Summary
Ett protokoll presenteras för produktion av tRNA (UUU) och analysen av tRNA (UUU) i komplex med enzymet TcdA genom agarosgel-retardationsanalyser.
Abstract
Vi demonstrerar metoder för uttryck och rening av tRNA (UUU) i Escherichia coli och analysen genom gel-retardationsanalyser av bindningen av tRNA (UUU) till TcdA, ett N6-treonylkarbamoyladenosin (t6A) dehydratas, som cykliserar treonylkarbamoylen Sidokedja fäst vid A37 i anticodonstamslingan (ASL) av tRNA till cyklisk t 6 A (ct 6 A). Transkription av den syntetiska genen som kodar för tRNA (UUU) induceras i E. coli med 1 mM isopropyl-P-D-1-tiogalaktopyranosid (IPTG) och cellerna innehållande tRNA skördas 24 h efter induktion. RNA-fraktionen renas med användning av syrafenol-extraktionsmetoden. Ren tRNA erhålles genom en gelfiltreringskromatografi som effektivt separerar de små mängderna tRNA-molekylerna från större intakta eller fragmenterade nukleinsyror. För att analysera TcdA-bindning till tRNA (UUU) blandas TcdA med tRNA (UUU) och separeras på en naturlig agarosgel vid 4 ° C.Det fria tRNA (UUU) migrerar snabbare, medan TcdA-tRNA (UUU) -komplexen genomgår en rörelsehämmande som kan observeras vid färgning av gelén. Vi visar att TcdA är ett tRNA (UUU) bindande enzym. Denna gel-retardationsanalys kan användas för att studera TcdA-mutanter och effekterna av tillsatser och andra proteiner vid bindning.
Introduction
Gel-retardationsanalysen 1 (även känd som elektroforetisk rörlighetskifteanalys, EMSA) är en elektroforetisk metod avsedd att studera och karaktärisera protein-nukleinsyrainteraktioner. Det möjliggör analys av protein-DNA såväl som protein-RNA-interaktioner och i synnerhet interaktioner mellan tRNA och tRNA-bindande proteiner, med användning av antingen renade komponenter eller komplexa blandningar av proteiner (t ex celllysater) eller nukleinsyror (t ex tRNA pooler). Vi har tillämpat gelretardationsanalyser för studien av interaktionen mellan renat tRNA (UUU) och TcdA, ett N6-treonylkarbamoyladenosin (t6A) dehydratas, vilket cykliserar treonylkarbamoyl-sidokedjan bunden till A37 i anticodon-stamslingan (ASL) Av tRNA till cyklisk t6 (ct 6A) 2 , 3 . TcdA är också känd som CsdL 3 ,Fc> 4. TcdA / csdL- genen bildar ett kluster med csdA- och csdE- generna 5 , som kodar för cystein-desulfuraset och svavelacceptorn för cysteinsulfinas-desulfinat-systemet (CSD) och krävs för att bibehålla TcdA-funktionen in vivo 3 .
Rationalet bakom gel-retardationsanalyserna är att medan de fria nukleinsyramolekylerna snabbt flyter till framsidan av akrylamid- eller agarosgeler på grund av sin stora negativa laddning, reduceras den elektroforetiska rörligheten för proteinkomplex av samma nukleinsyror dramatiskt. Minskningen i rörlighet visualiseras som ett "skift" i nukleinsyra-proteinkomplexen, vilka löser som diskreta band. Positivt laddat och större nukleinsyra-proteinkomplex uppvisar en större förändring eller minskning av rörligheten på en gel.
Eftersom laddningseutralisering av komplexet är ett universellt fenomenFör protein-nukleinsyrakomplex kan gelretardationsanalysen appliceras på ett brett spektrum av komplex och nukleinsyratyper. Metoden är enkel, billig och kan utföras i laboratorier med minsta utrustning. Det kräver endast små mängder proteiner och tRNA. Detta är en fördel jämfört med alternativa biofysiska tekniker, som vanligtvis konsumerar större mängder prov.
Gel-retardationsanalysen har använts i stor utsträckning för studier av transkriptionsfaktorer. Analysen har använts för att analysera bindningskinetik, styrka och specificitet av transkriptionsfaktorer för många olika DNA-sekvenser. Det var verkligen på detta område att EMSA utvecklades första 6 , 7 . Gel-retardationsanalyser med RNA 8 , 9 , 10 , 11 och tRNA-molekyler har också använts i ribosomforskningOch att analysera, som vi gör här, de enzymer som modifierar tRNA-nukleosider efter transkriptionellt.
Många olika parametrar påverkar resultatet av en gel-retardationsanalys, såsom temperatur, kvalitet hos proteinet och tRNA-provet och bindningsstyrkan. Noggrann planering och genomförande av experimentet är avgörande för tolkningen av resultaten av fria nukleinsyra och proteinbundna arter. Här använde vi den syntetiska genen som kodar för tRNA (UUU) klonad i en expressionsvektor vars promotor saknar Shine-Dalgarno-ribosombindningssätet, vilket leder till syntesen av stora mängder av tRNA 2 . Detta detaljerade protokoll är avsett att ge en tydlig guide för att utföra tRNA-gelretardationsexperiment samtidigt som man undviker vanliga misstag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Varning: Se alla relevanta säkerhetsdatablad (MSDS) före användning. Flera av de kemikalier som används i detta protokoll är giftiga och frätande. Använd lämplig praxis vid utvinning av tRNA med fenol, inklusive användning av rökkåpa och personlig skyddsutrustning (skyddsglasögon, handskar, labbrock, fulla byxor, slutna tånskor etc. ). Detta protokoll använder en icke-toxisk nukleinsyra fläck. Användning av alternativa fläckar kan kräva ytterligare försiktighetsåtgärder och specialavfall av färgämnet om det är giftigt och / eller cancerframkallande (t ex etidiumbromid).
1. Framställning av agarosgelén
- Väg 2 g agaros och lägg den till en glasflaska för att förbereda en 2% vikt / volym agarosgel.
- Tillsätt 100 ml 1x tris-borat-etylendiamintetraättiksyra (EDTA) (TBE) -buffert till den agaroshaltiga flaskan. Smält genom uppvärmning i en mikrovågsugn. Omvandlas innehållet med 30 s intervallerBra och upprepa detta steg tills agarosen är helt upplöst. Låt agaroslösningen svalna till ungefär 50-60 ° C.
- Tape de öppna kanterna på en gelskiva för att skapa en form, placera en lämplig kam för att skapa brunnarna och gjut den smälta agarosen in i den. Undvik bubbelbildning och låt det stelna vid rumstemperatur.
- Ställ sedan gelskivan i en elektroforesenhet och fyll den med TBE-buffert tills gelén är helt täckt.
2. Framställning av tRNA
- Express tRNA (UUU) i E. coli
- På morgonen använd en flaska med frusen E. coli BL21 (DE3) transformerad med expressionsvektorn pET23d-EcUUU 2 (hamnar genen som kodar för E. coli- tRNA (UUU)) för att stryka en Luria-buljong med lågt salt (LB) Plattan kompletterad med 100 μg / ml ampicillin. Vänd in plattan och placera den i en 37 ° C inkubator tills kolonierna uppträder (sen eftermiddagoon).
- Inokulera en vuxen, enstaka koloni i 5 ml LB plus 100 μg / ml ampicillin och odla över natten vid 220 rpm vid 37 ° C.
- Nästa morgon, pellets cellerna (6 500 xg i 10 min vid 4 ° C), byt medium med 5 ml färsk LB plus 100 μg / ml ampicillin och resuspendera. Använd denna suspension för att ympa 200 ml LB plus 100 | ig / ml ampicillin. Växa i 5 h vid 220 rpm vid 37 ° C.
- När den optiska densiteten hos kulturen vid 590 nm (OD 590 ) har nått 0,6 till 0,8, tillsätt 1 mM IPTG till odlingen för att utlösa uttrycket av tRNA (UUU) -genen. Inkubera vid 37 ° C i 3 timmar.
- Skörda cellerna genom att centrifugera kulturen vid 6 500 xg i 10 min vid 4 ° C.
- Lysis och extraktion
- Resuspendera cellpelleten i 5 ml lysbuffert (0,3 M natriumacetat, 10 mM EDTA). Från denna tidpunkt användes autoklaverade buffertar och behåller alla tRNA-innehållande prover vid 4 ° C för att förhindra tRNA-nedbrytning.
- Tillsätt 1 volym syrafenol (pH 4,3) till den resuspenderade cellpelleten i avloppsugan. Blanda i 1 min genom inversion för att lysa cellerna och centrifugera vid 10 000 xg (10 min, 4 ° C).
- Samla den övre vattenhaltiga fasen som innehåller det lösliga tRNA (UUU) (och mindre koncentrationer av de andra tRNA-poolerna) med hjälp av en pipett som tar hand om att inte aspirera den organiska (botten) fasen. Kassera bottenskiktet och pelleten, som består av organisk fas och cellrester, i en lämplig behållare.
- Precipitera tRNA genom att grundligt blanda den lösliga (vattenhaltiga) fasen med 2,5 volym 100% volym / volym etanol genom inversion i 1 timme vid 4 ° C. Centrifugera blandningen vid 15 000 xg (30 min, 4 ° C).
- Dekantera supernatanten försiktigt och resuspendera den tRNArika pelleten i 4 ml gelfiltreringsbuffert (20 mM natriumfosfat eller kaliumfosfat, pH 7,4, 0,1 mM EDTA). Kör 5 μL av den resuspenderade tRNA-poolen på en 2% vikt / volym agarosgel.
NOTERA:TRNA av god kvalitet visas som ett enda band (molekylstorlek mellan 50-100 bp).
- Rening av tRNA (UUU)
- Efter standardkromatografisk praxis 12 laddas det resuspenderade tRNA (UUU) på en preparat med hög upplösning av gelfiltreringskolonn (dimensioner: 16 x 600 mm, bäddvolym: 120 ml, upplösningsområde: 1000-70 000 Da), som tidigare är jämviktad i gelfiltreringsbuffert (Mobil fas). Ställ flödeshastigheten till 1 ml / min för att eluera proven.
OBS: TRNA (UUU) -spetsen eluerar approximativt vid 75,5 ml. Typiskt kan ett utbyte av 0,5-1,0 mg / 1 tRNA från odling erhållas. - Analysera proverna vid representativa elueringsvolymer genom att elektroforesera 5-10 l av varje prov på en 2% vikt / volym agarosgel.
- Efter standardkromatografisk praxis 12 laddas det resuspenderade tRNA (UUU) på en preparat med hög upplösning av gelfiltreringskolonn (dimensioner: 16 x 600 mm, bäddvolym: 120 ml, upplösningsområde: 1000-70 000 Da), som tidigare är jämviktad i gelfiltreringsbuffert (Mobil fas). Ställ flödeshastigheten till 1 ml / min för att eluera proven.
3. Provberedning
- Express och rena TcdA enligt López-Estepa et al . 2 .
OBS: Upp till 250 μMTcdA kan användas för studien. - Pipettera motsvarande mängd TcdA enligt tabell 1 i ordentligt märkta 1,5 ml centrifugrör. Tillsätt 1,6 mM tris (2-karboxietyl) fosfin (TCEP) (slutkoncentration) och blanda försiktigt med en pipett. Stäng locket och inkubera blandningen vid rumstemperatur i 5 minuter.
- Tillsätt 10 μM adenosintrifosfat (ATP) och 50 mM MgCl2 (slutliga koncentrationer). Blanda med en pipett och inkubera blandningen i 5 minuter vid rumstemperatur.
- Tillsätt renat tRNA (UUU) (avsnitt 2.3) enligt Tabell 1 , blanda med en pipett och inkubera vid rumstemperatur i 5 minuter.
- Tillsätt fosfatbuffrad saltlösning (PBS) upp till 100 μl slutvolym. Blanda ordentligt och tillsätt glycerol till en slutlig koncentration på 10% v / v.
- Vortexa provet och snurra kort innehållet i röret (10.000 xg, 1 min, 4 ° C).
4. Gelbelastning och elektroforesutveckling
- Placera elektroforesenheten i en bricka fylld med krossad is för att hålla kammaren vid 4 ° C under elektroforesen.
- Försiktigt pipetterar 5 μl av varje prov i motsvarande brunn. Lägg till en lämplig DNA-storleksmarkör.
- Anslut elektroderna till motsvarande slitsar på nätaggregatet. Slå på strömförsörjningsenheten och sätt spänningen till 100 V och kör gelén i 90 minuter.
5. Gelfärgning för att observera tRNA-proteininteraktion
- Förbered färgningslösningen genom att blanda 50 ml TBE med 1x av en lämplig DNA-färgning. Undvik att exponera färglösningen för solljus genom att täcka färgbehållaren med aluminiumfolie.
OBS: DNA-fläckar lagras vanligen som 10.000 eller 20.000x koncentrerade lager. - Efter 90 min elektrofores ska du försiktigt avlägsna gelén från brickan och placera den i en behållare med färglösning. Placera den på en rocker vid låg gungningshastighet vid rumstemperaturKlocka i 30 min.
- Ta bort agarosgelen från färgningsbehållaren, tryck försiktigt på en bit av cellulosavävnad eller filterpapper för att avlägsna överskottsvätska och placera den direkt på en transilluminator. Slå på UV-ljuset för att visualisera band som innehåller tRNA. Ta ett fotografi av gelén.
- Proteinfärgning (valfritt).
- Kassera DNA-färgningslösningen på ett säkert sätt (enligt säkerhetsförfaranden) och ersätt det med 50 ml Coomassie Brilliant Blue (CBB) lösning. Placera brickan på en vippare vid rumstemperatur och fläck över natten (> 12 h). Kassera CBB-färglösningen och ersätt den med 50 ml PBS för att avlägsna överflödigt färgämne. Destinera i 1 timme på en vippare.
- Visualisera proteininnehållande tRNA-komplex under en ljustransilluminator och ta fotografier av gelén för att jämföra med tRNA UV-gelbilden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Stora mängder tRNA (UUU) kan erhållas genom att uttrycka tRNA-genen i E. coli under kontroll av en stark inducerbar T7-promotor. Det uttryckta tRNA (UUU) ackumuleras i cytoplasman och berikas över poolen av naturligt rikliga tRNA. En tvåstegsreningsprocess bestående av ett fångst / extraktionssteg och ett gelfiltrerings / poleringssteg användes för erhållande av EMSA-klass-tRNA. Fångst / extraktionssteget använder pH 4,3 fenol för att uppnå samtidig utfällning av protein, cellrester, DNA och extraktion av tRNA (och andra RNA-molekyler). Vid detta steg kan mängden total tRNA-pool bedömas genom elektrofores på en 2% vikt / volym agarosgel. Det andra steget innefattar gelfiltreringskromatografi som separerar RNA-arter i enlighet med deras molekylära storlek. UV-spåret vid 254 nm används för att övervaka separationen och identifiera huvudelueringspinnarna ( Figur 1Toppen). Representativa alikvoter av toppfraktioner kördes på en 2% vikt / volym agarosgel för analys ( Figur 1 botten ). Majoriteten av tRNA-molekylerna ko-eluerar i en enda topp (mitten) av kromatografikörningen (här 75,5 ml i en 120 ml bäddstorlek). Vid separering av pooler som innehåller en enda överuttryckt art, som tRNA (UUU), hör mer än 90% av tRNA-molekylerna i poolen till det specifika tRNA, medan de återstående molekylerna motsvarar de naturligt överflödiga tRNA. Sekundära toppar observeras både före och efter den tRNA-innehållande centrala toppen. Toppen / topparna innehåller förut partiellt nedbrytna större RNA-molekyler (fraktioner 26 och 32; staplar i figur 1 ) och toppen / topparna i slutet av reningsrörelsen innehåller mycket små RNA och föroreningar (fraktioner 45 och 51; Staplar i figur 1 ). Efter poolning av fraktionerna under den centrala toppen (fraktionerna 39-43; Staplar i figur 1 ), mängden renat tRNA kan kvantifieras genom UV-spektroskopi och / eller i jämförelse med molekylstorlekstandarder på en 2% vikt / volym agarosgel.
TcdA och tRNA (UUU) -proverna kan blandas vid olika molförhållanden från 1,0 till 10,0 med användning av ett halvlogaritmiskt provtagningsschema ( tabell 1 ) och separeras på 2% vikt / volym agarosgeler ( Figur 2 ). Beroende på stabiliteten hos protein-tRNA-komplexen och stökiometrin för bindning kan ett eller flera band visualiseras på gelén. För TcdA-tRNA (UUU) bildas ett stökiometriskt komplex som löper som ett isolerat band innehållande både protein och tRNA. Typiskt migrerar fritt tRNA snabbare och kan observeras längst ned i gelén, medan protein-tRNA-komplex, som är mindre negativt laddade och är större i storlek, tenderar att migrera långsammare. Figur 2 visar en representant Ativ 2% vikt / volym agarosgel av TcdA-tRNA (UUU) komplex. I figur 2 tjänar de TcdA-endast och tRNA-enda band som negativa kontroller. När molförhållandet TcdA: tRNA (UUU) ökar, ökar mängden TcdA-tRNA (UUU) -komplex som bildas på bekostnad av det fria tRNA-bandet. Observera att intensiteten av fri tRNA minskar när mängden TcdA ökar. Det första komplexet att bilda är ett stökiometriskt komplex med 2: 1 innehållande en tRNA-molekyl per TcdA-dimer (synlig i banorna med 10, 20 eller 30 pM TcdA). Vid TcdA-mättnad utvecklas ett TcdA-tRNA (UUU) komplex med större molekylvikt som innehåller ett 2: 2 stökiometriskt komplex, där båda TcdA-subenheterna är bundna till en tRNA (UUU) -molekyl varje (synlig i banor med 30, 50 eller 75 | im). De två sista banorna med TcdA (50 eller 75 μM) har bundit all tRNA i reaktionen och saknar ett fritt tRNA-band.
Tp_upload / 55638 / 55638fig1.jpg "/>
Figur 1: Rening av tRNA (UUU) genom gelfiltrering. Kromatogram (topp) av gelfiltreringen av tRNA (UUU) över en högupplösande preparativ gelfiltreringskolonn som registrerades vid 254 nm. Den högsta toppen, innehållande tRNA-poolen berikad i tRNA (UUU) elueras vid ~ 75,5 ml. En 2% vikt / volym agarosgel (botten) kördes med alikvoter från de olika tRNA-elueringsfraktionerna. M, steget med molekylstorlek. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Gel-retardationsanalys med TcdA och tRNA (UUU). EMSA ger bevis för den fysiska bindningen av tRNA till TcdA. Proverna kördes på en 2% vikt / volym agarosgel vid 4 ° C under 90 minuter. En fast mängd tRNA (UUU), 7,5 μM, blandades med varierande mängder av TcdA (se tabell 1 ) och protein-tRNA-komplex separerades under elektrofores-körningen. Gelén färgades och visualiserades på en UV-transilluminator. Varje körfält innehåller 5 μl prov. M, steget med molekylstorlek. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protein-tRNA agaros gel-retardationsanalysen som beskrivs häri kan modifieras på ett antal sätt. För det första kan procentandelen agaros i gelén reduceras för att möjliggöra separation och visualisering av protein-tRNA-komplexa signifikant större än den som analyseras här (120 kDa). För det andra, om målproteinet är termolabilt måste extra försiktighetsåtgärder vidtas för att säkerställa att temperaturen hålls under den maximala acceptabla temperaturen genom att förflytta elektroforesapparaten till ett kallrum eller genom att använda isförpackningar inuti elektroforeskammaren för att omedelbart utsöndra den värme som produceras Under körningen. Andra buffertkompositioner ( t.ex. 0,5X TB, tris-borat) och löpparametrar (> 20 V / cm) kan modifieras för att förkorta körtiden om det är nödvändigt eller acceptabelt för proven 11 . Den föreslagna koncentrationen av MgCl2 kan reduceras om RNA-nedbrytning observeras under provberedningssteget, eftersom divalent catiOns kan potentiellt katalysera klyvning av nukleinsyror.
Huvudbegränsningen av tekniken är att protein-tRNA-banden typiskt är något mer diffusa än de som ses i akrylamidbaserade gelretardationsmetoder, vilka tenderar att vara skarpare och tydligare. En annan begränsning är att bredare, längre geler kan vara nödvändiga för samtidig analys av multipla prover och om protein-tRNA-komplex av olika storlekar och laddning ska lösas.
I jämförelse med befintliga metoder ger proteintrRNA-agaros gel-retardationsanalysen en signifikant minskning av arbetskraft och tid från provberedning till analys. Akrylamidgeler, innehåller skadliga kemikalier, är mödosamma att förbereda och ta längre tid att polymerisera. I motsats till detta är agarosgeler enkla, snabba att gjuta och sätta och inte involvera giftiga kemikalier. Experimentet kan slutföras på 2 timmar. Detta inkluderar 30 min för gelén att ställa in, 15 min för provberedning (vilket kan varaGjort under kylning av agarosen), 90 min för elektrofores och visualisering.
Framtida tillämpningar av metoden kan förbättra de detekteringsmetoder som används i detta protokoll och applicera det på detekteringen av mindre rikliga, mer instabila RNA-arter eller till proteinkomplex som kan uttryckas endast i mycket små mängder. Märkning av RNA eller proteinkomponenten med högkänsliga fluoroforer skulle möjliggöra detektion av mindre mängder protein-RNA-komplex. Vidare kan användning av fluoroforer med icke-överlappande utsläpp / exciteringstoppar möjliggöra multiplexeringsexperiment där olika protein- och / eller RNA-arter kunde visualiseras samtidigt i ett enda experiment.
Det finns tre kritiska steg i detta protokoll. Det första och mest uppenbara kritiska steget är uttryck och rening av tRNA (UUU). Om mängden renat tRNA (UUU) ligger under en viss minsta detekteringsgräns (mellan 25-200 ng tRNA per band) Eller nedbrytningsband blir uppenbara som föroreningar med lägre molekylstorlek, tRNA bör kasseras och återrenas. Användning av syrafenol (pH 4,3) vid tRNA-extraktion är väsentlig eftersom den selektivt fäller ut DNA medan RNA löses. Det andra kritiska steget handlar om framställning av proteinet-tRNA-proverna för analys. Tillräckliga mängder protein och tRNA måste användas för att möjliggöra en robust detektering av alla bildade komplex. Molnförhållandena för protein-tRNA måste anpassas för att förskjuta jämvikten mot komplexbildning. Det tredje kritiska steget är elektroforesen. TBE-bufferten måste användas fräsch (ej återanvänd) och det är nödvändigt att hålla agarosgelerna vid temperaturer där protein-tRNA-komplexen är stabila och inte denaturerar (vanligen 4-10 ° C). Försiktighet måste utövas för att hålla agarosgelen kall under hela elektroforesen, exempelvis genom att omge elektroforeskammaren med is och, när det är möjligt, springa försöketT i ett kallrum vid 4 ° C.
Vi har visat en enkel metod för att analysera, karakteriserande protein-tRNA-komplex med användning av TcdA-tRNA (UUU) som ett modellsystem, och med användning av agarosgelelektrofores istället för akrylamidelektrofores. Den senare tar längre tid att slutföra och är betydligt mer mödosam. Med hjälp av denna metod kan den elektroforetiska separationen på 2% vikt / agarosgeler (8 cm gelformat) åstadkommas på mindre än 90 minuter. Detta är ett lämpligt verktyg för analys av protein-tRNA-interaktioner och möjliggör samtidig analys av flera prover. Varianter av tRNA och / eller proteinmutanter kan screenas för bindning och stabilitet med användning av denna metod.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja.
Acknowledgments
MCV är medlem i CIB Intramural Program "Molecular Machines for Better Life" (MACBET). Forskningen som leder till dessa resultat har fått finansiering från det spanska institutet Salud Carlos III (PI12 / 01667 till MCV), den spanska ministeriet för ekonomi och konkurrensdeltagande (CTQ2015-66206-C2-2-R och SAF2015-72961-EXP till MCV ), Regionen Madrid (S2010 / BD-2316 till MCV) och Europeiska kommissionen (ramprogram 7 (K7)) projektet ComplexINC (kontrakt nr 279039 till MCV). Fundrarna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera eller förbereda manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| E. coli BL21(DE3) | Novagen | 70235 | DE3 lysogen contains T7 polymerase upon IPTG induction. |
| pET23d | Novagen | 69748-3 | pET23d confers resistance to ampicillin; T7 promoter. |
| LB Broth, Low Salt (Lennox L Broth), Granulated | Melford | GL1703 | Conventional LB Broth, High Salt, can also be used. |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | 10419313 | |
| Incubator Shaker (Thermostated) | NBS | Excella E24 | Any shaker incubator with temperature control can be used. |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG), >=99% | Acros Organics | BP1755 | |
| Sodium acetate, anhydrous, >99% | Melford | B4017 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), Disodium salt, >99% | Acros Organics | AC327205000 | Harmful if inhaled. |
| Centrifuge (refrigerated) | Eppendorf | 5430 | |
| Centrifuge (refrigerated) rotor | Eppendorf | 5430/5430P | |
| Centrifuge | Sorvall | RC5C | |
| Centrifuge rotor | Sorvall | SLA-3000 | |
| Phenol solution, Saturated with 0.1 M citrate buffer, pH 4.3 ± 0.2 | Sigma-Aldrich | P4682 | Acute toxicity (oral, dermal, inhalation), corrosive |
| Ethanol absolute for analysis, 100% v/v | Merck Millipore | 100983 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate, Na2HPO4, >=99% | Sigma-Aldrich | 71643 | |
| Potassium dihydrogen phosphate, KH2PO4 | Merck | 48,730,250 | |
| HiLoad 16/60 Superdex 75 | GE Healthcare | 28989333 | |
| Agarose | Melford | MB1200 | |
| Tris [Tris(hydroxymethyl) aminomethane HCl] | Melford | T1513 | |
| Boric Acid | Melford | B0503 | |
| Microwave | Haier | HDA-2070M | |
| TCEP [Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride] | Sigma-Aldrich | C4706 | Corrosive to metals and skin. |
| ATP [Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate], Grade I, >=99% | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| Magnesium chloride (MgCl2), anhydrous, >=98% | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Sodium chloride (NaCl), >99% | Fisher Bioreagents | BP358 | |
| Potassium chloride (KCl), >99% | Melford | P0515 | |
| NZYDNA Ladder VI | NZYtech | MB8901 | |
| Power supply | Consort | EV261 | |
| Electrophoresis unit | Real Laboratory | RELSMINI10 | |
| Real Safe nucleic acid staining | Real Laboratory | RBMSAFE | 20,000X stock |
| UV Transilluminator (G:Box/EF) | Syngene | 2216498 | |
| Coomassie Brilliant Blue G | Sigma-Aldrich | B0770 | |
| Rocker (Gyro-Rocker) | Stuart | SSL3 | |
| Mixer Vortex | Fisher brand | 13214789 |
References
- Scott, V., Clark, A. R., Docherty, K.
- López-Estepa, M., et al. The crystal structure and small-angle X-ray analysis of CsdL/TcdA reveal a new tRNA binding motif in the MoeB/E1 superfamily. Plos One. 10 (4), e0118606 (2015).
- Miyauchi, K., Kimura, S., Suzuki, T. A cyclic form of N6-threonylcarbamoyladenosine as a widely distributed tRNA hypermodification. Nat Chem Biol. 9 (2), 105-111 (2013).
- Bolstad, H. M., Botelho, D. J., Wood, M. J. Proteomic analysis of protein-protein interactions within the Cysteine Sulfinate Desulfinase Fe-S cluster biogenesis system. J Proteome Res. 9 (10), 5358-5369 (2010).
- Loiseau, L., Ollagnier-de Choudens, S., Lascoux, D., Forest, E., Fontecave, M., Barras, F. Analysis of the heteromeric CsdA-CsdE cysteine desulfurase, assisting Fe-S cluster biogenesis in Escherichia coli. J Biol Chem. 280 (29), 26760-26769 (2005).
- Fried, M. G., Crothers, D. M. Equilibrium studies of the cyclic AMP receptor protein-DNA interaction. J Mol Biol. 172 (3), 241-262 (1984).
- Garner, M. M., Revzin, A. A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system. Nucleic Acids Res. 9 (13), 3047-3060 (1981).
- Rio, D. C. Electrophoretic mobility shift assays for RNA-protein complexes. Cold Spring Harb Protoc. 2014 (4), 435-440 (2014).
- Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift. Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).
- Yakhnin, A. V., Yakhnin, H., Babitzke, P. Gel mobility shift assays to detect protein-RNA interactions. Methods Mol Biol. 905, 201-211 (2012).
- Ream, J. A., Lewis, L. K., Lewis, K. A. Rapid agarose gel electrophoretic mobility shift assay for quantitating protein: RNA interactions. Anal Biochem. 511, 36-41 (2016).
- Hagel, L.
