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Bioengineering

ऊतक इंजीनियरिंग के लिए vascularization इकाइयों के रूप में म्यूरीन वसा ऊतक व्युत्पन्न माईक्रवैस्कुलर टुकड़े के अलगाव

Published: April 30, 2017 doi: 10.3791/55721
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1
1Institute for Clinical and Experimental Surgery, Saarland University, 2Division of Plastic Surgery and Hand Surgery, University Hospital Zurich, University of Zurich

Summary

हम एक प्रोटोकॉल उपस्थित वसा ऊतकों व्युत्पन्न microvascular टुकड़े कि होनहार vascularization इकाइयों का प्रतिनिधित्व अलग करने के लिए। वे तेजी से अलग किया जा सकता, इन विट्रो प्रसंस्करण में की आवश्यकता नहीं है, और इस प्रकार ऊतक इंजीनियरिंग के विभिन्न क्षेत्रों में एक कदम prevascularization के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

Abstract

एक कार्यात्मक microvascular नेटवर्क अस्तित्व और इंजीनियर ऊतक निर्माणों के एकीकरण के लिए निर्णायक महत्व का है। इस प्रयोजन के लिए कई एन्जियोजेनिक और prevascularization रणनीतियों स्थापित किया गया है। हालांकि, ज्यादातर सेल-आधारित दृष्टिकोण एक microvascular नेटवर्क के गठन के लिए समय लेने वाली इन विट्रो चरणों में शामिल हैं। इसलिए, वे अंतर शल्य चिकित्सा एक कदम प्रक्रियाओं के लिए उपयुक्त नहीं हैं। वसा ऊतकों व्युत्पन्न microvascular टुकड़े (विज्ञापन MVF) होनहार vascularization इकाइयों का प्रतिनिधित्व करते हैं। वे आसानी से वसा ऊतकों से अलग किया जा सकता है और एक कार्यात्मक microvessel आकृति विज्ञान दिखा रहे हैं। इसके अलावा, वे तेजी से इन विवो आरोपण के बाद नए microvascular नेटवर्क में पुनः। इसके अलावा, विज्ञापन-MVF lymphangiogenesis प्रेरित करने के लिए दिखाया गया है। अंत में, वे मीजेनकाइमल स्टेम कोशिका है, जो आगे उनके उच्च vascularization क्षमता के लिए योगदान कर सकते हैं की एक समृद्ध स्रोत हैं। पिछले अध्ययनों में हम उल्लेखनीय vascularizati का प्रदर्शन किया हैइंजीनियर हड्डी और त्वचा के विकल्प में विज्ञापन-MVF की क्षमता पर। वर्तमान अध्ययन में, हम murine वसा ऊतकों से विज्ञापन-MVF की एंजाइमी अलगाव के लिए एक मानकीकृत प्रोटोकॉल पर रिपोर्ट।

Introduction

ऊतक इंजीनियरिंग ऊतक और अंग के विकल्प का कहना है कि, विवो समकक्षों 1, 2 में बहाल करने या निष्क्रिय के समारोह बढ़ाने के निर्माण पर केंद्रित है। इंजीनियर ऊतक निर्माणों के भाग्य महत्वपूर्ण एक पर्याप्त vascularization 3 पर निर्भर करता है। इन निर्माणों के भीतर माईक्रवैस्कुलर नेटवर्क पदानुक्रम के साथ धमनियों, केशिकाओं, और venules आयोजित किया जाना चाहिए प्राप्तकर्ता के वाहिका से 4 inosculation के बाद कुशल रक्त छिड़काव अनुमति देने के लिए। ऐसे नेटवर्क की पीढ़ी ऊतक इंजीनियरिंग में प्रमुख चुनौतियों में से एक है। इस प्रयोजन के लिए प्रयोगात्मक vascularization रणनीतियों की एक व्यापक स्पेक्ट्रम पिछले दो दशकों 5, 6 से अधिक शुरू किया गया है।

एन्जियोजेनिक दृष्टिकोण इंजीनियर Tiss में प्राप्तकर्ता microvessels की अंतर्वृद्धि को प्रोत्साहितइस तरह की वृद्धि का समावेश कारकों 7 के रूप में संरचनात्मक या भौतिक पाड़ संशोधन के माध्यम, से ues। हालांकि, बड़े तीन आयामी संरचनाओं के vascularization के लिए, एंजियोजिनेसिस पर निर्भर रणनीति स्पष्ट रूप से microvessels 8 के विकास की धीमी गति से विकास दर द्वारा सीमित हैं।

इसके विपरीत, prevascularization की अवधारणा ऊतक के भीतर उनके आरोपण 9 से पहले निर्माण करती कार्यात्मक microvascular नेटवर्क की पीढ़ी के लिए करना है। परम्परागत prevascularization ऐसे अंतर्कलीय कोशिकाओं, भित्ति कोशिकाओं या scaffolds के भीतर स्टेम सेल 10, के रूप में पोत बनाने की कोशिकाओं, के सह संस्कृति शामिल है। microvascular नेटवर्क गठन के बाद prevascularized निर्माणों तो ऊतक दोष में प्रत्यारोपित किया जा सकता है। ध्यान देने योग्य है, इस prevascularization दृष्टिकोण मुश्किल एक नैदानिक सेटिंग में लागू करने के लिए है, क्योंकि यह जटिल और समय लेने वाली इन विट्रो पर आधारित है </ em> प्रक्रियाओं, जो प्रमुख नियामक बाधाओं 9 द्वारा प्रतिबंधित हैं। तदनुसार, वहाँ अभी भी उपन्यास prevascularization रणनीतियों कि एक व्यापक नैदानिक ​​आवेदन के लिए अधिक उपयुक्त हैं के विकास के लिए एक की जरूरत है।

इस तरह की एक prevascularization रणनीति वसा ऊतकों व्युत्पन्न microvascular टुकड़े (विज्ञापन MVF) के आवेदन हो सकता है। विज्ञापन-MVF शक्तिशाली vascularization इकाइयों कि चूहों 11, 12 और चूहों 13 की वसा ऊतकों से बड़ी मात्रा में काटा जा सकता है प्रतिनिधित्व करते हैं। वे arteriolar, केशिका, और venular पोत क्षेत्रों, जो एक लुमेन के साथ एक शारीरिक microvessel आकृति विज्ञान प्रदर्शन और स्थिर परिवाहकीय कोशिकाओं 14, 15 से मिलकर बनता है। इस अनूठी विशेषता precultivation बिना ऊतक दोषों में विज्ञापन-MVF-वरीयता प्राप्त scaffolds के तत्काल आरोपण अनुमति देता है। वहाँ, विज्ञापन MVF तेजी में पुनःकार्यात्मक microvascular नेटवर्क के लिए। इसके अलावा, विज्ञापन-MVF मीजेनकाइमल स्टेम कोशिका 16 है, जो अतिरिक्त उनके हड़ताली पुनर्योजी क्षमता में योगदान कर सकते का एक समृद्ध स्रोत का प्रतिनिधित्व करते हैं। तदनुसार, विज्ञापन-MVF तेजी से ऊतक इंजीनियरिंग 14, 15, 17, 18, 19, 20, 21 के विभिन्न क्षेत्रों में किया जाता है।

विज्ञापन-MVF के अलगाव मूल रूप से 12 चूहों 11 में स्थापित किया गया है। इस के साथ साथ, हम एक प्रोटोकॉल है, जो अधिवृषणी वसा पैड से murine विज्ञापन-MVF के मानकीकृत अलगाव की अनुमति देता है का वर्णन। इस ट्रांसजेनिक माउस मॉडल का उपयोग करके अंतर्निहित विज्ञापन-MVF समारोह आणविक तंत्र में आगे अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं।

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Protocol

सभी प्रक्रियाओं प्रयोगात्मक जानवरों के इस्तेमाल के लिए स्वास्थ्य के दिशा-निर्देशों के राष्ट्रीय संस्थान के अनुसार प्रदर्शन किया और संस्थागत दिशा निर्देशों (Landesamt फर Soziales, Gesundheit und Verbraucherschutz, Abt। Lebensmittel- und Veterinärwesen, Zentralstelle, Saarbrücken, जर्मनी) पीछा किया गया था।

1. सर्जिकल उपकरण की तैयारी

  1. 10% भ्रूण बछड़ा सीरम (FCS), 100 यू / एमएल पेनिसिलिन, 0.1 मिलीग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन; तैयार विच्छेदन कैंची, शल्य चिकित्सा संदंश, छोटे तैयारी कैंची, ठीक संदंश और 15 एमएल Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM के साथ एक बाँझ पेट्री डिश रखें ) अधिवृषणी वसा पैड की कटाई के लिए।
  2. 5 मिनट के लिए एक विसंक्रमण समाधान के लिए शल्य चिकित्सा उपकरणों का पर्दाफाश। वैकल्पिक रूप से, उन्हें नसबंदी (भाप नसबंदी, 121 डिग्री सेल्सियस, 20 मिनट)।

2. पशु और संज्ञाहरण

  1. के रूप में अध्ययन और के लिए संकेत ध्यान से चूहों के तनाव चुनें जांच के तहत विषय।
    नोट: इस अध्ययन में हम अधिवृषणी वसा की कटाई के लिए दाताओं के रूप में पुरुष जंगली प्रकार C57BL / 6 चूहों का इस्तेमाल किया। ब्याज की, विज्ञापन MVF भी ट्रांसजेनिक हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) पॉजिटिव दाता जानवरों (C57BL 6 /-टीजी (सीएजी-EGFP) 1Osb / जम्मू) 22 से अलग किया जा सकता है। यह प्रमुख लाभ यह है कि टुकड़े आसानी से GFP-नकारात्मक जंगली प्रकार चूहों 14 में आरोपण के बाद GFP की प्रतिरक्षाऊतकरसायन धुंधला द्वारा पहचाने जा सकते भालू।
  2. xylazine (15 मिलीग्राम / किग्रा) और ketamine (/ किलो 75 मिलीग्राम) के एक इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन के साथ जानवरों anesthetize। सुनिश्चित करें कि जानवरों गहरा कोई जवाब नहीं के साथ एक पैर की अंगुली चुटकी प्रदर्शन से संज्ञाहरण कर रहे हैं। नेत्र स्नेहक संकेत नहीं है के रूप में दाता जानवरों वसा कटाई के बाद का बलिदान कर रहे हैं।
    ध्यान दें: यह सुनिश्चित करें कि पीड़ाशून्यता और शल्य चिकित्सा बाँझपन देश और संस्था, जहां प्रयोग की योजना है के संबंधित दिशा निर्देशों के साथ समझौते में हैं।
le "> 3। अधिवृषणी वसा पैड की कटाई

  1. एक ऑपरेशन टेबल के लिए पशु स्थानांतरित करें। एक लापरवाह स्थिति में पशु एक शल्य stereomicroscope के तहत रखें और पैर की अंगुली चुटकी का उपयोग कर गहरी संज्ञाहरण की पुष्टि करें।
  2. उन्हें एक शल्य कपड़ा करने के लिए टेप से पंजे को स्थिर और समाधान disinfecting के साथ पेट कीटाणुरहित।
  3. विच्छेदन कैंची के साथ अंतर्निहित मांसपेशियों परत से मुक्त पेट त्वचा अलग करें।
  4. विच्छेदन कैंची के साथ एक मध्य रेखा laparotomy प्रदर्शन करना और पार्श्व पेट की दीवार की फ्लैप उधेड़ना।
  5. द्विपक्षीय वृषण, अधिवृषण और अधिवृषणी वसा पैड ठीक संदंश (चित्रा 1) का उपयोग कर की पहचान। वसा पैड के मल प्रदूषण को रोकने के लिए आंतों संरचनाओं को नुकसान पहुँचा है।
  6. stereomicroscope के तहत छोटे तैयारी कैंची और ठीक संदंश के साथ अधिवृषणी वसा पैड जल को संचित करें। अधिवृषण और वसा के बीच कई मिमी की सुरक्षा मार्जिन रखेंआकस्मिक अधिवृषणी कटाई के जोखिम को कम।
    नोट: यह प्रक्रिया भी एक stereomicroscope के बिना किया जा सकता है। बहरहाल, यह आगे अधिवृषण और शुक्र तार के आकस्मिक चोट के खतरे को बढ़ा सकता है।
  7. DMEM के 15 एमएल युक्त एक पेट्री डिश में अधिवृषणी वसा पैड स्थानांतरण सेल प्रयोगशाला के लिए परिवहन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व गरम किया जाता।
  8. उदर महाधमनी या गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था का चीरा द्वारा पशु बलि।

4. विज्ञापन-MVF का अलगाव

  1. फॉस्फेट बफर खारा के 15 एमएल (पीबीएस), बाँझ 14 एमएल polypropylene (पीपी) ट्यूबों, एक बाँझ 50 मल एर्लेनमेयर फ्लास्क, बाँझ 1.5 एमएल शंक्वाकार microcentrifuge ट्यूब और निष्फल ठीक कैंची के साथ तीन बाँझ पेट्री डिश तैयार करें।
  2. वसा पैड लामिना का प्रवाह हुड के तहत पीबीएस के 15 एमएल के साथ पेट्री डिश में तीन बार धोएं।
  3. एक 14 एमएल पीपी ट्यूब में वसा स्थानांतरित करें। टी के माध्यम से (एमएल में) काटा वसा ऊतकों की मात्रा का निर्धारणवह ट्यूब पैमाने। ठीक कैंची के साथ यंत्रवत् वसा ऊतक क़ीमा जब तक एक सजातीय ऊतक निलंबन प्राप्त की है।
  4. पिपेट मापने 10-एमएल के माध्यम से एक 50 मल एर्लेनमेयर फ्लास्क में कोलैजिनेज़ NB4G (0.5 यू / एमएल पीबीएस) के दो संस्करणों के साथ कीमा बनाया हुआ ऊतक स्थानांतरण। कुल मात्रा कदम 4.3 में मापा वसा ऊतकों की मात्रा तीन बार हो जाता है। और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ 2 के साथ humidified वातावरण की स्थिति: एक स्वचालित दोषी (25 मिमी चुंबकीय हलचल बार का आकार) के माध्यम से जोरदार सरगर्मी के तहत 10 मिनट के लिए एक इनक्यूबेटर में ऊतक पाचन निष्पादित करें।
  5. एक खुर्दबीन के नीचे पचा ऊतक का एक छोटा सा अंश (10 μL) का निरीक्षण न्यायाधीश करने के लिए कि क्या पाचन रोका जा सकता है। पता लगाना है कि digestate मुख्य रूप से एकल कोशिकाओं के बगल में "मुक्त" विज्ञापन-MVF होता है, उपयुक्त बिंदु का संकेत एंजाइमी पाचन प्रक्रिया (चित्रा 2) को रोकने के लिए।
    नोट: यह कदम प्रक्रिया के साथ अनुभव की आवश्यकता है और गुणवत्ता के लिए महत्वपूर्ण हैकी पृथक विज्ञापन-MVF। बिना विज्ञापन-MVF एक एकल कोशिका निलंबन में वसा पाचन परिणाम लंबे समय तक।
  6. पीबीएस / 20% FCS के दो संस्करणों के साथ एंजाइम बेअसर। कुल मात्रा कदम 4.4 में सेल पोत निलंबन की मात्रा तीन बार हो जाता है। सेल पोत निलंबन नई पीपी ट्यूबों में वापस स्थानांतरित करें।
  7. 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए निलंबन सेते गंभीरता से वसा शेष से अलग करने के लिए विज्ञापन-MVF। फिर ध्यान से एक 1 एमएल परिशुद्धता विंदुक के साथ मुख्य वसा सतह पर तैरनेवाला हटाने। जब तक निलंबन वसा रहित हो गया लगता है इस चक्र एक 100 μL परिशुद्धता विंदुक के साथ कई बार दोहराएँ।
  8. एक 50 एमएल शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब के शीर्ष पर एक 500 सुक्ष्ममापी फिल्टर रखो। फिल्टर झिल्ली पर 14 एमएल पीपी ट्यूब से 10 एमएल मापने विंदुक के साथ सेल पोत निलंबन स्थानांतरण वसा के थक्के शेष दूर करने के लिए। अलग-अलग विज्ञापन-MVF की संख्या के अनुसार नए 14-एमएल पीपी ट्यूब में फ़िल्टर निलंबन स्थानांतरण की योजना बनाई प्रयोगों के लिए अलग कर।
    नोट: के लिए में vitrmicrovascular नेटवर्क के गठन पर ध्यान केंद्रित कर ओ assays, यह आगे सूक्ष्म विश्लेषण के दौरान इमेजिंग गुणवत्ता में सुधार करने के लिए सेल-पोत निलंबन शुद्ध करने के लिए फायदेमंद हो सकता है। इस प्रयोजन के लिए निलंबन अतिरिक्त एक बार एक 20 सुक्ष्ममापी फिल्टर के साथ विज्ञापन-MVF से एकल कोशिकाओं फिल्टर पर एकत्र दूर करने के लिए फ़िल्टर किया जा सकता है।
  9. एक गोली युक्त विज्ञापन-MVF प्राप्त करने के लिए सेल पोत निलंबन (600 XG, 5 मिनट, कमरे के तापमान) अपकेंद्रित्र।
  10. centrifugation के बाद, सतह पर तैरनेवाला 1 जब तक एमएल छोड़ दिया है हटा दें। इस 1 एमएल में विज्ञापन-MVF के साथ गोली Resuspend और 1.5 एमएल शंक्वाकार microcentrifuge ट्यूब में निलंबन हस्तांतरण।
  11. एक गोली प्राप्त करने के लिए microcentrifuge ट्यूब में विज्ञापन-MVF निलंबन (600 XG, 5 मिनट) अपकेंद्रित्र।
  12. सतह पर तैरनेवाला निकालें पीबीएस / 20% FCS के लिए जरूरी अंतिम मात्रा में गोली resuspend करने के लिए।
    नोट: अलग प्रति विज्ञापन-MVF की संख्या सूक्ष्म गिनती द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है। इस उद्देश्य, अंतिम सेल vesse की 1/10 के लिएएल निलंबन पीबीएस में पतला 1:10 रहा है और इस कमजोर पड़ने के 100 μL एक 96 अच्छी तरह से थाली के एक कुएँ में स्थानांतरित कर रहे हैं। एक पोत की तरह आकृति विज्ञान का प्रदर्शन विज्ञापन-MVF की पूरी संख्या तो गिना जाता है और पूरे अलग करने के लिए वाग्विस्तार होता है। आवश्यक विज्ञापन-MVF एकाग्रता और शोधन व्यक्तिगत रूप से इन विट्रो में या विज्ञापन-MVF की विवो आवेदन में संबंधित करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता। यह microvascular नेटवर्क के गठन के लिए इन विट्रो विश्लेषण या ऊतक दोषों में इन विवो आरोपण के लिए मचान पर विज्ञापन-MVF के बोने के लिए कोलेजन जैल में विज्ञापन-MVF की एम्बेडिंग शामिल कर सकते हैं।

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Representative Results

वर्तमान अध्ययन में हम 12 महीने पुराने पुरुष जंगली प्रकार C57BL / 6 चूहों (: 35 ± 1 ग्राम का मतलब शरीर के वजन) के लिए 7 से वसा ऊतकों सहित छह विज्ञापन-MVF अलगाव प्रक्रियाओं का प्रदर्शन किया। चित्रा 1 बाद में यांत्रिक और एंजाइमी विज्ञापन-MVF अलगाव के साथ murine अधिवृषणी वसा पैड की कटाई को दिखाता है। समय वसा की कटाई के लिए आवश्यक 30 मिनट था और विज्ञापन-MVF के अलगाव के लिए 120 मिनट था। कुल में, प्रक्रिया 150 मिनट लग गए।

हम दाता पशु प्रति वसा ऊतकों के 1.2 ± 0.1 एमएल काटा। वसा की यह राशि प्रति मिली 42,000 ± 2,000 विज्ञापन-MVF के अलगाव की अनुमति दी। पृथक विज्ञापन-MVF की औसत लंबाई 42 ± 1 सुक्ष्ममापी (चित्रा 2A) था। एंजाइमी पाचन की अवधि सूक्ष्म नियंत्रण के माध्यम से निर्धारित किया गया था के रूप में चित्रा 2 बी में दिखाया गया है। विज्ञापन-MVF श्रेणीबद्ध Ves के साथ एक विशिष्ट microvessel आकृति विज्ञान का प्रदर्शन कियाsel क्षेत्रों (चित्रा 2C)।

हम अतिरिक्त फ्लो के माध्यम से विज्ञापन-MVF होती है। इस प्रयोजन के लिए विज्ञापन-MVF आगे सेल टुकड़ी समाधान में 30 मिनट के लिए एकल कोशिकाओं 15 में पचा रहे थे। प्रवाह cytometric पता चला विश्लेषण है कि विज्ञापन-MVF 26 ± 2% CD31 पॉजिटिव endothelial कोशिकाओं, 17 ± 2% α-चिकनी पेशी actin (SMA) पॉजिटिव परिवाहकीय कोशिकाओं, और 9 ± 1% कोशिकाओं मध्योतक मूल सेल मार्कर के लिए सकारात्मक होते हैं CD117 (चित्रा 3 ए-सी)। एक चमड़े का त्वचा विकल्प है, जो तय किया गया था और ऊतकीय विश्लेषण के लिए तुरंत विभाजित किया, पर बोने के बाद बड़ी विज्ञापन-MVF मुख्य रूप से प्रत्यारोपण की सतह (चित्रा 3 डी) पर स्थानीय कर रहे थे। हालांकि, केशिका पोत खंडों भी अपने pores के भीतर से पता लगाया जा सकता है। वरीयता प्राप्त विज्ञापन-MVF की इम्युनोहिस्टोकैमिकल धुंधला आगे arteriolar, venular साथ शारीरिक microvessel विन्यास पता चलाऔर केशिका की तरह टुकड़े (चित्रा 3E)।

आकृति 1
चित्र 1: विज्ञापन-MVF अलगाव। ए) मध्य रेखा laparotomy के बाद, अधिवृषणी वसा पैड (तारांकन) पहचाने जाते हैं। वसा ऊतकों एक छोटे से तैयारी कैंची से काटा जाता है और पशु उदर महाधमनी (तीर) का चीरा द्वारा बलिदान कर रहा है। बी) ऊतक निलंबन तक ठीक कैंची के साथ वसा पैड की यांत्रिक नख़रेबाज़ सजातीय प्रकट होता है। सी) एंजाइमी पाचन के लिए, कोलैजिनेज़ ऊतक निलंबन में जोड़ा जाता है। डी) सेल पोत निलंबन इनक्यूबेट है और सतह पर तैरनेवाला वसा परत हटा दिया जाएगा। ई) centrifugation के बाद, गोली युक्त विज्ञापन-MVF resuspended है और इस तरह के microvasc की इन विट्रो विश्लेषण के रूप में विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकताular नेटवर्क के गठन या ऊतक दोषों में इन विवो आरोपण (एफ) के लिए मचान पर विज्ञापन-MVF के बोने। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्र 2: विज्ञापन-MVF की morphological विशेषताओं। ए) हाल में अलग-थलग पड़ विज्ञापन-MVF की लंबाई वितरण। माध्य का मतलब ± मानक त्रुटि (n = 6)। बड़े (तीर के साथ एक सेल पोत निलंबन धब्बा की बी) सूक्ष्म छवि), मध्यम आकार (डबल तीर) और छोटे (काला तीर) विज्ञापन-MVF के साथ ही एकल कोशिकाओं (श्वेत तीर)। स्केल बार = 110 सुक्ष्ममापी। उच्च आवर्धन (कि विज्ञापन-MVF प्रदर्शनी श्रेणीबद्ध microvessel क्षेत्रों के साथ एक परिपक्व microvessel आकृति विज्ञान का पता चलता है सी, यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्र 3: प्रवाह cytometric, ऊतकीय और विज्ञापन-MVF की इम्युनोहिस्टोकैमिकल लक्षण। एसी) प्रवाह cytometric हाल में अलग-थलग पड़ विज्ञापन-MVF illustrating CD31 पॉजिटिव endothelial सेल (ए), α-SMA पॉजिटिव परिवाहकीय सेल (बी) और CD117 पॉजिटिव मध्योतक मूल कोशिका (सी) अंशों का विश्लेषण करती है। उचित isotype समान नियंत्रण सीमा स्तर समायोजित करने के लिए इस्तेमाल किया गया। माध्य का मतलब ± मानक त्रुटि (n = 6)। डी) Hematoxylin और एक वरीयता प्राप्त त्वचीय त्वचा स्थानापन्न के इओसिन से सना हुआ अनुभाग। कुछ केशिका पोत क्षेत्रों प्रत्यारोपण में स्थित हैं और# 39; छिद्रों (तीर)। venular (डबल तीर) या arteriolar (तीर) आकृति विज्ञान के साथ बड़ा microvessels इसकी सतह पर स्थानीय कर रहे हैं। स्केल बार = 40 सुक्ष्ममापी। टूटी लाइन = प्रत्यारोपण सीमा। ई) endothelial सेल मार्कर CD31 (लाल की प्रतिरक्षाऊतकरसायन का पता लगाने) और परिवाहकीय सेल मार्कर α-SMA (हरा) के माध्यम से विज्ञापन-MVF की विशेषता। सेल नाभिक एक डीएनए बाध्यकारी फ्लोरोसेंट डाई (नीला) के साथ दाग रहे थे। Arteriolar विज्ञापन-MVF (तीर) एक मोटा α-SMA पॉजिटिव सेल परत की विशेषता है जब एक बड़ा लुमेन (डबल तीर) के साथ टुकड़े venular की तुलना में। तीर = केशिका विज्ञापन-MVF। स्केल बार = 25 सुक्ष्ममापी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इस अध्ययन में हम विज्ञापन-MVF के अलगाव के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। murine वसा ऊतकों से विज्ञापन-MVF प्राप्त करने में कुछ महत्वपूर्ण चरणों के साथ एक सीधी प्रक्रिया है। चूहे विभिन्न चमड़े के नीचे और intraabdominal वसा जमा दिखा रहे हैं। पहले से चूहों के लिए बताया गया है, विज्ञापन-MVF के अलगाव के लिए सबसे उपयुक्त वसा स्रोत उनके आकार, सजातीय संरचना और कम से कम प्रदूषण बड़ा रक्त वाहिकाओं 11 के साथ, 12 की वजह से अधिवृषणी वसा पैड है। इसके विपरीत, चूहों में वसा जमा बहुत छोटे और आसपास के ऊतकों में अधिक पक्षपाती हैं। हालांकि, अधिवृषणी वसा पैड के छांटना अधिवृषण और शुक्र तार के आकस्मिक चोट के जोखिम भालू, शुक्राणुओं के साथ काटा ऊतक के प्रदूषण में जिसके परिणामस्वरूप। इसलिए, अधिवृषण, वृषण और शुक्र तार की पहचान इस प्रक्रिया में प्रमुख महत्व का है। इसके अलावा, वसा पैड rapidl होना चाहिएy पूर्व विवो ऊतक क्षति को कम करने की कटाई के बाद संसाधित। अंत में, यह murine अधिवृषणी वसा पैड 23 की vascularization में प्रमुख उम्र पर निर्भर परिवर्तन होते हैं विचार किया जाना चाहिए। हमारे अनुभव में, 6 से 12 महीने पुराने पुरुष दाता चूहों के उपयोग के लिए इन विट्रो में और vivo अध्ययन में विज्ञापन-MVF पर्याप्त मात्रा में उपलब्ध कराता है। हालांकि, यह भी युवा चूहों जिसमे छोटे लेकिन अत्यधिक vascularized वसा पैड 24 प्रदर्शन से विज्ञापन-MVF अलग करना संभव हो सकता है।

काटा अधिवृषणी वसा पैड की एंजाइमी पाचन महत्वपूर्ण पृथक विज्ञापन-MVF की अंतिम गुणवत्ता निर्धारित करता है। कोलैजिनेज़ को बहुत छोटा प्रदर्शनी आसपास adipocytes से विज्ञापन-MVF का अधूरा जुदाई की ओर जाता है। दूसरी ओर, एक एकल कक्ष निलंबन के लिए विज्ञापन-MVF के विनाश में लंबे समय तक पाचन परिणाम, तथाकथित stromal संवहनी अंश SVF ()। SVF एक विषम सेल आबादी युक्त मीटर हैesenchymal स्टेम कोशिकाओं, endothelial कोशिकाओं, pericytes, मैक्रोफेज और पैराक्राइन और भेदभाव तंत्र 25 के माध्यम से पुनर्योजी क्षमता के साथ कई अन्य प्रकार की कोशिकाओं। विज्ञापन-MVF के उपयोग काफी लाभ दर्शाती है जब SVF-आधारित दृष्टिकोण की तुलना में। विज्ञापन-MVF की पूरी तरह कार्यात्मक microvessel आकृति विज्ञान समय लेने वाली और इन विट्रो खेती में जटिल बिना इन विवो प्रयोगों के लिए उनके तत्काल आरोपण अनुमति देता है। इसके अलावा, SVF के अलगाव आमतौर पर 90 मिनट 26 अप करने के लिए कोलैजिनेज़ साथ ऊतक के पाचन की आवश्यकता है। इसके विपरीत, ऊतक गिरावट विज्ञापन-MVF के अलगाव के लिए 10 मिनट से अधिक नहीं होना चाहिए। इस विज्ञापन-MVF 9 का अंतर शल्य चिकित्सा एक कदम अनुप्रयोगों के विचार का समर्थन करता है। इस प्रयोजन के लिए विज्ञापन-MVF स्वचालित रूप से ऑटोलॉगस lipoaspirates से अलग और ऑपरेशन थियेटर से बाहर निकले बिना रोगी के एक ऊतक दोष में वापस स्थानांतरित किया जा सकता। यह एक यथार्थवादी गोवा हैएल तथ्य यह है कि lipoaspirates से SVF के स्वचालित अलगाव पहले से ही प्लास्टिक सर्जरी 27, 28, 29 में एक नैदानिक स्थापित प्रक्रिया है पर विचार।

हाल ही में, हम हड्डी 14 और त्वचा 15 विकल्प के इन विवो vascularization पर विज्ञापन-MVF के एक मजबूत प्रभाव का प्रदर्शन किया है। ब्याज की, हमने पाया कि यह फायदेमंद है विज्ञापन-MVF से एकल कोशिकाओं को हटाने के लिए नहीं अलग है, क्योंकि वे एक अधिक शारीरिक वातावरण है कि विज्ञापन-MVF 13 के उच्च vascularization क्षमता के लिए योगदान दे सकते हैं। इसलिए, हम केवल बड़ा गैर पचा वसा के थक्के को हटाने के लिए विज्ञापन-MVF के अलगाव के दौरान एक 500 सुक्ष्ममापी फिल्टर का इस्तेमाल किया। इसके अलावा, हमने पाया है कि प्रत्यारोपित त्वचा में विज्ञापन-MVF प्रेरित lymphangiogenesis विकल्प 15। इसलिए, विज्ञापन-MVF भी lymphat के लिए बिल्डिंग ब्लॉक का वादा किया जा सकता हैआईसी ऊतक इंजीनियरिंग और lymphedema चिकित्सा।

नैदानिक ​​अभ्यास में इन प्रयोगात्मक निष्कर्षों के सफल अनुवाद के लिए, अगला तार्किक कदम स्पष्ट करने के लिए है कि मानव वसा ऊतकों को समान रूप से कृंतक वसा के रूप में विज्ञापन-MVF के अलगाव के लिए अनुकूल है। इस संदर्भ में, एक महत्वपूर्ण मुद्दा वसा की मात्रा विज्ञापन-MVF की बड़ी मात्रा को अलग करने के लिए आवश्यक है। इस के साथ साथ प्रोटोकॉल वर्णित प्रति एमएल वसा ऊतकों लगभग 40,000 विज्ञापन-MVF में हुई। तदनुसार, 3 एमएल वसा ऊतक त्वचीय त्वचा स्थानापन्न 15 की 1 सेमी 2 prevascularize करने के लिए आवश्यक हो जाएगा। इसलिए, इस दृष्टिकोण विज्ञापन-MVF अलगाव के लिए उपलब्ध वसा ऊतकों की एक सीमित मात्रा में होने के कारण बड़ा घाव या गंभीर रूप से बीमार रोगियों के उपचार के लिए संभव नहीं हो सकता है।

ऊतक इंजीनियरिंग और पुनर्योजी चिकित्सा इन विवो अनुप्रयोगों में क्षमता का एक व्यापक स्पेक्ट्रम के अलावा, विज्ञापन-MVF भी एन्जियोजेनिक proc के इन विट्रो मॉडलिंग के लिए उपयुक्त हैंesses। उदाहरण के लिए, चूहा विज्ञापन-MVF नई microvascular नेटवर्क 30 के गठन का अध्ययन करने के तीन आयामी कोलेजन हाइड्रोजेल में संवर्धित किया गया है। इसी दृष्टिकोण एंजियोजिनेसिस 31 के दौरान neovessel वृद्धि 13 या मध्यवर्ती मैट्रिक्स remodeling के दृश्य के लिए परिष्कृत इमेजिंग तकनीक का मूल्यांकन किया गया है।

एक साथ, ये निष्कर्षों से पता चलता है कि विज्ञापन-MVF केवल भविष्य चिकित्सकीय रणनीति के लिए vascularization और lymphangiogenic इकाइयों का वादा नहीं कर रहे हैं, लेकिन यह भी एंजियोजिनेसिस और संवहनी शरीर क्रिया विज्ञान के क्षेत्र में बुनियादी अनुसंधान के लिए।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है।

Acknowledgments

हम जैनी बेकर, कैरोलाइन बिकेलमैन और रूथ निकेल्‍स के उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए आभारी हैं। (- जर्मन रिसर्च फाउंडेशन DFG) - ला 2682 / 7-1 इस अध्ययन ड्यूश Forschungsgemeinschaft के अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5-mL conical microcentrifuge tube VWR, Kelsterbach, Germany 700-5239
100-µL precision pipette Eppendorf, Hamburg, Germany 4920000059
10-mL measuring pipette Costar, Corning Inc., New York, USA 4488
14-mL PP tubes Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany 187261
1-mL precision pipette Eppendorf, Hamburg, Germany 4920000083
500-µm filter (pluriStrainer 500 µm) HISS Diagnostics, Freiburg, Germany 43-50500-03
50-mL conical centrifuge tube Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany 227261
50-mL Erlenmeyer flask VWR, Kelsterbach, Germany 214-0211
96-well plate Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany 65518
cell detachment solution (Accutase) eBioscience, San Diego, CA USA 00-4555-56
C57BL/6 mice Charles River, Cologne, Germany 027
C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)1Osb/J mice The Jackson Laboratory, Bar Harbor, USA 003291
CD117-FITC BD Biosciences, Heidelberg, Germany 553373
CD31-PE BD Biosciences, Heidelberg, Germany 553354
Collagenase NB4G  Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany 17465.02 Lot tested by manufacturer for enzymatic activity
Dissection scissors Braun Aesculap AG &CoKG, Melsungen, Germany BC 601
DNA-binding dye (Bisbenzimide H33342) Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany B2261
Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM)  PAN Biotech, Rickenbach, Germany P04-03600
Fetal calf serum (FCS) Biochrom GmbH, Berlin, Germany S0615
Fine forceps S&T AG, Neuhausen, Switzerland FRS-15 RM-8
Fine scissors World Precision Instrumets, Sarasota, FL, USA 503261
Dermal skin substitute (Integra) Integra Life Sciences, Sain Priest, France 62021
Ketamine  Serumwerk Bernburg AG, Bernburg, Germany 7005294
M-IgG2akAL488   eBioscience, San Diego, CA USA 53-4724-80
Octeniderm (disinfecting solution) Schülke & Mayer, Norderstedt, Germany 118211
Penicillin/Streptomycin Biochrom, Berlin, Germany A2213
Petri dish Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany 664160
Phosphate-buffered saline (PBS) Lonza Group, Basel, Switzerland 17-516F
pluriStrainer 20-µm (20 µm filter) HISS Diagnostics, Freiburg, Germany 43-50020-03
Rat-IgG2akFITC BD Biosciences, Heidelberg, Germany 553988
Rat-IgG2akPE BD Biosciences, Heidelberg, Germany 553930
Small preparation scissors S&T AG, Neuhausen, Switzerland SDC-15 R-8S
Surgical forceps Braun Aesculap AG &CoKG, Melsungen, Germany BD510R
Tape (Heftpflaster Seide) 1.25 cm Fink & Walter GmbH, Mechweiler, Germany 1671801
Xylazine  Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany 1320422
α-SMA-AL488 eBioscience, San Diego, CA USA 53-9760-82 Intracellular labeling additionally requires Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences, Heidelberg, Germany; #554722)

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References

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Frueh, F. S., Später, T., Scheuer, C., Menger, M. D., Laschke, M. W. Isolation of Murine Adipose Tissue-derived Microvascular Fragments as Vascularization Units for Tissue Engineering. J. Vis. Exp. (122), e55721, doi:10.3791/55721 (2017).

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