Summary
介绍了通过琼脂糖凝胶阻滞测定技术生产tRNA（UUU）和tDNA（UUU）与酶TcdA复合物的分析方案。
Abstract
我们展示了在大肠杆菌中表达和纯化tRNA（UUU）的方法，并且通过凝胶阻滞测定法分析tRNA（UUU）与TcdA（ N 6 -苏氨酰氨基甲酰氨基腺苷（t6A）脱水酶）的结合的分析，其使苏氨酰氨基甲酰基侧链连接到tRNA的反密码子茎环（ASL）中的A37到循环t 6 A（ct 6 A）。在具有1mM异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）的大肠杆菌中诱导编码tRNA（UUU）的合成基因的转录，诱导后24小时收获含有tRNA的细胞。使用酸性酚提取法纯化RNA级分。通过凝胶过滤色谱法获得纯tRNA，其有效地将小尺寸tRNA分子与较大的完整或片段化的核酸分离。为了分析与tRNA（UUU）结合的TcdA，将TcdA与tRNA（UUU）混合，并在4℃下在天然琼脂糖凝胶上分离。游离tRNA（UUU）迁移更快，而TcdA-tRNA（UUU）复合物经历了在凝胶染色时可观察到的移动性延迟。我们证明TcdA是一种tRNA（UUU）结合酶。这种凝胶阻滞测定可用于研究TcdA突变体以及添加剂和其他蛋白质对结合的影响。
Introduction
凝胶阻滞测定1 （也称为电泳迁移率变动测定，EMSA）是设计用于研究和表征蛋白质 - 核酸相互作用的电泳方法。它允许使用纯化的组分或蛋白质（ 例如细胞裂解物）或核酸的复杂混合物（ 例如 ，tRNA）来分析蛋白质-DNA以及蛋白质 - RNA相互作用，特别是tRNA和tRNA结合蛋白质之间的相互作用池）。我们已经将凝胶阻滞测定法应用于纯化的tRNA（UUU）和TcdA（N6-磺酰基氨基甲酰基腺苷（t6A）脱水酶）之间相互作用的研究，该脱水酶使连接于A30的苏木糖氨基甲酰侧链在反密码子茎环（ASL）中环化，的tRNA到循环t 6 （ct 6 A） 2,3 。 TcdA也被称为CsdL 3 ，tcdA / csdL基因与csdA和csdE基因5形成簇，其编码半胱氨酸脱硫酶和半胱氨酸亚硫酸盐脱硫酸盐（CSD）系统的硫受体，并需要在体内维持TcdA功能3 。
凝胶阻滞测定的基本原理是，尽管游离核酸分子由于其大的负电荷而快速迁移到丙烯酰胺或琼脂糖凝胶的前部，但是相同核酸的蛋白质复合物的电泳迁移率显着降低。迁移率的降低可视化为核酸 - 蛋白质复合物中的“转移”，其作为离散条带解决。带正电荷的和较大的核酸 - 蛋白质复合物在凝胶上显示出更大的移动或降低迁移率。
由于复合体的电荷中和是普遍现象对于蛋白质 - 核酸复合物，凝胶阻滞测定可以应用于广泛的复合物和核酸类型。该方法简单，价格便宜，可在实验室内以最少的设备进行。它只需要少量的蛋白质和tRNA。这比替代生物物理技术有一个优势，通常消耗较大量的样品。
凝胶阻滞测定已广泛用于转录因子的研究。该测定已被用于分析许多不同DNA序列的转录因子的结合动力学，强度和特异性。 EMSA在这个领域确实是第一次开发6,7 。 RNA 8,9,10,11和tRNA分子的凝胶阻滞测定也用于核糖体研究并且像我们这里所说的那样分析在转录后修饰tRNA核苷的酶。
许多不同的参数影响凝胶阻滞测定的结果，例如温度，蛋白质和tRNA样品的质量以及结合强度。仔细规划和执行实验对于释放游离核酸和蛋白质结合物种的结果至关重要。在这里，我们使用编码tRNA（UUU）的合成基因克隆到启动子缺乏Shine-Dalgarno核糖体结合位点的表达载体中，导致大量tRNA2的合成。该详细方案旨在提供执行tRNA凝胶阻滞实验的明确指导，同时避免常见错误。
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Protocol
注意：使用前请咨询所有相关的材料安全数据表（MSDS）。本协议中使用的几种化学物质是有毒和腐蚀性的。使用苯酚进行tRNA提取时，请使用适当的做法，包括使用通风橱和个人防护装备（安全眼镜，手套，实验室外套，全长裤，闭式脚趾鞋等 ）。该方案使用无毒的核酸染色。使用替代污渍可能需要额外的预防措施，并且如果有毒和/或致癌（ 例如溴化乙锭），则染色剂的专门处置。
琼脂糖凝胶的制备
- 称量2 g琼脂糖，并加入玻璃瓶中制备2％w / v琼脂糖凝胶。
- 向含琼脂糖的瓶子中加入100毫升1x三硼酸盐 - 乙二胺四乙酸（EDTA）（TBE）运行缓冲液。通过在微波炉中加热熔化。以30秒的间隔旋转内容物进行混合并重复此步骤，直到琼脂糖完全溶解。使琼脂糖溶液冷却至约50-60℃。
- 粘贴凝胶托盘的开口边缘以产生模具，放置适当的梳子以产生孔并将熔融的琼脂糖投入其中。避免气泡形成，使其在室温下固化。
- 一旦凝固，将凝胶托盘放在电泳单元中，并用TBE缓冲液填充，直到凝胶完全被覆盖。
2.制备tRNA
- 在大肠杆菌中表达 tRNA（UUU）
- 早晨，使用用表达载体pET23d-EcUUU2（含有编码大肠杆菌 tRNA（UUU）的基因）转化的冷冻大肠杆菌 BL21（DE3）小瓶，连续制备低盐Luria Broth（LB）板补充100μg/ mL氨苄青霉素。倒置板并将其置于37℃的培养箱中，直到菌落出现（晚期）OON）。
- 接种在5 mL LB加100μg/ mL氨苄青霉素中的一个良好生长的单个菌落，并在37℃下以220 rpm生长过夜。
- 第二天早上，细胞沉淀（6,500 xg，4℃）10分钟，用5 mL新鲜LB加100μg/ mL氨苄西林替代培养基，并重新悬浮。使用该悬浮液接种200 mL LB加100μg/ mL氨苄青霉素。在37℃下以220rpm生长5小时。
- 当590nm（OD 590 ）培养物的光密度达到0.6-0.8时，向培养物中加入1mM IPTG以触发tRNA（UUU）基因的表达。在37℃孵育3小时。
- 通过在4℃下以6,500×g离心培养10分钟来收获细胞。
- 裂解和提取
- 将细胞沉淀重悬于5mL裂解缓冲液（0.3M乙酸钠，10mM EDTA）中。从此以后，使用高压灭菌的缓冲液并将所有含tRNA的样品保持在4℃以防止tRNA降解。
- 将1体积的酸性苯酚（pH 4.3）加入通风橱中的悬浮细胞沉淀。通过倒置混合1分钟以裂解细胞并以10,000xg（10分钟，4℃）离心。
- 使用移液管收集含有可溶性tRNA（UUU）（和较小浓度的其他tRNA库）的上层水相，注意不要抽吸有机（底部）相。将底层和由有机相和细胞碎片组成的沉淀物丢弃到足够的容器中。
- 通过在4℃下倒置1小时，将可溶（水）相与2.5体积的100％v / v乙醇充分混合，沉淀出tRNA。以15,000 xg（30分钟，4℃）离心混合物。
- 仔细倾倒上清液，并将富含tRNA的沉淀重悬于4 mL凝胶过滤缓冲液（20 mM磷酸钠或磷酸钾，pH 7.4，0.1 mM EDTA）中。在2％w / v琼脂糖凝胶上运行5μL重悬浮的tRNA库。
注意：质量好的tRNA表现为单一条带（分子大小在50-100bp之间）。
- 纯化tRNA（UUU）
- 按照标准色谱实践12 ，将重悬浮的tRNA（UUU）加载到先前在凝胶过滤缓冲液中平衡的高分辨率制备型凝胶过滤柱（尺寸：16×600mm，床体积：120mL，分辨率范围：1,000-70,000Da） （流动相）。将流速设置为1 mL / min以洗脱样品。
注意：tRNA（UUU）峰的洗脱大约为75.5 mL。通常，可以获得培养物的0.5-1.0mg / L tRNA的产量。 - 通过在2％w / v琼脂糖凝胶上电泳每个样品5 - 10μL，分析样品的代表性洗脱体积。
- 按照标准色谱实践12 ，将重悬浮的tRNA（UUU）加载到先前在凝胶过滤缓冲液中平衡的高分辨率制备型凝胶过滤柱（尺寸：16×600mm，床体积：120mL，分辨率范围：1,000-70,000Da） （流动相）。将流速设置为1 mL / min以洗脱样品。
3.样品制备
- 根据López-Estepa et al 。表达和纯化TcdA。 2 。
注意：最高可达250μMTcdA可用于研究。 - 将相应量的TcdA根据表1移取到适当标记的1.5 mL离心管中。加入1.6mM 三 （2-羧乙基）膦（TCEP）（终浓度），并使用移液管轻轻混合。关闭盖子并在室温下孵育混合物5分钟。
- 加入10μM三磷酸腺苷（ATP）和50mM MgCl 2 （终浓度）。用移液管混合，并在室温下孵育混合物5分钟。
- 加入纯化的tRNA（UUU）（第2.3节），如表1所示 ，用移液管混合，室温孵育5分钟。
- 加入最终达100μL的最终体积的磷酸盐缓冲盐水（PBS）。混合均匀并加入甘油至终浓度为10％v / v。
- 旋转样品并短暂地将管内容物（10,000 x g，1 min，4°C）旋下。
凝胶加载和电泳发展
- 将电泳单元放入装有碎冰的托盘中，以便在电泳过程中将室维持在4℃。
- 小心地，将5μL每个样品移液到相应的孔中。添加合适的DNA大小标记。
- 将电极插入电源单元的相应插槽。打开电源单元并将电压设置为100 V，并运行凝胶90分钟。
5.凝胶染色观察tRNA蛋白质相互作用
- 通过将50 mL TBE与1×合适的DNA染色液混合来制备染色溶液。通过用铝箔覆盖染色容器，避免将染色溶液暴露在阳光下。
注意：DNA污渍通常存储为10,000或20,000x浓缩的库存。 - 电泳90分钟后，小心地从托盘中取出凝胶，并将其放入带有染色溶液的容器中。在室温下以低摇摆速度将其放置在摇杆上ure 30分钟
- 从染色容器中取出琼脂糖凝胶，小心点在纤维素组织或滤纸上，以除去多余的液体，并将其直接放在透照器上。打开紫外光以使含有tRNA的条带可视化。拍摄凝胶照片。
- 蛋白质染色（可选）。
- 放弃DNA染色溶液（根据安全程序），并用50 mL考马斯亮蓝（CBB）溶液代替。将托盘放置在室温摇杆上，过夜（> 12 h）。丢弃CBB染色溶液，并用50 mL PBS替换，以除去多余的染料。在摇滚乐上消失1小时。
- 在光透照下可视化含蛋白质的tRNA复合物，并拍摄凝胶照片以与tRNA UV凝胶图片进行比较。
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Representative Results
通过在强诱导型T7启动子的控制下在大肠杆菌中表达tRNA基因可以获得大量的tRNA（UUU）。表达的tRNA（UUU）积累在细胞质中，并且在天然丰富的tRNA库中富集。使用由捕获/提取步骤和凝胶过滤/抛光步骤组成的两步纯化方法获得EMSA级tRNA。捕获/提取步骤使用pH 4.3苯酚来实现蛋白质，细胞碎片，DNA的同时沉淀和tRNA（和其他RNA分子）的提取。在该步骤中，可以通过在2％w / v琼脂糖凝胶上电泳来评估总tRNA库的总量。第二步采用凝胶过滤色谱法，根据分子大小分离RNA物种。 254nm处的紫外线踪迹用于监测分离并鉴定主要洗脱峰（ 图1）顶部）。在2％w / v琼脂糖凝胶上进行代表性的等分试样的峰分数（ 图1 底部 ）。大多数tRNA分子在色谱法的单个峰（中间）共洗脱（这里在120mL床大小的柱中为75.5mL）。当分离含有单个过表达物种（如tRNA（UUU））的池时，池中超过90％的tRNA分子属于该特定的tRNA，而剩余的分子对应于天然丰富的tRNA。在含有tRNA的中心峰前后观察到二次峰。含有部分降解较大的RNA分子（ 图 26和32; 图1中的条 ）之前的峰和纯化运行结束时的峰包含非常小的RNA和污染物（45和51级; 图1中的条 ）。将级分在中心峰下收集（分数39-43）; 图1中的条 ），纯化的tRNA的量可以通过UV光谱和/或通过与2％w / v琼脂糖凝胶上的分子尺寸标准物进行比较来定量。
可以使用半对数取样方案（ 表1 ）将不同摩尔比的TcdA和tRNA（UUU）样品混合在1.0至10.0之间，并在2％w / v琼脂糖凝胶上分离（ 图2 ）。根据蛋白质tRNA复合物的稳定性和结合的化学计量，可以在凝胶上显现一个或几个条带。对于TcdA-tRNA（UUU），形成化学计量复合物作为含有蛋白质和tRNA的分离条带。通常，游离的tRNA迁移速度更快，可以在凝胶的底部观察到，而蛋白质-tRNA复合物（其带负电荷较小且尺寸较大）倾向于较慢迁移。 图2显示了一个代表 2％w / v TcdA-tRNA（UUU）复合物的琼脂糖凝胶。在图2中 ，仅有TcdA和tRNA的条带用作阴性对照。随着TcdA：tRNA（UUU）摩尔比的增加，以游离tRNA带为代价形成的TcdA-tRNA（UUU）复合物的量增加。注意，游离tRNA的强度随着TcdA量的增加而减小。形成的第一个复合物是每个TcdA二聚体含有一个tRNA分子的2:1化学计量复合物（在具有10,20或30μMTcdA的泳道中可见）。在TcdA饱和度下，发展出含有2：2化学计量配合物的较大分子量的TcdA-tRNA（UUU）复合物，其中两个TcdA亚基都与一个tRNA（UUU）分子结合（每个具有30,50或75μM）。具有TcdA（50或75μM）的最后两条通道已经结合了反应中的所有tRNA并且缺乏游离的tRNA带。
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图1：通过凝胶过滤纯化tRNA（UUU）。在254nm处记录的高分辨率制备型凝胶过滤柱上的tRNA（UUU）凝胶过滤的色谱图（顶部）。含有富含tRNA（UUU）的tRNA库的最高峰在〜75.5mL处洗脱。用各种tRNA洗脱级分的等分试样运行2％w / v琼脂糖凝胶（底部）。 M，分子大小梯。 请点击此处查看此图的较大版本。
图2：TcdA和tRNA（UUU）的凝胶阻滞测定。 EMSA提供tRNA与TcdA的物理结合的证据。样品在2％w / v琼脂糖凝胶上在4℃下运行90分钟。固定量的tRNA（UUU），7.5μM与可变量的TcdA（ 参见表1 ）混合，并且在电泳过程中分离蛋白质-tRNA复合物。将凝胶染色并在UV透射仪上显现。每条泳道含有5μL样品。 M，分子大小梯。 请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
本文描述的蛋白质-TRNA琼脂糖凝胶阻滞测定可以以多种方式进行修饰。首先，可以减少凝胶中琼脂糖的百分比，以使蛋白质tRNA复合物的分离和可视化显着大于本文分析的（120 kDa）。第二，如果目标蛋白是不耐热的，则必须采取额外的预防措施，以确保通过将电泳装置移动到冷藏室或使用电泳室内的冰袋将温度保持在最高可接受温度以下，以立即消散产生的热量在运行期间。如果需要或可接受的样品11，可以修改其他缓冲组合物（ 例如 ，0.5X TB，三硼酸盐）和运行参数（> 20V / cm）以缩短运行时间。如果在样品制备步骤中观察到RNA降解，则建议的MgCl 2浓度可以降低，因为二价阴离子可以潜在地催化核酸的切割。
该技术的主要限制是蛋白质-tRNA带通常比基于丙烯酰胺的凝胶延迟方法中观察到的那些更容易扩散，其趋于更清晰和更清晰。另一个限制是，对于多个样品的同时分析以及如何解决各种尺寸和电荷的蛋白质-TRNA复合物可能需要更长的较长的凝胶。
与现有的方法相比，蛋白质tRNA琼脂糖凝胶阻滞测定显着降低了从样品制备到分析的劳动和时间。丙烯酰胺凝胶含有有害化学物质，很难制备并需要更长时间聚合。相比之下，琼脂糖凝胶简单，快速铸造和固化，不涉及有毒化学物质。实验可以在2小时内完成。这包括凝胶30分钟，样品制备15分钟（可以在冷却琼脂糖时完成），90分钟进行电泳和可视化。
该方法的未来应用可以改进本方案中使用的检测方法，并将其应用于检测较不丰富，更不稳定的RNA物种或仅可以非常少量表达的蛋白质复合物。用高度敏感的荧光团标记RNA或蛋白质组分将允许检测较少量的蛋白质-RNA复合物。此外，使用具有非重叠发射/激发峰的荧光团可以允许多重实验，其中不同的蛋白质和/或RNA物种可以在单个实验中同时可视化。
该协议有三个关键步骤。第一个也是最明显的关键步骤是tRNA（UUU）的表达和纯化。如果纯化的tRNA（UUU）的量低于某一最低检测限（每条带在25-200ng tRNA之间）），或降解带变得更明显，因为较低分子量的污染物，tRNA应被丢弃和再纯化。在tRNA提取过程中使用酸性酚（pH 4.3）是必不可少的，因为它选择性沉淀DNA同时保持RNA可溶。第二个关键步骤涉及蛋白质tRNA样品的制备用于分析。必须使用足够量的蛋白质和tRNA才能对形成的所有复合物进行鲁棒检测。蛋白质-tRNA的摩尔比必须调整以将平衡置换为复合物形成。第三个关键步骤是电泳。 TBE缓冲液必须使用新鲜（不重复使用），并且必须将琼脂糖凝胶保持在蛋白质-TRNA复合物稳定且不变性（通常为4-10℃）的温度。必须注意在整个电泳过程中保持琼脂糖凝胶冷，例如，用冰包围电泳室，并尽可能地运行实验在4℃的寒冷室中。
我们已经证明了使用TcdA-tRNA（UUU）作为模型系统分析，表征蛋白质-TRNA复合物的简单方法，并且使用琼脂糖凝胶电泳代替丙烯酰胺电泳。后者需要更长的时间才能完成，而且费力。使用该方法，可以在不到90分钟内完成2％w / v琼脂糖凝胶（8cm凝胶形式）上的电泳分离。这是分析蛋白质tRNA相互作用的便捷工具，可以同时分析多个样品。可以使用该方法筛选tRNA和/或蛋白质突变体的变体的结合和稳定性。
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Disclosures
作者没有什么可以披露的。
Acknowledgments
MCV是CIB校内计划“更好生命的分子机器”（MACBET）的成员。导致这些结果的研究已经获得了西班牙萨洛德卡洛斯III研究所（PI12 / 01667至MCV）的资助，西班牙经济贸易部长（CTQ2015-66206-C2-2-R和SAF2015-72961-EXP至MCV） ），马德里区域政府（S2010 / BD-2316至MCV）和欧盟委员会（框架计划7（FP7））项目ComplexINC（MCV合同号279039）。资助者在研究设计，数据收集和分析，决定出版或准备稿件方面没有任何作用。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| E. coli BL21(DE3) | Novagen | 70235 | DE3 lysogen contains T7 polymerase upon IPTG induction. |
| pET23d | Novagen | 69748-3 | pET23d confers resistance to ampicillin; T7 promoter. |
| LB Broth, Low Salt (Lennox L Broth), Granulated | Melford | GL1703 | Conventional LB Broth, High Salt, can also be used. |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | 10419313 | |
| Incubator Shaker (Thermostated) | NBS | Excella E24 | Any shaker incubator with temperature control can be used. |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG), >=99% | Acros Organics | BP1755 | |
| Sodium acetate, anhydrous, >99% | Melford | B4017 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), Disodium salt, >99% | Acros Organics | AC327205000 | Harmful if inhaled. |
| Centrifuge (refrigerated) | Eppendorf | 5430 | |
| Centrifuge (refrigerated) rotor | Eppendorf | 5430/5430P | |
| Centrifuge | Sorvall | RC5C | |
| Centrifuge rotor | Sorvall | SLA-3000 | |
| Phenol solution, Saturated with 0.1 M citrate buffer, pH 4.3 ± 0.2 | Sigma-Aldrich | P4682 | Acute toxicity (oral, dermal, inhalation), corrosive |
| Ethanol absolute for analysis, 100% v/v | Merck Millipore | 100983 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate, Na2HPO4, >=99% | Sigma-Aldrich | 71643 | |
| Potassium dihydrogen phosphate, KH2PO4 | Merck | 48,730,250 | |
| HiLoad 16/60 Superdex 75 | GE Healthcare | 28989333 | |
| Agarose | Melford | MB1200 | |
| Tris [Tris(hydroxymethyl) aminomethane HCl] | Melford | T1513 | |
| Boric Acid | Melford | B0503 | |
| Microwave | Haier | HDA-2070M | |
| TCEP [Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride] | Sigma-Aldrich | C4706 | Corrosive to metals and skin. |
| ATP [Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate], Grade I, >=99% | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| Magnesium chloride (MgCl2), anhydrous, >=98% | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Sodium chloride (NaCl), >99% | Fisher Bioreagents | BP358 | |
| Potassium chloride (KCl), >99% | Melford | P0515 | |
| NZYDNA Ladder VI | NZYtech | MB8901 | |
| Power supply | Consort | EV261 | |
| Electrophoresis unit | Real Laboratory | RELSMINI10 | |
| Real Safe nucleic acid staining | Real Laboratory | RBMSAFE | 20,000X stock |
| UV Transilluminator (G:Box/EF) | Syngene | 2216498 | |
| Coomassie Brilliant Blue G | Sigma-Aldrich | B0770 | |
| Rocker (Gyro-Rocker) | Stuart | SSL3 | |
| Mixer Vortex | Fisher brand | 13214789 |
References
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- López-Estepa, M., et al. The crystal structure and small-angle X-ray analysis of CsdL/TcdA reveal a new tRNA binding motif in the MoeB/E1 superfamily. Plos One. 10 (4), e0118606 (2015).
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