Summary
프로토콜은 tRNA (UUU)의 생산 및 효소 TcdA와 복합체로 된 tRNA (UUU)의 분석을 아가로 오스 겔 지연 분석법을 통해 제시합니다.
Abstract
우리는 Escherichia coli 에서 tRNA (UUU)의 발현과 정제를위한 방법과 tRNA (UUU)와 N6- threonylcarbamoyladenosine (t6 A) 탈수 효소 인 TcdA의 결합에 대한 겔 지연 분석에 의한 분석을 시연한다. threonylcarbamoyl cyclic t6 A (ct6 A)에 tRNA의 anticodon stem loop (ASL)에서 A37에 부착 된 측쇄. tRNA (UUU)를 암호화하는 합성 유전자의 전사는 1 mM 이소 프로필 β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)를 갖는 대장균 에서 유도되고 tRNA를 함유하는 세포는 유도 후 24 시간에 수확된다. RNA 분획은 산성 페놀 추출법을 사용하여 정제한다. 순수한 tRNA는 소형 tRNA 분자를 더 큰 손상되지 않은 핵산 또는 조각난 핵산에서 효율적으로 분리하는 겔 여과 크로마토 그래피에 의해 얻어집니다. tRNA (UUU)에 대한 TcdA 결합을 분석하기 위해 TcdA를 tRNA (UUU)와 혼합하고 4 ℃에서 천연 아가 로스 겔로 분리한다.TcdA-tRNA (UUU) 복합체는 젤의 염색시 관찰 할 수있는 이동성 지연을 겪는 반면, 자유 tRNA (UUU)는 더 빠르게 이동합니다. 우리는 TcdA가 tRNA (UUU) 결합 효소임을 입증합니다. 이 겔 지연 분석은 TcdA 돌연변이 체와 첨가제 및 기타 단백질이 결합에 미치는 영향을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.
Introduction
겔 지연 분석 1 (전기 이동성 이동 분석, EMSA라고도 함)은 단백질 - 핵산 상호 작용을 연구하고 특성화하기 위해 고안된 전기 영동 방법입니다. 단백질 - RNA 상호 작용뿐 아니라 정제 된 성분 또는 단백질 ( 예 : 세포 용 해물) 또는 핵산 ( 예 : tRNA)의 복잡한 혼합물을 사용하여 tRNA와 tRNA 결합 단백질 간의 상호 작용뿐만 아니라 단백질 -DNA의 분석도 가능합니다 수영장). 우리는 정제 된 tRNA (UUU)와 anticodon stem loop (ASL)에서 A37에 부착 된 threonylcarbamoyl 측쇄를 고리 화하는 N 6 - threonylcarbamoyladenosine (t 6 A) 탈수 효소 인 TcdA 사이의 상호 작용 연구에 겔 지연 분석을 적용했습니다. tRNA의 cyclic t 6 (ct 6 A) 2 , 3 로의 전환. TcdA는 또한 CsdL 3 ,tcdA / csdL 유전자는 csdA 와 csdE 유전자를 갖는 클러스터를 형성하는데, 시스테인 탈황 효소와 시스테인 술핀 데스 탈 루핀 (CSD) 시스템의 황 수용체를 암호화하고 생체 내에서 TcdA 기능을 유지해야한다.
겔 지연 분석법의 근거는 유리 핵산 분자가 큰 음전하 때문에 아크릴 아마이드 또는 아가로 오스 겔의 앞쪽으로 빠르게 이동하지만 동일한 핵산의 단백질 복합체의 전기 영동 이동도가 크게 감소한다는 것입니다. 이동성의 감소는 핵산 - 단백질 복합체에서 "이동"으로 시각화되어 개별 밴드로 분해됩니다. 양전하를 띠고 큰 핵산 - 단백질 복합체는 겔상에서보다 큰 이동도 또는 이동도 감소를 나타낸다.
복합체의 전하 중화는 보편적 인 현상이므로단백질 - 핵산 복합체의 경우, 겔 지연 분석은 광범위한 복합체 및 핵산 유형에 적용될 수 있습니다. 이 방법은 간단하고 저렴하며 최소한의 장비로 실험실에서 수행 할 수 있습니다. 소량의 단백질과 tRNA 만 있으면됩니다. 이것은 대체로 더 많은 양의 표본을 소비하는 대체 생물 물리 기술보다 유리합니다.
겔 지연 분석은 전사 인자 연구에 널리 사용되었습니다. 이 분석법은 많은 다른 DNA 서열에 대한 전사 인자의 결합 동역학, 강도 및 특이성을 분석하는 데 사용되었습니다. 이 분야에서 실제로 EMSA가 처음 개발 된 것은 6 , 7 이었다. RNA 8 , 9 , 10 , 11 및 tRNA 분자를 이용한 겔 지연 분석도 리보솜 연구에 사용되었습니다우리가 여기에서와 같이 전사 후 tRNA 뉴 클레오 시드를 변형시키는 효소를 분석 할 수 있습니다.
다양한 매개 변수가 온도, 단백질 및 tRNA 샘플의 품질, 결합 강도와 같은 겔 지연 분석의 결과에 영향을 미칩니다. 실험의 신중한 계획과 실행은 유리 핵산과 단백질 결합 종의 결과 해석에 중요합니다. 여기에서, 프로모터가 Shine-Dalgarno 리보솜 결합 부위가 결여 된 발현 벡터에 클로닝 된 tRNA (UUU)를 코딩하는 합성 유전자를 사용하여 다량의 tRNA 2 의 합성을 유도 하였다. 이 상세한 프로토콜은 일반적인 실수를 피하면서 tRNA 겔 지연 실험을 수행하기위한 명확한 안내서를 제공하기위한 것입니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
주의 : 사용하기 전에 관련된 모든 물질 안전 보건 자료 (MSDS)를 참조하십시오. 이 프로토콜에 사용 된 화학 물질 중 일부는 독성과 부식성이 있습니다. 흄 후드 및 개인 보호 장비 (안전 안경, 장갑, 실험실 코트, 긴 바지, 닫힌 발가락 신발 등 )의 사용을 포함하여 페놀을 사용하여 tRNA 추출을 수행 할 때 적절한 방법을 사용하십시오. 이 프로토콜은 무독성 핵산 얼룩을 사용합니다. 대체 얼룩의 사용은 독성 및 / 또는 발암 성 ( 예 : ethidium bromide)이있는 경우 염색제의 추가 예방 조치 및 특수 처분이 필요할 수 있습니다.
1. 아가로 오스 겔의 제조
- 아가로 오스 2g을 달아 유리 병에 넣고 2 % w / v 아가 로스 겔을 만든다.
- 아가로 오스 함유 병에 1X 트리스 - 보레이트 - 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) (TBE) 러닝 버퍼 100 ML을 추가합니다. 전자 레인지에서 가열하여 녹입니다. 30 초 간격으로 내용물을 혼합하여 혼합하십시오아가로 오스가 완전히 용해 될 때까지이 단계를 반복하십시오. 아가 로스 용액을 약 50-60 ° C로 식힌다.
- 겔 쟁반의 열린 가장자리를 테이프로 곰팡이를 만들고 적절한 빗을 넣어 우물을 만들고 용융 된 아가로 오스를 넣습니다. 거품 형성을 피하고 실온에서 응고 시키십시오.
- 응고되면 겔 트레이를 전기 영동 장치에 넣고 겔이 완전히 덮일 때까지 TBE 완충액으로 채 웁니다.
2. tRNA의 제조
- 대장균 에서 Express tRNA (UUU)
- 아침에 낮은 염 Luria Broth (LB)를 줄기 위해 발현 벡터 pET23d-EcUUU 2 ( 대장균 tRNA (UUU)를 코딩하는 유전자가 있음)로 형질 전환 된 냉동 E. coli BL21 (DE3) 100 μg / mL 암피실린을 보충 한 플레이트. 식민지가 나타날 때까지 접시를 뒤집고 37 ° C 배양기에 넣으십시오 (늦은 오후oon).
- 5 ML LB + 100 μg / ML 암피실린에 잘 자란 단일 식민지를 접종하고 37 220 ML에서 밤새 성장 ° C.
- 다음날 아침에 펠렛 세포 (4 ℃에서 10 분 동안 6,500 xg)를 5 ㎖ 신선한 LB + 100 ㎍ / mL 암피실린으로 재현 탁하고 재현 탁한다. 이 현탁액을 사용하여 200 mL LB와 100 μg / mL 암피실린을 접종하십시오. 37 ℃에서 220 rpm으로 5 시간 동안 성장시킨다.
- 590 nm (OD 590 )에서 배양 물의 광학 밀도가 0.6 - 0.8에 도달 할 때, 1 mM IPTG를 배양 물에 첨가하여 tRNA (UUU) 유전자의 발현을 촉발시켰다. 37 ° C에서 3 시간 동안 배양하십시오.
- 4 ° C에서 10 분 동안 6,500 xg에서 문화를 centrifuging하여 세포를 수확.
- 용해 및 추출
- 5 ML의 용해 버퍼 (0.3 M 나트륨 아세테이트, 10 MM EDTA)에 세포 펠렛을 Resuspend. 이 시점부터 오토 클레이브 된 완충액을 사용하고 4 ℃에서 모든 tRNA- 함유 시료를 유지하여 tRNA 분해.
- 흄 후드에 resuspended 세포 펠렛에 산성 페놀 (산도 4.3) 1 볼륨을 추가합니다. inversion에 의해 1 분간 혼합하여 세포를 용해시키고 10,000 xg (10 분, 4 ℃)에서 원심 분리한다.
- 유기 (바닥) 단계를 대기음하지 않도록주의하면서 피펫을 사용하여 가용성 tRNA (UUU) (그리고 다른 tRNA 풀의 작은 농도)를 포함하는 상단 수성 단계를 수집하십시오. 유기층과 세포 잔해로 구성된 펠렛을 적절한 용기에 버리십시오.
- 4 ° C에서 1 시간 동안 inversion하여 2.5 volume 100 % v / v 에탄올로 용해성 (수성) 상을 완전히 혼합하여 tRNA를 침전시킨다. 혼합물을 15,000 xg (30 분, 4 ° C)에서 원심 분리하십시오.
- 뜨는을 조심스럽게 버리고 4 ML 겔 여과 버퍼 (20 MM 인산 나트륨 또는 인산 칼륨, 산도 7.4, 0.1 MM EDTA)에 tRNA가 풍부한 펠렛을 resuspend. 2 % w / v 아가로 오스 젤에 resuspended tRNA 풀 5 μL를 실행합니다.
노트:좋은 품질의 tRNA는 단일 밴드 (50-100 bp 사이의 분자 크기)로 나타납니다.
- tRNA (UUU)의 정제
- 표준 크로마토 그래피 실습 12 에 따라 겔 여과 버퍼에서 미리 평형화 된 고해상도 분 취용 겔 여과 컬럼 (크기 : 16 x 600 mm, 베드 용적 : 120 mL, 분해능 범위 : 1,000 - 70,000 Da)에 재현 탁된 tRNA (UUU) (이동상). 샘플을 용리시키기 위해 유속을 1 mL / min으로 설정하십시오.
참고 : tRNA (UUU) 피크는 대략 75.5 mL에서 용리됩니다. 전형적으로, 배양 물의 0.5 내지 1.0 mg / L 수율의 tRNA가 수득 될 수있다. - 2 % w / v 아가로 오스 겔에서 각 시료 5 - 10 μL를 전기 영동하여 대표 용리 부피에서 시료를 분석하십시오.
- 표준 크로마토 그래피 실습 12 에 따라 겔 여과 버퍼에서 미리 평형화 된 고해상도 분 취용 겔 여과 컬럼 (크기 : 16 x 600 mm, 베드 용적 : 120 mL, 분해능 범위 : 1,000 - 70,000 Da)에 재현 탁된 tRNA (UUU) (이동상). 샘플을 용리시키기 위해 유속을 1 mL / min으로 설정하십시오.
3. 샘플 준비
- Lopez-Estepa et al .에 따라 TcdA를 표현하고 정제하십시오. 2 .
참고 : 최대 250 μMTcdA는 연구에 사용될 수 있습니다. - 표 1 에 따라 TcdA의 해당 양을 적절하게 표시된 1.5 mL 원심 분리 튜브에 피펫 팅합니다. 1.6 MM 트리스 (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP) (최종 농도)을 추가하고 피펫을 사용하여 부드럽게 섞는다. 뚜껑을 닫고 5 분 동안 실온에서 혼합물을 품어.
- 10 μM의 아데노신 트리 포스페이트 (ATP)와 50 mM MgCl 2 (최종 농도)를 첨가한다. 피펫과 혼합하고 실온에서 5 분 동안 혼합물을 품어.
- 표 1에 따라 정제 tRNA (UUU) (섹션 2.3)를 추가하고 피펫과 섞은 다음 5 분 동안 실온에서 배양하십시오.
- 최종 볼륨 100 μL까지 인산염 완충 식염수 (PBS)를 추가합니다. 제대로 혼합하고 10 % v / v의 최종 농도에 글리세롤을 첨가하십시오.
- 시료를 보텍스하고 튜브의 내용물을 잠깐 스핀 다운하십시오 (10,000 xg, 1 분, 4 ° C).
4. 겔 적재 및 전기 영동 개발
- 전기 영동을 수행하는 동안 챔버를 4 ° C로 유지하기 위해 분쇄 얼음으로 채워진 트레이에 전기 영동 장치를 놓습니다.
- 조심스럽게 각 샘플 5 μL를 해당 우물에 피펫 팅합니다. 적합한 DNA 크기 마커를 추가하십시오.
- 전극을 전원 공급 장치의 해당 슬롯에 꽂습니다. 전원 공급 장치를 켜고 전압을 100V로 설정하고 90 분 동안 젤을 실행하십시오.
5. tRNA- 단백질 상호 작용을 관찰하기위한 젤 염색
- TBE 50 ML과 적절한 DNA 얼룩 1X를 혼합하여 얼룩 솔루션을 준비합니다. 얼룩이있는 용기를 알루미늄 호일로 가려서 햇빛에 염색 용액을 노출시키지 마십시오.
참고 : DNA 얼룩은 일반적으로 10,000 또는 20,000 배 농축 주식으로 저장됩니다. - 전기 영동 90 분 후 조심스럽게 쟁반에서 젤을 제거하고 얼룩 솔루션과 컨테이너에 넣으십시오. 실내 온도에서 낮은 흔들림 속도로 로커에 올려 놓으십시오.30 분간 방치한다.
- 염색 용기에서 아가로 오스 겔을 꺼내어 셀룰로오스 조직이나 여과지에주의하여 가볍게 두드려 과잉 액을 제거하고 직접 투광기 위에 놓습니다. 자외선을 켜고 tRNA가 포함 된 밴드를 시각화하십시오. 젤의 사진을 찍으십시오.
- 단백질 염색 (선택).
- DNA 염색 용액을 안전하게 폐기하고 (안전 절차에 따라) 50 mL의 Coomassie Brilliant Blue (CBB) 용액으로 대체하십시오. 트레이를 실온에서 로커에 놓고 밤새 얼룩이 져야합니다 (> 12 시간). 과도한 염료를 제거 CBB 얼룩 솔루션을 폐기하고 50 ML PBS로 교체하십시오. 로커에서 1 시간 동안 처치하십시오.
- 가벼운 transilluminator에서 단백질 함유 tRNA 복합체를 시각화하고 젤의 사진을 찍어 tRNA UV 젤 그림과 비교하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
강력한 유도 성 T7 프로모터의 제어하에 대장균 에서 tRNA 유전자를 발현시킴으로써 대량의 tRNA (UUU)를 얻을 수있다. 발현 된 tRNA (UUU)는 세포질에 축적되며 자연적으로 풍부한 tRNA 풀을 풍부하게합니다. 포획 / 추출 단계 및 겔 여과 / 연마 단계로 이루어진 2 단계 정제 공정을 이용하여 EMSA 급 tRNA를 수득 하였다. 포획 / 추출 단계는 단백질, 세포 파편, DNA 및 tRNA (및 기타 RNA 분자) 추출의 동시 침전을 달성하기 위해 pH 4.3 페놀을 사용합니다. 이 단계에서 총 tRNA 풀의 양은 2 % w / v 아가로 오스 겔에서 전기 영동으로 평가할 수 있습니다. 두 번째 단계는 RNA 종류를 분자 크기에 따라 분리하는 겔 여과 크로마토 그래피를 통합합니다. 254 nm의 UV 추적을 사용하여 분리를 모니터하고 주요 용리 피크를 확인합니다 ( 그림 1상단). 피크 분획의 대표 분취 량을 분석을 위해 2 % w / v 아가로 오스 겔상에서 수행 하였다 ( 도 1 하단 ). 대부분의 tRNA 분자는 크로마토 그래피 실행의 단일 피크 (중간)에서 동시 용리됩니다 (여기에서 120 mL 침대 크기 컬럼에서 75.5 mL). tRNA (UUU)와 같이 단일 과발현 된 종을 함유 한 풀을 분리 할 때 풀의 tRNA 분자 중 90 % 이상이 특정 tRNA에 속하며 나머지 분자는 자연적으로 풍부한 tRNA에 해당합니다. 2 차 피크는 tRNA- 함유 중앙 피크 전후에 관찰된다. 전처리 된 부분은 부분적으로 분해 된 큰 RNA 분자 (분획 26과 32, 그림 1의 막대)와 정화 작업 마지막의 피크는 매우 작은 RNA와 오염 물질을 포함합니다 (분수 45와 51; 그림 1의 막대). 중앙 피크 아래의 분획들을 모으고 (분획 39-43; 그림 1의 바), 정제 된 tRNA의 양은 UV 분광법 및 / 또는 2 % w / v 아가 로즈 겔에서 분자 크기 표준과의 비교에 의해 정량 될 수있다.
TcdA 및 tRNA (UUU) 샘플은 반 대수 표본 추출 체계 ( 표 1 )를 사용하여 1.0에서 10.0까지의 다양한 몰 비율로 혼합하고 2 % w / v 아가로 오스 젤 ( 그림 2 )로 분리 할 수 있습니다. 단백질 -tRNA 복합체의 안정성 및 결합의 화학량 론에 따라, 하나 또는 여러 개의 밴드가 겔 상에 가시화 될 수있다. TcdA-tRNA (UUU)의 경우, 단백질과 tRNA를 모두 포함하는 분리 된 밴드로 실행되는 화학량 론적 복합체가 형성됩니다. 일반적으로 자유 tRNA는보다 빠르게 이동하고 겔의 바닥에서 관찰 될 수 있으며, 반면에 음전하가 적고 크기가 큰 단백질 -TNR 복합체는 더 느리게 이동하는 경향이있다. 도 2 는 TcdA-tRNA (UUU) 복합체의 2 % w / v 아가 로스 젤 그림 2 에서 TcdA 전용 및 tRNA 전용 밴드는 음성 대조군 역할을합니다. TcdA : tRNA (UUU) 몰비가 증가함에 따라, 유리 tRNA 밴드를 희생시켜 형성된 TcdA-tRNA (UUU) 복합체의 양이 증가한다. 유리 tRNA의 강도는 TcdA의 양이 증가함에 따라 감소한다는 것을 유의하십시오. 첫 번째 복합체는 TcdA 이량 체 당 하나의 tRNA 분자를 함유 한 2 : 1 화학량 론적 착물이다 (10, 20 또는 30 μM TcdA를 갖는 레인에서 볼 수 있음). TcdA 포화시 TcdA 서브 유니트가 각각 하나의 tRNA (UUU) 분자에 결합되는 2 : 2 화학 양롞 착물을 포함하는 더 큰 분자량의 TcdA-tRNA (UUU) 복합체가 생성됩니다 (30, 50 또는 75 μM). TcdA (50 또는 75 μM)를 사용한 두 개의 최종 레인은 반응에서 모든 tRNA를 결합 시켰으며 자유 tRNA 밴드가 결여되어있다.
tp_upload / 55638 / 55638fig1.jpg "/>
그림 1 : 젤 여과에 의한 tRNA (UUU)의 정제. 254 nm에서 기록 된 고해상도 분 취용 겔 여과 칼럼을 통한 tRNA (UUU)의 겔 여과 크로마토 그래피 (상단). tRNA (UUU)가 풍부한 tRNA 풀을 포함하고있는 최고 피크는 ~ 75.5 mL에서 용리됩니다. 2 % w / v 아가로 오스 겔 (바닥)을 다양한 tRNA 용출 분획으로부터 분취 량으로 수행 하였다. M, 분자 크기 사다리. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : TcdA 및 tRNA (UUU)를 사용한 젤 리타 데이션 분석. EMSA는 TcdA에 tRNA가 물리적으로 결합하는 증거를 제공합니다. 샘플을 2 % w / v 아가 로즈 겔에서 4 ° C로 90 분 동안 작동시켰다. 고정 된 양의 tRNA (UUU), 7.5μM을 가변 량의 TcdA ( 표 1 참조)와 혼합하고, 전기 영동 실행 중에 단백질 -tRNA 복합체를 분리시켰다. 겔을 염색하고 자외선 전조기를 통해 가시화 하였다. 각 차선에는 5 μL의 시료가 들어 있습니다. M, 분자 크기 사다리. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
본원에 기술 된 단백질 -tRNA 아가로 오스 겔 지연 분석법은 여러 가지 방법으로 변형 될 수있다. 첫째, 젤에서 아가로 오스의 비율은 여기 분석 (120 kDa)보다 훨씬 큰 단백질 - tRNA 복합체의 분리 및 시각화를 허용하기 위해 줄일 수 있습니다. 둘째, 목표 단백질이 열 안정성이있는 경우, 전기 영동 장치를 차가운 방으로 옮기거나 전기 영동 챔버 내부의 얼음 팩을 사용하여 생성 된 열을 즉시 소산시킴으로써 온도가 최대 허용 온도 이하로 유지되도록하는 추가 예방 조치가 취해 져야합니다 달리는 동안. 필요에 따라 또는 샘플 11에서 허용되는 경우 실행 시간을 단축하기 위해 다른 버퍼 조성물 ( 예 : 0.5X TB, 트리스 - 보레이트) 및 작동 매개 변수 (> 20V / cm)를 수정할 수 있습니다. 제안 된 MgCl 2 농도는 시료 준비 단계에서 RNA 분해가 관찰되면 감소 될 수 있는데, 이는 2가 cati잠재적으로 핵산의 절단을 촉매 할 수있다.
이 기술의 주요 한계는 단백질 - tRNA 밴드가 일반적으로 아크릴 아미드 기반의 겔 지연 방법에서 볼 수있는 것보다 약간 더 확산되어 더 선명하고 명확 해지는 경향이 있다는 것입니다. 또 다른 한계는 여러 샘플의 동시 분석과 다양한 크기와 전하의 단백질 -tRNA 복합체가 분석되어야하는 경우 더 넓고 긴 젤이 필요할 수 있다는 것입니다.
기존의 방법과 비교하여 protein-tRNA 아가로 오스 겔 지연 분석법을 사용하면 시료 준비에서 분석까지 노동력과 시간을 크게 줄일 수 있습니다. Acrylamide 젤은 유해한 화학 물질을 포함하고 있으며, 준비하기가 힘들고 중합하는데 오래 걸립니다. 대조적으로, 아가로 오스 젤은 간단하고, 캐스트와 세트가 빠르고, 독성 화학 물질을 포함하지 않습니다. 실험은 2 시간 이내에 완료 될 수 있습니다. 여기에는 젤을 넣기위한 30 분, 시료 준비를위한 15 분 (아가로 오스 냉각 동안 완료), 전기 영동 및 시각화를위한 90 분.
이 방법의 향후 적용은이 프로토콜에 사용 된 검출 방법을 정제하여 덜 풍부하고 불안정한 RNA 종 또는 매우 적은 양으로 만 표현 될 수있는 단백질 복합체의 검출에 적용 할 수 있습니다. RNA 또는 단백질 성분을 고감도 형광 물질로 표지하면보다 적은 양의 단백질 -RNA 복합체를 검출 할 수 있습니다. 또한, non-overlapping emission / excitation peak가있는 fluorophores를 사용하면 여러 단백질 및 / 또는 RNA 종을 단일 실험에서 동시에 시각화 할 수있는 다중화 실험을 수행 할 수 있습니다.
이 프로토콜에는 세 가지 중요한 단계가 있습니다. 가장 중요한 첫 번째 단계는 tRNA (UUU)의 발현 및 정제입니다. 정제 된 tRNA (UUU)의 양이 특정 최소 검출 한계 (밴드 당 25 ~ 200 ng 사이) 인 경우) 또는 분해 띠가 더 낮은 분자 크기의 오염 물질로서 명백 해지면 tRNA는 폐기되고 재 정화되어야한다. tRNA 추출 동안 산성 페놀 (pH 4.3)을 사용하는 것은 RNA를 용해성으로 유지하면서 DNA를 선택적으로 침전시키기 때문에 필수적이다. 두 번째 중요한 단계는 분석을 위해 단백질 -tRNA 샘플을 준비하는 것입니다. 형성된 모든 복합체를 확실하게 검출 할 수 있도록 충분한 양의 단백질과 tRNA를 사용해야합니다. 단백질 - tRNA의 몰비는 평형을 복합체 형성으로 옮기기 위해 조절되어야한다. 세 번째 중요한 단계는 전기 영동이다. TBE 완충액은 신선한 상태로 사용해야하며 (재사용하지 않음) protein-tRNA 복합체가 안정하고 변성되지 않는 온도 (일반적으로 4-10 ° C)에서 아가로 오스 겔을 유지해야합니다. 예를 들어, 전기 영동 챔버를 얼음으로 둘러 싸고 가능하다면 실험을 실행하여 전체 전기 영동 중에 아가 로스 젤을 차가운 상태로 유지하도록주의해야한다4 ° C의 차가운 방에 방치하십시오.
우리는 모델 시스템으로 TcdA-tRNA (UUU)를 사용하고 아크릴 아마이드 전기 영동 대신에 아가로 오스 겔 전기 영동을 사용하여 단백질 tRNA 복합체를 분석하고 특성을 분석하는 간단한 방법을 입증했습니다. 후자는 완료하는 데 더 오래 걸리며 상당히 힘들어합니다. 이 방법을 사용하면 2 % w / v 아가로 오스 젤 (8cm 겔 형식)에서 전기 영동 분리를 90 분 이내에 완료 할 수 있습니다. 이것은 protein-tRNA 상호 작용의 분석을위한 편리한 도구이며 여러 시료의 동시 분석이 가능합니다. tRNA 및 / 또는 단백질 돌연변이 체의 변이체는이 방법을 사용하여 결합 및 안정성을 스크리닝 할 수있다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
MCV는 CIB 교내 프로그램 "더 나은 삶을위한 분자 기계"(MACBET)의 회원입니다. 이 결과를 이끌어 낸 연구는 Salut Carlos III 스페인 연구소 (PI12 / 01667에서 MCV), 스페인의 Competitividad Ministerio Competitividad (CTQ2015-66206-C2-2-R 및 SAF2015-72961-MCV의 EXP)로부터 자금을 지원 받았다. ), 마드리드 지방 정부 (S2010 / BD-2316 ~ MCV) 및 유럽위원회 (Framework Program 7 (FP7)) 프로젝트 ComplexINC (계약 번호 279039 - MCV) 재단 기금은 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 출판 결정 또는 원고 작성에 아무런 역할을하지 못했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| E. coli BL21(DE3) | Novagen | 70235 | DE3 lysogen contains T7 polymerase upon IPTG induction. |
| pET23d | Novagen | 69748-3 | pET23d confers resistance to ampicillin; T7 promoter. |
| LB Broth, Low Salt (Lennox L Broth), Granulated | Melford | GL1703 | Conventional LB Broth, High Salt, can also be used. |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | 10419313 | |
| Incubator Shaker (Thermostated) | NBS | Excella E24 | Any shaker incubator with temperature control can be used. |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG), >=99% | Acros Organics | BP1755 | |
| Sodium acetate, anhydrous, >99% | Melford | B4017 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), Disodium salt, >99% | Acros Organics | AC327205000 | Harmful if inhaled. |
| Centrifuge (refrigerated) | Eppendorf | 5430 | |
| Centrifuge (refrigerated) rotor | Eppendorf | 5430/5430P | |
| Centrifuge | Sorvall | RC5C | |
| Centrifuge rotor | Sorvall | SLA-3000 | |
| Phenol solution, Saturated with 0.1 M citrate buffer, pH 4.3 ± 0.2 | Sigma-Aldrich | P4682 | Acute toxicity (oral, dermal, inhalation), corrosive |
| Ethanol absolute for analysis, 100% v/v | Merck Millipore | 100983 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate, Na2HPO4, >=99% | Sigma-Aldrich | 71643 | |
| Potassium dihydrogen phosphate, KH2PO4 | Merck | 48,730,250 | |
| HiLoad 16/60 Superdex 75 | GE Healthcare | 28989333 | |
| Agarose | Melford | MB1200 | |
| Tris [Tris(hydroxymethyl) aminomethane HCl] | Melford | T1513 | |
| Boric Acid | Melford | B0503 | |
| Microwave | Haier | HDA-2070M | |
| TCEP [Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride] | Sigma-Aldrich | C4706 | Corrosive to metals and skin. |
| ATP [Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate], Grade I, >=99% | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| Magnesium chloride (MgCl2), anhydrous, >=98% | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Sodium chloride (NaCl), >99% | Fisher Bioreagents | BP358 | |
| Potassium chloride (KCl), >99% | Melford | P0515 | |
| NZYDNA Ladder VI | NZYtech | MB8901 | |
| Power supply | Consort | EV261 | |
| Electrophoresis unit | Real Laboratory | RELSMINI10 | |
| Real Safe nucleic acid staining | Real Laboratory | RBMSAFE | 20,000X stock |
| UV Transilluminator (G:Box/EF) | Syngene | 2216498 | |
| Coomassie Brilliant Blue G | Sigma-Aldrich | B0770 | |
| Rocker (Gyro-Rocker) | Stuart | SSL3 | |
| Mixer Vortex | Fisher brand | 13214789 |
References
- Scott, V., Clark, A. R., Docherty, K.
- López-Estepa, M., et al. The crystal structure and small-angle X-ray analysis of CsdL/TcdA reveal a new tRNA binding motif in the MoeB/E1 superfamily. Plos One. 10 (4), e0118606 (2015).
- Miyauchi, K., Kimura, S., Suzuki, T. A cyclic form of N6-threonylcarbamoyladenosine as a widely distributed tRNA hypermodification. Nat Chem Biol. 9 (2), 105-111 (2013).
- Bolstad, H. M., Botelho, D. J., Wood, M. J. Proteomic analysis of protein-protein interactions within the Cysteine Sulfinate Desulfinase Fe-S cluster biogenesis system. J Proteome Res. 9 (10), 5358-5369 (2010).
- Loiseau, L., Ollagnier-de Choudens, S., Lascoux, D., Forest, E., Fontecave, M., Barras, F. Analysis of the heteromeric CsdA-CsdE cysteine desulfurase, assisting Fe-S cluster biogenesis in Escherichia coli. J Biol Chem. 280 (29), 26760-26769 (2005).
- Fried, M. G., Crothers, D. M. Equilibrium studies of the cyclic AMP receptor protein-DNA interaction. J Mol Biol. 172 (3), 241-262 (1984).
- Garner, M. M., Revzin, A. A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system. Nucleic Acids Res. 9 (13), 3047-3060 (1981).
- Rio, D. C. Electrophoretic mobility shift assays for RNA-protein complexes. Cold Spring Harb Protoc. 2014 (4), 435-440 (2014).
- Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift. Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).
- Yakhnin, A. V., Yakhnin, H., Babitzke, P. Gel mobility shift assays to detect protein-RNA interactions. Methods Mol Biol. 905, 201-211 (2012).
- Ream, J. A., Lewis, L. K., Lewis, K. A. Rapid agarose gel electrophoretic mobility shift assay for quantitating protein: RNA interactions. Anal Biochem. 511, 36-41 (2016).
- Hagel, L.
