Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

البروتين الحمض الريبي النووي النقال - أغروز فحوصات جل التخلف عن تحليل Published: June 21, 2017 doi: 10.3791/55638
Automatic Translation
1,2,3, 1, 1, 1, 1
1Department of Physical Chemical Biology, Center for Biological Research (CIB-CSIC), Spanish National Research Council (CSIC), 2Department of Immunology, Complutense University School of Medicine, 3Abvance Biotech srl

Summary

ويرد بروتوكول لإنتاج الحمض الريبي النووي النقال (وو) وتحليل الحمض الريبي النووي النقال (ووو) في مجمع مع تسدا انزيم من قبل الاغاروز فحوصات التخلف هلام.

Abstract

علينا أن نظهر أساليب للتعبير وتنقية الحمض الريبي النووي النقال (أوو) في الإشريكية القولونية والتحليل من خلال المقايسات التخلف هلام من ربط الحمض الريبي النووي النقال (أوو) إلى تسدا، و N 6 -threonylcarbamoyladenosine (ر 6 A) ديهيدراتاس، الذي سيكليزس ثريونيلكاربامويل سلسلة جانبية تعلق على A37 في حلقة الجذعية أنتيكودون (أسل) من ترناس إلى دوري T 6 A (كت 6 A). ويتسبب النسخ من ترميز الحمض الريبي النووي النقال ترميز الحمض النووي الريبي (أوو) في E. القولونية مع 1 ملي الآيزوبروبيل β-D-1-ثيوغالاكتوبيرانوسيد (إيبت) ويتم حصاد الخلايا التي تحتوي على الحمض الريبي النووي النقال 24 ساعة بعد الاستقراء. يتم تنقية جزء الحمض النووي الريبي باستخدام طريقة استخراج الفينول حمض. يتم الحصول على الحمض الريبي النووي النقال النقي من قبل اللوني الترشيح هلام أن يفصل بكفاءة الجزيئات الحمض الريبي النووي النقال صغيرة الحجم من أكبر الأحماض النووية سليمة أو مجزأة. لتحليل تسدا ملزمة ل الحمض الريبي النووي النقال (وو)، يتم خلط تسدا مع الحمض الريبي النووي النقال (وو) وفصلها على هلام الاغاروز الأصلي في 4 درجات مئوية.الحمض الريبي النووي النقال مجانا (وو) يهاجر بشكل أسرع، في حين أن المجمعات تسدا-ترنا (وو) تخضع للتخلف التنقل التي يمكن ملاحظتها عند تلطيخ هلام. علينا أن نظهر أن تسدا هو الحمض الريبي النووي النقال (وو) - انزيم ملزمة. هذا الفحص هلام التخلف يمكن استخدامها لدراسة المسوخ تسدا وآثار الإضافات والبروتينات الأخرى على ملزمة.

Introduction

اختبار التخثر هلام 1 (المعروف أيضا باسم التحولات الكهربي التحول التحول، إمزا) هو طريقة إليكتروفوريتيك مصممة لدراسة وتوصيف التفاعلات حمض البروتين النووي. فإنه يسمح لتحليل البروتين الحمض النووي، فضلا عن التفاعلات البروتين رنا وعلى وجه الخصوص، والتفاعلات بين الحمض الريبي النووي النقال والبروتينات ملزمة الحمض الريبي النووي النقال، وذلك باستخدام إما مكونات تنقية أو مخاليط معقدة من البروتينات (على سبيل المثال ، خلية لستيس) أو الأحماض النووية (على سبيل المثال ، الحمض الريبي النووي النقال حمامات). لقد قمنا بتطبيق مقايسات التخلف هلام لدراسة التفاعل بين الحمض الريبي النووي النقال المنقى (وو) و تسدا، و N 6- ثريونيلكاربامويلادينوسين (ر 6 A) ديهيدراتاز، الذي سيكليزس سلسلة جانبية ثريونيلكاربامويل تعلق على A37 في حلقة الجذعية أنتيكودون (أسل) من ترناس إلى دوري t 6 (ط 6 أ) 2 ، 3 . ومن المعروف أيضا تسدا كما سدل 3 ،f "> 4. يشكل الجين تسدا / كسدل كتلة مع جينات كسدا و كسد 5 ، التي ترميز ديسولفورياز السيستين والمتقبل الكبريت من سيستين سلفيناز ديسولفينات (كسد) النظام ومطلوب للحفاظ على وظيفة تكدا في الجسم الحي 3 .

الأساس المنطقي وراء المقايسات التخلف هلام هو أنه في حين أن جزيئات الحمض النووي الحرة تهاجر بسرعة إلى الجزء الأمامي من المواد الهلامية الأكريلاميد أو الاغاروز بحكم تهمة سلبية كبيرة، والتنقل الكهربي من المجمعات البروتين من نفس الأحماض النووية هو انخفاض كبير. يتم تصور الانخفاض في التنقل باعتباره "التحول" في المجمعات الحمض النووي البروتين، والتي حلت كما العصابات منفصلة. المشحونة إيجابيا وأكبر مجمع الحمض النووي البروتين تظهر زيادة التحول أو الحد في التنقل على هلام.

منذ تهمة تهمة المجمع هو ظاهرة عالميةلمجمعات حمض البروتين النووي، ويمكن تطبيق فحص التخثر هلام لمجموعة واسعة من المجمعات وأنواع الحمض النووي. طريقة بسيطة وغير مكلفة، ويمكن إجراءها في المختبرات مع الحد الأدنى من المعدات. فإنه يتطلب كميات صغيرة فقط من البروتينات والحمض النووي الريبي. وهذه ميزة على التقنيات الفيزيائية الحيوية البديلة التي تستهلك عادة كميات أكبر من العينة.

وقد استخدمت على نطاق واسع اختبار التخلف هلام لدراسة عوامل النسخ. وقد استخدمت مقايسة لتحليل حركية ملزمة، والقوة، وخصوصية عوامل النسخ للعديد من تسلسل الحمض النووي المختلفة. وكان في الواقع في هذا المجال أن إمسا وضعت لأول مرة 6 ، 7 . وقد استخدمت أيضا فحوصات التخلف هلام مع رنا 8 ، 9 ، 10 ، 11 والجزيئات الحمض الريبي النووي النقال في البحوث الريبوسوموتحليل، كما نفعل هنا، الإنزيمات التي تعدل نوكلأوسيدس الحمض الريبي النووي النقال بعد ترانسكريبتيونالي.

العديد من المعلمات المختلفة تؤثر على نتيجة لفحص هلام التخلف مثل درجة الحرارة، ونوعية البروتين وعينة الحمض الريبي النووي النقال، وقوة ملزمة. التخطيط الدقيق وتنفيذ التجربة أمر حاسم لتفسير نتائج الحمض النووي الحرة والأنواع المرتبطة بالبروتين. هنا، استخدمنا الجين الاصطناعية ترنا الحمض الريبي النووي النقال (أوو) المستنسخة في ناقلات التعبير الذي يفتقر المروج على شاين دالغارنو ريبوسوم موقع ملزم، مما يؤدي إلى تخليق كميات كبيرة من الحمض الريبي النووي النقال 2 . ويهدف هذا البروتوكول مفصل لتوفير دليل واضح لأداء الحمض النووي الريبي الحمض النووي الريبي التخلف التجارب مع تجنب الأخطاء الشائعة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تنبيه: استشر جميع صحائف بيانات سلامة المواد ذات الصلة (مسس) قبل الاستخدام. العديد من المواد الكيميائية المستخدمة في هذا البروتوكول هي سامة وتآكل. استخدام الممارسات المناسبة عند تنفيذ استخراج الحمض الريبي النووي النقال باستخدام الفينول، بما في ذلك استخدام غطاء الدخان ومعدات الحماية الشخصية (نظارات السلامة، والقفازات، معطف المختبر، والسراويل كامل طول، وأحذية مغلقة اصبع القدم، وما إلى ذلك ). يستخدم هذا البروتوكول وصمة عار الحمض النووي غير سامة. قد يتطلب استخدام البقع البديلة احتياطات إضافية والتخلص المتخصص من عامل تلطيخ إذا سامة و / أو مسرطنة (على سبيل المثال ، إيثيديوم بروميد).

1. إعداد أغاروس هلام

  1. تزن 2 غرام من الاغاروز وإضافته إلى زجاجة لإعداد 2٪ ث / الخامس الاغاروز هلام.
  2. إضافة 100 مل من 1X تريس-بورات-إثيلينديامينيتتراسيتيك حمض (إدتا) (تب) تشغيل عازلة إلى زجاجة تحتوي على الاغاروز. تذوب عن طريق التسخين في الميكروويف. على فترات 30 ثانية، دوامة محتويات لخلطجيدا وتكرار هذه الخطوة حتى يتم حل الاغاروز تماما. السماح حل الاغاروز يبرد إلى ما يقرب من 50-60 درجة مئوية.
  3. الشريط حواف مفتوحة من علبة هلام لخلق العفن، ووضع مشط مناسب لإنشاء الآبار ويلقي الاغاروز المنصهر في ذلك. تجنب تشكيل فقاعة والسماح لها ترسيخ في درجة حرارة الغرفة.
  4. مرة واحدة عزز، ضع علبة هلام في وحدة الكهربائي وملء مع تب العازلة حتى يتم تغطية هلام تماما.

2. إعداد الحمض الريبي النووي النقال

  1. التعبير عن الحمض الريبي النووي النقال (وو) في E. القولونية
    1. في الصباح، واستخدام قارورة من E.Coli القولونية BL21 (DE3) المجمدة تتحول مع ناقلات التعبير pET23d-إكوو 2 (المرافئ ترميز الجينات E. القولونية الحمض الريبي النووي النقال (ووو))، لخط منخفض الملح لوريا مرق (لب) لوحة تستكمل مع 100 ميكروغرام / مل أمبيسيلين. عكس لوحة ووضعه في حاضنة 37 درجة مئوية حتى تظهر المستعمرات (في وقت متأخر بعد الظهرأون).
    2. تطعيم واحدة نمت جيدا، مستعمرة واحدة في 5 مل لب بالإضافة إلى 100 ميكروغرام / مل أمبيسلين وتنمو بين عشية وضحاها في 220 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية.
    3. في صباح اليوم التالي، بيليه الخلايا (6،500 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية)، استبدال المتوسطة مع 5 مل لب الطازجة بالإضافة إلى 100 ميكروغرام / مل أمبيسيلين و ريسوسبيند. استخدام هذا التعليق لتطعيم 200 مل لب بالإضافة إلى 100 ميكروغرام / مل أمبيسيلين. تنمو لمدة 5 ساعات في 220 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية.
    4. عندما بلغت الكثافة البصرية للثقافة في 590 نانومتر (أود 590 ) 0.6 - 0.8، إضافة 1 ملي إيبت إلى الثقافة لتحريك التعبير عن الحمض الريبي النووي النقال (وو) الجينات. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات.
    5. حصاد الخلايا بواسطة الطرد المركزي الثقافة في 6،500 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية.
  2. تحلل واستخراج
    1. ريسوسبيند بيليه الخلية في 5 مل العازلة تحلل (0.3 M خلات الصوديوم، 10 ملي إدتا). من هذه النقطة فصاعدا، وتستخدم مخازن تعقيمها والحفاظ على جميع العينات التي تحتوي على الحمض الريبي النووي النقال عند 4 درجات مئوية لمنع تيتدهور الحمض النووي الريبي.
    2. إضافة 1 حجم الفينول حمض (الرقم الهيدروجيني 4.3) إلى بيليه الخلية معلق في غطاء الدخان. مزيج لمدة 1 دقيقة عن طريق عكس ل ليز الخلايا وأجهزة الطرد المركزي في 10،000 x ج (10 دقيقة، 4 درجات مئوية).
    3. جمع المرحلة المائية العليا التي تحتوي على الحمض الريبي النووي النقال ذوبان (وو) (وتركيزات أصغر من برك الحمض النووي الريبي الأخرى) باستخدام ماصة مع الحرص على عدم نضح المرحلة العضوية (القاع). تجاهل الطبقة السفلى وبيليه، والذي يتكون من المرحلة العضوية والحطام الخلية، في حاوية كافية.
    4. يعجل الحمض الريبي النووي النقال عن طريق خلط دقيق للذوبان (مائي) المرحلة مع 2.5 حجم 100٪ V / V الايثانول عن طريق انقلاب لمدة 1 ساعة عند 4 درجات مئوية. الطرد المركزي الخليط في 15،000 زغ (30 دقيقة، 4 درجات مئوية).
    5. صب طاف بعناية و ريسوسبيند بيليه الغنية الحمض الريبي النووي النقال في 4 مل العازلة الترشيح هلام (20 ملي فوسفات الصوديوم أو فوسفات البوتاسيوم، ودرجة الحموضة 7.4، 0.1 ملي إدتا). تشغيل 5 ميكرولتر من تجمع الحمض الريبي النووي النقال معلق على 2٪ ث / الخامس الاغاروز هلام.
      ملحوظة:يظهر نوعية جيدة الحمض الريبي النووي النقال كما الفرقة واحدة (حجم الجزيئي بين 50-100 بي بي).
  3. تنقية الحمض الريبي النووي النقال (وو)
    1. بعد الممارسة الكروماتوغرافية القياسية 12 ، تحميل الحمض الريبي النووي النقال معلق (ووو) على عالية الدقة التحضير هلام الترشيح العمود (أبعاد: 16 × 600 مم، حجم السرير: 120 مل، نطاق القرار: 1،000-70،000 دا) سابقا معايرتها في العازلة الترشيح هلام (المرحلة المتنقلة). تعيين معدل التدفق إلى 1 مل / دقيقة إلى أزل العينات.
      ملاحظة: الحمض الريبي النووي النقال (وو) الذروة إلوتس حوالي 75.5 مل. عادة، يمكن الحصول على العائد من 0.5-1.0 ملغ / لتر الحمض الريبي النووي النقال من الثقافة.
    2. تحليل العينات في مجلدات شطف ممثل عن طريق إليكتروفوريسينغ 5-10 ميكرولتر من كل عينة على 2٪ ث / الخامس أغاروس هلام.

3. إعداد العينة

  1. اكسبرس وتنقية تكدا وفقا لوبيز-إستيبا وآخرون . 2 -
    ملاحظة: ما يصل إلى 250 ميكرومترتسدا يمكن استخدامها للدراسة.
  2. ماصة المبلغ المقابل من تكدا وفقا للجدول 1 في وصفها بشكل صحيح أنابيب 1.5 مل الطرد المركزي. إضافة 1.6 مم تريس (2-كاربوكسيثيل) الفوسفين (تسيب) (التركيز النهائي) وخلط بلطف باستخدام ماصة. إغلاق الغطاء واحتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
  3. إضافة 10 ميكرومتر من ثلاثي الفوسفات أدينوسين (أتب) و 50 ملي مغكل 2 (تركيزات النهائية). مزيج مع ماصة واحتضان الخليط لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  4. إضافة الحمض الريبي النووي النقال المنقى (أوو) (القسم 2.3) وفقا للجدول 1 ، مزيج مع ماصة واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
  5. إضافة الفوسفات مخزنة المالحة (بس) ما يصل إلى 100 ميكرولتر الحجم النهائي. مزيج بشكل صحيح وإضافة الجلسرين إلى تركيز النهائي من 10٪ الخامس / الخامس.
  6. دوامة العينة وتدور لفترة وجيزة أسفل محتويات الأنبوب (10،000 x ج، 1 دقيقة، 4 درجات مئوية).

4. جل تحميل والتنمية الكهربي

  1. مكان وحدة الكهربائي في علبة مليئة الجليد سحق للحفاظ على غرفة في 4 درجات مئوية خلال تشغيل الكهربائي.
  2. بعناية، ماصة 5 ميكرولتر من كل عينة في المقابلة جيدا. إضافة مناسبة حجم الحمض النووي علامة.
  3. توصيل الأقطاب في فتحات المقابلة من وحدة امدادات الطاقة. بدوره على وحدة امدادات الطاقة وضبط الجهد إلى 100 فولت وتشغيل هلام لمدة 90 دقيقة.

5. جل تلطيخ لمراقبة الحمض الريبي النووي النقال-البروتين التفاعل

  1. إعداد حل تلطيخ عن طريق خلط 50 مل من تب مع 1X من وصمة عار الحمض النووي المناسب. تجنب تعريض حل تلطيخ لأشعة الشمس من خلال تغطية حاوية تلطيخ مع رقائق الألومنيوم.
    ملاحظة: عادة ما يتم تخزين البقع دنا كما 10،000 أو 20،000x الأسهم المركزة.
  2. بعد 90 دقيقة من الكهربائي، وإزالة بعناية هلام من علبة ووضعه في وعاء مع حل تلطيخ. وضعه على الروك في انخفاض سرعة هزاز في غرفة تمبراتأور لمدة 30 دقيقة.
  3. إزالة هلام الاغاروز من حاوية تلطيخ، اضغط عليها بعناية على قطعة من الأنسجة السليلوز أو ورقة تصفية لإزالة السائل الزائد، ووضعه مباشرة على ترانزيلوميناتور. التبديل على ضوء الأشعة فوق البنفسجية لتصور العصابات التي تحتوي على الحمض الريبي النووي النقال. التقاط صورة من هلام.
  4. تلطيخ البروتين (اختياري).
    1. تجاهل حل تلطيخ الحمض النووي بأمان (وفقا لإجراءات السلامة) واستبدالها مع 50 مل كوماسي بريليانت الأزرق (كبب) الحل. وضع الدرج على الروك في درجة حرارة الغرفة وصمة عار بين عشية وضحاها (> 12 ساعة). تجاهل حل تلطيخ مصرف البحرين المركزي واستبدالها مع 50 مل برنامج تلفزيوني لإزالة الصبغة الزائدة. إزاحة لمدة 1 ساعة على الروك.
  5. تصور المجمعات التي تحتوي على البروتين الحمض الريبي النووي النقال التي تحتوي على ترانزيلوميناتور الضوء والتقاط صور من هلام للمقارنة مع الحمض الريبي النووي النقال الصورة هلام الأشعة فوق البنفسجية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

كميات كبيرة من الحمض الريبي النووي النقال (وو) يمكن الحصول عليها عن طريق التعبير عن الجينات الحمض الريبي النووي النقال في E. القولونية تحت سيطرة محفز T7 قوي محفز. الحمض الريبي النووي النقال أعرب (أوو) يتراكم في السيتوبلازم ويتم إثراء على بركة من الحمض الريبي النووي النقال وفيرة بشكل طبيعي. وقد تم استخدام عملية تنقية من خطوتين تتكون من خطوة التقاط / الاستخراج، والهلام الترشيح / خطوة تلميع للحصول على الحمض الريبي النووي النقال الصف إمزا. الخطوة التقاط / استخراج يستخدم الرقم الهيدروجيني 4.3 الفينول لتحقيق هطول الأمطار في وقت واحد من البروتين، والحطام الخلية، والحمض النووي، واستخراج الحمض الريبي النووي النقال (وجزيئات الحمض النووي الريبي الأخرى). في هذه الخطوة، وكمية من مجموع الحمض الريبي النووي النقال تجمع يمكن تقييمها بواسطة الكهربائي على 2٪ ث / الخامس أغاروس هلام. وتتضمن الخطوة الثانية اللوني الترشيح هلام الذي يفصل أنواع الحمض النووي الريبي وفقا لحجمها الجزيئي. يتم استخدام أثر الأشعة فوق البنفسجية في 254 نانومتر لمراقبة الفصل وتحديد قمم شطف الرئيسي ( الشكل 1أعلى). تم تشغيل أليكوتس ممثل من ذروة الكسور على 2٪ ث / الخامس أغاروس هلام لتحليل ( الشكل 1 أسفل ). معظم جزيئات الحمض الريبي النووي النقال مشترك أزل في ذروة واحدة (الوسط) من تشغيل اللوني (هنا، 75.5 مل في عمود حجم السرير 120 مل). عند فصل برك تحتوي على نوع واحد أوفيركسرسد، مثل الحمض الريبي النووي النقال (وو)، أكثر من 90٪ من جزيئات الحمض الريبي النووي النقال في تجمع تنتمي إلى أن الحمض الريبي النووي النقال محددة، في حين أن الجزيئات المتبقية تتوافق مع الحمض الريبي النووي النقال وفيرة بشكل طبيعي. لوحظت قمم الثانوية على حد سواء قبل وبعد الحمض الريبي النووي النقال التي تحتوي على الذروة المركزية. الذروة (ق) قبل تحتوي على جزيئات رنا أكبر تحطمت جزئيا (الكسور 26 و 32؛ أشرطة في الشكل 1 )، والذروة (ق) في نهاية تشغيل تنقية تحتوي على رنا صغيرة جدا والملوثات (الكسور 45 و 51؛ الحانات في الشكل 1 ). بعد تجميع الكسور تحت الذروة المركزية (الكسور 39-43. والحانات في الشكل 1 )، وكمية من الحمض الريبي النووي النقال المنقى يمكن كوانتيتاتد بواسطة الأشعة فوق البنفسجية الطيفي و / أو بالمقارنة مع معايير حجم الجزيئي على 2٪ ث / أغ الاغاروز هلام.

يمكن خلط عينات تسدا و ترنا (أوو) بنسب مولار مختلفة من 1.0 إلى 10.0 باستخدام مخطط أخذ العينات شبه لوغاريتمي ( الجدول 1 ) وفصلها على 2٪ ث / أغ الاغاروز المواد الهلامية ( الشكل 2 ). اعتمادا على استقرار المجمعات البروتين الحمض الريبي النووي النقال وتناثرية ملزمة، ويمكن تصور واحد أو عدة العصابات على هلام. ل تسدا-الحمض الريبي النووي النقال (وو)، يتم تشكيل مجمع الكيمياء المتكافئة التي تعمل كفرقة معزولة تحتوي على كل من البروتين و الحمض الريبي النووي النقال. عادة، يهاجر الحمض الريبي النووي النقال مجانا بشكل أسرع ويمكن ملاحظتها في الجزء السفلي من هلام، في حين أن المجمعات البروتين الحمض الريبي النووي النقال، والتي هي أقل سلبا مشحونة وأكبر في الحجم، تميل إلى الهجرة أبطأ. ويبين الشكل 2 تمثيل أتيف 2٪ ث / الخامس أغاروس هلام من تسدا-الحمض النووي الريبي النووي (أوو) المجمعات. في الشكل 2 ، و تسدا فقط و الحمض الريبي النووي النقال فقط العصابات بمثابة الضوابط السلبية. كما تزدا: الحمض النووي الريبي النووي (و) زيادة نسبة المولي، وكمية من تسدا-ترنا (أوو) المجمعات تشكلت على حساب الفرقة الحمض الريبي النووي النقال الحرة، ويزيد. لاحظ أن شدة الحمض الريبي النووي النقال الحرة يتناقص مع زيادة كمية تسدا. أول مجمع لتشكيل هو 2: 1 مجمع متكافئ يحتوي على جزيء الحمض النووي الريبي واحد في دمار تسدا (مرئية في الممرات مع 10 أو 20 أو 30 ميكرومتر تسدا). في التشبع تسدا، يتطور أكبر مجمع الوزن الجزيئي تسدا-ترنا (أوو) الذي يحتوي على 2: 2 معقدة متكافئة، حيث كل من الوحدات الفرعية تسدا ملزمة لجزيء الحمض الريبي النووي النقال واحد (أوو) كل (مرئية في الممرات مع 30، 50 أو 75 ميكرومتر). اثنين من الممرات الأخيرة مع تسدا (50 أو 75 ميكرومتر) قد ربطت كل الحمض الريبي النووي النقال في رد الفعل وعدم وجود الحمض الريبي النووي النقال الحرة الفرقة.

tp_upload / 55638 / 55638fig1.jpg "/>
الشكل 1: تنقية الحمض الريبي النووي النقال (وو) من قبل الترشيح جل. كروماتوغرام (أعلى) من الترشيح هلام الحمض الريبي النووي النقال (وو) على ارتفاع عالية الدقة التحضير هلام الترشيح العمود سجلت في 254 نانومتر. يتم إلحاق أعلى قمة، تحتوي على بركة الحمض الريبي النووي النقال المخصب في الحمض الريبي النووي النقال (ووو) في ~ 75.5 مل. تم تشغيل 2٪ ث / الخامس أغاروس هلام (القاع) مع أليكوتس من مختلف الكسور الحمض الريبي النووي النقال شطف. M، الجزيئي حجم سلم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: الجل التأخر الفحص مع تسدا و الحمض الريبي النووي النقال (وو). يوفر إمزا أدلة على ملزمة المادية من الحمض الريبي النووي النقال إلى تسدا. تم تشغيل العينات على 2٪ ث / الخامس أغاروس هلام في 4 درجات مئوية لمدة 90 دقيقة. وهناك كمية ثابتة من الحمض الريبي النووي النقال (وو)، 7.5 μM، كانت مختلطة مع كميات متغيرة من تسدا (انظر الجدول 1 )، وتم فصل المجمعات البروتين الحمض الريبي النووي النقال أثناء تشغيل الكهربائي. كان ملطخة هلام وتصور على ترانسيلوميناتور الأشعة فوق البنفسجية. كل حارة تحتوي على 5 ميكرولتر من العينة. M، الجزيئي حجم سلم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ويمكن تعديل البروتين الحمض الريبي النووي النقال الاغاروز مقايسة التخثر هلام وصفها هنا في عدد من الطرق. أولا، يمكن تخفيض نسبة الاغاروز في هلام للسماح للفصل والتصور من المجمعات البروتين الحمض الريبي النووي النقال أكبر بكثير من واحد تحليلها هنا (120 كيلو دالتون). ثانيا، إذا كان البروتين المستهدف هو ثيرمولابيل، يجب اتخاذ الاحتياطات الإضافية لضمان أن يتم الاحتفاظ درجة الحرارة تحت الحد الأقصى من درجة الحرارة المقبولة عن طريق تحريك جهاز الكهربائي إلى غرفة باردة أو باستخدام حزم الجليد داخل غرفة الكهربائي لتبديد فورا الحرارة المنتجة أثناء التشغيل. يمكن تعديل تركيبات عازلة أخرى (على سبيل المثال ، 0.5X تب، تريس-بورات) ومعلمات تشغيل (> 20 V / سم) لتقصير وقت التشغيل إذا لزم الأمر أو مقبولة للعينات 11 . يمكن تخفيض تركيز مغكل 2 المقترحة إذا لوحظ تدهور الحمض النووي الريبي خلال الخطوة إعداد العينة، منذ كاتي ثنائي التكافؤيمكن أن يحفز على انشقاق الأحماض النووية.

الحد الرئيسي للتقنية هو أن العصابات البروتين الحمض الريبي النووي النقال هي عادة أكثر انتشارا قليلا من تلك التي ينظر إليها في الأساليب القائمة على الأكريلاميد التخلف هلام، والتي تميل إلى أن تكون أكثر وضوحا وأكثر وضوحا. قيود أخرى هي أن أوسع، هلام أطول قد يكون ضروريا للتحليل المتزامن للعينات متعددة وإذا المجمعات البروتين الحمض الريبي النووي النقال من مختلف الأحجام والشحن هي التي يتعين حلها.

بالمقارنة مع الطرق الموجودة، البروتين الحمض الريبي النووي النقال الاغاروز فحص هلام التخلف يتيح تخفيض كبير في العمل والوقت من إعداد العينة لتحليلها. المواد الهلامية الأكريلاميد، تحتوي على المواد الكيميائية الضارة، شاقة لإعداد وتأخذ وقتا أطول لبلمرة. في المقابل، الاغاروز المواد الهلامية هي بسيطة وسريعة لادلى وتعيين، ولا تنطوي على المواد الكيميائية السامة. يمكن أن تكتمل التجربة في 2 ساعة. وهذا يشمل 30 دقيقة ل هلام لضبط، 15 دقيقة لإعداد العينة (والتي يمكن أن تكونالقيام به في حين تبريد الاغاروز)، 90 دقيقة للالكهربائية والتصور.

التطبيقات المستقبلية لهذه الطريقة قد صقل طرق الكشف المستخدمة في هذا البروتوكول وتطبيقه على الكشف عن أقل وفرة، وغير مستقرة أنواع الحمض النووي الريبي، أو لمجمعات البروتين التي يمكن التعبير عنها إلا في كميات صغيرة جدا. وضع العلامات على الحمض النووي الريبي أو عنصر البروتين مع فلوروفوريس حساسة للغاية تسمح للكشف عن كميات صغيرة من البروتينات رنا المجمعات. وعلاوة على ذلك، فإن استخدام الفلوروفوريس مع قمم الانبعاث / الإثارة غير المتداخلة يمكن أن يسمح بتعدد التجارب حيث يمكن تصور أنواع مختلفة من البروتين و / أو الحمض النووي الريبي في وقت واحد في تجربة واحدة.

هناك ثلاث خطوات حاسمة في هذا البروتوكول. الخطوة الحرجة الأولى والأكثر وضوحا هي التعبير وتنقية الحمض الريبي النووي النقال (وو). إذا كانت كمية من الحمض الريبي النووي النقال المنقى (ووو) أقل من حد الحد الأدنى للكشف معين (بين 25-200 نغ الحمض الريبي النووي النقال لكل الفرقة)، أو العصابات تدهور تصبح واضحة كما الملوثات حجم الجزيئي أقل، ينبغي التخلص من الحمض الريبي النووي النقال وإعادة تنقيته. استخدام حمض الفينول (الرقم الهيدروجيني 4.3) خلال الحمض الريبي النووي النقال استخراج ضروري لأنه يعجل بشكل انتقائي الحمض النووي مع الحفاظ على الحمض النووي الريبي للذوبان. الخطوة الثانية الحاسمة تتعلق بإعداد البروتين الحمض الريبي النووي النقال عينات للتحليل. كميات كافية من البروتين والحمض الريبي النووي النقال يجب أن تستخدم للسماح للكشف قوية من جميع المجمعات تشكلت. يجب تعديل نسب مولار البروتين الحمض الريبي النووي النقال - بروتين لتحل محل التوازن نحو تشكيل معقد. الخطوة الحاسمة الثالثة هي الكهربائي. يجب استخدام المخزن المؤقت تب الطازجة (لا إعادة استخدامها) وأنه من الضروري للحفاظ على المواد الهلامية الاغاروز في درجات الحرارة حيث المجمعات البروتين الحمض الريبي النووي النقال مستقرة ولا تنكر (عادة، 4-10 درجة مئوية). يجب توخي الحذر للحفاظ على الاغاروز هلام البرد خلال الكهربائي بأكمله، على سبيل المثال، عن طريق المحيطة غرفة الكهربائي مع الجليد، كلما كان ذلك ممكنا، تشغيل إكسيريمنر في غرفة باردة عند 4 درجات مئوية.

لقد أثبتنا طريقة واضحة لتحليل، توصيف المجمعات البروتين الحمض الريبي النووي النقال باستخدام تدا-الحمض الريبي النووي النقال (ووو) كنموذج النظام، واستخدام الاغاروز الكهربائي هلام بدلا من الكهربائي الاكريلاميد. هذا الأخير يستغرق وقتا أطول لإكمال وأكثر شاقة بكثير. باستخدام هذه الطريقة، والفصل الكهربي على 2٪ ث / الخامس الاغاروز المواد الهلامية (8 سم الأشكال هلام) يمكن أن يتحقق في أقل من 90 دقيقة. هذا هو أداة مريحة لتحليل التفاعلات البروتين الحمض الريبي النووي النقال، ويسمح للتحليل في وقت واحد من عينات متعددة. يمكن فحص المتغيرات من الحمض الريبي النووي النقال و / أو المسوخ البروتين لربط والاستقرار باستخدام هذه الطريقة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

مكف هو عضو في برنامج سيب الداخلي "الآلات الجزيئية لحياة أفضل" (ماكبيت). وقد تلقت البحوث المؤدية إلى هذه النتائج تمويلا من المعهد الإسباني للسلود كارلوس الثالث (PI12 / 01667 إلى مكف)، والوزارة الإسبانية دي إكونوميا y كومبيتيتيفيداد (CTQ2015-66206-C2-2-R و SAF2015-72961-إكس إلى مكف )، والحكومة الإقليمية في مدريد (S2010 / بد-2316 إلى مكف)، والمفوضية الأوروبية (برنامج الإطار 7 (FP7)) كومبليكسينك (العقد رقم 279039 إلى مكف). ولم يكن للممولين دور في تصميم الدراسة، وجمع البيانات وتحليلها، أو قرار نشرها، أو إعداد المخطوطة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
E. coli BL21(DE3) Novagen 70235 DE3 lysogen contains T7 polymerase upon IPTG induction.
pET23d Novagen 69748-3 pET23d confers resistance to ampicillin; T7 promoter.
LB Broth, Low Salt (Lennox L Broth), Granulated Melford GL1703 Conventional LB Broth, High Salt, can also be used.
Ampicillin Sigma-Aldrich 10419313
Incubator Shaker (Thermostated) NBS Excella E24  Any shaker incubator with temperature control can be used.
Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG), >=99% Acros Organics BP1755
Sodium acetate, anhydrous, >99% Melford B4017
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), Disodium salt, >99% Acros Organics AC327205000 Harmful if inhaled.
Centrifuge (refrigerated) Eppendorf 5430
Centrifuge (refrigerated) rotor Eppendorf 5430/5430P
Centrifuge Sorvall RC5C
Centrifuge rotor Sorvall SLA-3000
Phenol solution, Saturated with 0.1 M citrate buffer, pH 4.3 ± 0.2 Sigma-Aldrich P4682 Acute toxicity (oral, dermal, inhalation), corrosive
Ethanol absolute for analysis, 100% v/v Merck Millipore 100983
Sodium phosphate dibasic dihydrate, Na2HPO4, >=99% Sigma-Aldrich 71643
Potassium dihydrogen phosphate, KH2PO4 Merck 48,730,250
HiLoad 16/60 Superdex 75  GE Healthcare 28989333
Agarose Melford MB1200
Tris [Tris(hydroxymethyl) aminomethane HCl] Melford T1513
Boric Acid Melford B0503
Microwave Haier HDA-2070M
TCEP [Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride] Sigma-Aldrich C4706 Corrosive to metals and skin.
ATP [Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate], Grade I, >=99% Sigma-Aldrich A2383
Magnesium chloride (MgCl2), anhydrous, >=98% Sigma-Aldrich M8266
Sodium chloride (NaCl), >99% Fisher Bioreagents BP358
Potassium chloride (KCl), >99% Melford P0515
NZYDNA Ladder VI NZYtech MB8901
Power supply Consort EV261
Electrophoresis unit Real Laboratory RELSMINI10
Real Safe nucleic acid staining Real Laboratory RBMSAFE 20,000X stock
UV Transilluminator (G:Box/EF) Syngene 2216498
Coomassie Brilliant Blue G Sigma-Aldrich B0770
Rocker (Gyro-Rocker) Stuart SSL3
Mixer Vortex  Fisher brand 13214789

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Scott, V., Clark, A. R., Docherty, K. The gel retardation assay. Methods Mol Biol. 31, 339-347 (1994).
  2. López-Estepa, M., et al. The crystal structure and small-angle X-ray analysis of CsdL/TcdA reveal a new tRNA binding motif in the MoeB/E1 superfamily. Plos One. 10 (4), e0118606 (2015).
  3. Miyauchi, K., Kimura, S., Suzuki, T. A cyclic form of N6-threonylcarbamoyladenosine as a widely distributed tRNA hypermodification. Nat Chem Biol. 9 (2), 105-111 (2013).
  4. Bolstad, H. M., Botelho, D. J., Wood, M. J. Proteomic analysis of protein-protein interactions within the Cysteine Sulfinate Desulfinase Fe-S cluster biogenesis system. J Proteome Res. 9 (10), 5358-5369 (2010).
  5. Loiseau, L., Ollagnier-de Choudens, S., Lascoux, D., Forest, E., Fontecave, M., Barras, F. Analysis of the heteromeric CsdA-CsdE cysteine desulfurase, assisting Fe-S cluster biogenesis in Escherichia coli. J Biol Chem. 280 (29), 26760-26769 (2005).
  6. Fried, M. G., Crothers, D. M. Equilibrium studies of the cyclic AMP receptor protein-DNA interaction. J Mol Biol. 172 (3), 241-262 (1984).
  7. Garner, M. M., Revzin, A. A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system. Nucleic Acids Res. 9 (13), 3047-3060 (1981).
  8. Rio, D. C. Electrophoretic mobility shift assays for RNA-protein complexes. Cold Spring Harb Protoc. 2014 (4), 435-440 (2014).
  9. Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift. Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).
  10. Yakhnin, A. V., Yakhnin, H., Babitzke, P. Gel mobility shift assays to detect protein-RNA interactions. Methods Mol Biol. 905, 201-211 (2012).
  11. Ream, J. A., Lewis, L. K., Lewis, K. A. Rapid agarose gel electrophoretic mobility shift assay for quantitating protein: RNA interactions. Anal Biochem. 511, 36-41 (2016).
  12. Hagel, L. Gel-filtration chromatography. Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 10, Unit 10.9 (2001).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 124، سدل، دوري ر
البروتين الحمض الريبي النووي النقال - أغروز فحوصات جل التخلف عن تحليل<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -threonylcarbamoyladenosine وظيفة تددا
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fernández, F. J., Gómez,… More

Fernández, F. J., Gómez, S., Navas-Yuste, S., López-Estepa, M., Vega, M. C. Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays for the Analysis of the N6-threonylcarbamoyladenosine TcdA Function. J. Vis. Exp. (124), e55638, doi:10.3791/55638 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter