ved 6.500 xg i 10 minutter ved 4 ° C.
- Lysis og ekstraktion
- Resuspender cellepelleten i 5 ml lysisbuffer (0,3 M natriumacetat, 10 mM EDTA). Fra dette punkt anvendte autoklaverede buffere og opbevar alle de tRNA-holdige prøver ved 4 ° C for at forhindre tRNA nedbrydning.
- Tilsæt 1 volumen syrephenol (pH 4,3) til den resuspenderede cellepille i røgglasset. Bland i 1 minut ved inversion for at lysere cellerne og centrifuge ved 10.000 xg (10 min, 4 ° C).
- Saml den øvre vandige fase indeholdende det opløselige tRNA (UUU) (og mindre koncentrationer af de andre tRNA-puljer) ved hjælp af en pipette, idet man sørger for ikke at aspirere den organiske (bund) fase. Kassér bundlaget og pelleten, som består af den organiske fase og celleaffald, i en passende beholder.
- Præcipiterer tRNA ved grundigt at blande den opløselige (vandige) fase med 2,5 volumen 100% v / v ethanol ved inversion i 1 time ved 4 ° C. Centrifuger blandingen ved 15.000 xg (30 min, 4 ° C).
- Dekanter supernatanten omhyggeligt og resuspender den tRNA-rige pellet i 4 ml gelfiltreringsbuffer (20 mM natriumphosphat eller kaliumphosphat, pH 7,4, 0,1 mM EDTA). Kør 5 μl af den resuspenderede tRNA-pulje på en 2% w / v agarosegel.
BEMÆRK:TRNA af god kvalitet fremstår som et enkeltbånd (molekylær størrelse mellem 50-100 bp).
- Oprensning af tRNA (UUU)
- Efter standardkromatografisk praksis 12 , indlæses det resuspenderede tRNA (UUU) på en præparativ gelfiltreringskolonne med høj opløsning (dimensioner: 16 x 600 mm, sengevolumen: 120 ml, opløsningsområde: 1.000-70.000 Da), der tidligere er ækvilibreret i gelfiltreringsbuffer (Mobil fase). Indstil strømningshastigheden til 1 ml / min for at eluere prøverne.
BEMÆRK: TRNA-spidsen (UUU) eluerer ca. 75,5 ml. Typisk kan et udbytte på 0,5-1,0 mg / l tRNA fra dyrkning opnås. - Analyser prøverne ved repræsentative elueringsvolumener ved elektroforese 5-10 μl af hver prøve på en 2% vægt / volumar agarosegel.
- Efter standardkromatografisk praksis 12 , indlæses det resuspenderede tRNA (UUU) på en præparativ gelfiltreringskolonne med høj opløsning (dimensioner: 16 x 600 mm, sengevolumen: 120 ml, opløsningsområde: 1.000-70.000 Da), der tidligere er ækvilibreret i gelfiltreringsbuffer (Mobil fase). Indstil strømningshastigheden til 1 ml / min for at eluere prøverne.
3. Prøveforberedelse
- Eksplodere og rense TcdA ifølge López-Estepa et al . 2 .
BEMÆRK: Op til 250 μMTcdA kan bruges til undersøgelsen. - Pipetter den tilsvarende mængde TcdA som i tabel 1 til korrekt mærket 1,5 ml centrifugerør. Tilsæt 1,6 mM tris (2-carboxyethyl) phosphin (TCEP) (slutkoncentration) og bland forsigtigt ved hjælp af en pipette. Luk låget og inkubér blandingen ved stuetemperatur i 5 minutter.
- Tilsæt 10 μM adenosintrifosfat (ATP) og 50 mM MgCl2 (slutkoncentrationer). Bland med en pipette og inkuber blandingen i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Tilsæt renset tRNA (UUU) (afsnit 2.3) som i tabel 1 , bland med en pipette og inkuber ved stuetemperatur i 5 minutter.
- Tilsæt phosphatpufret saltopløsning (PBS) op til 100 μl slutvolumen. Bland korrekt og tilsæt glycerol til en slutkoncentration på 10% v / v.
- Vortex prøven og drej kort indholdet af røret kort (10.000 xg, 1 min, 4 ° C).
4. Gelbelastning og elektroforeseudvikling
- Placer elektroforeseenheden i en bakke fyldt med knust is for at opretholde kammeret ved 4 ° C under elektroforese-løbet.
- Pipetter forsigtigt 5 μl af hver prøve i den tilsvarende brønd. Tilsæt en passende DNA-størrelse markør.
- Sæt elektroderne i de tilsvarende slidser i strømforsyningen. Tænd for strømforsyningen og indstil spændingen til 100 V og kør gelen i 90 min.
5. Gel-farvning for at observere tRNA-proteininteraktion
- Forbered farvningsopløsningen ved at blande 50 ml TBE med 1x af en egnet DNA-plet. Undgå at udsætte farvningsopløsningen for sollys ved at dække farvningsbeholderen med aluminiumsfolie.
BEMÆRK: DNA-pletter opbevares normalt som 10.000 eller 20.000x koncentrerede lagre. - Efter 90 min elektroforese skal du forsigtigt fjerne gelen fra bakken og placere den i en beholder med farvestof. Placer den på en rocker ved lav rockinghastighed ved stuetemperaturUre i 30 min.
- Fjern agarosegelen fra farvningsbeholderen, tryk den forsigtigt på et stykke cellulosevæv eller filterpapir for at fjerne overskydende væske og placere det direkte på en transilluminator. Tænd UV-lyset for at visualisere bånd, der indeholder tRNA. Tag et billede af gelen.
- Proteinfarvning (valgfri).
- Kassér DNA-farvningsopløsningen på en sikker måde (ifølge sikkerhedsprocedurer) og erstat den med 50 ml Coomassie Brilliant Blue (CBB) -opløsning. Placer bakken på en rocker ved stuetemperatur og farvel natten over (> 12 timer). Kassér CBB-farvningsopløsningen og erstat den med 50 ml PBS for at fjerne overskydende farvestof. Destinere i 1 time på en vippe.
- Visualiser proteinholdige tRNA-komplekser under en lystransilluminator og tag fotografier af gelen for at sammenligne med tRNA UV gelbilledet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Store mængder tRNA (UUU) kan opnås ved at udtrykke tRNA genet i E. coli under kontrol af en stærk inducerbar T7 promotor. Det udtrykte tRNA (UUU) akkumuleres i cytoplasmaet og beriges over puljen af naturligt rigelige tRNA'er. En to-trins oprensningsproces bestående af et capture / ekstraktionstrin og et gelfiltrerings / poleringstrin blev anvendt til opnåelse af EMSA-grade tRNA. Fangst / ekstraktionstrinnet bruger pH 4,3 phenol til opnåelse af samtidig udfældning af protein, celleaffald, DNA og ekstraktion af tRNA (og andre RNA-molekyler). Ved dette trin kan mængden af total tRNA-pool vurderes ved elektroforese på en 2% vægt / volumar agarosegel. Det andet trin inkorporerer gelfiltreringskromatografi, der adskiller RNA-arter i overensstemmelse med deres molekylstørrelse. UV-sporet ved 254 nm anvendes til at overvåge separationen og identificere de vigtigste elueringspopper ( figur 1Top). Repræsentative alikvoter af topfraktioner blev kørt på en 2% w / v agarosegel til analyse ( figur 1 bund ). Størstedelen af tRNA-molekylerne co-eluerer i en enkelt top (midten) af kromatografikørslen (her 75,5 ml i en 120 ml søjlekolonne). Ved separering af puljer indeholdende en enkelt overudtrykt art, som tRNA (UUU) tilhører mere end 90% af tRNA-molekylerne i puljen det specifikke tRNA, medens de resterende molekyler svarer til de naturligt forekommende tRNA'er. Sekundære toppe observeres både før og efter den tRNA-holdige centrale top. Toppen / præparaterne indeholder tidligere delvist nedbrudte større RNA-molekyler (fraktioner 26 og 32; søjler i figur 1 ), og toppen (e) i slutningen af rensningsforløbet indeholder meget små RNA'er og forurenende stoffer (fraktioner 45 og 51; Stænger i figur 1 ). Efter pooling af fraktionerne under den centrale top (fraktioner 39-43; Stænger i figur 1 ), mængden af oprenset tRNA kan kvantificeres ved UV-spektroskopi og / eller i sammenligning med molekylstørrelsesstandarder på en 2% vægt / volumar agarosegel.
TcdA og tRNA (UUU) prøverne kan blandes ved forskellige molforhold fra 1,0 til 10,0 ved anvendelse af et semi-logaritmisk prøveudtagningsskema ( tabel 1 ) og adskilt på 2% vægt / volumar agarosegeler ( figur 2 ). Afhængigt af stabiliteten af protein-tRNA-komplekserne og støkiometrien for binding kan et eller flere bånd visualiseres på gelen. For TcdA-tRNA (UUU) dannes et støkiometrisk kompleks, som løber som et isoleret bånd indeholdende både protein og tRNA. Typisk migrerer frit tRNA hurtigere og kan observeres i bunden af gelen, mens protein-tRNA-komplekser, som er mindre negativt ladede og er større i størrelse, har tendens til at migrere langsommere. Figur 2 viser en repræsentant Ativ 2% w / v agarosegel af TcdA-tRNA (UUU) komplekser. I figur 2 tjener TcdA-only og tRNA-only bands som negative kontroller. Efterhånden som TcdA: tRNA (UUU) molforholdet stiger, øges mængden af TcdA-tRNA (UUU) komplekser dannet på bekostning af det frie tRNA-bånd. Bemærk, at intensiteten af fri tRNA formindskes, da mængden af TcdA øges. Det første kompleks til dannelse er et 2: 1 støkiometrisk kompleks indeholdende et tRNA-molekyle pr. TcdA-dimer (synlig i banerne med 10, 20 eller 30 μM TcdA). Ved TcdA-mætning udvikles et større molekylært TcdA-tRNA (UUU) kompleks, der indeholder et 2: 2 støkiometrisk kompleks, hvor begge TcdA-underenhederne er bundet til et tRNA (UUU) molekyle hver (synligt i baner med 30, 50 eller 75 μM). De to sidste baner med TcdA (50 eller 75 μM) har bundet alle tRNA'et i reaktionen og mangler et frit tRNA-bånd.
Tp_upload / 55638 / 55638fig1.jpg "/>
Figur 1: Oprensning af tRNA (UUU) ved gelfiltrering. Kromatogram (top) af gelfiltreringen af tRNA (UUU) over en præparativ gelfiltreringskolonne med høj opløsning registreret ved 254 nm. Den højeste top, der indeholder tRNA-puljen beriget i tRNA (UUU) elueres ved ~ 75,5 ml. En 2% w / v agarosegel (bund) blev kørt med alikvoter fra de forskellige tRNA-elueringsfraktioner. M, molekylær stige. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Gel Retardation Assay med TcdA og tRNA (UUU). EMSA giver bevis for den fysiske binding af tRNA til TcdA. Prøver blev kørt på en 2% w / v agarosegel ved 4 ° C i 90 minutter. En fast mængde tRNA (UUU), 7,5 μM blev blandet med variable mængder af TcdA (se tabel 1 ), og protein-tRNA-komplekser blev separeret under elektroforese-løbet. Gelen blev farvet og visualiseret på en UV-transilluminator. Hver bane indeholder 5 μL prøve. M, molekylær stige. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protein-tRNA agarosegelretarderingsassayet beskrevet heri kan modificeres på en række måder. For det første kan procentdelen af agarose i gelen reduceres for at muliggøre adskillelse og visualisering af protein-tRNA-komplekser signifikant større end den her analyserede (120 kDa). For det andet, hvis målproteinet er termolabilt, skal der træffes ekstra forholdsregler for at sikre, at temperaturen holdes under den maksimale acceptable temperatur ved at flytte elektroforeseapparatet til et forkølelokale eller ved at anvende ispakninger inde i elektroforesekammeret for øjeblikkeligt at sprede den producerede varme Under løbetidet. Andre buffersammensætninger ( f.eks . 0,5X TB, trisborat) og løbeparametre (> 20 V / cm) kan modificeres for at forkorte driftstiden, hvis det er nødvendigt eller acceptabelt for prøverne 11 . Den foreslåede koncentration af MgCl2 kan reduceres, hvis RNA-nedbrydning observeres under prøveforberedelsestrinnet, da divalent catiOns kan potentielt katalysere spaltningen af nukleinsyrer.
Hovedbegrænsningen af teknikken er, at protein-tRNA-båndene typisk er lidt mere diffuse end dem, der ses i acrylamidbaserede gelretarderingsmetoder, som har tendens til at være skarpere og klarere. En anden begrænsning er, at bredere, længere geler kan være nødvendige til samtidig analyse af flere prøver, og hvis protein-tRNA-komplekser af forskellig størrelse og ladning skal løses.
I sammenligning med eksisterende metoder giver protein-tRNA agarosegel-retardationsassayet en signifikant reduktion i arbejdskraft og tid fra prøvepræparation til analyse. Acrylamidgeler, indeholder skadelige kemikalier, er besværlige at forberede og tage længere tid at polymerisere. I modsætning hertil er agarosegeler enkle, hurtige til at kaste og sætte og involverer ikke giftige kemikalier. Forsøget kan afsluttes om 2 timer. Dette inkluderer 30 minutter for gelen at indstille, 15 min til prøvepræparation (som kan væreGjort under afkøling af agarosen), 90 minutter til elektroforese og visualisering.
Fremtidige anvendelser af fremgangsmåden kan forfine detekteringsmetoderne anvendt i denne protokol og anvende den til påvisning af mindre rigelige, mere ustabile RNA-arter eller til proteinkomplekser, som kun kan udtrykkes i meget små mængder. Etikettering af RNA eller proteinkomponenten med yderst følsomme fluoroforer ville muliggøre detektion af mindre mængder protein-RNA-komplekser. Desuden kunne anvendelse af fluorophorer med ikke-overlappende emission / exciteringstoppe muliggøre multiplexeringsforsøg, hvor forskellige protein- og / eller RNA-arter kunne visualiseres samtidigt i et enkelt forsøg.
Der er tre kritiske trin i denne protokol. Det første og mest oplagte kritiske trin er udtrykket og oprensningen af tRNA (UUU). Hvis mængden af oprenset tRNA (UUU) er under en vis mindste detektionsgrænse (mellem 25-200 ng tRNA pr. Bånd) Eller nedbrydningsbånd bliver tydelige som forureninger med lav molekylær størrelse, tRNAet skal kasseres og genrenses. Ved anvendelse af sur phenol (pH 4,3) under tRNA-ekstraktion er det essentielt, da det selektivt præcipiterer DNA, samtidig med at RNA opløses. Det andet kritiske trin vedrører fremstillingen af protein-tRNA-prøverne til analyse. Tilstrækkelige mængder protein og tRNA skal anvendes til at muliggøre den robuste detektion af alle dannede komplekser. Protein-tRNA-molforholdene skal indstilles til at forskyde ligevægten mod kompleks dannelse. Det tredje kritiske trin er elektroforese. TBE-bufferen skal anvendes frisk (ikke genanvendt), og det er nødvendigt at holde agarosegelene ved temperaturer, hvor protein-tRNA-komplekserne er stabile og ikke denaturerer (typisk 4-10 ° C). Der skal udvises forsigtighed for at holde agarosegelen kold under hele elektroforeseen, for eksempel ved at omdanne elektroforesekammeret med is og, når det er muligt, køre eksperimentetT i et koldt rum ved 4 ° C.
Vi har demonstreret en retfærdig metode til analyse, karakterisering af protein-tRNA-komplekser ved anvendelse af TcdA-tRNA (UUU) som et modelsystem og anvendelse af agarosegelelektroforese i stedet for acrylamidelektroforese. Sidstnævnte tager længere tid at fuldføre og er betydeligt mere arbejdskrævende. Ved anvendelse af denne metode kan den elektroforetiske adskillelse på 2% vægt / v agarose geler (8 cm gelformater) udføres på mindre end 90 min. Dette er et bekvemt værktøj til analyse af protein-tRNA-interaktioner og muliggør samtidig analyse af flere prøver. Varianter af tRNA og / eller proteinmutanter kan screenes for binding og stabilitet under anvendelse af denne fremgangsmåde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
MCV er medlem af CIB Intramural Program "Molecular Machines for Better Life" (MACBET). Den forskning, der fører til disse resultater, har modtaget finansiering fra det spanske institut Salud Carlos III (PI12 / 01667 til MCV), Spaniens ministerium for økonomi og konkurrenceindivid (CTQ2015-66206-C2-2-R og SAF2015-72961-EXP til MCV ), Den regionale regering i Madrid (S2010 / BD-2316 til MCV) og Europa-Kommissionen (rammeprogram 7 (RP7)) projektet ComplexINC (Kontrakt nr. 279039 til MCV). Fundersne havde ingen rolle i studiedesign, dataindsamling og analyse, beslutning om at offentliggøre eller udarbejde manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| E. coli BL21(DE3) | Novagen | 70235 | DE3 lysogen contains T7 polymerase upon IPTG induction. |
| pET23d | Novagen | 69748-3 | pET23d confers resistance to ampicillin; T7 promoter. |
| LB Broth, Low Salt (Lennox L Broth), Granulated | Melford | GL1703 | Conventional LB Broth, High Salt, can also be used. |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | 10419313 | |
| Incubator Shaker (Thermostated) | NBS | Excella E24 | Any shaker incubator with temperature control can be used. |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG), >=99% | Acros Organics | BP1755 | |
| Sodium acetate, anhydrous, >99% | Melford | B4017 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), Disodium salt, >99% | Acros Organics | AC327205000 | Harmful if inhaled. |
| Centrifuge (refrigerated) | Eppendorf | 5430 | |
| Centrifuge (refrigerated) rotor | Eppendorf | 5430/5430P | |
| Centrifuge | Sorvall | RC5C | |
| Centrifuge rotor | Sorvall | SLA-3000 | |
| Phenol solution, Saturated with 0.1 M citrate buffer, pH 4.3 ± 0.2 | Sigma-Aldrich | P4682 | Acute toxicity (oral, dermal, inhalation), corrosive |
| Ethanol absolute for analysis, 100% v/v | Merck Millipore | 100983 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate, Na2HPO4, >=99% | Sigma-Aldrich | 71643 | |
| Potassium dihydrogen phosphate, KH2PO4 | Merck | 48,730,250 | |
| HiLoad 16/60 Superdex 75 | GE Healthcare | 28989333 | |
| Agarose | Melford | MB1200 | |
| Tris [Tris(hydroxymethyl) aminomethane HCl] | Melford | T1513 | |
| Boric Acid | Melford | B0503 | |
| Microwave | Haier | HDA-2070M | |
| TCEP [Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride] | Sigma-Aldrich | C4706 | Corrosive to metals and skin. |
| ATP [Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate], Grade I, >=99% | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| Magnesium chloride (MgCl2), anhydrous, >=98% | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Sodium chloride (NaCl), >99% | Fisher Bioreagents | BP358 | |
| Potassium chloride (KCl), >99% | Melford | P0515 | |
| NZYDNA Ladder VI | NZYtech | MB8901 | |
| Power supply | Consort | EV261 | |
| Electrophoresis unit | Real Laboratory | RELSMINI10 | |
| Real Safe nucleic acid staining | Real Laboratory | RBMSAFE | 20,000X stock |
| UV Transilluminator (G:Box/EF) | Syngene | 2216498 | |
| Coomassie Brilliant Blue G | Sigma-Aldrich | B0770 | |
| Rocker (Gyro-Rocker) | Stuart | SSL3 | |
| Mixer Vortex | Fisher brand | 13214789 |
References
- Scott, V., Clark, A. R., Docherty, K.
- López-Estepa, M., et al. The crystal structure and small-angle X-ray analysis of CsdL/TcdA reveal a new tRNA binding motif in the MoeB/E1 superfamily. Plos One. 10 (4), e0118606 (2015).
- Miyauchi, K., Kimura, S., Suzuki, T. A cyclic form of N6-threonylcarbamoyladenosine as a widely distributed tRNA hypermodification. Nat Chem Biol. 9 (2), 105-111 (2013).
- Bolstad, H. M., Botelho, D. J., Wood, M. J. Proteomic analysis of protein-protein interactions within the Cysteine Sulfinate Desulfinase Fe-S cluster biogenesis system. J Proteome Res. 9 (10), 5358-5369 (2010).
- Loiseau, L., Ollagnier-de Choudens, S., Lascoux, D., Forest, E., Fontecave, M., Barras, F. Analysis of the heteromeric CsdA-CsdE cysteine desulfurase, assisting Fe-S cluster biogenesis in Escherichia coli. J Biol Chem. 280 (29), 26760-26769 (2005).
- Fried, M. G., Crothers, D. M. Equilibrium studies of the cyclic AMP receptor protein-DNA interaction. J Mol Biol. 172 (3), 241-262 (1984).
- Garner, M. M., Revzin, A. A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system. Nucleic Acids Res. 9 (13), 3047-3060 (1981).
- Rio, D. C. Electrophoretic mobility shift assays for RNA-protein complexes. Cold Spring Harb Protoc. 2014 (4), 435-440 (2014).
- Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift. Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).
- Yakhnin, A. V., Yakhnin, H., Babitzke, P. Gel mobility shift assays to detect protein-RNA interactions. Methods Mol Biol. 905, 201-211 (2012).
- Ream, J. A., Lewis, L. K., Lewis, K. A. Rapid agarose gel electrophoretic mobility shift assay for quantitating protein: RNA interactions. Anal Biochem. 511, 36-41 (2016).
- Hagel, L.
