Summary
Ein Protokoll wird für die Produktion von tRNA (UUU) und die Analyse von tRNA (UUU) im Komplex mit dem Enzym TcdA durch Agarose-Gel-Retardierungs-Assays vorgestellt.
Abstract
Wir zeigen Methoden zur Expression und Reinigung von tRNA (UUU) in Escherichia coli und die Analyse durch Gelretardierungsassays der Bindung von tRNA (UUU) an TcdA, eine N 6 -Dreonylcarbamoyladenosin (t 6 A) Dehydratase, die das Threonylcarbamoyl cyclisiert Seitenkette an A37 in der Anticodon-Stammschleife (ASL) von tRNAs an cyclische t 6 A (ct 6 A) gebunden. Die Transkription des für tRNA (UUU) kodierenden synthetischen Gens wird in E. coli mit 1 mM Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) induziert und die tRNA enthaltenden Zellen werden nach der Induktion von 24 h geerntet. Die RNA-Fraktion wird unter Verwendung des Säurephenol-Extraktionsverfahrens gereinigt. Die reine tRNA wird durch eine Gelfiltrationschromatographie erhalten, die die kleineren tRNA-Moleküle effizient von größeren intakten oder fragmentierten Nukleinsäuren trennt. Um die TcdA-Bindung an tRNA (UUU) zu analysieren, wird TcdA mit tRNA (UUU) gemischt und auf einem nativen Agarosegel bei 4 ° C abgetrennt.Die freie tRNA (UUU) wandert schneller, während die TcdA-tRNA (UUU) -Komplexe einer Mobilitätsverzögerung unterliegen, die bei der Färbung des Gels beobachtet werden kann. Wir zeigen, dass TcdA ein tRNA (UUU) -Bindungsenzym ist. Dieser Gel-Retardierungs-Assay kann verwendet werden, um TcdA-Mutanten und die Wirkungen von Additiven und anderen Proteinen auf die Bindung zu untersuchen.
Introduction
Der Gel-Retardierungs-Assay 1 (auch bekannt als elektrophoretischer Mobilitätsverschiebungs-Assay, EMSA) ist ein elektrophoretisches Verfahren zur Untersuchung und Charakterisierung von Protein-Nukleinsäure-Wechselwirkungen. Es erlaubt die Analyse von Protein-DNA sowie Protein-RNA-Wechselwirkungen und insbesondere Wechselwirkungen zwischen tRNA und tRNA-bindenden Proteinen unter Verwendung von entweder gereinigten Komponenten oder komplexen Mischungen von Proteinen ( zB Zelllysaten) oder Nukleinsäuren ( zB tRNA Pools). Wir haben Gel-Retardierungs-Assays zur Untersuchung der Wechselwirkung zwischen gereinigter tRNA (UUU) und TcdA, einer N 6- Threonylcarbamoyladenosin (t 6 A) -Dehydratase, die die an A37 in der Anticodon-Stammschleife (ASL) gebundene Threonylcarbamoyl-Seitenkette cyclisiert, Von tRNAs zu cyclischen t 6 (ct 6 A) 2 , 3 . TcdA ist auch bekannt als CsdL 3 ,F "> 4. Das tcdA / csdL- Gen bildet mit den csdA- und csdE- Genen 5 einen Cluster, der die Cystein-Desulfurase und den Schwefelakzeptor des Cysteinsulfinase-Desulfinats (CSD-Systems) codiert und die TcdA-Funktion in vivo 3 aufrechterhalten muss.
Der Grundgedanke der Gel-Retardierungs-Assays besteht darin, dass während der freien Nukleinsäuremoleküle aufgrund ihrer großen negativen Ladung schnell an die Vorderseite von Acrylamid- oder Agarosegelen wandern, wird die elektrophoretische Beweglichkeit von Proteinkomplexen derselben Nukleinsäuren drastisch reduziert. Die Verminderung der Mobilität wird als "Verschiebung" in den Nukleinsäure-Protein-Komplexen visualisiert, die als diskrete Banden aufgelöst werden. Positiv geladene und größere Nukleinsäure-Protein-Komplex zeigen eine größere Verschiebung oder Verminderung der Mobilität auf einem Gel.
Da die Ladungsneutralisierung des Komplexes ein universelles Phänomen istFür Protein-Nukleinsäure-Komplexe kann der Gel-Retardierungs-Assay auf eine breite Palette von Komplexen und Nukleinsäure-Typen angewendet werden. Die Methode ist einfach, preiswert und kann in Laboratorien mit minimaler Ausrüstung durchgeführt werden. Es erfordert nur geringe Mengen an Proteinen und tRNA. Dies ist ein Vorteil gegenüber alternativen biophysikalischen Techniken, die in der Regel größere Probenmengen verbrauchen.
Der Gel-Retardierungs-Assay wurde weithin für die Untersuchung von Transkriptionsfaktoren verwendet. Der Assay wurde verwendet, um die Bindungskinetik, die Stärke und die Spezifität der Transkriptionsfaktoren für viele verschiedene DNA-Sequenzen zu analysieren. Es war tatsächlich auf diesem Gebiet, dass die EMSA erstmals 6 , 7 entwickelt wurde . Gel-Retardierungs-Assays mit RNA 8 , 9 , 10 , 11 und tRNA-Moleküle wurden auch in der Ribosomenforschung eingesetztUnd zu analysieren, wie wir hier tun, die Enzyme, die tRNA-Nukleoside nachtranskriptional modifizieren.
Viele verschiedene Parameter beeinflussen das Ergebnis eines Gel-Retardierungs-Assays wie Temperatur, Qualität der Protein- und tRNA-Probe und die Stärke der Bindung. Eine sorgfältige Planung und Durchführung des Experiments ist entscheidend für die Interpretation der Ergebnisse der freien Nukleinsäure und der Protein-gebundenen Spezies. Hier nutzten wir das für tRNA (UUU) kodierende synthetische Gen, das in einen Expressionsvektor kloniert wurde, dessen Promotor die Shine-Dalgarno-Ribosomenbindungsstelle fehlt, was zur Synthese großer Mengen der tRNA 2 führt . Dieses detaillierte Protokoll soll einen klaren Leitfaden für die Durchführung von tRNA-Gel-Retardierungsexperimenten liefern, während gemeinsame Fehler vermieden werden.
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Protocol
Achtung: Vor dem Gebrauch alle relevanten Sicherheitsdatenblätter (MSDS) beachten. Mehrere der in diesem Protokoll verwendeten Chemikalien sind toxisch und korrosiv. Verwenden Sie geeignete Praktiken bei der Durchführung der Extraktion von tRNA mit Phenol, einschließlich der Verwendung einer Dunstabzugshaube und persönlicher Schutzausrüstung (Schutzbrille, Handschuhe, Laborkittel, Volllängenhosen, Schuhspitzen, etc. ). Dieses Protokoll verwendet einen nicht-toxischen Nukleinsäure-Fleck. Die Verwendung von alternativen Flecken kann zusätzliche Vorsichtsmaßnahmen und die spezialisierte Entsorgung des Färbemittels erfordern, wenn sie toxisch und / oder krebserregend sind ( z . B. Ethidiumbromid).
1. Vorbereitung des Agarosegels
- 2 g Agarose wiegen und zu einer Glasflasche geben, um ein 2% iges w / v Agarosegel zuzubereiten.
- Füge 100 ml von 1 × tris-borat-ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) (TBE) laufenden Puffer zu der agarosehaltigen Flasche hinzu. Schmelzen durch Erhitzen in einer Mikrowelle. In 30 s Intervallen, swirl die Inhalte zu mischenGut und wiederholen Sie diesen Schritt, bis die Agarose vollständig aufgelöst ist. Lassen Sie die Agarose-Lösung auf ca. 50-60 ° C abkühlen.
- Tape die offenen Kanten eines Gel-Tray, um eine Form zu schaffen, legen Sie einen geeigneten Kamm, um die Brunnen zu schaffen und die geschmolzene Agarose in sie zu werfen. Vermeiden Sie die Blasenbildung und lassen Sie sie bei Raumtemperatur erstarren.
- Nach dem Erstarren legen Sie den Gelträger in eine Elektrophoreseeinheit und füllen ihn mit TBE-Puffer, bis das Gel vollständig bedeckt ist.
2. Vorbereitung der tRNA
- Express-tRNA (UUU) in E. coli
- Am Morgen wird ein mit dem Expressionsvektor pET23d-EcUUU 2 transformiertes Fläschchen mit gefrorenem E. coli BL21 (DE3) verwendet, das das für E. coli tRNA (UUU) kodierende Gen enthält, um eine salzarme Luria Brühe (LB) Platte, ergänzt mit 100 μg / ml Ampicillin. Umkehren Sie die Platte und legen Sie sie in einen 37 ° C Inkubator, bis Kolonien erscheinen (spät nachtOon)
- Inokulieren einer gut gewachsenen Einzelkolonie in 5 ml LB plus 100 μg / ml Ampicillin und wachsen über Nacht bei 220 U / min bei 37 ° C.
- Am nächsten Morgen pellet man die Zellen (6.500 xg für 10 min bei 4 ° C), ersetzen Sie das Medium mit 5 mL frischem LB plus 100 μg / mL Ampicillin und resuspend. Verwenden Sie diese Suspension, um 200 ml LB plus 100 μg / ml Ampicillin zu inokulieren. Für 5 h bei 220 U / min bei 37 ° C wachsen.
- Wenn die optische Dichte der Kultur bei 590 nm (OD 590 ) 0,6 - 0,8 erreicht hat, füge 1 mM IPTG zur Kultur hinzu, um die Expression des tRNA (UUU) -Gens auszulösen. Inkubieren bei 37 ° C für 3 h.
- Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugieren der Kultur bei 6.500 xg für 10 min bei 4 ° C.
- Lyse und Extraktion
- Das Zellpellet wird in 5 ml Lysepuffer (0,3 M Natriumacetat, 10 mM EDTA) resuspendiert. Von diesem Zeitpunkt an benutzten autoklavierte Puffer und halten alle tRNA-haltigen Proben bei 4 ° C, um t zu verhindernRNA-Abbau
- Füge 1 Volumen Säurephenol (pH 4,3) zum resuspendierten Zellpellet in der Dunstabzugshaube hinzu. Mischen für 1 min durch Inversion, um die Zellen zu lysieren und bei 10.000 xg (10 min, 4 ° C) zu zentrifugieren.
- Sammeln Sie die obere wässrige Phase, die die lösliche tRNA (UUU) (und kleinere Konzentrationen der anderen tRNA-Pools) enthält, unter Verwendung einer Pipette, wobei darauf geachtet wird, dass die organische (untere) Phase nicht abgesaugt wird. Verwerfen Sie die untere Schicht und das Pellet, das aus der organischen Phase und Zelltrümmer besteht, in einen geeigneten Behälter.
- Ausfällen der tRNA durch gründliches Mischen der löslichen (wässrigen) Phase mit 2,5 Vol .-% 100% V / V Ethanol durch Inversion für 1 h bei 4 ° C. Die Mischung wird bei 15.000 xg (30 min, 4 ° C) zentrifugiert.
- Den Überstand sorgfältig dekantieren und das tRNA-reiche Pellet in 4 mL Gelfiltrationspuffer (20 mM Natriumphosphat oder Kaliumphosphat, pH 7,4, 0,1 mM EDTA) resuspendieren. Führen Sie 5 μl des resuspendierten tRNA-Pools auf einem 2% w / v Agarosegel.
HINWEIS:Gute Qualität tRNA erscheint als Einzelband (Molekulargröße zwischen 50-100 bp).
- Reinigung von tRNA (UUU)
- Nach der üblichen chromatographischen Praxis 12 beladen die resuspendierte tRNA (UUU) auf eine hochauflösende präparative Gelfiltrationssäule (Abmessungen: 16 x 600 mm, Bettvolumen: 120 mL, Auflösungsbereich: 1.000-70.000 Da), die zuvor im Gelfiltrationspuffer äquilibriert wurden (Mobile Phase). Stellen Sie den Durchfluss auf 1 mL / min ein, um die Proben zu eluieren.
HINWEIS: Der tRNA (UUU) Peak eluiert etwa bei 75,5 ml. Typischerweise kann eine Ausbeute von 0,5-1,0 mg / l tRNA der Kultur erhalten werden. - Analysieren Sie die Proben bei repräsentativen Elutionsvolumina durch Elektrophorese von 5 - 10 & mgr; l jeder Probe auf einem 2% w / v Agarosegel.
- Nach der üblichen chromatographischen Praxis 12 beladen die resuspendierte tRNA (UUU) auf eine hochauflösende präparative Gelfiltrationssäule (Abmessungen: 16 x 600 mm, Bettvolumen: 120 mL, Auflösungsbereich: 1.000-70.000 Da), die zuvor im Gelfiltrationspuffer äquilibriert wurden (Mobile Phase). Stellen Sie den Durchfluss auf 1 mL / min ein, um die Proben zu eluieren.
3. Probenvorbereitung
- Express und Reinigung von TcdA nach López-Estepa et al . 2
HINWEIS: Bis zu 250 μMTcdA kann für die Studie verwendet werden. - Die entsprechende Menge an TcdA gemäß Tabelle 1 in gut markierte 1,5 mL Zentrifugenröhrchen pipettieren. Zugabe von 1,6 mM Tris (2-carboxyethyl) phosphin (TCEP) (Endkonzentration) und sanftes Mischen mit einer Pipette. Schließen Sie den Deckel und inkubieren Sie die Mischung bei Raumtemperatur für 5 min.
- 10 μM Adenosintriphosphat (ATP) und 50 mM MgCl 2 (Endkonzentrationen) zugeben. Mit einer Pipette vermischen und die Mischung 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Fügen Sie gereinigte tRNA (UUU) (Abschnitt 2.3) gemäß Tabelle 1 hinzu , mischen mit einer Pipette und inkubieren bei Raumtemperatur für 5 min.
- Füge phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) bis zu 100 μl Endvolumen hinzu. Mischen Sie richtig und fügen Sie Glycerin zu einer Endkonzentration von 10% v / v hinzu.
- Vortexen Sie die Probe und drehen Sie kurz den Inhalt des Röhrchens (10.000 xg, 1 min, 4 ° C).
4. Gel Loading und Elektrophorese Entwicklung
- Legen Sie die Elektrophoreseeinheit in eine mit Crushed Ice gefüllte Schale, um die Kammer bei 4 ° C während des Elektrophoreselaufs zu halten.
- Sorgfältig pipettieren Sie 5 μl jeder Probe in die entsprechende Vertiefung. Füge einen geeigneten DNA-Größenmarker hinzu.
- Stecken Sie die Elektroden in die entsprechenden Steckplätze des Netzteils. Schalten Sie das Netzteil ein und stellen Sie die Spannung auf 100 V und führen Sie das Gel für 90 min.
5. Gel-Färbung zur Beobachtung der tRNA-Protein-Wechselwirkung
- Die Färbelösung durch Mischen von 50 ml TBE mit 1x eines geeigneten DNA-Flecks zubereiten. Vermeiden Sie es, die Färbelösung dem Sonnenlicht auszusetzen, indem Sie den Färbebehälter mit Aluminiumfolie abdecken.
HINWEIS: DNA-Flecken werden in der Regel als 10.000 oder 20.000x konzentrierte Bestände gelagert. - Nach 90 min Elektrophorese entfernen Sie das Gel vorsichtig aus dem Tablett und legen es in einen Behälter mit Färbelösung. Legen Sie es auf eine Wippe bei niedriger Schaukelgeschwindigkeit bei RaumtemperaturUre für 30 min.
- Entfernen Sie das Agarosegel aus dem Färbebehälter, klopfen Sie es sorgfältig auf ein Stück Zellstoffgewebe oder Filterpapier, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen, und legen Sie es direkt auf einen Transilluminator. Schalte das UV-Licht ein, um Bänder mit tRNA zu visualisieren. Nehmen Sie ein Foto von dem Gel.
- Proteinfärbung (optional).
- Die DNA-Färbelösung sicher (nach Sicherheitsverfahren) verwerfen und mit 50 ml Coomassie Brilliant Blue (CBB) -Lösung ersetzen. Legen Sie das Tablett auf eine Wippe bei Raumtemperatur und Fleck über Nacht (> 12 h). Die CBB-Färbelösung verwerfen und mit 50 mL PBS ersetzen, um überschüssigen Farbstoff zu entfernen. Für 1 h auf einer Wippe entschuldigen.
- Visualisierung von Protein enthaltenden tRNA-Komplexen unter einem leichten Transilluminator und fotografieren das Gel, um mit dem tRNA-UV-Gelbild zu vergleichen.
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Representative Results
Große Mengen an tRNA (UUU) können durch Expression des tRNA-Gens in E. coli unter der Kontrolle eines stark induzierbaren T7-Promotors erhalten werden. Die exprimierte tRNA (UUU) akkumuliert im Cytoplasma und ist über den Pool von natürlich reichlich vorhandenen tRNAs angereichert. Ein zweistufiger Reinigungsprozess, der aus einem Einfang / Extraktionsschritt und einem Gelfiltrations- / Polierschritt bestand, wurde verwendet, um eine eTA-Klasse-tRNA zu erhalten. Der Einfang / Extraktionsschritt verwendet pH 4,3 Phenol, um die gleichzeitige Ausfällung von Protein, Zelltrümmer, DNA und die Extraktion von tRNA (und anderen RNA-Molekülen) zu erreichen. Bei diesem Schritt kann die Menge des gesamten tRNA-Pools durch Elektrophorese auf einem 2% igen w / v-Agarosegel beurteilt werden. Der zweite Schritt beinhaltet die Gelfiltrationschromatographie, die die RNA-Spezies nach ihrer Molekülgröße trennt. Die UV-Spur bei 254 nm wird verwendet, um die Trennung zu überwachen und die Hauptelutionsspitzen zu identifizieren ( Abbildung 1Oben). Repräsentative Aliquots von Peakfraktionen wurden auf einem 2% w / v Agarosegel zur Analyse durchgeführt ( Abbildung 1 unten ). Die Mehrheit der tRNA-Moleküle koexuliert in einem einzigen Peak (der Mitte) des Chromatographie-Laufs (hier 75,5 ml in einer 120 ml-Bett-Säule). Bei der Trennung von Pools, die eine einzige überexprimierte Spezies enthalten, wie tRNA (UUU), gehören mehr als 90% der tRNA-Moleküle im Pool zu dieser spezifischen tRNA, während die verbleibenden Moleküle den natürlich abfälligen tRNAs entsprechen. Sekundäre Peaks werden sowohl vor als auch nach dem tRNA-haltigen zentralen Peak beobachtet. Die Peak (s) vorher enthalten teilweise abgebaut größere RNA-Moleküle (Fraktionen 26 und 32, Stäbe in Abbildung 1 ) und die Peaks am Ende des Reinigungslaufs enthalten sehr kleine RNAs und Verunreinigungen (Fraktionen 45 und 51; Stäbe in Abbildung 1 ). Nach dem Bündeln der Fraktionen unter dem zentralen Gipfel (Fraktionen 39-43; Stäbe in Abbildung 1 ) kann die Menge der gereinigten tRNA durch UV-Spektroskopie und / oder durch Vergleich mit Molekulargrößenstandards auf einem 2% igen w / v Agarosegel quantifiziert werden.
Die TcdA- und tRNA- (UUU-) Proben können in verschiedenen Molverhältnissen von 1,0 bis 10,0 unter Verwendung eines semi-logarithmischen Probenentnahmeschemas ( Tabelle 1 ) gemischt und auf 2% w / v Agarosegelen abgetrennt werden ( Abbildung 2 ). Abhängig von der Stabilität der Protein-tRNA-Komplexe und der Stöchiometrie der Bindung können ein oder mehrere Banden auf dem Gel sichtbar gemacht werden. Für TcdA-tRNA (UUU) wird ein stöchiometrischer Komplex gebildet, der als isolierte Band mit Protein und tRNA läuft. Typischerweise wandert die freie tRNA schneller und kann am Boden des Gels beobachtet werden, während Protein-tRNA-Komplexe, die weniger negativ geladen und grßer sind, dazu neigen, langsamer zu wandern. Fig. 2 zeigt eine Darstellung Ative 2% w / v Agarosegel von TcdA-tRNA (UUU) -Komplexen. In Fig. 2 dienen die TcdA-only- und tRNA-only-Banden als Negativkontrollen. Wenn das molare Verhältnis von TcdA: tRNA (UUU) zunimmt, nimmt die Menge an TcdA-tRNA (UUU) -Komplexen, die auf Kosten der freien tRNA-Bande gebildet wird, zu. Man beachte, daß die Intensität der freien tRNA abnimmt, wenn die Menge an TcdA zunimmt. Der erste zu bildende Komplex ist ein 2: 1 stöchiometrischer Komplex, der ein tRNA-Molekül pro TcdA-Dimer enthält (sichtbar in den Bahnen mit 10, 20 oder 30 μM TcdA). Bei der TcdA-Sättigung entwickelt sich ein größerer Molekulargewichts-TcdA-tRNA (UUU) -Komplex, der einen 2: 2-stöchiometrischen Komplex enthält, wobei beide TcdA-Untereinheiten jeweils an ein tRNA (UUU) -Molekül gebunden sind (sichtbar in Spuren mit 30, 50 oder 75 & mgr; M). Die beiden letzten Bahnen mit TcdA (50 oder 75 μM) haben die gesamte tRNA in der Reaktion gebunden und fehlen eine freie tRNA-Bande.
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Abbildung 1: Reinigung von tRNA (UUU) durch Gelfiltration. Chromatogramm (oben) der Gelfiltration von tRNA (UUU) über eine hochauflösende präparative Gelfiltrationssäule, die bei 254 nm aufgezeichnet wurde. Der höchste Peak, der den in tRNA (UUU) angereicherten tRNA-Pool enthält, wird bei ~ 75,5 ml eluiert. Ein 2% iges w / v Agarosegel (unten) wurde mit Aliquoten aus den verschiedenen tRNA-Elutionsfraktionen durchgeführt. M, Molekülgröße Leiter. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Gel-Retardations-Assay mit TcdA und tRNA (UUU). EMSA liefert Beweise für die physikalische Bindung von tRNA an TcdA. Die Proben wurden auf einem 2% igen w / v-Agarosegel bei 4 ° C für 90 min durchgeführt. Eine feste Menge an tRNA (UUU), 7,5 μM, wurde mit variablen Mengen an TcdA gemischt (siehe Tabelle 1 ), und Protein-tRNA-Komplexe wurden während des Elektrophoreselaufs abgetrennt. Das Gel wurde gefärbt und auf einem UV-Transilluminator sichtbar gemacht. Jede Spur enthält 5 μl Probe. M, Molekülgröße Leiter. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Der hierin beschriebene Protein-tRNA-Agarose-Gel-Retardierungs-Assay kann auf eine Anzahl von Weisen modifiziert werden. Zuerst kann der Prozentsatz der Agarose im Gel reduziert werden, um die Trennung und Visualisierung von Protein-tRNA-Komplexen signifikant größer zu machen als die hier analysierte (120 kDa). Zweitens, wenn das Zielprotein thermolabile ist, müssen zusätzliche Vorkehrungen getroffen werden, um sicherzustellen, dass die Temperatur unterhalb der maximal akzeptablen Temperatur gehalten wird, indem die Elektrophoresevorrichtung in einen kalten Raum bewegt wird oder indem Eispackungen in der Elektrophoresekammer verwendet werden, um die erzeugte Wärme sofort zu zerstreuen Während des laufes Andere Pufferzusammensetzungen ( z. B. 0,5X TB, Tris-borat) und laufende Parameter (> 20 V / cm) können modifiziert werden, um die Laufzeit zu verkürzen, falls erforderlich oder für die Proben 11 akzeptabel. Die vorgeschlagene MgCl 2 -Konzentration kann reduziert werden, wenn der RNA-Abbau während des Probenvorbereitungsschrittes beobachtet wird, da zweiwertige KatiOns kann die Spaltung von Nukleinsäuren potentiell katalysieren.
Die Hauptbeschränkung der Technik besteht darin, dass die Protein-tRNA-Banden typischerweise etwas diffuser sind als diejenigen, die bei Acrylamid-basierten Gel-Retardierungsverfahren gesehen werden, die dazu neigen, schärfer und klarer zu sein. Eine weitere Einschränkung ist, dass breitere, längere Gele für die gleichzeitige Analyse mehrerer Proben notwendig sein können und wenn Protein-tRNA-Komplexe verschiedener Größen und Ladungen aufgelöst werden sollen.
Im Vergleich zu existierenden Verfahren liefert der Protein-tRNA-Agarose-Gel-Retardierungs-Assay eine signifikante Reduktion der Arbeitszeit und der Zeit von der Probenvorbereitung bis zur Analyse. Acrylamidgele, enthalten schädliche Chemikalien, sind aufwendig vorzubereiten und länger zu polymerisieren. Im Gegensatz dazu sind Agarosegele einfach, schnell zu gießen und zu setzen, und beinhalten keine toxischen Chemikalien. Das Experiment kann in 2 h abgeschlossen werden. Dazu gehören 30 min für das Gel, 15 min für die Probenvorbereitung (was sein kannGetan beim Kühlen der Agarose), 90 min für die Elektrophorese und Visualisierung.
Zukünftige Anwendungen des Verfahrens können die in diesem Protokoll verwendeten Nachweisverfahren verfeinern und auf den Nachweis von weniger reichhaltigen, instabileren RNA-Spezies oder auf Proteinkomplexe anwenden, die nur in sehr geringen Mengen exprimiert werden können. Die Markierung der RNA oder der Proteinkomponente mit hochempfindlichen Fluorophoren würde den Nachweis kleinerer Mengen an Protein-RNA-Komplexen ermöglichen. Darüber hinaus könnten unter Verwendung von Fluorophoren mit nicht überlappenden Emissions- / Anregungspeaks Multiplex-Experimente ermöglichen, bei denen verschiedene Protein- und / oder RNA-Spezies gleichzeitig in einem einzigen Experiment sichtbar gemacht werden konnten.
Es gibt drei kritische Schritte in diesem Protokoll. Der erste und offensichtlichste kritische Schritt ist die Expression und Reinigung von tRNA (UUU). Wenn die Menge der gereinigten tRNA (UUU) unterhalb einer bestimmten minimalen Nachweisgrenze liegt (zwischen 25-200 ng tRNA pro Bande)) Oder Degradationsbanden als niedermolekulare Verunreinigungen sichtbar werden, sollte die tRNA verworfen und erneut gereinigt werden. Die Verwendung von Säurephenol (pH 4,3) während der tRNA-Extraktion ist essentiell, da sie selektiv DNA ausfällt, während RNA löslich bleibt. Der zweite kritische Schritt betrifft die Herstellung der Protein-tRNA-Proben zur Analyse. Ausreichende Mengen an Protein und tRNA müssen verwendet werden, um die robuste Detektion aller gebildeten Komplexe zu ermöglichen. Die molaren Verhältnisse von Protein-tRNA müssen angepasst werden, um das Gleichgewicht zur komplexen Bildung zu verschieben. Der dritte kritische Schritt ist die Elektrophorese. Der TBE-Puffer muss frisch verwendet werden (nicht wiederverwendet) und es ist notwendig, die Agarosegele bei Temperaturen zu halten, bei denen die Protein-tRNA-Komplexe stabil sind und nicht denaturieren (typischerweise 4-10 ° C). Es muss darauf geachtet werden, das Agarosegel während der gesamten Elektrophorese kalt zu halten, indem man beispielsweise die Elektrophoresekammer mit Eis umgibt und, wann immer möglich, das Experiment durchführtT in einem kalten Raum bei 4 ° C.
Wir haben eine einfache Methode zur Analyse, Charakterisierung von Protein-tRNA-Komplexen unter Verwendung von TcdA-tRNA (UUU) als Modellsystem und unter Verwendung von Agarose-Gelelektrophorese anstelle von Acrylamid-Elektrophorese gezeigt. Letzteres dauert länger und ist wesentlich mühsamer. Unter Verwendung dieses Verfahrens kann die elektrophoretische Trennung auf 2% w / v Agarosegelen (8 cm Gelformate) in weniger als 90 min durchgeführt werden. Dies ist ein praktisches Werkzeug für die Analyse von Protein-tRNA-Wechselwirkungen und ermöglicht die gleichzeitige Analyse mehrerer Proben. Varianten von tRNA und / oder Proteinmutanten können mit dieser Methode auf Bindung und Stabilität untersucht werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
MCV ist Mitglied des CIB Intramural Programms "Molecular Machines for Better Life" (MACBET). Die Forschungsergebnisse, die zu diesen Ergebnissen führten, wurden vom spanischen Instituto de Salud Carlos III (PI12 / 01667 bis MCV), dem spanischen Ministerio de Economía y Competitividad (CTQ2015-66206-C2-2-R und SAF2015-72961-EXP bis MCV) gefördert ), Die Regionalregierung von Madrid (S2010 / BD-2316 bis MCV) und die Europäische Kommission (Rahmenprogramm 7 (RP7)) Projekt ComplexINC (Vertrag Nr. 279039 bis MCV). Die Förderer hatten keine Rolle in Studienentwurf, Datenerfassung und -analyse, Entscheidung zur Veröffentlichung oder Vorbereitung des Manuskripts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| E. coli BL21(DE3) | Novagen | 70235 | DE3 lysogen contains T7 polymerase upon IPTG induction. |
| pET23d | Novagen | 69748-3 | pET23d confers resistance to ampicillin; T7 promoter. |
| LB Broth, Low Salt (Lennox L Broth), Granulated | Melford | GL1703 | Conventional LB Broth, High Salt, can also be used. |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | 10419313 | |
| Incubator Shaker (Thermostated) | NBS | Excella E24 | Any shaker incubator with temperature control can be used. |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG), >=99% | Acros Organics | BP1755 | |
| Sodium acetate, anhydrous, >99% | Melford | B4017 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), Disodium salt, >99% | Acros Organics | AC327205000 | Harmful if inhaled. |
| Centrifuge (refrigerated) | Eppendorf | 5430 | |
| Centrifuge (refrigerated) rotor | Eppendorf | 5430/5430P | |
| Centrifuge | Sorvall | RC5C | |
| Centrifuge rotor | Sorvall | SLA-3000 | |
| Phenol solution, Saturated with 0.1 M citrate buffer, pH 4.3 ± 0.2 | Sigma-Aldrich | P4682 | Acute toxicity (oral, dermal, inhalation), corrosive |
| Ethanol absolute for analysis, 100% v/v | Merck Millipore | 100983 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate, Na2HPO4, >=99% | Sigma-Aldrich | 71643 | |
| Potassium dihydrogen phosphate, KH2PO4 | Merck | 48,730,250 | |
| HiLoad 16/60 Superdex 75 | GE Healthcare | 28989333 | |
| Agarose | Melford | MB1200 | |
| Tris [Tris(hydroxymethyl) aminomethane HCl] | Melford | T1513 | |
| Boric Acid | Melford | B0503 | |
| Microwave | Haier | HDA-2070M | |
| TCEP [Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride] | Sigma-Aldrich | C4706 | Corrosive to metals and skin. |
| ATP [Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate], Grade I, >=99% | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| Magnesium chloride (MgCl2), anhydrous, >=98% | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Sodium chloride (NaCl), >99% | Fisher Bioreagents | BP358 | |
| Potassium chloride (KCl), >99% | Melford | P0515 | |
| NZYDNA Ladder VI | NZYtech | MB8901 | |
| Power supply | Consort | EV261 | |
| Electrophoresis unit | Real Laboratory | RELSMINI10 | |
| Real Safe nucleic acid staining | Real Laboratory | RBMSAFE | 20,000X stock |
| UV Transilluminator (G:Box/EF) | Syngene | 2216498 | |
| Coomassie Brilliant Blue G | Sigma-Aldrich | B0770 | |
| Rocker (Gyro-Rocker) | Stuart | SSL3 | |
| Mixer Vortex | Fisher brand | 13214789 |
References
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- López-Estepa, M., et al. The crystal structure and small-angle X-ray analysis of CsdL/TcdA reveal a new tRNA binding motif in the MoeB/E1 superfamily. Plos One. 10 (4), e0118606 (2015).
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