Summary
Viene presentato un protocollo per la produzione di tRNA (UUU) e l'analisi di tRNA (UUU) in complesso con l'enzima TcdA mediante saggi di retardazione del gel agarosio.
Abstract
Esistono metodi per l'espressione e la purificazione di tRNA (UUU) in Escherichia coli e l'analisi mediante test di ritardo di gel del legame di tRNA (UUU) a TcdA, una N 6 -reonilcarbamoyladenosina (t 6 A) deidratasi che ciclizza il treonilcarbamoil La catena laterale attaccata ad A37 nel loop di gambo anticodon (ASL) di tRNA a ciclica t 6 A (ct 6 A). La transcrizione del gene sintetico che codifica il tRNA (UUU) è indotta in E. coli con 1 mM isopropil β-D-1-tiogalattopiranoside (IPTG) e le cellule contenenti tRNA vengono raccolte 24 h postinduzione. La frazione RNA viene purificata usando il metodo di estrazione di fenolo acido. Il tRNA puro viene ottenuto mediante una cromatografia di filtrazione a gel che effettua la separazione efficiente delle molecole di tRNA di piccole dimensioni dai più grandi acidi nucleici intatti o frammentati. Per analizzare il legame TcdA a tRNA (UUU), TcdA viene mescolato con tRNA (UUU) e separato su un gel agarosico nativo a 4 ° C.Il tRNA libero (UUU) migra più velocemente, mentre i complessi TcdA-tRNA (UUU) subiscono un ritardo di mobilità che può essere osservato durante la colorazione del gel. Abbiamo dimostrato che TcdA è un enzima tRNA (UUU) -binding. Questo test di ritardo di gel può essere utilizzato per studiare mutanti TcdA e gli effetti degli additivi e di altre proteine sul legame.
Introduction
Il saggio di ritardo di gel 1 (noto anche come test di spostamento di mobilità elettroforetica, EMSA) è un metodo elettroforetico progettato per studiare e caratterizzare le interazioni proteiche-acido nucleico. Permette di analizzare le proteine-DNA e le interazioni proteine-RNA e in particolare le interazioni tra tRNA e proteine leganti tRNA, utilizzando componenti purificati o miscele complesse di proteine ( ad es. , Lisati cellulari) o acidi nucleici ( ad esempio tRNA piscine). Abbiamo applicato saggi di retardazione del gel allo studio dell'interazione tra tRNA purificato (UUU) e TcdA, una N 6 -reonilcarbamoyladenosina (t 6 A) deidratasi, che ciclizza la catena laterale di treonilcarbamoil attaccata ad A37 nel ciclo anticodonale (ASL) Di tRNA a ciclica t 6 (ct 6 A) 2 , 3 . TcdA è anche conosciuto come CsdL 3 ,F "> 4. Il gene tcdA / csdL forma un cluster con i geni 5 e 5 che codificano la cisteina desulfurasi e l'acquirente dello zolfo del sistema cisina sulfinasi desulfinato (CSD) ed è richiesto per sostenere la funzione TcdA in vivo 3 .
La ragione dietro i test di retardazione del gel è che, mentre le molecole di acido nucleico libere migrano rapidamente alla parte anteriore di acrilammide o gel agarosio in virtù della loro grande carica negativa, la mobilità elettroforetica dei complessi proteici degli stessi acidi nucleici è drasticamente ridotta. La riduzione della mobilità è visualizzata come un "spostamento" nei complessi proteici dell'acido nucleico, che risolvono come bande discrete. Il complesso proteico acido nucleico caricato e maggiormente mostrato mostra un maggiore spostamento o riduzione della mobilità su un gel.
Poiché la neutralizzazione del carico del complesso è un fenomeno universalePer i complessi di acido nucleico proteico, il saggio di retardazione del gel può essere applicato ad una vasta gamma di complessi e tipi di acido nucleico. Il metodo è semplice, poco costoso e può essere condotto in laboratori con attrezzature minime. Richiede solo piccole quantità di proteine e tRNA. Questo è un vantaggio rispetto alle tecniche biofisiche alternative, che di solito consumano grandi quantità di campioni.
Il saggio di retardazione del gel è stato ampiamente usato per lo studio dei fattori di trascrizione. Il saggio è stato utilizzato per analizzare la cinetica legante, la forza e la specificità dei fattori di trascrizione per molte sequenze di DNA diverse. Fu proprio in questo campo che l'EMSA fu per la prima volta sviluppata 6 , 7 . I test di ritardo di gel con RNA 8 , 9 , 10 , 11 e molecole di tRNA sono stati utilizzati anche nella ricerca di ribosomiE di analizzare, come facciamo qui, gli enzimi che modificano i nucleosidi del tRNA post-trascrizionale.
Molti parametri diversi influenzano il risultato di un test di ritardo di gel come la temperatura, la qualità della proteina e il campione tRNA e la forza del legame. La pianificazione e l'esecuzione attenta dell'esperimento è fondamentale per l'interpretazione dei risultati delle specie libere di acido nucleico e proteine. Qui abbiamo usato il tRNA (UUU) codificante gene sintetico clonato in un vettore di espressione il cui promotore manca del sito di legame dei ribosomi Shine-Dalgarno, portando alla sintesi di grandi quantità del tRNA 2 . Questo protocollo dettagliato è inteso a fornire una guida chiara per eseguire esperimenti di ritardo del tRNA gel evitando errori comuni.
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Protocol
Attenzione: Prima dell'uso consultare tutte le schede tecniche di sicurezza relative ai materiali (MSDS). Molte delle sostanze chimiche utilizzate in questo protocollo sono tossiche e corrosive. Utilizzare pratiche appropriate quando si esegue l'estrazione di tRNA utilizzando fenolo, incluso l'uso di un cappuccio e delle attrezzature di protezione individuale (occhiali di sicurezza, guanti, cappotto di laboratorio, pantaloni lunghi, scarpe chiuse, ecc .). Questo protocollo utilizza una macchia acida nucleica non tossica. L'uso di macchie alternative può richiedere ulteriori precauzioni e smaltimento specializzato del colorante se tossico e / o cancerogeno ( es . Bromuro di etidio).
1. Preparazione del gel agarosico
- Pesare 2 g di agarosio e aggiungerlo ad una bottiglia di vetro per preparare un gel agarosico al 2% in peso.
- Aggiungere 100 ml di tampone di tris-borato-etilendiammetraacetico (EDTA) (TBE) alla bottiglia contenente agarosio. Sciogliere per riscaldamento in un forno a microonde. A intervalli di 30 secondi, ruotare il contenuto da mescolareBene e ripetere questa fase fino a quando l'agarosio è completamente sciolto. Lasciare raffreddare la soluzione agarosa a circa 50-60 ° C.
- Nastri i bordi aperti di un vassoio di gel per creare uno stampo, posizionare un pettine appropriato per creare i pozzetti e lanciare l'agarosio fuso in esso. Evitare la formazione di bolle e lasciarlo solidificare a temperatura ambiente.
- Una volta solidificato, posizionare il vassoio gel in un'unità di elettroforesi e riempirlo con tampone TBE fino a quando il gel è completamente coperto.
2. Preparazione del tRNA
- Express tRNA (UUU) in E. coli
- In mattinata, utilizzare un flacone di E. coli BL21 congelato (DE3) trasformato con il vettore di espressione pET23d-EcUUU 2 (porti il gene che codifica E. coli tRNA (UUU)) per strisciare un Luria Broth (LB) Piastra integrata con 100 μg / mL di ampicillina. Invertire la piastra e posizionarla in un incubatore a 37 ° C fino a quando le colonie non appaiono (tardi afternoon).
- Inoculare una ben coltivata singola colonia in 5 mL di LB e 100 μg / mL di ampicillina e si sviluppa per una notte a 220 giri / min a 37 ° C.
- La mattina successiva, le cellule (6,500 xg per 10 minuti a 4 ° C), sostituire il mezzo con 5 ml di LB fresco e 100 μg / mL di ampicillina e risospendere. Utilizzare questa sospensione per inoculare 200 mL LB più 100 μg / mL ampicillina. Crescere per 5 ore a 220 giri / min a 37 ° C.
- Quando la densità ottica della coltura a 590 nm (OD 590 ) ha raggiunto 0,6 - 0,8, aggiungere 1 mM IPTG alla coltura per innescare l'espressione del gene tRNA (UUU). Incubare a 37 ° C per 3 ore.
- Raccogliere le cellule centrifugando la coltura a 6.500 xg per 10 minuti a 4 ° C.
- Lisi e estrazione
- Resuspendere il pellet cellulare in 5 ml di tampone di lisi (0,3 M acetato di sodio, 10 mM EDTA). Da questo punto in poi, utilizzavano buffers autoclavati e mantenete tutti i campioni contenenti tRNA a 4 ° C per evitare tRNA degradazione.
- Aggiungere 1 volume di fenolo acido (pH 4,3) al pellet di cellule risospese nel cofano. Mescolare per 1 min per inversione per lire le cellule e centrifugare a 10.000 xg (10 min, 4 ° C).
- Raccogliere la fase acquosa superiore contenente il tRNA solubile (UUU) (e minori concentrazioni degli altri pool di tRNA) usando una pipetta facendo attenzione a non aspirare la fase organica (inferiore). Scartare lo strato inferiore e il pellet, costituito dalla fase organica e dai detriti cellulari, in un contenitore adeguato.
- Precipitare il tRNA mescolando accuratamente la fase solubile (acquosa) con etanolo da 2,5 vol. Al 100% v / v per inversione per 1 h a 4 ° C. Centrifugare la miscela a 15.000 xg (30 min, 4 ° C).
- Decanta il supernatante con attenzione e riposiziona il pellet ricco di tRNA in tampone di filtrazione gel da 4 mL (20 mM fosfato di sodio o fosfato di potassio, pH 7,4, 0,1 mM EDTA). Eseguire 5 μL del pool tRNA risospeso in un agarosio di 2% in peso.
NOTA:Il tRNA di buona qualità appare come una singola banda (dimensione molecolare tra 50-100 bp).
- Purificazione di tRNA (UUU)
- Seguendo la pratica cromatografica standard 12 , caricare il tRNA (UUU) resuspendito su una colonna di filtrazione gel ad alta risoluzione (dimensioni: 16 x 600 mm, volume letto: 120 mL, intervallo di risoluzione: 1.000-70.000 Da) precedentemente equilibrato nel tampone di filtrazione gel (fase mobile). Impostare la portata a 1 mL / min per eluire i campioni.
NOTA: Il picco di tRNA (UUU) eluisce approssimativamente a 75,5 ml. In genere, si può ottenere una resa di 0,5-1,0 mg / l tRNA di coltura. - Analizzare i campioni nei volumi rappresentativi di eluizione mediante elettroforesi di 5-10 μL di ciascun campione su un agarosio 2% in peso di agarosio.
- Seguendo la pratica cromatografica standard 12 , caricare il tRNA (UUU) resuspendito su una colonna di filtrazione gel ad alta risoluzione (dimensioni: 16 x 600 mm, volume letto: 120 mL, intervallo di risoluzione: 1.000-70.000 Da) precedentemente equilibrato nel tampone di filtrazione gel (fase mobile). Impostare la portata a 1 mL / min per eluire i campioni.
3. Preparazione del campione
- Esprimere e purificare TcdA secondo López-Estepa et al . 2 .
NOTA: Fino a 250 μMTcdA può essere utilizzato per lo studio. - Pipettare la corrispondente quantità di TcdA come indicato nella tabella 1 in tubi centrifugati di 1,5 ml etichettati correttamente. Aggiungere 1,6 mM di tris (2-carbossietil) fosfina (TCEP) (concentrazione finale) e mescolare delicatamente usando una pipetta. Chiudere il coperchio e incubare la miscela a temperatura ambiente per 5 min.
- Aggiungere 10 μM di trifosfato di adenosina (ATP) e 50 mM di MgCl2 (concentrazioni finali). Mescolare con una pipetta e incubare la miscela per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Aggiungere il tRNA purificato (UUU) (sezione 2.3) secondo la tabella 1 , mescolare con una pipetta e incubare a temperatura ambiente per 5 min.
- Aggiungere salina tampone fosfato (PBS) fino a 100 μL di volume finale. Mescolare correttamente e aggiungere glicerolo ad una concentrazione finale del 10% v / v.
- Vortice il campione e brevemente scomponi il contenuto del tubo (10.000 xg, 1 min, 4 ° C).
4. Sviluppo del gel e di elettroforesi
- Posizionare l'unità di elettroforesi in un vassoio pieno di ghiaccio tritato per mantenere la camera a 4 ° C durante l'esecuzione dell'elettroforesi.
- Attentamente, pipettare 5 μL di ogni campione nel pozzetto corrispondente. Aggiungere un indicatore appropriato del DNA.
- Inserire gli elettrodi negli appositi alloggiamenti dell'alimentatore. Accendere l'alimentatore e impostare la tensione su 100 V e far funzionare il gel per 90 minuti.
5. La colorazione del gel per osservare l'interazione tRNA-Protein
- Preparare la soluzione di colorazione mescolando 50 ml di TBE con 1x di una macchia adeguata del DNA. Evitare di esporre la soluzione di colorazione alla luce solare coprendo il contenitore di colorazione con foglio di alluminio.
NOTA: le macchie di DNA vengono normalmente memorizzate come scorte concentrate di 10.000 o 20.000x. - Dopo 90 minuti di elettroforesi, rimuovere accuratamente il gel dal vassoio e metterlo in un contenitore con una soluzione di colorazione. Posizionarlo su un bilanciere a bassa velocità di rotazione a temperatura ambienteUre per 30 min.
- Rimuovere il gel agarosio dal contenitore di colorazione, toccarlo con cura su un pezzo di tessuto di cellulosa o carta filtrante per rimuovere il liquido in eccesso e collocarlo direttamente su un transilluminatore. Accendere la luce UV per visualizzare le bande contenenti tRNA. Prendi una fotografia del gel.
- Colorazione delle proteine (opzionale).
- Eliminare in modo sicuro la soluzione di colorazione del DNA (secondo procedure di sicurezza) e sostituirla con 50 ml di soluzione Coomassie Brilliant Blue (CBB). Posizionare il vassoio su un bilanciere a temperatura ambiente e macchiare durante la notte (> 12 h). Eliminare la soluzione di colorazione CBB e sostituirla con 50 mL di PBS per rimuovere la tintura in eccesso. Destain per 1 ora su un rocker.
- Visualizzare i complessi tRNA contenenti proteine sotto un transilluminatore di luce e fotografare il gel da confrontare con l'immagine del gel tRNA UV.
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Representative Results
Grandi quantità di tRNA (UUU) possono essere ottenute esprimendo il gene tRNA in E. coli sotto il controllo di un forte promotore T7 inducibile. L'espresso tRNA (UUU) si accumula nel citoplasma e si arricchisce sulla piscina di tRNA naturali abbondanti. Un procedimento di purificazione a due fasi costituito da una fase di cattura / estrazione e una fase di filtrazione / lucidatura gel è stata utilizzata per ottenere il tRNA di grado EMSA. La fase di cattura / estrazione utilizza il fenolo di pH 4,3 per ottenere la precipitazione simultanea di proteine, detriti cellulari, DNA e l'estrazione di tRNA (e di altre molecole RNA). A questo punto, la quantità di totale tRNA pool può essere valutata mediante elettroforesi su un gel agarosico del 2% w / v. Il secondo passo comprende la cromatografia di filtrazione a gel che separa le specie di RNA in base alla loro dimensione molecolare. La traccia UV a 254 nm viene utilizzata per monitorare la separazione e identificare i principali picchi di eluizione ( Figura 1In alto). Le aliquote rappresentative delle frazioni di picco sono state eseguite su un gel agarosico al 2% in peso per analisi ( figura 1 in basso ). La maggior parte delle molecole di tRNA co-eluiscono in un singolo picco (medio) della cromatografia (qui, 75,5 mL in una colonna di letto di 120 mL). Quando si separano le piscine contenenti una singola specie sovraespressa, come il tRNA (UUU), più del 90% delle molecole tRNA in piscina appartengono a quel tRNA specifico, mentre le restanti molecole corrispondono ai tRNA naturali abbondanti. Le cime secondarie sono osservate sia prima che dopo il picco centrale del tRNA. Il picco / i che contengono prima molecole RNA parzialmente degradate (frazioni 26 e 32, barre in figura 1 ) e il picco (i) alla fine della fase di purificazione contengono RNA molto piccoli e contaminanti (frazioni 45 e 51; Bar in figura 1 ). Dopo aver poolato le frazioni sotto il picco centrale (frazioni 39-43; Bar in Figura 1 ), la quantità di tRNA purificata può essere quantificata mediante spettroscopia a raggi UV e / o confrontando con le norme di dimensione molecolare su un gel agarosico del 2% w / v.
I campioni TcdA e tRNA (UUU) possono essere mescolati a diversi rapporti molari da 1,0 a 10,0 utilizzando un schema semi-logaritmico di campionamento ( tabella 1 ) e separato su 2% in peso di gel agarosio ( Figura 2 ). A seconda della stabilità dei complessi proteina-tRNA e della stechiometria del legame, una o più bande possono essere visualizzate sul gel. Per TcdA-tRNA (UUU), si forma un complesso stechiometrico che funziona come una banda isolata contenente sia proteine che tRNA. Tipicamente, il tRNA libero migra più velocemente e può essere osservato nella parte inferiore del gel, mentre i complessi proteina-tRNA, che sono meno caricati negativamente e sono di dimensioni maggiori, tendono a migrare più lentamente. La Figura 2 mostra un rappresentativo Attivo al 2% in peso di agarosio di complessi TcdA-tRNA (UUU). Nella figura 2 , le bande solo TcdA e solo tRNA servono come controlli negativi. Mentre il rapporto molare TcdA: tRNA (UUU) aumenta, aumenta la quantità di complessi TcdA-tRNA (UUU) formati a scapito della banda libera di tRNA. Si noti che l'intensità del tRNA libero diminuisce in quanto aumenta la quantità di TcdA. Il primo complesso da formare è un complesso stochiometrico 2: 1 contenente una molecola tRNA per dimensione TcdA (visibile nelle corsie con 10, 20 o 30 μM TcdA). Alla saturazione di TcdA si sviluppa un complesso TcdA-tRNA (UUU) di peso molecolare più grande che contiene un complesso stoichiometrico 2: 2, dove entrambe le subunità TcdA sono associate a una molecola tRNA (UUU) ciascuna (visibile in corsie a 30, 50 o 75 μM). Le due ultime corsie con TcdA (50 o 75 μM) hanno legato tutto il tRNA nella reazione e mancano di una banda libera di tRNA.
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Figura 1: Purificazione di tRNA (UUU) mediante filtrazione a gel. Cromatogramma (superiore) della filtrazione a gel di tRNA (UUU) su una colonna di filtrazione preparativa gel ad alta risoluzione registrata a 254 nm. Il picco più alto, contenente la tRNA pool arricchita in tRNA (UUU) viene eluita a ~ 75,5 mL. Un gel al 2% in peso di agarosio (in basso) è stato eseguito con aliquote delle varie frazioni di eluizione tRNA. M, scala di dimensioni molecolari. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Saggio di retardazione del gel con TcdA e tRNA (UUU). EMSA fornisce prove per il legame fisico di tRNA a TcdA. I campioni sono stati eseguiti su un agarosio al 2% in peso di vivo a 4 ° C per 90 minuti. Una quantità fissa di tRNA (UUU), 7,5 μM, è stato miscelato con quantità variabili di TcdA (vedi tabella 1 ) e complessi proteina-tRNA sono stati separati durante l'esecuzione dell'elettroforesi. Il gel è stato macchiato e visualizzato su un transilluminatore UV. Ogni corsia contiene 5 μl di campione. M, scala di dimensioni molecolari. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il saggio di retardazione del gel agarosico di proteina-tRNA descritto qui può essere modificato in diversi modi. In primo luogo, la percentuale di agarosio nel gel può essere ridotta per consentire la separazione e la visualizzazione di complessi proteina-tRNA significativamente più grandi di quelli analizzati qui (120 kDa). In secondo luogo, se la proteina bersaglio è termolabile, occorre prendere ulteriori precauzioni per garantire che la temperatura sia mantenuta al di sotto della massima temperatura accettabile spostando l'apparecchio elettroforetico in una camera fredda o utilizzando pacchetti di ghiaccio all'interno della camera elettroforesi per dissipare immediatamente il calore prodotto Durante la corsa. Possono essere modificate altre composizioni tampone ( es . 0.5X TB, tris-borato) e parametri di funzionamento (> 20 V / cm) per abbreviare il tempo di esecuzione se necessario o accettabile per i campioni 11 . La concentrazione di MgCl2 suggerita può essere ridotta se il degrado del RNA è osservato durante la fase di preparazione del campione, dal momento che il cali divalenteOns può potenzialmente catalizzare la scissione degli acidi nucleici.
La principale limitazione della tecnica è che le bande di proteina-tRNA sono tipicamente leggermente più diffuse di quelle osservate nei metodi di ritardo di gel a base di acrilamide, che tendono ad essere più nitidi e più chiari. Un'altra limitazione è che i gel più lunghi e più lunghi possono essere necessari per l'analisi simultanea di campioni multipli e se i complessi proteina-tRNA di varie dimensioni e carica devono essere risolti.
Rispetto ai metodi esistenti, il test di retardazione del gel agarosico proteina-tRNA offre una significativa riduzione del lavoro e del tempo dal preparato del campione all'analisi. I gel di acrilamide, contengono sostanze chimiche nocive, sono fatali per prepararsi e richiedere più tempo per polimerizzare. Al contrario, i gel di agarosio sono semplici, veloci da lanciare e impostare, e non implicano sostanze chimiche tossiche. L'esperimento può essere completato in 2 ore. Questo include 30 minuti per il gel da impostare, 15 minuti per la preparazione del campione (che può essereFatto mentre si raffredda l'agarosio), 90 minuti per l'elettroforesi e la visualizzazione.
Le applicazioni future del metodo possono perfezionare i metodi di rilevazione utilizzati in questo protocollo e applicarli alla rilevazione di specie RNA meno abbondanti, più instabili, oa complessi proteici che possono essere espressi solo in piccole quantità. Etichettare l'RNA o la componente proteica con fluorofori altamente sensibili consentirebbe di individuare piccole quantità di complessi proteina-RNA. Inoltre, utilizzando fluorofori con picchi di emissione / eccitazione non sovrapponibili potrebbero consentire esperimenti di multiplexing dove diverse specie di proteine e / o RNA potrebbero essere visualizzate contemporaneamente in un singolo esperimento.
Ci sono tre passaggi critici in questo protocollo. Il primo e più ovvio passo critico è l'espressione e la purificazione del tRNA (UUU). Se la quantità di tRNA purificato (UUU) è inferiore a un determinato limite minimo di rilevazione (tra 25-200 ng tRNA per banda) O le bande di degradazione diventano apparenti come contaminanti di dimensione molecolare inferiore, il tRNA deve essere scartato e riproposto. L'utilizzo di acido fenolo (pH 4.3) durante l'estrazione del tRNA è essenziale poiché precipita selettivamente il DNA pur mantenendo solubile l'RNA. La seconda fase critica riguarda la preparazione dei campioni proteina-tRNA per l'analisi. Devono essere utilizzate quantità sufficienti di proteine e tRNA per consentire la rilevazione robusta di tutti i complessi formati. I rapporti molari proteina-tRNA devono essere regolati per spostare l'equilibrio verso la formazione complessa. Il terzo passo critico è l'elettroforesi. Il tampone TBE deve essere utilizzato fresco (non riutilizzato) e è necessario mantenere i gel agarosici a temperature in cui i complessi proteina-tRNA sono stabili e non denaturano (tipicamente 4-10 ° C). È necessario esercitare la cura per mantenere freddo il gel agarosico durante l'intera elettroforesi, ad esempio circondando la camera di elettroforesi con ghiaccio e, quando possibile, eseguendo l'esperimentoT in una stanza fredda a 4 ° C.
Abbiamo dimostrato un metodo diretto per analizzare e caratterizzare i complessi protein-tRNA usando TcdA-tRNA (UUU) come sistema di modello e utilizzando elettroforesi a base di agarosio invece di elettroforesi di acrilammide. Quest'ultimo richiede più tempo per completare ed è considerevolmente più laborioso. Utilizzando questo metodo, la separazione elettroforetica su 2% in peso di gel agarosio (formati di gel da 8 cm) può essere effettuata in meno di 90 minuti. Questo è un utile strumento per l'analisi delle interazioni proteina-tRNA e permette l'analisi simultanea di campioni multipli. Varianti di mutanti tRNA e / o proteine possono essere sottoposti a screening per legame e stabilità usando questo metodo.
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Disclosures
Gli autori non hanno niente da rivelare.
Acknowledgments
MCV è membro del programma CIB Intramural "Macchine Molecolari per una migliore vita" (MACBET). La ricerca che ha portato a questi risultati è stato finanziato dall'ente spagnolo Instituto de Salud Carlos III (PI12 / 01667 a MCV), dal ministero spagnolo de Economía y Competitividad (CTQ2015-66206-C2-2-R e SAF2015-72961-EXP alla MCV ), Il governo regionale di Madrid (S2010 / BD-2316 a MCV) e la Commissione europea (Programma quadro 7 (FP7)) il progetto ComplexINC (contratto n. 279039 a MCV). I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta di dati e nell'analisi, nella decisione di pubblicare o nella preparazione del manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| E. coli BL21(DE3) | Novagen | 70235 | DE3 lysogen contains T7 polymerase upon IPTG induction. |
| pET23d | Novagen | 69748-3 | pET23d confers resistance to ampicillin; T7 promoter. |
| LB Broth, Low Salt (Lennox L Broth), Granulated | Melford | GL1703 | Conventional LB Broth, High Salt, can also be used. |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | 10419313 | |
| Incubator Shaker (Thermostated) | NBS | Excella E24 | Any shaker incubator with temperature control can be used. |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG), >=99% | Acros Organics | BP1755 | |
| Sodium acetate, anhydrous, >99% | Melford | B4017 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), Disodium salt, >99% | Acros Organics | AC327205000 | Harmful if inhaled. |
| Centrifuge (refrigerated) | Eppendorf | 5430 | |
| Centrifuge (refrigerated) rotor | Eppendorf | 5430/5430P | |
| Centrifuge | Sorvall | RC5C | |
| Centrifuge rotor | Sorvall | SLA-3000 | |
| Phenol solution, Saturated with 0.1 M citrate buffer, pH 4.3 ± 0.2 | Sigma-Aldrich | P4682 | Acute toxicity (oral, dermal, inhalation), corrosive |
| Ethanol absolute for analysis, 100% v/v | Merck Millipore | 100983 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate, Na2HPO4, >=99% | Sigma-Aldrich | 71643 | |
| Potassium dihydrogen phosphate, KH2PO4 | Merck | 48,730,250 | |
| HiLoad 16/60 Superdex 75 | GE Healthcare | 28989333 | |
| Agarose | Melford | MB1200 | |
| Tris [Tris(hydroxymethyl) aminomethane HCl] | Melford | T1513 | |
| Boric Acid | Melford | B0503 | |
| Microwave | Haier | HDA-2070M | |
| TCEP [Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride] | Sigma-Aldrich | C4706 | Corrosive to metals and skin. |
| ATP [Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate], Grade I, >=99% | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| Magnesium chloride (MgCl2), anhydrous, >=98% | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Sodium chloride (NaCl), >99% | Fisher Bioreagents | BP358 | |
| Potassium chloride (KCl), >99% | Melford | P0515 | |
| NZYDNA Ladder VI | NZYtech | MB8901 | |
| Power supply | Consort | EV261 | |
| Electrophoresis unit | Real Laboratory | RELSMINI10 | |
| Real Safe nucleic acid staining | Real Laboratory | RBMSAFE | 20,000X stock |
| UV Transilluminator (G:Box/EF) | Syngene | 2216498 | |
| Coomassie Brilliant Blue G | Sigma-Aldrich | B0770 | |
| Rocker (Gyro-Rocker) | Stuart | SSL3 | |
| Mixer Vortex | Fisher brand | 13214789 |
References
- Scott, V., Clark, A. R., Docherty, K.
- López-Estepa, M., et al. The crystal structure and small-angle X-ray analysis of CsdL/TcdA reveal a new tRNA binding motif in the MoeB/E1 superfamily. Plos One. 10 (4), e0118606 (2015).
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