Summary
Протокол представлен для получения тРНК (UUU) и анализа тРНК (UUU) в комплексе с ферментом TcdA с помощью тестов запаздывания агарозного геля.
Abstract
Мы демонстрируем способы экспрессии и очистки тРНК (UUU) в Escherichia coli и анализ с помощью анализов на замедление геля связывания тРНК (UUU) с TcdA, дегидратазой N6- треонилкарбамоиладенозина (t 6 A), которая циклизует треонилкарбамоил Боковая цепь, присоединенная к A37 в петле антикодонового штока (ASL) тРНК до циклического t 6 A (ct 6 A). Транскрипцию синтетического гена, кодирующего тРНК (UUU), индуцируют в E.coli с 1 мМ изопропил-D-1-тиогалактопиранозидом (IPTG), а клетки, содержащие тРНК, собирают через 24 ч после индукции. Фракцию РНК очищают с использованием метода экстракции кислотным фенолом. Чистую тРНК получают гель-фильтрационной хроматографией, которая эффективно отделяет малые молекулы тРНК от более крупных интактных или фрагментированных нуклеиновых кислот. Для анализа связывания TcdA с тРНК (UUU) TcdA смешивают с тРНК (UUU) и отделяют на природном агарозном геле при 4 ° С.Свободная тРНК (UUU) мигрирует быстрее, тогда как комплексы TcdA-тРНК (UUU) подвергаются задержке подвижности, которая может наблюдаться при окрашивании геля. Мы демонстрируем, что TcdA представляет собой тРНК (UUU) -связывающий фермент. Этот анализ запаздывания геля может быть использован для изучения мутантов TcdA и эффектов добавок и других белков при связывании.
Introduction
Анализ запаздывания геля 1 (также известный как анализ сдвига электрофоретической подвижности, EMSA) представляет собой электрофоретический метод, предназначенный для изучения и характеристики взаимодействия белок-нуклеиновая кислота. Он позволяет анализировать белок-ДНК, а также взаимодействия белок-РНК и, в частности, взаимодействия между тРНК и тРНК-связывающими белками с использованием либо очищенных компонентов, либо сложных смесей белков ( например , клеточных лизатов) или нуклеиновых кислот ( например , тРНК бассейны). Мы применили анализы гель-запаздывания к изучению взаимодействия между очищенной тРНК (UUU) и TcdA, дегидратазой N6- треонилкарбамоиладенозина (t 6 A), которая циклизует боковую цепь треонилкарбамоила, присоединенную к A37 в антикодоновой штоковой петле (ASL) От тРНК до циклического t 6 (ct 6 A) 2 , 3 . TcdA также известен как CsdL 3 ,F "> 4. Ген tcdA / csdL образует кластер с генами csdA и csdE 5 , которые кодируют цистеин-десульфуразу и акцептор серы системы цистеинсульфазасульфиназы (CSD) и требуется для поддержания функции TcdA in vivo 3 .
Обоснованием анализа запаздывания геля является то, что, хотя свободные молекулы нуклеиновой кислоты быстро мигрируют к фронту акриламидных или агарозных гелей из-за их большого отрицательного заряда, электрофоретическая подвижность белковых комплексов тех же нуклеиновых кислот резко снижается. Снижение подвижности визуализируется как «сдвиг» в комплексах нуклеиновых кислот и белков, которые разрешаются в виде дискретных полос. Положительно заряженный и более крупный нуклеиново-кислотно-белковый комплекс проявляет больший сдвиг или снижение подвижности на геле.
Поскольку нейтрализация заряда комплекса является универсальным явлениемДля комплексов белок-нуклеиновая кислота анализ запаздывания геля может быть применен к широкому спектру комплексов и типов нуклеиновых кислот. Метод прост, недорог и может проводиться в лабораториях с минимальным оборудованием. Это требует лишь небольшого количества белков и тРНК. Это преимущество перед альтернативными биофизическими методами, которые обычно потребляют большее количество образца.
Анализ запаздывания геля широко использовался для изучения факторов транскрипции. Анализ был использован для анализа кинетики связывания, прочности и специфичности факторов транскрипции для многих различных последовательностей ДНК. Именно в этой области EMSA был впервые разработан 6 , 7 . Анализы запаздывания геля с молекулами РНК 8 , 9 , 10 , 11 и тРНК также использовались в исследованиях рибосомИ проанализировать, как мы здесь делаем, ферменты, которые после транскрипции изменяют нуклеозиды тРНК.
Многие результаты влияют на результат анализа запаздывания геля, такого как температура, качество белка и тРНК, а также прочность связывания. Тщательное планирование и выполнение эксперимента имеет решающее значение для интерпретации результатов свободной нуклеиновой кислоты и связанных с белком видов. Здесь мы использовали синтетический ген, кодирующий тРНК (UUU), клонированный в экспрессионный вектор, промотор которого не обладает сайтом связывания рибосом Shine-Dalgarno, что приводит к синтезу больших количеств тРНК 2 . Этот подробный протокол предназначен для предоставления четкого руководства для проведения экспериментов по замещению гена тРНК, избегая при этом распространенных ошибок.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Предостережение: Перед использованием ознакомьтесь со всеми листами данных о безопасности материалов (MSDS). Некоторые из химических веществ, используемых в этом протоколе, являются токсичными и коррозионными. Используйте подходящие методы при экстракции тРНК с использованием фенола, включая использование вытяжного шкафа и средств индивидуальной защиты (защитные очки, перчатки, лабораторные халаты, штаны полной длины, туфли с закрытыми носками и т . Д.). В этом протоколе используется нетоксичное окрашивание нуклеиновой кислоты. Использование альтернативных пятен может потребовать дополнительных мер предосторожности и специализированного удаления окрашивающего агента, если оно токсично и / или канцерогенно ( например , бромид этидия).
1. Получение агарозного геля
- Взвесьте 2 г агарозы и добавьте ее в стеклянную бутылку для приготовления 2% -ного агарозного геля.
- Добавить 100 мл 1x буфера трис-борат-этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA) (TBE) в бутылку, содержащую агарозу. Растопите нагреванием в микроволновой печи. Через 30 с перевернуть содержимое для смешиванияИ повторите этот шаг до полного растворения агарозы. Дайте раствору агарозы остыть примерно до 50-60 ° C.
- Наденьте открытые края лотка для геля, чтобы создать форму, поместите подходящий гребень для создания колодцев и влейте в него расплавленную агарозу. Избегайте образования пузырьков и дайте ему застыть при комнатной температуре.
- После затвердевания поместите лоток для геля в блок электрофореза и заполните его TBE-буфером до полного покрытия геля.
2. Получение тРНК
- Экспресс-тРНК (UUU) в E. coli
- Утром используйте флакон из замороженной E. coli BL21 (DE3), трансформированный экспрессирующим вектором pET23d-EcUUU 2 (содержит ген, кодирующий тРНК E. coli (UUU)), для полоскания Lolia Broth с низкой солью (LB) С добавлением 100 мкг / мл ампициллина. Инвертируйте планшет и поместите их в 37 ° C инкубатор, пока не появятся колонии (поздний конецУн).
- Инокулируют одну хорошо выраженную единичную колонию в 5 мл LB плюс 100 мкг / мл ампициллина и растут в течение ночи при 220 об / мин при 37 ° C.
- На следующее утро гранулируют клетки (6500 мкг в течение 10 мин при 4 ° С), заменяют среду 5 мл свежего LB плюс 100 мкг / мл ампициллина и ресуспендируют. Используйте эту суспензию для инокуляции 200 мл LB плюс 100 мкг / мл ампициллина. Растут в течение 5 ч при 220 об / мин при 37 ° С.
- Когда оптическая плотность культуры при 590 нм (OD 590 ) достигла 0,6-0,8, добавьте 1 мМ IPTG в культуру, чтобы вызвать экспрессию гена тРНК (UUU). Инкубируйте при 37 ° C в течение 3 часов.
- Убирают клетки путем центрифугирования культуры при 6500 мкг в течение 10 мин при 4 ° С.
- Лизис и экстракция
- Ресуспендируют клеточный осадок в 5 мл буфера для лизиса (0,3 М ацетата натрия, 10 мМ ЭДТА). С этого момента используются автоклавированные буферы и сохраняют все образцы, содержащие тРНК, при 4 ° C, чтобы предотвратить tДеградация РНК.
- Добавьте 1 объем кислотного фенола (рН 4,3) в ресуспендированный клеточный осадок в вытяжном шкафу. Смешивают в течение 1 мин путем инверсии для лизиса клеток и центрифугирования при 10000 мкг (10 мин, 4 ° С).
- Соберите верхнюю водную фазу, содержащую растворимую тРНК (UUU) (и меньшие концентрации других пулов тРНК), используя пипетку, стараясь не аспирировать органическую (нижнюю) фазу. Отбросьте нижний слой и осадок, который состоит из органической фазы и клеточного мусора, в соответствующий контейнер.
- Осаждают тРНК путем тщательного смешивания растворимой (водной) фазы с 2,5 об. 100% об. / Об. Этанолом путем инверсии в течение 1 часа при 4 ° С. Центрифугируют смесь при 15000 xg (30 мин, 4 ° C).
- Декантируют супернатант осторожно и ресуспендируют гранулы, богатые тРНК, в 4 мл гель-фильтрационного буфера (20 мМ фосфата натрия или фосфата калия, рН 7,4, 0,1 мМ ЭДТА). Прогон 5 мкл ресуспендированного пула тРНК на 2% -ном агарозном геле.
ЗАМЕТКА:ТРНК хорошего качества проявляется как одна полоса (молекулярный размер между 50-100 б.п.).
- Очистка тРНК (UUU)
- Следуя стандартной хроматографической практике 12 , загрузите ресуспендированную тРНК (UUU) на подготовительную гель-фильтрационную колонку высокого разрешения (размеры: 16 x 600 мм, объем слоя: 120 мл, диапазон разрешения: 1000-70 000 Да), предварительно уравновешенный в гелевом фильтровальном буфере (Мобильная фаза). Установите расход до 1 мл / мин для элюирования образцов.
ПРИМЕЧАНИЕ. Пик тРНК (UUU) элюируется приблизительно на 75,5 мл. Как правило, может быть получен выход 0,5-1,0 мг / л тРНК культуры. - Проанализируйте образцы в типичных объемах элюирования путем электрофореза на 5-10 мкл каждого образца на 2% -ном агарозном геле.
- Следуя стандартной хроматографической практике 12 , загрузите ресуспендированную тРНК (UUU) на подготовительную гель-фильтрационную колонку высокого разрешения (размеры: 16 x 600 мм, объем слоя: 120 мл, диапазон разрешения: 1000-70 000 Да), предварительно уравновешенный в гелевом фильтровальном буфере (Мобильная фаза). Установите расход до 1 мл / мин для элюирования образцов.
3. Подготовка проб
- Экспресс и очистка TcdA согласно López-Estepa et al . 2 .
ПРИМЕЧАНИЕ. До 250 мкМTcdA может использоваться для исследования. - Пипеткой соответствующее количество TcdA согласно таблице 1 в правильно помеченные 1,5 мл центрифужные пробирки. Добавить 1,6 мМ трис (2-карбоксиэтил) фосфин (TCEP) (конечная концентрация) и осторожно перемешать с помощью пипетки. Закройте крышку и инкубируйте смесь при комнатной температуре в течение 5 минут.
- Добавить 10 мкМ аденозинтрифосфата (АТФ) и 50 мМ MgCl 2 (конечные концентрации). Смешайте с пипеткой и инкубируйте смесь в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Добавить очищенную тРНК (UUU) (раздел 2.3) согласно таблице 1 , смешать с пипеткой и инкубировать при комнатной температуре в течение 5 мин.
- Добавляют фосфатный буферный солевой раствор (PBS) до конечного объема до 100 мкл. Правильно перемешать и добавить глицерин до конечной концентрации 10% об. / Об.
- Вверните образец и кратко открутите содержимое трубки (10 000 xg, 1 мин, 4 ° C).
4. Гелевая загрузка и развитие электрофореза
- Поместите блок электрофореза в лоток, заполненный измельченным льдом, чтобы поддерживать камеру при 4 ° C во время прогона электрофореза.
- Осторожно пипеткой по 5 мкл каждого образца в соответствующую лунку. Добавьте подходящий маркер размера ДНК.
- Подключите электроды к соответствующим гнездам блока питания. Включите блок питания и установите напряжение до 100 В и запустите гель в течение 90 мин.
5. Окрашивание геля для наблюдения взаимодействия тРНК-белок
- Подготовьте окрашивающий раствор, смешав 50 мл TBE с 1x подходящего пятна ДНК. Избегайте воздействия на окрашивающий раствор солнечным светом, покрывая окрашивающий контейнер алюминиевой фольгой.
ПРИМЕЧАНИЕ. Пятна ДНК обычно хранятся в виде концентрированных запасов в количестве 10 000 или 20 000 штук. - После 90 минут электрофореза осторожно удалите гель из лотка и поместите его в контейнер с окрашивающим раствором. Поместите его на рокер при низкой скорости качания при комнатной температуреВ течение 30 мин.
- Удалите агарозный гель из окрашивающего контейнера, осторожно нажмите его на кусок целлюлозной ткани или фильтровальной бумаги, чтобы удалить лишнюю жидкость, и поместите ее непосредственно на трансиллюминатор. Включите УФ-излучение, чтобы визуализировать полосы, содержащие тРНК. Сделайте снимок геля.
- Протеиновое окрашивание (необязательно).
- Сбросьте раствор для окрашивания ДНК безопасно (в соответствии с процедурами безопасности) и замените его 50 мл раствора Coomassie Brilliant Blue (CBB). Поместите лоток на качалку при комнатной температуре и окрасьте в течение ночи (> 12 часов). Отмените окрашивающий раствор CBB и замените его на 50 мл PBS для удаления избытка красителя. Придерживайтесь в течение 1 часа на качалке.
- Визуализируйте белоксодержащие комплексы тРНК под легким трансиллюминатором и сфотографируйте гель, чтобы сравнить с картиной ультрафиолетового геля тРНК.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Большие количества тРНК (UUU) могут быть получены путем экспрессии гена тРНК в E. coli под контролем сильного индуцибельного промотора T7. Выраженная тРНК (UUU) накапливается в цитоплазме и обогащается пулом естественно обильных тРНК. Для получения тРНК EMSA-класса использовали двухстадийный процесс очистки, состоящий из стадии захвата / экстракции и стадии гель-фильтрации / полирования. На стадии захвата / экстракции используется рН 4,3 фенола для достижения одновременного осаждения белка, клеточного мусора, ДНК и экстракции тРНК (и других молекул РНК). На этом этапе количество общего пула тРНК можно оценить электрофорезом на 2% -ном агарозном геле. Второй этап включает гель-фильтрационную хроматографию, которая разделяет виды РНК в зависимости от их молекулярного размера. Ультрафиолетовая трасса при 254 нм используется для контроля разделения и идентификации основных пиков элюирования ( рисунок 1Сверху). Представительные аликвоты пиковых фракций проводили на 2% -ном агарозном геле для анализа ( рисунок 1 внизу ). Большинство молекул тРНК совместно элюируются в одном пике (в середине) хроматографии (здесь 75,5 мл в колонке размером 120 мл). При разделении пулов, содержащих один сверхэкспрессированный вид, например тРНК (UUU), более 90% молекул тРНК в пуле относятся к этой специфической тРНК, а остальные молекулы соответствуют естественным обильным тРНК. Вторичные пики наблюдаются как до, так и после центрального пика, содержащего тРНК. Пик (ы) до этого содержат частично разрушенные молекулы больших РНК (фракции 26 и 32, бруски на рисунке 1 ) и пик (ы) в конце цикла очистки содержат очень маленькие РНК и загрязняющие вещества (фракции 45 и 51; Баров на рис. 1 ). После объединения фракций под центральным пиком (фракции 39-43; Баров на рис. 1 ), количество очищенной тРНК можно количественно оценить с помощью УФ-спектроскопии и / или сравнением с стандартами молекулярного размера на 2% -ном агарозном геле.
Образцы TcdA и тРНК (UUU) могут быть смешаны при разных молярных соотношениях от 1,0 до 10,0 с использованием полулогарифмической схемы выборки ( таблица 1 ) и разделены на 2% мас. / Об. Агарозных гелях ( фиг. 2 ). В зависимости от стабильности комплексов белок-тРНК и стехиометрии связывания на геле можно визуализировать одну или несколько полос. Для TcdA-тРНК (UUU) образуется стехиометрический комплекс, который протекает как изолированная полоса, содержащая как белок, так и тРНК. Как правило, свободная тРНК быстрее мигрирует и может наблюдаться на дне геля, тогда как комплексы белок-тРНК, которые менее отрицательно заряжены и имеют больший размер, имеют тенденцию к миграции медленнее. На рисунке 2 показано представление 2 г / г агарозного геля комплексов TcdA-тРНК (UUU). На рисунке 2 только группы TcdA-only и tRNA-only служат отрицательными элементами управления. По мере увеличения молярного отношения TcdA: тРНК (UUU) количество комплексов TcdA-тРНК (UUU), образованных за счет свободной тРНК-полосы, увеличивается. Обратите внимание, что интенсивность свободной тРНК уменьшается по мере увеличения количества TcdA. Первый сложный комплекс представляет собой стехиометрический комплекс 2: 1, содержащий одну молекулу тРНК на димер TcdA (видимый в полосах с 10, 20 или 30 мкМ TcdA). При насыщении TcdA развивается более крупный молекулярно-массовый комплекс TcdA-тРНК (UUU), который содержит стехиометрический комплекс 2: 2, где обе субъединицы TcdA связаны с одной молекулой тРНК (UUU) каждый (видны в дорожках с 30, 50 или 75 мкМ). Две последние полосы с TcdA (50 или 75 мкМ) связывали всю тРНК в реакции и не имели свободной полосы тРНК.
Tp_upload / 55638 / 55638fig1.jpg "/>
Рисунок 1: Очистка тРНК (UUU) с помощью фильтрации геля. Хроматограмма (верхняя часть) гель-фильтрации тРНК (UUU) над препаративной гель-фильтрационной колонкой высокого разрешения, зарегистрированной при 254 нм. Самый высокий пик, содержащий пул тРНК, обогащенный тРНК (UUU), элюируется при ~ 75,5 мл. 2% мас. / Об. Агарозного геля (снизу) проводили с аликвотами из различных фракций элюирования тРНК. M, лестница молекулярного размера. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Анализ запаздывания геля с TcdA и тРНК (UUU). EMSA предоставляет доказательства физического связывания тРНК с TcdA. Образцы проводили на 2% -ном агарозном геле при 4 ° С в течение 90 мин. Фиксированное количество тРНК (UUU), 7,5 мкM, смешивали с переменными количествами TcdA (см. Таблицу 1 ), и комплексы белок-тРНК разделяли во время электрофореза. Гель окрашивали и визуализировали на УФ-трансиллюминаторе. Каждая полоса содержит 5 мкл образца. M, лестница молекулярного размера. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Проведенный здесь анализ запаздывания гена агарозы с белком-тРНК может быть модифицирован несколькими способами. Во-первых, процентное содержание агарозы в геле может быть уменьшено, чтобы обеспечить разделение и визуализацию комплексов белок-тРНК, значительно превышающих анализируемый здесь (120 кДа). Во-вторых, если целевой белок термолабилен, необходимо принять дополнительные меры предосторожности, чтобы температура поддерживалась ниже максимально допустимой температуры, перемещая устройство электрофореза в холодную комнату или используя пакеты льда внутри камеры электрофореза, чтобы немедленно рассеять полученное тепло Во время пробега. Другие буферные композиции ( например , 0,5X ТБ, трис-борат) и рабочие параметры (> 20 В / см) могут быть изменены для сокращения времени выполнения, если это необходимо или приемлемо для образцов 11 . Предложенную концентрацию MgCl 2 можно уменьшить, если разложение РНК наблюдается во время стадии подготовки образца, поскольку двухвалентные катиМогут потенциально катализировать расщепление нуклеиновых кислот.
Основное ограничение техники заключается в том, что полосы белок-тРНК обычно немного более диффузны, чем те, которые наблюдаются в методах замедления геля на основе акриламида, которые имеют тенденцию быть более четкими и четкими. Другим ограничением является то, что для одновременного анализа множественных образцов необходимо более широкий, более длинные гели, и если будут решены комплексы белка-тРНК различных размеров и заряда.
По сравнению с существующими методами анализ запаздывания запаздывания с белковой тРНК-агарозой дает значительное сокращение трудозатрат и время от подготовки проб до анализа. Акриламидные гели, содержащие вредные химические вещества, являются трудоемкими для подготовки и более длительного полимеризации. Напротив, агарозные гели просты, быстро ливают и устанавливают и не включают токсичные химикаты. Эксперимент может быть завершен за 2 часа. Это включает 30 минут для установки геля, 15 минут для подготовки образца (что может бытьПри охлаждении агарозы), 90 мин для электрофореза и визуализации.
Будущие применения метода могут уточнить методы обнаружения, используемые в этом протоколе, и применить его к обнаружению менее распространенных, более нестабильных видов РНК или к белковым комплексам, которые могут быть выражены только в очень малых количествах. Маркировка РНК или белкового компонента высокочувствительными флуорофорами позволила бы обнаружить меньшие количества комплексов белок-РНК. Кроме того, использование флуорофоров с неперекрывающимися пиками эмиссии / возбуждения могло бы позволить эксперименты по мультиплексированию, где различные виды белка и / или РНК могут быть визуализированы одновременно в одном эксперименте.
В этом протоколе есть три важных шага. Первым и наиболее очевидным критическим шагом является экспрессия и очистка тРНК (UUU). Если количество очищенной тРНК (UUU) ниже определенного минимального предела обнаружения (между 25-200 нг тРНК на полосу), Или полосы деградации становятся очевидными как загрязнители с более низким молекулярным размером, тРНК следует отбросить и повторно очистить. Использование кислотного фенола (рН 4,3) во время экстракции тРНК является существенным, поскольку он селективно осаждает ДНК, сохраняя растворимость РНК. Второй критический шаг касается подготовки образцов белка-тРНК для анализа. Достаточное количество белка и тРНК должно использоваться для обеспечения надежного обнаружения всех образованных комплексов. Молярные отношения белок-тРНК должны быть скорректированы для смещения равновесия в сторону комплексного образования. Третьим критическим шагом является электрофорез. Буфер TBE необходимо использовать свежим (не повторно использовать), и необходимо поддерживать агарозные гели при температурах, где комплексы белок-тРНК являются стабильными и не денатурируются (обычно 4-10 ° C). Следует проявлять осторожность, чтобы поддерживать агарозный гель во время всего электрофореза, например, окружая камеру электрофореза льдом и, по возможности, запуская экспериментТ в холодной комнате при 4 ° С.
Мы продемонстрировали простой метод анализа, характеризующий комплексы белок-тРНК с использованием TcdA-тРНК (UUU) в качестве модельной системы и используя электрофорез в агарозном геле вместо акриламидного электрофореза. Последнее занимает больше времени, и оно значительно более трудоемок. Используя этот метод, электрофоретическое разделение на 2% мас. / Об. Агарозных гелях (формами геля 8 см) может быть выполнено менее чем за 90 мин. Это удобный инструмент для анализа взаимодействия белок-тРНК и позволяет проводить одновременный анализ нескольких образцов. Варианты тРНК и / или белковых мутантов можно скринировать для связывания и стабильности с использованием этого метода.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
MCV является членом CIB Intrumural Programme «Молекулярные машины для лучшей жизни» (MACBET). Исследование, ведущее к этим результатам, получило финансирование от испанского Instituto de Salud Carlos III (PI12 / 01667 до MCV), Испанского министерства экономики и конкурентоспособности (CTQ2015-66206-C2-2-R и SAF2015-72961-EXP до MCV ), Региональное правительство Мадрида (S2010 / BD-2316 - MCV) и Европейская комиссия (Рамочная программа 7 (FP7)), проект ComplexINC (контракт № 279039 на MCV). Финансисты не играли никакой роли в разработке исследований, сборе и анализе данных, решении опубликовать или подготовить рукопись.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| E. coli BL21(DE3) | Novagen | 70235 | DE3 lysogen contains T7 polymerase upon IPTG induction. |
| pET23d | Novagen | 69748-3 | pET23d confers resistance to ampicillin; T7 promoter. |
| LB Broth, Low Salt (Lennox L Broth), Granulated | Melford | GL1703 | Conventional LB Broth, High Salt, can also be used. |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | 10419313 | |
| Incubator Shaker (Thermostated) | NBS | Excella E24 | Any shaker incubator with temperature control can be used. |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG), >=99% | Acros Organics | BP1755 | |
| Sodium acetate, anhydrous, >99% | Melford | B4017 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), Disodium salt, >99% | Acros Organics | AC327205000 | Harmful if inhaled. |
| Centrifuge (refrigerated) | Eppendorf | 5430 | |
| Centrifuge (refrigerated) rotor | Eppendorf | 5430/5430P | |
| Centrifuge | Sorvall | RC5C | |
| Centrifuge rotor | Sorvall | SLA-3000 | |
| Phenol solution, Saturated with 0.1 M citrate buffer, pH 4.3 ± 0.2 | Sigma-Aldrich | P4682 | Acute toxicity (oral, dermal, inhalation), corrosive |
| Ethanol absolute for analysis, 100% v/v | Merck Millipore | 100983 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate, Na2HPO4, >=99% | Sigma-Aldrich | 71643 | |
| Potassium dihydrogen phosphate, KH2PO4 | Merck | 48,730,250 | |
| HiLoad 16/60 Superdex 75 | GE Healthcare | 28989333 | |
| Agarose | Melford | MB1200 | |
| Tris [Tris(hydroxymethyl) aminomethane HCl] | Melford | T1513 | |
| Boric Acid | Melford | B0503 | |
| Microwave | Haier | HDA-2070M | |
| TCEP [Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride] | Sigma-Aldrich | C4706 | Corrosive to metals and skin. |
| ATP [Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate], Grade I, >=99% | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| Magnesium chloride (MgCl2), anhydrous, >=98% | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Sodium chloride (NaCl), >99% | Fisher Bioreagents | BP358 | |
| Potassium chloride (KCl), >99% | Melford | P0515 | |
| NZYDNA Ladder VI | NZYtech | MB8901 | |
| Power supply | Consort | EV261 | |
| Electrophoresis unit | Real Laboratory | RELSMINI10 | |
| Real Safe nucleic acid staining | Real Laboratory | RBMSAFE | 20,000X stock |
| UV Transilluminator (G:Box/EF) | Syngene | 2216498 | |
| Coomassie Brilliant Blue G | Sigma-Aldrich | B0770 | |
| Rocker (Gyro-Rocker) | Stuart | SSL3 | |
| Mixer Vortex | Fisher brand | 13214789 |
References
- Scott, V., Clark, A. R., Docherty, K.
- López-Estepa, M., et al. The crystal structure and small-angle X-ray analysis of CsdL/TcdA reveal a new tRNA binding motif in the MoeB/E1 superfamily. Plos One. 10 (4), e0118606 (2015).
- Miyauchi, K., Kimura, S., Suzuki, T. A cyclic form of N6-threonylcarbamoyladenosine as a widely distributed tRNA hypermodification. Nat Chem Biol. 9 (2), 105-111 (2013).
- Bolstad, H. M., Botelho, D. J., Wood, M. J. Proteomic analysis of protein-protein interactions within the Cysteine Sulfinate Desulfinase Fe-S cluster biogenesis system. J Proteome Res. 9 (10), 5358-5369 (2010).
- Loiseau, L., Ollagnier-de Choudens, S., Lascoux, D., Forest, E., Fontecave, M., Barras, F. Analysis of the heteromeric CsdA-CsdE cysteine desulfurase, assisting Fe-S cluster biogenesis in Escherichia coli. J Biol Chem. 280 (29), 26760-26769 (2005).
- Fried, M. G., Crothers, D. M. Equilibrium studies of the cyclic AMP receptor protein-DNA interaction. J Mol Biol. 172 (3), 241-262 (1984).
- Garner, M. M., Revzin, A. A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system. Nucleic Acids Res. 9 (13), 3047-3060 (1981).
- Rio, D. C. Electrophoretic mobility shift assays for RNA-protein complexes. Cold Spring Harb Protoc. 2014 (4), 435-440 (2014).
- Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift. Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).
- Yakhnin, A. V., Yakhnin, H., Babitzke, P. Gel mobility shift assays to detect protein-RNA interactions. Methods Mol Biol. 905, 201-211 (2012).
- Ream, J. A., Lewis, L. K., Lewis, K. A. Rapid agarose gel electrophoretic mobility shift assay for quantitating protein: RNA interactions. Anal Biochem. 511, 36-41 (2016).
- Hagel, L.
