Summary
Bu umut verici vaskülarizasyon birimlerini temsil adipoz doku türevli mikrovasküler fragmanları izole etmek için bir protokol mevcut. Bunlar hızlı bir şekilde izole edilebilir, bu nedenle, doku mühendisliği farklı alanlarında tek aşamalı prevascularization için kullanılabilmektedir, nitro işleme gerektirmez ve yoktur.
Abstract
Fonksiyonel bir mikrovasküler ağ hayatta kalma ve mühendislik doku yapıları entegrasyonu için önemli bir önem taşımaktadır. Bu amaçla, çeşitli anjiyogenik ve prevascularization stratejileri kurulmuştur. Bununla birlikte, bir çok hücre-bazlı yaklaşımlar mikrovasküler ağı oluşumu için zaman alıcı, in vitro aşamaları içermektedir. Bu nedenle, bu operasyon sırasında tek aşamalı yöntemler için uygun değildir. Adipoz doku türevli mikrovasküler fragmanları (reklam MVF) umut vadeden vaskülarizasyon birimini temsil eder. Kolayca yağ dokusundan izole edilmiş ve bir işlevsel mikrodamar morfoloji sergiler edilebilir. Dahası, hızla in vivo implantasyonu sonrası yeni mikrovasküler ağlara yeniden birleştirmek. Ayrıca, reklam-MVF lemfanjiojenezi neden olduğu gösterilmiştir. Son olarak, daha da yüksek vaskülarizasyon etkisine de katkıda mezenkimal kök hücrelerin zengin bir kaynaktır. Daha önceki çalışmalarda biz olağanüstü vascularizati göstermiştirmühendislik kemik ve cilt ikame reklam-mvf kapasitesine. Bu çalışmada, biz fare yağ dokusundan reklam mvf enzimatik izolasyonu için standart bir protokol rapor.
Introduction
Doku mühendisliği, in vivo meslektaşları 1, 2 çalışamaz işlevini geri ya da takviye iddia ettikleri doku ve organ ikamelerinin üretim odaklanmaktadır. Mühendislik doku yapıları kaderi önemlisi yeterli vaskülarizasyon 3 bağlıdır. Bu yapılara içinde Mikrovasküler ağlar hiyerarşik alıcının damarsal 4'e kaynaştırma sonra verimli kan perfüzyonunu sağlamak için Arterioller, kapiller ve venüllerden ile düzenlenmelidir. Bu tür ağların nesil doku mühendisliğinde temel zorluklardan biridir. Bu amaçla, deneysel vaskülarizasyon stratejileri geniş spektrumlu son yirmi yılda 5, 6 üzerinde tanıtıldı.
Anjiojenik yaklaşımlar mühendislik Tiss içine alıcı mikrodamarlar içeri büyümesini teşvikBu tür büyüme dahil 7 faktörleri olarak yapısal ya da fiziko-kimyasal iskele modifikasyonu vasıtasıyla evet. Bununla birlikte, büyük bir üç boyutlu yapıları vaskülarizasyonu için, anjiyogenez-bağımlı stratejiler belirgin mikrodamarlar gelişmekte olan 8 yavaş büyüme oranları ile sınırlıdır.
Doku yerlefltirilifl 9 öncesinde inşa dahilinde aksine, prevascularization kavramı fonksiyonel mikrovasküler ağların nesil için hedefliyor. Geleneksel prevascularization bu iskeleler olan endotel hücreleri, duvar hücreleri veya kök hücreler 10 gibi kap oluşturan hücre, ko-kültür içerir. mikrovasküler ağ oluşturulduktan sonra prevascularized yapıları daha sonra doku defektlerinin implante edilebilir. Karmaşık ve zaman alıcı in vitro temel aldığı için dikkate değer, bu prevascularization yaklaşım, klinik ortamda uygulamak zordur </ em> önemli düzenleyici engeller 9 kısıtlandığı prosedürleri,. Bu duruma göre, geniş bir klinik uygulama için daha müsait olan yeni prevascularization stratejilerinin geliştirilmesi için hala bir ihtiyaç vardır.
Bu tür bir prevascularization stratejisi adipoz doku türevli mikrovasküler parçalarının (reklam MVF) uygulanması olabilir. Reklam-MVF sıçanlarda 11, 12 ve fareler 13 yağ dokusundan büyük miktarlarda hasat edilebilir kuvvetli vaskülarizasyon birimini temsil eder. Bunlar arteriyoler, kapiler ve bir lümen içeren bir fizyolojik mikrodamar morfolojisi sergileyen venüler damar bölümü ve stabilize edici perivasküler hücreleri 14, 15 oluşmaktadır. Bu benzersiz özellik Bakterinin yetişmesinden önceki süreye olmadan doku defektleri içine reklam MVF seribaşı iskelelerinin hemen implantasyonu verir. Orada, ad-MVF hızla içinde yeniden birleştirmekFonksiyonel mikrovasküler ağlara. Ayrıca, reklam MVF ilave olarak kendi çarpıcı rejeneratif kapasitesine katkıda mezenkimal kök hücrelerin 16, zengin bir kaynak oluşturmaktadır. Buna uygun olarak, reklam MVF artan doku mühendisliği 14, 15, 17, 18, 19, 20, 21 farklı alanlarında kullanılmaktadır.
Ad-mvf izolasyonu aslen 12 sıçanlarda 11 kurulmuştur. Bu yazıda, epididimal yağ pedleri gelen fare reklam mvf standardize izolasyonunu sağlayan bir protokol, açıklar. Bu transgenik fare modelleri kullanılarak reklam MVF fonksiyonu altında yatan moleküler mekanizmaların daha başka bilgi sağlayabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm prosedürler deney hayvanlarının kullanımı için Sağlık kılavuzların Ulusal Enstitüsü göre gerçekleştirilmiştir ve kurumsal yönergelere (Landesamt für Soziales, Gesundheit und Verbraucherschutz Abt. Lebensmittel- und Veterinär-, Zentralstelle, Saarbrücken, Almanya) izledi.
Cerrahi Araçların hazırlanması 1.
- % 10 fetal dana serumu (FCS), 100 U / mL penisilin, 0.1 mg / mL streptomisin, hazır diseksiyon makas, cerrahi forseps, küçük hazırlama makas, ince forseps ve 15 ml Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle ortamında (DMEM ile steril bir Petri kabı tutmak ) epididimal yağ yastıkları hasat için.
- 5 dakika için dezenfekte edici bir çözeltisine cerrahi aletleri Açığa. Seçenek olarak ise, (buhar sterilizasyonu, 121 ° C, 20 dakika) sterilize.
2. Hayvanlar ve Anestezi
- çalışma ve için belirtildiği gibi dikkatle farelerin zorlanma seç soruşturma altında konu.
NOT: Bu çalışmada epididimal yağ hasat için donör olarak erkek vahşi tip C57BL / 6 fareler kullanıldı. Ilgi konusu olan, reklam MVF aynı zamanda transjenik yeşil floresan protein (GFP) pozitif ve donor hayvandan (C57BL / 6-Tg (CAG EGFP) 1Osb / J) 22 izole edilebilir. Bu fragmanlar, GFP-negatif yabani tip farelere 14 implantasyon sonrası GFP immünohistokimyasal boyama ile kolayca tespit edilebilir olan büyük bir avantaj taşımaktadır. - ksilazin (15 mg / kg) ve ketamin (75 mg / kg) intraperitonal enjeksiyonu ile hayvanlar anestezisi. hayvanlar derinden hiçbir yanıt ile bir ayak parmağı tutam yaparak anestezi emin olun. verici hayvanlar yağ hasattan sonra öldürülür olarak göz yağ belirtilmemektedir.
NOT: analjezi ve cerrahi sterilite deneyleri planlanan ülke ve kurumun ilgili kurallarına uyum içindedir emin olun.
- Bir işlem tabloya hayvan aktarın. Cerrahi bir stereomikroskop altında yatar pozisyonda hayvan koyun ve ayak Tutam kullanarak derin anestezi onaylayın.
- Bir cerrahi kumaş bantla yapıştırılarak pençelerini hareketsizleştiriniz ve çözüm dezenfekte ile karın dezenfekte.
- diseksiyon makas ile altta yatan kas tabakasının serbest karın cildi ayırın.
- diseksiyon makas ile orta hat laparotomi ve yanal olarak karın duvarı kanatlarını açığa.
- Bilateral testis, epididimis ve ince forseps (Şekil 1) kullanılarak epididimal yağ pedi tanımlar. Yağ yastıklarının dışkı bulaşmasını önlemek için bağırsak yapıları zarar vermeyin.
- stereomikroskop altında küçük hazırlık makas ve ince forseps ile epididimal yağ yastıkları Hasat. Epididim ve yağ arasında birkaç mm'lik bir emniyet marjı tutunKazara epididimal hasat riskini azaltır.
NOT: Bu prosedür ayrıca bir stereo olmadan gerçekleştirilebilir. Ancak, bu daha da epididim ve spermatik kord kazara yaralanma riskini artırabilir. - DMEM 15 mL içeren bir Petri kutusu içine epididimal yağ pedleri transfer hücre laboratuara taşınması için 37 ° C sıcaklıkta önceden ısıtılır.
- abdominal aort ya da servikal bozma çizilmesi ile hayvan kurban.
ad-mvf 4. İzolasyonu
- 15, fosfat tamponlu tuzlu su mL (PBS), steril bir 14-ml polipropilen (PP) tüpler, steril bir 50 ml Erlenmeyer şişesinde, steril 1.5 mL konik mikrosantrifüj tüpleri ve sterilize ince makas üç steril Petri kapları hazırlayın.
- bir laminar akış başlığı altında 15 ml PBS ile üç kere Petri tabaklarında yağ pedlerine yıkayın.
- 14 mL'lik bir PP tüpe yağ aktarın. t vasıtasıyla (mL) toplandı yağ dokusu hacminin belirlenmesio boru ölçeği. homojen bir doku süspansiyon elde edilene kadar ince makas mekanik yağ dokusunu inceltmek.
- pipet ölçüm 10 mL vasıtasıyla 50 mL'lik bir Erlenmeyer şişesi içine kollajenaz NB4G (0.5 U / ml PBS) iki hacim ile kıyılmış doku aktarın. Toplam hacim adım 4.3 'de ölçülen yağ dokusu hacim üç kez olur. 37 ° C'de ve% 5 CO2 ile nemlendirilmiş atmosfer koşullarına: Otomatik bir karıştırıcı (25 mm Manyetik bir karıştırma çubuğuna boyutu) ile kuvvetli karıştırma altında 10 dakika için bir kuluçka makinesi içinde doku sindirim gerçekleştirin.
- sindirim durdurulabilir olmadığını yargılama mikroskop altında sindirilmiş doku küçük bir bölümünü (10 uL) dikkate alınmalıdır. Enzimatik sindirim olan (Şekil 2) durdurmak için uygun noktayı gösteren Digestate esas olarak aşağıdaki tek hücre "serbest" ad-MVF içerdiğini teyit edin.
NOT: Bu adım prosedürü ile tecrübe gerektirir ve kalite için kritiktirreklam-MVF izole edilmiştir. ad-mvf olmadan tek hücreli süspansiyon yağ sindirimi sonucu uzun süre. - PBS /% 20 FCS iki hacim enzim nötralize. Toplam hacim aşama 4.4'te hücre-damar süspansiyonu hacmi üç kez olur. Yeni PP tüpler içine arka cep damar süspansiyon aktarın.
- yerçekimi ile yağ kalan reklam-MVF ayırmak için 37 ° C de 5 dakika süre ile süspansiyon inkübe edin. Daha sonra dikkatli bir şekilde 1 mL hassas pipet ile ana yağ süpernatant kaldırmak. Süspansiyon yağsız olması görünene kadar 100 mcL hassas pipet ile bu döngüyü birkaç kez tekrarlayın.
- 50 ml konik santrifüj tüpüne üstüne bir 500 um filtre koyun. yağ pıhtıları kalan çıkarmak için filtre zarı üzerine 14 ml PP tüpler 10 ml ölçüm pipet ile hücre-damar süspansiyon aktarın. tek reklam-MVF sayısına göre yeni bir 14-ml PP tüplere süzüldü süspansiyon aktarın planlanan deneyler için izole eder.
NOT: İn vitrmikrovasküler ağı oluşumu odaklanan O deneyleri, ayrıca mikroskopik analiz sırasında görüntüleme kalitesini artırmak için, hücre-damar süspansiyonu saflaştırmak için yararlı olabilir. Bu amaç için, süspansiyon ek olarak, filtre üzerinde toplanan reklam MVF gelen tek hücreleri çıkarmak için, bir 20-mikron filtre ile bir kez filtrelenebilir. - Reklam-MVF ihtiva eden bir pelet elde etmek için, hücre-damar süspansiyonu (600 x g, 5 dakika, oda sıcaklığı) santrifüjleyin.
- Santrifüj işleminden sonra, ml bırakılır 1 kadar supernatant çıkarın. Bu 1 mL reklam MVF ile pelet yeniden süspanse edin ve 1.5 ml konik bir mikrosantrifüj tüpü içine süspansiyon aktarın.
- bir pelet elde etmek için bir mikrosantrifüj tüpü içinde bir reklam-MVF süspansiyonu (600 x g, 5 dakika) santrifüj.
- PBS /% 20 FCS gereken son hacmine pelet yeniden askıya almak için süpernatantı.
NOT: izolatı başına reklam mvf sayısının mikroskobik sayımı ile tespit edilebilir. Nihai hücre vesse bu amaçla, 1/10 İçinl süspansiyonu PBS içinde 1:10 seyreltilir ve bu seyreltme 100 uL, 96 oyuklu bir plaka iyi aktarılır. bir kap benzeri morfolojisi sergileyen reklam MVF tüm sayı daha sonra sayılmış ve bütün izolat için ekstrapole edilir. Gerekli reklam-MVF Konsantrasyon ve saflaştırma tek in vitro veya reklam MVF in vivo uygulamada ilgili uyarlanabilir. Bu mikrovasküler ağ oluşumunun in vitro analizi veya doku defektlerinin içine in vivo implantasyonu için iskeleler reklam-MVF tohumlanmasından kolojen jeller reklam-MVF gömülmesini içerebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu çalışmada, 12 aylık erkek, vahşi tip C57BL / 6 farelerinin (: 35 ± 1 g vücut ağırlığı ortalaması) 7- yağ dokusu ile altı reklam-MVF izolasyon prosedürleri gerçekleştirildi. Şekil 1, daha sonra, mekanik ve enzimatik reklam-MVF yalıtımlı murin epididimal yağ pedleri hasat göstermektedir. yağ toplama için gereken süre 30 dakika olmuştur ve reklam MVF izolasyonu için 120 dakika idi. Toplam olarak, prosedür, 150 dakika sürdü.
Donör hayvan başına adipoz doku 1.2 ± 0.1 mL toplandı. bu yağ miktarı ml başına 42.000 ± 2.000 reklam-MVF izolasyonunu sağladı. İzole edilmiş bir reklam-MVF ortalama uzunluğu 42 ± 1 mikron (Şekil 2A) idi. Şekil 2B'de gösterildiği gibi enzimatik sindirim süresi mikroskopik kontrol ile belirlendi. Reklam-MVF hiyerarşik ves ile tipik bir mikro-damar morfoloji sergilemiştirsel bölümleri (Şekil 2C).
Biz ayrıca akış sitometrisi vasıtasıyla reklam MVF karakterize edilir. Bu amaç için, bir reklam-MVF ayrıca tek hücreler 15 içine 30 dakika boyunca hücre ayırma çözeltisi içinde sindirildi. Akış sitometrik reklam-MVF mezenkimal kök hücre markörü için pozitif 26 ±% 2, CD31-pozitif endotel hücreleri, 17 ±% 2 α-düz kas aktin (SmA) -pozitif perivasküler hücreler ve 9 ±% 1 hücreleri içeren olduğunu ortaya koydu CD117 (Şekil 3A-C). Fikse edilmiş ve histolojik analizler için hemen kesit bir deri deri yerine, ilgili Tohumlanma sonrasında daha büyük reklam-MVF esas olarak implantın yüzeyi (Şekil 3D) üzerinde lokalize edilmiştir. Ancak, kılcal damar segmentleri aynı zamanda gözenekleri içinde tespit edilebilir. tohumlanmış reklam MVF immünohistokimyasal boyanması daha arteriyoler, venülar fizyolojik mikrodamar yapılandırmasını ortayave kılcal damar benzeri fragmanları (Şekil 3E).
Şekil 1: reklam MVF izolasyonu. A) orta hat operasyonunu takiben, epididimal yağ pedleri (yıldız) tespit edilir. adipoz doku küçük hazırlama makas ile hasat edilir ve hayvan abdominal aorta (ok başı) çizilmesi ile kurban edilir. B) doku süspansiyonu kadar ince makas yağ pedleri mekanik kıyma homojen bir şekilde gerçekleşir. Enzimatik sindirimi için C), kolajenaz doku süspansiyona ilave edilir. D) hücre-damar süspansiyonu inkübe edilir ve yüzer tabaka yağ tabakası atılır. E) Santrifüj işleminden sonra, reklam MVF içeren pelet tekrar süspanse edilir ve bu Microvasc in vitro analizi gibi farklı uygulamalar için kullanılabilirular ağı oluşumu ya da doku defektlerinin içine in vivo implantasyonu (F) iskeleler reklam-MVF tohumlama. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Şekil 2: ad-mvf Morfolojik Özellikleri. Taze izole edilmiş bir reklam-MVF A) Uzunluk dağılımı. ortalamanın ortalama ± standart hatadır (n = 6). Büyük (ok sahip olan bir hücre-damar süspansiyon yayma B) Mikroskobik resim), orta büyüklükte (çift ok) ve küçük (siyah ok başları) reklam MVF hem de tek hücreler (beyaz ok başları). Ölçü bar = 110 um. Daha yüksek büyütme, (C o reklam-MVF sergi hiyerarşik mikrovasküler kesimleriyle olgun mikrodamar morfolojisi ortaya koymaktadır
Şekil 3: Akım Sitometrisi, histolojik ve ad-mvf immünohistokimyasal özellikleri. Ac) sitometrik gösteren yeni izole edilmiş bir reklam-MVF CD31-pozitif endotel hücreleri (A), α-SMA pozitif perivasküler hücresi (B) ve CD117 pozitif mezenkimal kök hücre (C), fraksiyon analizi akış. Uygun izotip-eş kontrol eşik seviyesini ayarlamak için kullanıldı. ortalamanın ortalama ± standart hatadır (n = 6). D) hematoksilin ve tohumlanmış deri deri yerine eozin lekeli bölümü. Birkaç kılcal damar segmentleri implant bulunan &# 39; ları gözenekler (ok başları). venülar (çift ok) veya arteriolar (ok) morfolojiye sahip büyük mikrodamar yüzeyi üzerinde lokalize. Ölçek çubuğu 40 um =. Kırık çizgi = implant sınır. E) immünohistokimyasal endotelyal hücre belirteci, CD31 (kırmızı tespiti) ve perivasküler hücre işaretleyici α-SMA (yeşil) vasıtasıyla reklam MVF karakterizasyonu. Hücre çekirdekleri bir DNA-bağlama floresan boya (mavi) ile boyanmıştır. Daha büyük bir lümen (çift ok) fragmanları venüler karşılaştırıldığında Arterioler reklam-MVF (ok) daha kalın bir α-SMA pozitif hücre katmanı ile karakterize edilir. Ok uçları = kılcal ad-MVF. Ölçek çubuğu 25 um =. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışmada reklam mvf izolasyonu için köklü bir protokol mevcut. fare adipoz dokudan reklam MVF edinme birkaç kritik adımlarla basit bir işlemdir. Fareler farklı subkutanöz ve karın içi yağ birikintilerini sergiler. Daha önce fareler için tarif edildiği gibi, reklam MVF izolasyonu için en uygun yağ kaynağı, daha büyük kan damarlarının 11 ile boyut, homojen bir yapı ve en az kirlenme, 12 epididimal yağ pedleri. Bunun aksine, farelerde subkütan yağ tortularının çevreleyen dokuya çok daha küçük ve daha yapışkan bulunmaktadır. Ancak, epididimal yağ pedleri eksizyonu sperm ile hasat doku kirlenme sonuçlanan epididim ve spermatik kord kazara yaralanma riskini taşımaktadır. Bu nedenle, epididimis, testis ve spermatik kord kimlik bu prosedürde büyük önem taşımaktadır. Ayrıca yağ pedleri rapidl olmalıy, ex vivo doku hasarı en aza indirmek için hasat edilmesinden sonra işleme. Son olarak, fare epididimal yağ pedleri 23 vaskülerizasyonunda önemli yaşa bağlı değişimler olduğu dikkate alınmalıdır. Deneyimlerimize göre, 6 ila 12 aylık erkek donör farelerin kullanımı in vitro ve in vivo çalışmalar reklam MVF yeterli miktarda içerir. Bununla birlikte, aynı zamanda daha küçük ama oldukça vaskülarize yağ pedleri 24 sergileyen genç farelerde, reklam-MVF izole edilmesi mümkün olabilir.
Hasat epididimal yağ pedleri enzimatik sindirim önemlisi izole reklam MVF nihai kalitesini belirler. kolajenaz için çok kısa bir anlatım çevreleyen adipositlerden reklam MVF eksik ayrılmasına neden olur. Öte yandan, tek bir hücre süspansiyonu için reklam MVF imha uzun parçalama, sözde stromal vasküler fraksiyon (SVF). SVF heterojen hücre popülasyonu içeren m,esenchymal kök hücreler, endotelyal hücreler, perisitler, makrofajlar ve parakrin ve farklılaşma mekanizmaları 25 sayesinde yeniden üretilebilir potansiyel ile bir çok diğer hücre türleri. Reklam-MVF kullanımı SVF dayalı yaklaşımların karşılaştırıldığında önemli avantajlar arzetmektedir. Reklam-MVF tam fonksiyonel mikrodamar morfolojisi in vitro yetiştirme zaman alıcı ve karmaşık olmadan in vivo deneyler için acil implantasyonu sağlar. Ayrıca, SVF izolasyonu genellikle 90 dakika ila 26 kadar kolajenaz doku sindirilmesini gerektirir. Bunun aksine, doku bozulması, reklam MVF izolasyonu için 10 dk aşmamalıdır. Bu reklam-mvf 9'un ameliyat sırasında tek adımlı uygulamalar fikrini desteklemektedir. Bu amaç için, bir reklam-MVF otomatik olarak otolog lipoaspirates izole edilebilir ve işletme etkinlikleri çıkmadan hastanın bir doku defekti içine geri aktarılır. Bu gerçekçi bir Goa olduğunulipoaspirates gelen SVF otomatik izolasyon zaten plastik cerrahi 27, 28, 29 klinik olarak prosedürdür olduğu gerçeğini göz önünde bulundurarak ben.
Son zamanlarda, kemik 14 ve cilt 15 ikamelerinin, in vivo vaskülarizasyonda yer alan reklam MVF güçlü bir etki göstermişlerdir. Ilgi konusu olan, bunun da reklam MVF 13 yüksek vaskülarizasyon kapasitesine katkıda daha fizyolojik bir ortam sağlar, çünkü izole reklam-MVF gelen tek hücreleri çıkarmak için yararlı olduğunu bulduk. Bu nedenle, sadece daha büyük olmayan sindirilmiş yağ pıhtılarının çıkarılması için reklam MVF izolasyonu sırasında 500 um filtre kullanılır. Ayrıca, implante deride o reklam-MVF neden lenfanjiogenetik 15 yerine bulundu. Dolayısıyla, reklam MVF da lymphat için yapı taşlarını umut verici olabilirIC doku mühendisliği ve ödem tedavisi.
klinik uygulamaya bu deneysel bulguların başarılı çeviri için, bir sonraki mantıksal aşama insan adipoz dokusu kemirgen yağ olarak reklam-MVF izolasyonu için aynı derecede uygun olup olmadığını ortaya koymaktır. Bu bağlamda, kritik bir konu reklam mvf büyük miktarda izole etmek gerekli yağ miktarıdır. protokolü, burada tarif edildiği ml yağ doku başına yaklaşık 40,000 reklam-MVF sonuçlanmıştır. Bu duruma göre, 3 ml yağ dokusu cilt cilt yerine 15 1 cm 2 prevascularize için gerekli olacaktır. Dolayısıyla, bu yaklaşım nedeniyle reklam MVF izolasyonu için kullanılabilir yağ dokusunun sınırlı bir miktarda daha büyük yaralar veya ağır hastalarda tedavisi için uygun olmayabilir.
Doku mühendisliği ve rejeneratif tıpta in vivo uygulamalarda büyük bir potansiyele geniş spektrumlu yanında, reklam MVF da anjiyojenik proc in vitro model için uygunduresses. Örneğin, sıçan ad-MVF yeni mikrovasküler ağlar 30 oluşumunu incelemek için üç boyutlu kolajen Hidrojellerde kültürlenmiştir. Benzer yaklaşımlar, anjiyojenez 31 boyunca neoveseller büyüme 13 veya geçiş matris yeniden görselleştirilmesi için gelişmiş görüntüleme tekniklerini değerlendirmek için kullanılmıştır.
Birlikte ele alındığında, bu bulgular söz konusu reklam-MVF sadece değil, aynı zamanda anjiyogenez ve vasküler fizyoloji alanında temel araştırmalar için, gelecekteki terapötik stratejiler için vaskülarizasyon lenfanjiyojenik birimleri vaat değil göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.
Acknowledgments
Biz Janine Becker, Caroline Bickelmann ve Ruth Nickels mükemmel teknik yardım için teşekkür ederiz. (- Alman Araştırma Vakfı DFG) - LA 2682 / 7-1 Bu çalışma, Deutsche Forschungsgemeinschaft hibe ile finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5-mL conical microcentrifuge tube | VWR, Kelsterbach, Germany | 700-5239 | |
| 100-µL precision pipette | Eppendorf, Hamburg, Germany | 4920000059 | |
| 10-mL measuring pipette | Costar, Corning Inc., New York, USA | 4488 | |
| 14-mL PP tubes | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 187261 | |
| 1-mL precision pipette | Eppendorf, Hamburg, Germany | 4920000083 | |
| 500-µm filter (pluriStrainer 500 µm) | HISS Diagnostics, Freiburg, Germany | 43-50500-03 | |
| 50-mL conical centrifuge tube | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 227261 | |
| 50-mL Erlenmeyer flask | VWR, Kelsterbach, Germany | 214-0211 | |
| 96-well plate | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 65518 | |
| cell detachment solution (Accutase) | eBioscience, San Diego, CA USA | 00-4555-56 | |
| C57BL/6 mice | Charles River, Cologne, Germany | 027 | |
| C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)1Osb/J mice | The Jackson Laboratory, Bar Harbor, USA | 003291 | |
| CD117-FITC | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553373 | |
| CD31-PE | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553354 | |
| Collagenase NB4G | Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany | 17465.02 | Lot tested by manufacturer for enzymatic activity |
| Dissection scissors | Braun Aesculap AG &CoKG, Melsungen, Germany | BC 601 | |
| DNA-binding dye (Bisbenzimide H33342) | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | B2261 | |
| Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) | PAN Biotech, Rickenbach, Germany | P04-03600 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Biochrom GmbH, Berlin, Germany | S0615 | |
| Fine forceps | S&T AG, Neuhausen, Switzerland | FRS-15 RM-8 | |
| Fine scissors | World Precision Instrumets, Sarasota, FL, USA | 503261 | |
| Dermal skin substitute (Integra) | Integra Life Sciences, Sain Priest, France | 62021 | |
| Ketamine | Serumwerk Bernburg AG, Bernburg, Germany | 7005294 | |
| M-IgG2akAL488 | eBioscience, San Diego, CA USA | 53-4724-80 | |
| Octeniderm (disinfecting solution) | Schülke & Mayer, Norderstedt, Germany | 118211 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom, Berlin, Germany | A2213 | |
| Petri dish | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 664160 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Lonza Group, Basel, Switzerland | 17-516F | |
| pluriStrainer 20-µm (20 µm filter) | HISS Diagnostics, Freiburg, Germany | 43-50020-03 | |
| Rat-IgG2akFITC | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553988 | |
| Rat-IgG2akPE | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553930 | |
| Small preparation scissors | S&T AG, Neuhausen, Switzerland | SDC-15 R-8S | |
| Surgical forceps | Braun Aesculap AG &CoKG, Melsungen, Germany | BD510R | |
| Tape (Heftpflaster Seide) 1.25 cm | Fink & Walter GmbH, Mechweiler, Germany | 1671801 | |
| Xylazine | Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany | 1320422 | |
| α-SMA-AL488 | eBioscience, San Diego, CA USA | 53-9760-82 | Intracellular labeling additionally requires Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences, Heidelberg, Germany; #554722) |
References
- Langer, R., Vacanti, J. P. Tissue engineering. Science. 260 (5110), 920-926 (1993).
- Khademhosseini, A., Langer, R. A decade of progress in tissue engineering. Nat Protoc. 11 (10), 1775-1781 (2016).
- Novosel, E. C., Kleinhans, C., Kluger, P. J. Vascularization is the key challenge in tissue engineering. Adv Drug Deliv Rev. 63 (4-5), 300-311 (2011).
- Rouwkema, J., Khademhosseini, A. Vascularization and Angiogenesis in Tissue Engineering: Beyond Creating Static Networks. Trends Biotechnol. 34 (9), 733-745 (2016).
- Laschke, M. W., Menger, M. D. Vascularization in tissue engineering: angiogenesis versus inosculation. Eur Surg Res. 48 (2), 85-92 (2012).
- Sarker, M., Chen, X. B., Schreyer, D. J. Experimental approaches to vascularisation within tissue engineering constructs. J Biomater Sci Polym Ed. 26 (12), 683-734 (2015).
- Frueh, F. S., Menger, M. D., Lindenblatt, N., Giovanoli, P., Laschke, M. W. Current and emerging vascularization strategies in skin tissue engineering. Crit Rev Biotechnol. 20, 1-13 (2016).
- Utzinger, U., Baggett, B., Weiss, J. A., Hoying, J. B., Edgar, L. T. Large-scale time series microscopy of neovessel growth during angiogenesis. Angiogenesis. 18 (3), 219-232 (2015).
- Laschke, M. W., Menger, M. D. Prevascularization in tissue engineering: Current concepts and future directions. Biotechnol Adv. 34 (2), 112-121 (2016).
- Baiguera, S., Ribatti, D. Endothelialization approaches for viable engineered tissues. Angiogenesis. 16 (1), 1-14 (2013).
- Wagner, R. C., Kreiner, P., Barrnett, R. J., Bitensky, M. W. Biochemical characterization and cytochemical localization of a catecholamine-sensitive adenylate cyclase in isolated capillary endothelium. Proc Natl Acad Sci U S A. 69 (11), 3175-3179 (1972).
- Wagner, R. C., Matthews, M. A. The isolation and culture of capillary endothelium from epididymal fat. Microvasc Res. 10 (3), 286-297 (1975).
- Laschke, M. W., Menger, M. D. Adipose tissue-derived microvascular fragments: natural vascularization units for regenerative medicine. Trends Biotechnol. 33 (8), 442-448 (2015).
- Laschke, M. W., et al. Vascularisation of porous scaffolds is improved by incorporation of adipose tissue-derived microvascular fragments. Eur Cell Mater. 24, 266-277 (2012).
- Frueh, F. S., et al. Adipose tissue-derived microvascular fragments improve vascularization, lymphangiogenesis and integration of dermal skin substitutes. J Invest Dermatol. 137 (1), 217-227 (2017).
- McDaniel, J. S., Pilia, M., Ward, C. L., Pollot, B. E., Rathbone, C. R. Characterization and multilineage potential of cells derived from isolated microvascular fragments. J Surg Res. 192 (1), 214-222 (2014).
- Nakano, M., et al. Effect of autotransplantation of microvessel fragments on experimental random-pattern flaps in the rat. Eur Surg Res. 30 (3), 149-160 (1998).
- Nakano, M., et al. Successful autotransplantation of microvessel fragments into the rat heart. Eur Surg Res. 31 (3), 240-248 (1999).
- Shepherd, B. R., Hoying, J. B., Williams, S. K. Microvascular transplantation after acute myocardial infarction. Tissue Eng. 13 (12), 2871-2879 (2007).
- Pilia, M., et al. Transplantation and perfusion of microvascular fragments in a rodent model of volumetric muscle loss injury. Eur Cell Mater. 28, 11-23 (2014).
- Laschke, M. W., et al. Adipose tissue-derived microvascular fragments from aged donors exhibit an impaired vascularisation capacity. Eur Cell Mater. 28, 287-298 (2015).
- Okabe, M., Ikawa, M., Kominami, K., Nakanishi, T., Nishimune, Y. 'Green mice' as a source of ubiquitous green cells. FEBS Lett. 407 (3), 313-319 (1997).
- Honek, J., et al. Modulation of age-related insulin sensitivity by VEGF-dependent vascular plasticity in adipose tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (41), 14906-14911 (2014).
- Cho, C. H., et al. Angiogenic role of LYVE-1-positive macrophages in adipose tissue. Circ Res. 100 (4), e47-e57 (2007).
- Han, S., Sun, H. M., Hwang, K. C., Kim, S. W. Adipose-Derived Stromal Vascular Fraction Cells: Update on Clinical Utility and Efficacy. Crit Rev Eukaryot Gene Expr. 25 (2), 145-152 (2015).
- Chen, Y. J., et al. Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues. J Vis Exp. (109), e53886 (2016).
- Guillaume-Jugnot, P., et al. Autologous adipose-derived stromal vascular fraction in patients with systemic sclerosis: 12-month follow-up. Rheumatology (Oxford). 55 (2), 301-306 (2016).
- Tissiani, L. A., Alonso, N. A Prospective and Controlled Clinical Trial on Stromal Vascular Fraction Enriched Fat Grafts in Secondary Breast Reconstruction. Stem Cells Int. , 2636454 (2016).
- Calcagni, M., et al. The novel treatment of SVF-enriched fat grafting for painful end-neuromas of superficial radial nerve. Microsurgery. , (2016).
- Hoying, J. B., Boswell, C. A., Williams, S. K. Angiogenic potential of microvessel fragments established in three-dimensional collagen gels. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 32 (7), 409-419 (1996).
- Kirkpatrick, N. D., Andreou, S., Hoying, J. B., Utzinger, U. Live imaging of collagen remodeling during angiogenesis. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 292 (6), H3198-H3206 (2007).
