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Biochemistry

प्रोटीन-टीआरएनए एगरोस जेल डिटैडेडेशन एसेरेस ऑफ़ द एनालिसिस Published: June 21, 2017 doi: 10.3791/55638
Automatic Translation
1,2,3, 1, 1, 1, 1
1Department of Physical Chemical Biology, Center for Biological Research (CIB-CSIC), Spanish National Research Council (CSIC), 2Department of Immunology, Complutense University School of Medicine, 3Abvance Biotech srl

Summary

एक प्रोटोकॉल टीआरएनए (यूयूयू) के उत्पादन के लिए प्रस्तुत किया गया है और एंजॉयस जेएल रिटेडेडेन एशेज द्वारा एंजाइम टीसीडीए के साथ परिसर में टीआरएनए (यूयूयू) का विश्लेषण किया गया है।

Abstract

हम एस्चेरीचिया कोलाई में टीआरएनए (यूयूयू) की अभिव्यक्ति और शुद्धिकरण के तरीकों को और टीआरएनए (यूयूयू) के बंधन के जीएल रिटर्डेशन एसेल्स द्वारा एनसी -6 -थोरोनिलकार्बामॉलेडेनोसिन (टी 6 ए) डीहाइड्राटेस के विश्लेषण का प्रदर्शन करते हैं, जो थ्रेनील्कार्बामॉयल चक्रीय टी 6 ए (सीटी 6 ए) में टीआरएनए के एंटीकोडन स्टेम लूप (एएसएल) में A37 से जुड़ी साइड चेन। सिंथेटिक जीन एन्कोडिंग टीआरएनए (यूयूयू) का ट्रांसक्रिप्शन ई। कोलाई में 1 एमएम isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (आईपीटीजी) के साथ प्रेरित किया जाता है और टीआरएनए वाले कोशिकाओं को 24 घंटे के बाद शामिल किया जाता है। आरएनए अंश को एसिड फिनोल निष्कर्षण पद्धति का उपयोग करके शुद्ध किया जाता है। शुद्ध टीआरएनए एक जेल निस्पंदन क्रोमैटोग्राफी द्वारा प्राप्त किया जाता है जो बड़े अक्षुण्ण या खंडित न्यूक्लिक एसिड से छोटे आकार के टीआरएनए अणुओं को कुशलता से अलग करता है। टीसीडीए को टीआरएनए (यूयूयू) के लिए बाइंडिंग का विश्लेषण करने के लिए, टीसीडीए को टीआरएनए (यूयूयू) के साथ मिश्रित किया जाता है और 4 डिग्री सेल्सियस पर एक देशी एगरोस जेल पर अलग होता हैनि: शुल्क टीआरएनए (यूयूयू) तेजी से पलायन करता है, जबकि टीसीडीए-टीआरएनए (यूयूयू) परिसरों में गतिशीलता मंदता होती है जिसे जेल के धुंधला पर देखा जा सकता है। हम यह दर्शाते हैं कि टीसीडीए एक टीआरएनए (यूयूयू) -बाइंडिंग एंजाइम है। इस जेल की मंदता परख का उपयोग टीसीडीए म्यूटेंट और बाइंडिंग पर एडिटिव्स और अन्य प्रोटीन के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।

Introduction

जेल रिडर्डेशन परख 1 (जिसे इलेक्ट्रोफोरेक्टिक गतिशीलता पारी परख के रूप में भी जाना जाता है, ईएमएसए) प्रोटीन-न्यूक्लिक एसिड इंटरैक्शन को अध्ययन और विशेषता के लिए डिज़ाइन किया गया एक इलेक्ट्रोफोरेक्टिक विधि है। यह प्रोटीन-डीएनए के विश्लेषण के साथ-साथ प्रोटीन-आरएनए बातचीत और विशेष रूप से, टीआरएनए और टीआरएनए बाध्यकारी प्रोटीन के बीच बातचीत, या तो शुद्ध घटकों या प्रोटीन के जटिल मिश्रण ( जैसे , सेल lysates) या न्यूक्लिक एसिड ( जैसे , टीआरएनए पूल)। हमने शुद्ध टीआरएनए (यूयूयू) और टीसीडीए, एन 6- थ्रेनीएल्कार्बामॉलेडिनोसिन (टी 6 ए) डिहाइड्रेटसे के बीच बातचीत के अध्ययन के लिए जेल रिटेडेडेन एशेज लागू किया है, जो एंटीकोडन स्टेम लूप (एएसएल) में ए 37 से जुड़े थ्रेनील्कार्बामॉयल साइड चेन को साइक्सेल करता है। टीआरएनए की चक्रीय टी 6 (सीटी 6 ए) 2 , 3 टीसीडीए को सीएसडीएल 3 के रूप में भी जाना जाता है ,एफ "> 4। टीसीडीए / सीएसडीएल जीन सीएसडीए और सीएसडीई जीन 5 के साथ एक क्लस्टर बनाती है, जो सिस्टीन डसफोरास और सिस्टीन सल्फाइनस डिस्ल्टिनेट (सीएसडी) प्रणाली के सल्फर स्वीकर्ता को एनकोड करते हैं और विवो 3 में टीसीडीए फ़ंक्शन को बनाए रखने के लिए आवश्यक है।

जेल रिटेडेडेन एल्स के पीछे का तर्क यह है कि, जबकि मुक्त न्यूक्लिक एसिड अणुओं को उनके बड़े नकारात्मक आरोपों के कारण एक्रिलमाइड या एगरोज़ जेल के मोर्चे पर तेजी से स्थानांतरित किया जाता है, वही न्यूक्लिक एसिड के प्रोटीन परिसरों की इलेक्ट्रोफोरेक्टिक गतिशीलता नाटकीय रूप से कम हो जाती है। गतिशीलता में कमी को न्यूक्लिक एसिड-प्रोटीन परिसरों में एक "बदलाव" के रूप में देखा जाता है, जो असतत बैंड के रूप में तय होता है। सकारात्मक रूप से चार्ज किया गया और बड़ा न्यूक्लिक एसिड-प्रोटीन परिसर एक जेल पर गतिशीलता में अधिक बदलाव या कमी दिखाता है।

चूंकि परिसर के प्रभारी निस्तारण एक सार्वभौमिक घटना हैप्रोटीन-न्यूक्लिक एसिड कॉम्प्लेक्सों के लिए, जेल डिटैडेडेशन परख परिसर और न्यूक्लिक एसिड प्रकारों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए लागू किया जा सकता है। विधि सरल, सस्ती है, और न्यूनतम उपकरणों के साथ प्रयोगशालाओं में आयोजित किया जा सकता है। इसमें प्रोटीन और टीआरएनए की थोड़ी मात्रा की आवश्यकता होती है। यह वैकल्पिक बायोफिजिकल तकनीक पर एक फायदा है, जो आम तौर पर बड़ी संख्या में नमूने का उपभोग करता है।

प्रतिलेखन कारकों के अध्ययन के लिए जेल की मंदता परख का व्यापक रूप से उपयोग किया गया है। परख कई अलग डीएनए दृश्यों के लिए बाध्यकारी कैनेटीक्स, शक्ति, और प्रतिलेखन कारकों की विशिष्टता का विश्लेषण करने के लिए उपयोग किया गया है। यह वास्तव में इस क्षेत्र में था कि ईएमएसए को पहली बार 6 , 7 विकसित किया गया था। आरआईए 8 , 9 , 10 , 11 और टीआरएनए अणुओं के साथ जेल रिटेडेडेशन एनाल्स का उपयोग राइबोसोम अनुसंधान में किया गया हैऔर विश्लेषण करने के लिए, जैसा कि हम यहां करते हैं, एंजाइमों में टीआरएनए न्यूक्लॉसाइड को ट्रांसलेटिलेशनल पोस्ट के बाद संशोधित किया जाता है।

कई अलग-अलग मापदंडों में जेल की मंदता परख के परिणाम जैसे कि तापमान, प्रोटीन की गुणवत्ता और टीआरएनए नमूना, और बाध्यकारी की शक्ति को प्रभावित करते हैं। नि: शुल्क न्यूक्लिक एसिड और प्रोटीन बाध्य प्रजातियों के परिणामों की व्याख्या के लिए प्रयोग की सावधानीपूर्वक योजना और निष्पादन महत्वपूर्ण है। यहां, हमने सिंथेटिक जीन एन्कोडिंग टीआरएनए (यूयूयू) का उपयोग एक्सप्रैक्शन वेक्टर में किया था जिसका प्रमोटर शाइन-डाल्गर्नो रिबोसोम बाइंडिंग साइट का अभाव है, जिससे टीआरएनए 2 की बड़ी मात्रा में संश्लेषण होता है। सामान्य गलतियों से बचते समय टीआरएनए जेल की मंदता के प्रयोगों के लिए एक स्पष्ट गाइड प्रदान करने के लिए यह विस्तृत प्रोटोकॉल का उद्देश्य है।

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Protocol

सावधानी: उपयोग करने से पहले सभी प्रासंगिक सामग्री सुरक्षा डेटा शीट (एमएसडीएस) से परामर्श करें। इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल कई रसायनों विषाक्त और संक्षारक हैं। फ़िनोम का इस्तेमाल करते हुए टीआरएनए की निकासी करते समय उचित अभ्यास का प्रयोग करें, जिसमें धूआं हुड और व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरण (सुरक्षा चश्मा, दस्ताने, प्रयोगशाला कोट, पूर्ण लंबाई वाली पैंट, बंद-पैर की अंगुली का जूते, आदि ) शामिल हैं। यह प्रोटोकॉल एक गैर विषैले न्यूक्लिक एसिड दाग का उपयोग करता है। विषाक्त और / या कैसिनोजेनिक ( जैसे , नैथिडियम ब्रोमाइड), वैकल्पिक दागों के उपयोग को अतिरिक्त सावधानी और धुंधला एजेंट के विशेष निपटान की आवश्यकता हो सकती है।

1. Agarose जेल की तैयारी

  1. Agarose के 2 ग्राम वजन और एक 2% वाइड / agarose जेल तैयार करने के लिए एक कांच की बोतल में जोड़ें।
  2. Agarose युक्त बोतल में 100 एमएल 1x ट्राइस-बोरेट-एथिलेनेयनिइमेनेटेटिक एसिड (ईडीटीए) (टीबीई) चलने वाला बफर जोड़ें। एक माइक्रोवेव में हीटिंग द्वारा पिघल 30 के अंतराल पर, सामग्री को मिश्रण करने के लिए भंवरअच्छी तरह से और जब तक agarose पूरी तरह भंग है इस कदम को दोहराने। Agarose समाधान को लगभग 50-60 डिग्री सेल्सियस तक शांत करने दें
  3. एक मोल्ड बनाने के लिए एक जेल ट्रे के खुले किनारों को टेप करें, कुएं बनाने के लिए एक उचित कंघी रखें और इसमें पिघला हुआ एगारोज डालें। बुलबुले के गठन से बचें और इसे कमरे के तापमान पर स्थिर करें।
  4. एक बार जमकर, एक वैद्युतकणसंचलन इकाई में जेल ट्रे रखें और टीबीई बफर से भरें जब तक कि जेल पूरी तरह से कवर नहीं हो जाता।

2. टीआरएनए की तैयारी

  1. ई। कोलाई में एक्सप्रेस टीआरएनए (यूयूयू)
    1. सुबह में, जमे हुए ई। कोली बीएल 21 (डीई 3) का एक शीशी का प्रयोग करें, जो कम-नमक लुरीया ब्रोथ (एलबी) के लकीर के लिए अभिव्यक्ति वेक्टर पीईटी 23 डी-ईकेयूयूयूयू 2 (जीन एन्कोडिंग ई कोलाई टीआरएनए (यूयूयू) प्लेट 100 μg / एमएल एम्पीसिलीन के साथ पूरक प्लेट को उलटा दें और इसे 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में डाल दें जब तक कि कालोनियों को दिखाई नहीं देता (देर से पूर्वoon)।
    2. 5 एमएल एलबी प्लस 100 μg / एमएल एम्पीसिलीन में एक अच्छी तरह से विकसित, एकल कॉलोनी डालना और 37 डिग्री सेल्सियस पर 220 आरपीएम पर रात भर बढ़ता है।
    3. अगली सुबह, कोशिकाओं (6,500 x 10 डिग्री सेल्सियस 4 डिग्री सेल्सियस) पर गोली करें, 5 एमएल ताजा एलबी प्लस 100 मिग्रा / एमएल एम्पीसिलीन और रेसस्पेंड के साथ मध्यम बदलें। इस निलंबन का उपयोग 200 एमएल एलबी प्लस 100 माइक्रोग्राम / एमएल एम्पीसिलीन से करें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 220 आरपीएम पर 5 घंटे के लिए बढ़ोतरी
    4. जब 590 एनएम (ओडी 590 ) पर संस्कृति का ऑप्टिकल घनत्व 0.6-0.8 पर पहुंच गया, तो टीआरएनए (यूयूयू) जीन की अभिव्यक्ति को ट्रिगर करने के लिए संस्कृति में 1 एमएम आईपीटीजी जोड़ना। 3 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 6,500 xg पर संस्कृति को केन्द्रित करके कोशिकाओं का फसल करें।
  2. Lysis और निष्कर्षण
    1. 5 मिलीलीटर की बफर में सेल गोली resuspend (0.3 एम सोडियम एसीटेट, 10 मिमी EDTA)। इस बिंदु से आगे, ऑटोक्लाइड बफ़र्स का इस्तेमाल किया जाता है और सभी टीआरएनए वाले नमूनों को 4 डिग्री सेल्सियस पर रखने से रोकने के लिएआरएएनए डिग्रेडेशन
    2. फ्यूम हुड में resuspended सेल गोली को एसिड फिनोल (पीएच 4.3) के 1 मात्रा जोड़ें। 10,000 xg (10 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस) में कोशिकाओं और अपकेंद्रित्र को बोलने के लिए उलटा द्वारा 1 मिनट के लिए मिलाएं।
    3. जैविक (तल) चरण की महाप्राणण करने के लिए देखभाल करने वाले विंदुक का उपयोग करते हुए घुलनशील टीआरएनए (यूयूयू) (और अन्य टीआरएनए पूल के छोटे सांद्रता) वाले ऊपरी जलीय चरण को ले लीजिए। नीचे की परत और गोली को छोड़ दें, जिसमें कार्बनिक चरण और सेल मलबे शामिल हैं, एक पर्याप्त कंटेनर में।
    4. टीआरएनए को घुलनशील (जलीय) चरण को 2.5 डिग्री 100% वी / वी एथनॉल के साथ अच्छी तरह से मिलाकर 1 घंटे 4 डिग्री सेल्सियस तक उलटा हो। 15,000 xg (30 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस) पर मिश्रण को अपकेंद्रित्र।
    5. सतह पर तैरनेवाला को सावधानी से घटाएं और 4 एमएल जेल निस्पंदन बफर (20 मिमी सोडियम फॉस्फेट या पोटेशियम फॉस्फेट, पीएच 7.4, 0.1 एमएम ईडीटीए) में टीआरएनए से भरपूर गोली को फिर से खोलें। 2% w / v agarose जेल पर resuspended tRNA पूल के 5 μL भागो
      ध्यान दें:अच्छी गुणवत्ता वाले टीआरएनए एक बैंड के रूप में प्रकट होता है (50-100 बीपी के बीच आणविक आकार)
  3. टीआरएनए की शुद्धि (यूयूयू)
    1. मानक क्रोमैटोग्राफिक अभ्यास 12 के बाद , उच्च संकल्प तैयार करने वाले जेल निस्पंदन स्तंभ (आयाम: 16 x 600 मिमी, बिस्तर मात्रा: 120 एमएल, रिज़ॉल्यूशन रेंज: 1,000-70,000 दा) पूर्व में जेल निस्पंदन बफर में समतल किए गए रिज्यूस्ड टीआरएनए (यूयूयू) को लोड करें। (मोबाइल फेज़)। नमूनों को साफ़ करने के लिए प्रवाह दर 1 एमएल / मिनट में सेट करें
      नोट: टीआरएनए (यूयूयू) चोटी लगभग 75.5 एमएल पर लेटा हुआ है आमतौर पर, संस्कृति का 0.5-1.0 मिलीग्राम / एल टीआरएनए की उपज प्राप्त की जा सकती है।
    2. 2% w / v agarose जेल पर प्रत्येक नमूने के 5-10 μL electrophoresing द्वारा प्रतिनिधि अलौकिक संस्करणों पर नमूने का विश्लेषण करें।

3. नमूना तैयार करना

  1. लोपेज-एस्तेपा एट अल के अनुसार टीसीडीए एक्सप्रेस और शुद्ध करें 2
    नोट: 250 माइक्रोन तकटीसीडीए का इस्तेमाल अध्ययन के लिए किया जा सकता है।
  2. तालिका 1 के अनुसार टीसीडीए की इसी राशि को 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूबों के लेबल के अनुसार पिपेट करें। 1.6 मिमी ट्राइस (2-कार्बोक्सीथाइल) फॉस्फ़िन (टीसीईपी) (अंतिम एकाग्रता) जोड़ें और धीरे से विंदुक का उपयोग कर मिलाएं। ढक्कन बंद करें और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मिश्रण सेते।
  3. एडीनोसिन ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) और 50 मिमी एमजीसीएल 2 (अंतिम सांद्रता) के 10 सुक्ष्ममापी जोड़ें। एक विंदुक के साथ मिश्रण और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए मिश्रण सेते हैं।
  4. तालिका 1 के अनुसार शुद्ध टीआरएनए (यूयूयू) (सेक्शन 2.3) जोड़ें, पिपेट के साथ मिलाएं और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
  5. फॉस्फेट बुफ़ेड खारा (पीबीएस) 100 μL अंतिम मात्रा तक जोड़ें। ठीक से मिक्स करें और ग्लाइसरॉल को 10% वी / वी के अंतिम एकाग्रता में जोड़ें।
  6. नमूना भंवर और संक्षेप में ट्यूब की सामग्री (1000 xg, 1 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस) स्पिन करें

4. जेल लोडिंग और इलैक्ट्रोफोरिसिस डेवलपमेंट

  1. वैद्युतकणसंचलन इकाई को चारों ओर 4 डिग्री सेल्सियस पर चैम्बर को बनाए रखने के लिए कुचल बर्फ से भरे ट्रे में रखें।
  2. ध्यान से, संबंधित नमक में प्रत्येक नमूने के 5 μL विंदुक एक उपयुक्त डीएनए आकार मार्कर जोड़ें
  3. विद्युत आपूर्ति इकाई के संबंधित स्लॉट में इलेक्ट्रोड को प्लग करें। बिजली की आपूर्ति इकाई चालू करें और वोल्टेज को 100 वी तक सेट करें और 90 मिनट के लिए जेल चलाएं।

5. टीआरएनए-प्रोटीन इंटरैक्शन को देखने के लिए जेल स्टीनिंग

  1. एक उपयुक्त डीएनए दाग के 1x के साथ टीबीई के 50 एमएल मिश्रण करके धुंधला हो जाना समाधान तैयार करें। एल्यूमीनियम पन्नी के साथ धुंधला कंटेनर को कवर करके सूर्य के प्रकाश के धुंधला समाधान को उजागर न करें।
    नोट: डीएनए के दाग आमतौर पर 10,000 या 20,000 रूप से केंद्रित स्टॉक के रूप में जमा किए जाते हैं।
  2. 90 मिनट के वैद्युतकणसंचलन के बाद, ट्रे से जेल को ध्यान से हटा दें और इसे कंटेनर में धुंधला हो जाना समाधान के साथ रखें। कमरे के तापमान पर कम कमाल की गति पर घुमाव पर रखें30 मिनट के लिए ure
  3. धुंधला कंटेनर से agarose जेल निकालें, अतिरिक्त तरल को हटाने के लिए सेलूलोज़ टिशू या फिल्टर पेपर के एक टुकड़े पर ध्यान से इसे टैप करें, और सीधे ट्रांसिल्युमिनेटर पर रखें। टीआरएनए वाले बैंड को देखने के लिए यूवी प्रकाश पर स्विच करें। जेल की एक तस्वीर ले लो
  4. प्रोटीन धुंधला हो जाना (वैकल्पिक)
    1. डीएनए स्टेनिंग समाधान सुरक्षित रूप से (सुरक्षा प्रक्रियाओं के अनुसार) को त्यागें और 50 एमएल कॉमॉसी बिलियेट ब्लू (सीबीबी) समाधान के साथ प्रतिस्थापित करें। कमरे के तापमान पर एक घुमाव पर ट्रे रखें और रात भर (> 12 घंटे) दाग़। सीबीबी स्टेनिंग समाधान को त्यागें और इसे 50 एमएल पीबीएस के साथ अतिरिक्त डाई हटाने के लिए बदलें। एक घुमाव पर 1 घंटे के लिए गंतव्य
  5. प्रोटीन युक्त टीआरएनए परिसरों को प्रकाश ट्रांसिलमिनेटर के नीचे देखें और टीआरएनए यूवी जेल चित्र के साथ तुलना करने के लिए जेल की तस्वीरें लें।

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Representative Results

टीआरएनए (यूयूयू) की बड़ी मात्रा में ई। कोलाई में टीआरएनए जीन को एक मजबूत inducible T7 प्रमोटर के नियंत्रण में व्यक्त करके प्राप्त किया जा सकता है। व्यक्त टीआरएनए (यूयूयू) कोशिका द्रव्य में जम जाता है और स्वाभाविक रूप से प्रचुर मात्रा में टीआरएनए के पूल पर समृद्ध है। एक दो-चरण शुद्धि प्रक्रिया जिसमें एक कैप्चर / निष्कर्षण कदम होता है और एक जेल छानने का काम / चमकाने वाला कदम ईएमएसए ग्रेड टीआरएनए प्राप्त करने के लिए उपयोग किया गया था। कैप्चर / निष्कर्षण चरण प्रोटीन, सेल मलबे, डीएनए, और टीआरएनए (और अन्य आरएनए अणुओं) की निकासी को प्राप्त करने के लिए पीएच 4.3 फिनोल का उपयोग करता है। इस चरण में, कुल टीआरएनए पूल की मात्रा 2% w / v agarose जेल पर वैद्युतकणसंचलन द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है। दूसरे चरण में जेल छानने का काम क्रोमैटोग्राफी शामिल है जो आरएनए प्रजातियों को उनके आणविक आकार के अनुसार अलग करती है। 254 एनएम पर यूवी ट्रेस का इस्तेमाल पृथक्करण की निगरानी और मुख्य अलौकिक चोटियों की पहचान करने के लिए किया जाता है ( चित्रा 1शीर्ष) चोटी के अंशों के प्रतिनिधि अल्कोट्स विश्लेषण के लिए 2% w / v agarose जेल पर चल रहे थे ( चित्रा 1 नीचे )। टीआरएनए अणुओं के बहुमत क्रोमैटोग्राफी चलाने के एक सिंगल पीक (मध्य) में सह-एलिट (यहां, 120 एमएल बेड-साइज कॉलम में 75.5 एमएल)। जब पूल में एक ओवरेक्सार्ड प्रजातियां अलग होती हैं, जैसे कि टीआरएनए (यूयूयू), पूल में टीआरएनए अणुओं का 90% से अधिक उस विशिष्ट टीआरएनए से संबंधित होता है, जबकि शेष अणु स्वाभाविक रूप से प्रचुर मात्रा में टीआरएनए के अनुरूप होते हैं। माध्यमिक चोटियों को टीआरएनए युक्त केंद्रीय शिखर से पहले और बाद में देखा जाता है। पहले पीक (एस) में आंशिक रूप से अवक्रमित बड़ा आरएनए अणु ( चित्रा 1 में अंश 26 और 32), और शुद्धि के अंत में शिखर (एस) में बहुत छोटे आरएनए और दूषित पदार्थ (अंश 45 और 51; चित्रा 1 में सलाखों) केंद्रीय शिखर के तहत अंश को जमा करने के बाद (अंश 39-43; चित्रा 1 में सलाखों), शुद्ध टीआरएनए की मात्रा यूवी स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा मात्रात्मक और / या 2% w / v agarose जेल पर आणविक आकार के मानकों के साथ तुलना की जा सकती है।

टीसीडीए और टीआरएनए (यूयूयू) नमूनों को अलग-अलग दाढ़ अनुपात में 1.0 से 10.0 तक मिलाकर अर्द्ध-लॉगरिदमिक नमूनाकरण योजना ( तालिका 1 ) का प्रयोग किया जा सकता है और 2% वाय / एग्रोरेज जैल ( चित्रा 2 ) से अलग हो सकता है। प्रोटीन-टीआरएनए परिसरों की स्थिरता और बाध्यकारी के स्टेइइइएमेट्री के आधार पर, एक या कई बैंड जेल पर देखे जा सकते हैं। टीसीडीए-टीआरएनए (यूयूयू) के लिए, एक स्टोइकीओमेट्रिक कॉम्प्लेक्स का गठन होता है जो एक पृथक बैंड के रूप में चलता है जिसमें प्रोटीन और टीआरएनए दोनों होते हैं। आमतौर पर, मुक्त टीआरएनए तेजी से पलायन करता है और जेल के नीचे देखा जा सकता है, जबकि प्रोटीन-टीआरएनए परिसरों, जो कम नकारात्मक रूप से चार्ज किए जाते हैं और आकार में बड़े होते हैं, धीमे स्थानांतरित होने देते हैं चित्रा 2 दिखाता है एक प्रतिनिधित्व टीसीडीए-टीआरएनए (यूयूयू) कॉम्प्लेक्स के एटीवी 2% वाय / वी एग्रोसोज जेल चित्रा 2 में , टीसीडीए-केवल और टीआरएनए-केवल बैंड नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करते हैं। टीसीडीए के रूप में: टीआरएनए (यूयूयू) दाढ़ अनुपात बढ़ जाता है, मुफ्त टीआरएनए बैंड की कीमत पर बने टीसीडीए-टीआरएनए (यूयूयू) परिसरों की मात्रा बढ़ जाती है। ध्यान दें कि नि: शुल्क टीआरएनए की तीव्रता टीसीडीए बढ़ने की मात्रा को कम करती है। सबसे पहले जटिल एक 2: 1 स्टोइचीओमेट्रिक परिसर होता है जिसमें एक टीसीएनए अणु प्रति टीसीडीए डिमर होता है (10, 20 या 30 माइक्रोग्राम टीसीडीए युक्त लेन में दिखाई देता है)। टीसीडीए संतृप्ति पर, एक बड़ा आणविक भार टीसीडीए-टीआरएनए (यूयूयू) जटिल विकसित होता है जिसमें 2: 2 स्टोइकीओमेट्रिक कॉम्प्लेक्स होता है, जहां टीसीडीए सब यूनिट एक टीआरएनए (यूयूयू) अणु के लिए बाध्य होते हैं (30, 50 या 75 माइक्रोन) टीसीडीए (50 या 75 माइक्रोन) वाले दो अंतिम लेन ने प्रतिक्रिया में सभी टीआरएनए को बाध्य किया है और एक मुफ्त टीआरएनए बैंड की कमी है।

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चित्रा 1: जेल फ़िल्ट्रेशन द्वारा टीआरएनए (यूयूयू) की शुद्धि। उच्च संकल्प तैयार करने वाले जेल निस्पंदन स्तंभ पर टीआरएनए (यूयूयू) के जेल छानने का क्रोमैटोग्राम (शीर्ष) 254 एनएम दर्ज किया गया। टीआरएनए (यूयूयू) में समृद्ध टीआरएनए पूल वाला सबसे ऊंचा शिखर ~ 75.5 एमएल पर आधारित है। विभिन्न टीआरएनए एल्यूशन अंशों में से 2% वाइ / वी एगरोज़ जेल (नीचे) को अलिक्टुओं के साथ चलाया गया था। एम, आणविक आकार की सीढ़ी इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र 2
चित्रा 2: टीसीडीए और टीआरएनए (यूयूयू) के साथ जेल रिडार्डेशन परख। ईएमएसए टीसीएनए को शारीरिक बाध्यकारी के लिए सबूत प्रदान करता है नमूने 2% w / v agarose जेल पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 90 मिनट के लिए चल रहे थे टीआरएनए (यूयूयू) की एक निश्चित राशि, 7.5 μएम, टीसीडीए की चर मात्रा (मिलाकर तालिका देखें) के साथ मिश्रित था, और प्रोटीन-टीआरएनए परिसरों इलैक्ट्रोफोरेसिस रन के दौरान अलग हो गए थे। जेल दाग गया था और यूवी ट्रांसिलमिनेटर पर देखा गया था। प्रत्येक लेन में 5 μL का नमूना होता है। एम, आणविक आकार की सीढ़ी इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

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Discussion

यहां वर्णित प्रोटीन-टीआरएनए एगरोज जेल रेटार्डेशन परख कई तरीकों से संशोधित किया जा सकता है। सबसे पहले, जेल में agarose का प्रतिशत कम हो सकता है जिससे कि प्रोटीन-टीआरएनए कॉम्प्लेक्स की जुदाई और विज़ुअलाइजेशन (120 केडीए) का विश्लेषण किया जा सके। दूसरा, यदि लक्ष्य प्रोटीन थर्मोलाबिल है, तो यह सुनिश्चित करने के लिए अतिरिक्त सावधानी बरती जानी चाहिए कि तापमान को एक स्वीकार्य तापमान से नीचे रखा जा सकता है, जिसने इलेक्ट्रोफोरेसिस तंत्र को एक ठंडे कमरे में ले जाया जा सकता है या इलेक्ट्रोफोरेसिस कक्ष के अंदर बर्फ पैक का उपयोग करके गर्मी का तुरंत उगाने रन के दौरान अन्य बफर रचनाएं ( उदाहरण के लिए , 0.5 एक्स टीबी, ट्रिस-बोरेट) और चलने वाले पैरामीटर्स (> 20 वी / सेमी) को संशोधित किया जा सकता है यदि नमूने 11 के लिए आवश्यक या स्वीकार्य है प्रस्तावित एमजीसीएल 2 एकाग्रता को कम किया जा सकता है यदि आरएनए में कमी को नमूना तैयार करने के चरण के दौरान मनाया जाता है, क्योंकि द्विपक्षीय कैटीओएनस संभावित न्यूक्लिक एसिड के दरार को उत्प्रेरित कर सकता है।

इस तकनीक की प्रमुख सीमा यह है कि प्रोटीन-टीआरएनए बैंड आमतौर पर ऐक्रलामाइड-आधारित जेल रिक्ति के तरीकों के मुकाबले थोड़ा अधिक फैल जाते हैं, जो तेज और स्पष्ट होते हैं। एक और सीमा यह है कि कई नमूने के एक साथ विश्लेषण के लिए व्यापक, लंबे समय तक जैल आवश्यक हो सकते हैं और यदि विभिन्न आकारों और चार्जों के प्रोटीन-टीआरएनए परिसरों को हल किया जाना है।

मौजूदा तरीकों के मुकाबले, प्रोटीन-टीआरएनए एगरोज जेल डिटर्डेशन परख नमूना तैयार करने से लेकर विश्लेषण तक श्रम और समय में महत्वपूर्ण कमी को देता है। एसीयलामाइड जैल में हानिकारक रसायनों होते हैं, वे बहुमूल्य बनाने के लिए तैयार होते हैं और लंबे समय तक लेते हैं। इसके विपरीत, agarose जैल सरल, डाली और सेट करने के लिए तेज है, और जहरीले रसायनों को शामिल नहीं है। प्रयोग 2 घंटे में पूरा किया जा सकता है इसमें जेल के लिए 30 मिनट, नमूना तैयार करने के लिए 15 मिनट शामिल हैं (जो हो सकता हैAgarose ठंडा करते हुए किया), 90 विक्टोपोरेसिस और दृश्य के लिए मिनट।

विधि के भविष्य के अनुप्रयोग इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त पहचान विधियों को परिष्कृत कर सकते हैं और इसे कम प्रचुर मात्रा में, अधिक अस्थिर आरएनए प्रजातियों, या प्रोटीन परिसरों की पहचान करने के लिए लागू करते हैं जो केवल बहुत ही कम मात्रा में व्यक्त किए जा सकते हैं। अत्यधिक संवेदनशील फ्लोरोफोर्स वाले आरएनए या प्रोटीन घटक लेबलिंग प्रोटीन-आरएनए परिसरों की छोटी मात्रा का पता लगाने की अनुमति देगा। इसके अलावा, गैर-ओवरलैपिंग उत्सर्जन / उत्तेजना शिखर वाले फ्लोराफोर्स का उपयोग मल्टीप्लेक्सिंग प्रयोगों की अनुमति दे सकता है जहां एक ही प्रयोग में विभिन्न प्रोटीन और / या आरएनए प्रजातियों को एक साथ देखा जा सकता है।

इस प्रोटोकॉल में तीन महत्वपूर्ण कदम हैं पहला और सबसे स्पष्ट महत्वपूर्ण चरण टीआरएनए (यूयूयू) की अभिव्यक्ति और शुद्धि है यदि शुद्ध टीआरएनए (यूयूयू) की मात्रा एक निश्चित न्यूनतम पहचान सीमा से कम है (25-200 एनजी टीआरएनए प्रति बैंड), या गिरावट बैंड कम आणविक आकार के संदूषक के रूप में स्पष्ट हो जाते हैं, टीआरएनए को खारिज किया जाना चाहिए और फिर से शुद्ध किया जाना चाहिए। टीआरएनए निष्कर्षण के दौरान एसिड फिनाल (पीएच 4.3) का प्रयोग करना जरूरी है क्योंकि यह आरएनए घुलनशील रखते हुए चुनिंदा डीएनए की शुरुआत करता है। दूसरा महत्वपूर्ण कदम विश्लेषण के लिए प्रोटीन-टीआरएनए नमूनों की तैयारी से संबंधित है। प्रोटीन और टीआरएनए की पर्याप्त मात्रा में उपयोग किए जाने वाले सभी परिसरों का मजबूत पता लगाने के लिए उपयोग किया जाना चाहिए। जटिल संरचना की ओर संतुलन को स्थानांतरित करने के लिए प्रोटीन-टीआरएनए का विद्वान अनुपात समायोजित किया जाना चाहिए। तीसरा महत्वपूर्ण कदम वैद्युतकणसंचलन है। टीबीई बफर ताजा इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए (पुन: उपयोग नहीं किया जाना चाहिए) और एग्रोसे जैल को तापमान पर रखना आवश्यक है जहां प्रोटीन-टीआरएनए परिसरों स्थिर होते हैं और इनकार नहीं करते (आमतौर पर, 4-10 डिग्री सेल्सियस)। पूरे वैद्युतकणसंचलन के दौरान agarose जेल को ठंडे रखने के लिए देखभाल का प्रयोग किया जाना चाहिए, उदाहरण के लिए, बर्फ के साथ इलेक्ट्रोफोरेसिस कक्ष के आस-पास और, जब भी संभव हो, प्रयोग चल रहा होठंडे कमरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर

हम टीसीडीए-टीआरएनए (यूयूयू) का प्रयोग मॉडल सिस्टम के रूप में प्रोटीन-टीआरएनए कॉम्प्लेक्स को दर्शाने और एक्रॉलाइड वैद्युतकणसंचयन के बजाय एगरोस जेल वैद्युतकणसंचलन का विश्लेषण करने के लिए एक सीधा तरीका दिखा चुके हैं। बाद में पूरा करने में अधिक समय लगता है और काफी अधिक श्रमसाध्य है। इस पद्धति का उपयोग करते हुए, 2% w / v agarose gels (8 सेमी जेल प्रारूप) पर इलेक्ट्रोफोरेक्टिक जुदाई 90 मिनट से भी कम समय में पूरा किया जा सकता है। प्रोटीन-टीआरएनए बातचीत के विश्लेषण के लिए यह एक सुविधाजनक उपकरण है और कई नमूने के साथ-साथ विश्लेषण के लिए अनुमति देता है। टीआरएनए और / या प्रोटीन म्यूटेंट के संस्करणों को इस पद्धति का उपयोग करके बाध्यकारी और स्थिरता के लिए जांच की जा सकती है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

एमसीवी सीआईबी अंतराल कार्यक्रम "बेहतर जीवन के लिए आणविक मशीनों" (मैकबेट) का सदस्य है। इन परिणामों के लिए अग्रणी शोध स्पैनिश इंस्टीटूटो डी सलाद कार्लोस III (पीआई 12/01667 से एमसीवी), स्पेनी मंत्री मंत्री इंकियाआइए कॉम्पिटिटिडड (सीटीक2015-66206-सी -2-2-आर और एसएएफ2015-72 9 61-एमसीवी को एसईपी) से धन प्राप्त हुआ है। ), मैड्रिड की क्षेत्रीय सरकार (एस -2010 / बीडी -2316 टू एमसीवी), और यूरोपीय आयोग (फ्रेमवर्क प्रोग्राम 7 (एफपी 7)) परियोजना कॉम्प्लेक्सिन (अनुबंध नंबर 279039 से एमसीवी)। फंडर्स का अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने का निर्णय, या पांडुलिपि की तैयारी में कोई भूमिका नहीं थी।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
E. coli BL21(DE3) Novagen 70235 DE3 lysogen contains T7 polymerase upon IPTG induction.
pET23d Novagen 69748-3 pET23d confers resistance to ampicillin; T7 promoter.
LB Broth, Low Salt (Lennox L Broth), Granulated Melford GL1703 Conventional LB Broth, High Salt, can also be used.
Ampicillin Sigma-Aldrich 10419313
Incubator Shaker (Thermostated) NBS Excella E24  Any shaker incubator with temperature control can be used.
Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG), >=99% Acros Organics BP1755
Sodium acetate, anhydrous, >99% Melford B4017
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), Disodium salt, >99% Acros Organics AC327205000 Harmful if inhaled.
Centrifuge (refrigerated) Eppendorf 5430
Centrifuge (refrigerated) rotor Eppendorf 5430/5430P
Centrifuge Sorvall RC5C
Centrifuge rotor Sorvall SLA-3000
Phenol solution, Saturated with 0.1 M citrate buffer, pH 4.3 ± 0.2 Sigma-Aldrich P4682 Acute toxicity (oral, dermal, inhalation), corrosive
Ethanol absolute for analysis, 100% v/v Merck Millipore 100983
Sodium phosphate dibasic dihydrate, Na2HPO4, >=99% Sigma-Aldrich 71643
Potassium dihydrogen phosphate, KH2PO4 Merck 48,730,250
HiLoad 16/60 Superdex 75  GE Healthcare 28989333
Agarose Melford MB1200
Tris [Tris(hydroxymethyl) aminomethane HCl] Melford T1513
Boric Acid Melford B0503
Microwave Haier HDA-2070M
TCEP [Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride] Sigma-Aldrich C4706 Corrosive to metals and skin.
ATP [Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate], Grade I, >=99% Sigma-Aldrich A2383
Magnesium chloride (MgCl2), anhydrous, >=98% Sigma-Aldrich M8266
Sodium chloride (NaCl), >99% Fisher Bioreagents BP358
Potassium chloride (KCl), >99% Melford P0515
NZYDNA Ladder VI NZYtech MB8901
Power supply Consort EV261
Electrophoresis unit Real Laboratory RELSMINI10
Real Safe nucleic acid staining Real Laboratory RBMSAFE 20,000X stock
UV Transilluminator (G:Box/EF) Syngene 2216498
Coomassie Brilliant Blue G Sigma-Aldrich B0770
Rocker (Gyro-Rocker) Stuart SSL3
Mixer Vortex  Fisher brand 13214789

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References

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जैव रसायन अंक 124 सीएसडीएल चक्रीय टी सिस्टीन सल्फाइनेट डिस्फ़ाफ़ाइनास (सीएसडी) जेल रिटर्डेशन परख, टीसीडीए आरएनए (टीआरएनए) ट्रांसफर टीआरएनए हार्मोमोडाइफ़िकेशन
प्रोटीन-टीआरएनए एगरोस जेल डिटैडेडेशन एसेरेस ऑफ़ द एनालिसिस<em&gt; एन</em<sup&gt; 6</sup&gt; -रेरोनीएल्कार्बामॉलेडिनोसिन टीसीडीए फंक्शन
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Fernández, F. J., Gómez,… More

Fernández, F. J., Gómez, S., Navas-Yuste, S., López-Estepa, M., Vega, M. C. Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays for the Analysis of the N6-threonylcarbamoyladenosine TcdA Function. J. Vis. Exp. (124), e55638, doi:10.3791/55638 (2017).

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