Summary
Vi præsenterer en protokol til isolering fedtvævslidelser-afledte mikrovaskulære fragmenter, der repræsenterer lovende vaskularisering enheder. De kan hurtigt isoleres, ikke kræver in vitro behandling og således kan anvendes til et-trins prevascularization i forskellige områder af vævsmanipulering.
Abstract
Et funktionelt mikrovaskulær netværk er af central betydning for overlevelse og integration af manipulerede vævskonstruktioner. Til dette formål er der etableret flere angiogene og prevascularization strategier. Men de fleste cellebaserede midler indbefatter tidskrævende in vitro trin til dannelse af en mikrovaskulær netværk. Derfor er de ikke egnede til intraoperative éttrins procedurer. Adipøst vævsafledte mikrovaskulære fragmenter (ad-MVF) repræsenterer lovende vaskularisering enheder. De let kan isoleres fra fedtvæv og udviser en funktionel mikrokar morfologi. Desuden har de hurtigt samle ind i nye mikrovaskulære netværk efter in vivo implantation. Desuden har ad-MVF vist sig at inducere lymfangiogenese. Endelig er de en rig kilde til mesenkymale stamceller, som yderligere kan bidrage til deres høje vaskularisering potentiale. I tidligere undersøgelser har vi vist den bemærkelsesværdige vascularizatipå kapaciteten af ad-MVF i manipuleret knogle og hud erstatninger. I den foreliggende undersøgelse rapporterer vi på en standardiseret protokol for den enzymatiske isolation af ad-MVF fra murine fedtvæv.
Introduction
Tissue engineering fokuserer på fremstillingen af vævs- og organ-erstatninger, der opretholder, genoprette eller forøge funktionen af inoperabel in vivo modstykker 1, 2. Den skæbne manipuleret væv konstruktioner er helt afhængig af en tilstrækkelig vaskularisering 3. Mikrovaskulære netværk inden disse konstruktioner skal hierarkisk organiseret med arteriolerne, kapillærer og små blodårer til at tillade effektiv blod perfusion efter inosculation til modtagerens kar 4. Dannelsen af sådanne netværk er blandt de centrale udfordringer i tissue engineering. Til dette formål har et bredt spektrum af eksperimentelle vaskularisering strategier blevet indført i løbet af de sidste to årtier 5, 6.
Angiogene fremgangsmåder stimulerer indvæksten af modtagende mikrokar i manipulerede tissdier ved hjælp af strukturel eller fysisk stillads modifikation, såsom inkorporering af vækstfaktorer 7. Men for vaskularisering af store tredimensionale konstruktioner, angiogeneseafhængige strategier er markant begrænset af langsomme vækstrater for udvikling af mikrokar 8.
Derimod begrebet prevascularization sigter til generering af funktionelle mikrovaskulære netværk inden væv konstruerer før deres implantation 9. Konventionel prevascularization involverer co-dyrkning af fartøjers-dannende celler, såsom endotelceller, murkrone celler eller stamceller 10, inden stilladser. Efter mikrovaskulær netværksdannelse kan de prevascularized konstruktioner derefter implanteres i vævsdefekter. Bemærkelsesværdige, denne prevascularization tilgang er vanskelig at anvende i et klinisk miljø, fordi den er baseret på komplekse og tidskrævende in vitro </ em> procedurer, som er begrænset af de store lovgivningsmæssige forhindringer 9. Følgelig er der stadig et behov for udviklingen af hidtil ukendte prevascularization strategier, der er mere egnet til en bred klinisk anvendelse.
En sådan prevascularization strategi kan være anvendelsen af adipøst væv-afledte mikrovaskulære fragmenter (ad-MVF). ad-MVF repræsenterer potente vaskularisering enheder, som kan høstes i store mængder fra fedtvævet af rotter 11, 12 og mus 13. De består af arteriolær, kapillær, og venular karsegmenter, der udviser en fysiologisk mikrokar morfologi med et lumen og stabiliserende perivaskulære celler 14, 15. Denne unikke funktion giver den umiddelbare implantation af ad-MVF-seedede stilladser i væv defekter uden precultivation. Der er ad-MVF hurtigt samle itil funktionelle mikrovaskulære netværk. Endvidere ad-MVF repræsenterer en rig kilde til mesenkymale stamceller 16, som yderligere kan bidrage til deres slående regenerationsevne. Følgelig er ad-MVF stigende grad anvendes i forskellige områder af vævsmanipulering 14, 15, 17, 18, 19, 20, 21.
Isoleringen af ad-MVF oprindeligt blev etableret i rotter 11, 12. Heri beskriver vi en protokol, der tillader den standardiserede isolering af henholdsvis murine ad-MVF fra epididymale fedtpuder. Dette kan give yderligere indsigt i molekylære mekanismer bag ad-MVF funktion ved hjælp af transgene musemodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer blev udført i overensstemmelse med National Institute of Health retningslinjer for brugen af forsøgsdyr og fulgte institutionelle retningslinier (Landesamt für Soziales, Gesundheit und Verbraucherschutz, Abt. Lebensmittel- und Veterinärwesen, Zentralstelle, Saarbrücken, Tyskland).
1. Fremstilling af kirurgiske instrumenter
- Holde klar dissektion saks, kirurgiske pincet, små forberedelse saks, fine pincet og en steril petriskål med 15 ml Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM, 10% føtalt kalveserum (FCS), 100 U / ml penicillin, 0,1 mg / ml streptomycin ) til høst af epididymisfedtpuderne.
- Expose de kirurgiske instrumenter til en desinficerende opløsning i 5 min. Alternativt sterilisere dem (dampsterilisering, 121 ° C, 20 min).
2. Dyr og Anæstesi
- Vælg omhyggeligt stammen af musene som angivet for undersøgelsen og emne, der undersøges.
BEMÆRK: I dette studie anvendte vi mandlige vildtype C57BL / 6-mus som donorer for høst af epididymal fedt. Af interesse, kan ad-MVF også isoleret fra transgene grønne fluorescerende protein (GFP) -positive donordyr (C57BL / 6-Tg (CAG-EGFP) 1Osb / J) 22. Dette er forsynet med store fordel at fragmenterne er let påviselige ved immunhistokemisk farvning af GFP efter implantation i GFP-negative vildtypemus 14. - Bedøver dyrene med en intraperitoneal injektion af xylazin (15 mg / kg) og ketamin (75 mg / kg). Sørg for, at dyrene er dybt bedøvet ved at udføre en tå knivspids med intet svar. Øje smøremiddel angives ikke som donordyr aflives efter fedt høst.
BEMÆRK: Sørg for, at analgesi og kirurgisk sterilitet er i overensstemmelse med de respektive retningslinjer i landet og institution, hvor der er planlagt forsøgene.
- Overfør dyret til en operation tabel. Placer dyret i liggende stilling under en kirurgisk stereomikroskop og bekræft dyb anæstesi ved hjælp tå knivspids.
- Bloker poterne ved at tape dem til et kirurgisk afdækningsstykke og desinficere maven med desinficerende løsning.
- Adskil abdominale hud fri af det underliggende muskellag med dissektion saks.
- Udfør en midtlinie laparotomi med dissektion saks og lateralt udfolde flapperne i bugvæggen.
- Bilateralt identificere testikel, epididymis og epididymale fedtpude under anvendelse af de fine pincet (figur 1). Må ikke skade tarmens strukturer til at forhindre fækal forurening af fedtpuder.
- Høst de epididymale fedtpuder med de små forberedelse saks og de fine pincet under stereomikroskop. Hold en sikkerhedsafstand på flere mm mellem bitestiklen og fedt tilreducere risikoen for utilsigtet epididymis høst.
BEMÆRK: Denne procedure kan også udføres uden et stereomikroskop. Imidlertid kan dette yderligere øge risikoen for utilsigtet skade i epididymis og spermatic snore. - Overfør epididymisfedtpuderne i en petriskål indeholdende 15 ml DMEM forvarmet ved 37 ° C til transport til cellen laboratorium.
- Ofre dyret ved snit af den abdominale aorta eller cervikal dislokation.
4. Isolering af ad-MVF
- Forberede tre sterile petriskåle med 15 ml phosphatbufret saltvand (PBS), sterilt 14 ml polypropylen (PP) rør, et sterilt 50-ml Erlenmeyer-kolbe, sterile 1.5 ml konisk Mikrocentrifugerør og steriliserede fine sakse.
- Vask de fedtpuder tre gange i petriskåle med 15 ml PBS under laminar udsugning.
- Overfør fedtet til et 14-ml PP-rør. Bestemme volumenet af høstede fedtvæv (i ml) ved hjælp af than rør skala. Hak fedtvævet mekanisk med de fine sakse, indtil en homogen vævssuspension opnås.
- Overfør det hakkede væv med to volumener collagenase NB4G (0,5 U / ml PBS) i en 50 ml Erlenmeyer-kolbe ved hjælp af 10-ml måler pipette. Det totale volumen bliver tre gange mængden af fedtvæv målt i trin 4.3. Udføre vævsfordøjelse i en inkubator i 10 minutter under kraftig omrøring ved hjælp af en automatiseret omrører (størrelse af magnetisk omrører: 25 mm) ved 37 ° C og fugtede atmosfæriske betingelser med 5% CO2.
- Observere en lille brøkdel (10 pi) af det fordøjede væv under et mikroskop for at bedømme, om fordøjelsen kan stoppes. Konstatere, at det fermenterede hovedsageligt indeholder "fri" ad-MVF siden af enkelte celler, hvilket indikerer den passende punkt for at stoppe den enzymatiske fordøjelsesproces (figur 2).
BEMÆRK: Dette trin kræver erfaring med proceduren og er kritisk for kvalitetenaf isolerede ad-MVF. Langvarig fedt fordøjelse resulterer i en enkelt-cellesuspension uden ad-MVF. - Neutraliser enzymet med to volumener PBS / 20% FCS. Det totale volumen bliver tre gange volumenet af suspensionen celle-fartøj i trin 4.4. Suspensionen overføres celle-fartøj tilbage i nye PP rør.
- Inkubere suspensionen i 5 minutter ved 37 ° C for at adskille ad-MVF forbliver fedt af tyngdekraften. Fjern derefter forsigtigt den vigtigste fedt supernatanten med en 1-ml pipette. Gentag denne cyklus flere gange med en 100-uL pipette, indtil suspensionen synes at være fedtfri.
- Sætte en 500-um filter oven på en 50 ml konisk centrifugerør. Suspensionen overføres celle-fartøj med en 10-ml måling pipette fra de 14-ml PP-rør på filteret membran for at fjerne resterende fedt blodpropper. Overfør den filtrerede suspension i nye 14-ml PP-rør i forhold til antallet af individuelle ad-MVF isolater for de planlagte eksperimenter.
BEMÆRK: i vi troo assays fokus på mikrovaskulær netværksdannelse, kan det være fordelagtigt yderligere at oprense den celle-fartøj suspension for at forbedre kvaliteten billeddannelse under mikroskopiske analyser. Til dette formål kan suspensionen yderligere filtreres en gang med en 20-um filter for at fjerne enkelte celler fra ad-MVF opsamlet på filteret. - Centrifugeres suspensionen celle-beholder (600 xg, 5 min, stuetemperatur) til opnåelse af en pellet indeholdende ad-MVF.
- Efter centrifugering fjernes supernatanten indtil 1 ml er tilbage. Pelleten resuspenderes med ad-MVF i denne 1 ml og overfør suspensionen i et 1,5-ml konisk mikrocentrifugeglas.
- Centrifugeres ad-MVF suspension i mikrocentrifugerør (600 xg, 5 min) for at opnå en pellet.
- Fjern supernatanten for at resuspendere pelleten i den krævede endelige volumen af PBS / 20% FCS.
BEMÆRK: Antallet af ad-MVF pr isolat kan vurderes ved mikroskopisk tælling. Til dette formål 1/10 af den endelige celle-vessel suspension fortyndet 1:10 i PBS og 100 pi af denne fortynding overføres til en brønd i en plade med 96 brønde. Hele antal ad-MVF udviser en beholder-lignende morfologi derefter tælles og ekstrapoleres til hele isolat. Den krævede ad-MVF koncentration og oprensning kan tilpasses individuelt til de respektive in vitro eller in vivo anvendelse af ad-MVF. Dette kan omfatte indlejring af ad-MVF i kollagengeler til in vitro analyse af mikrovaskulære netværk dannelse eller podningen af ad-MVF på stillads til in vivo implantation i vævsdefekter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I den foreliggende undersøgelse har vi udført seks ad-MVF isoleringsprocedurer med fedtvæv fra 7- til 12-måneder gammel mand vildtype C57BL / 6-mus (gennemsnitlig kropsvægt: 35 ± 1 g). Figur 1 illustrerer høst af murine epididymisfedtpuderne med efterfølgende mekanisk og enzymatisk ad-MVF isolation. Den nødvendige tid for høstning af fedt var 30 minutter, og til isolering af ad-MVF var 120 min. I alt proceduren tog 150 min.
Vi høstede 1,2 ± 0,1 ml fedtvæv pr donordyret. Denne mængde fedt tillod isoleringen af 42.000 ± 2.000 ad-MVF per ml. Middellængden af det isolerede ad-MVF var 42 ± 1 um (figur 2A). Varigheden af enzymatisk fordøjelse blev bestemt ved hjælp af mikroskopisk kontrol som vist i figur 2B. ad-MVF udviste en typisk mikrokar morfologi med hierarkiske vessel segmenter (figur 2C).
Vi har desuden kendetegnet ad-MVF ved hjælp af flowcytometri. Til dette formål blev ad-MVF yderligere spaltet i celle løsrivelse opløsning i 30 minutter i enkelte celler 15. Den flowcytometriske analyser afslørede, at ad-MVF indeholder 26 ± 2% CD31-positive endotelceller, 17 ± 2% α-glatmuskelactin (SMA) -positive perivaskulære celler og 9 ± 1% celler er positive for den mesenchymale stamcelle markør CD117 (figur 3A-C). Efter podning på en dermal hudsubstitut, som blev fikseret og snittet umiddelbart til histologiske analyser, større ad-MVF hovedsagelig lokaliseret på implantatets overflade (figur 3D). Imidlertid kunne også påvises kapillære karsegmenter inden dens porer. Immunhistokemisk farvning af podet ad-MVF afslørede yderligere fysiologisk mikrokar konfiguration med arteriolær, venularog kapillaragtige fragmenter (figur 3E).
Figur 1: ad-MVF Isolation. A) Efter midterlinjen laparotomi, er epididymisfedtpuderne (stjerner) identificeret. Fedtvæv høstes med en lille forberedelse saks og dyret aflivet ved indsnit i den abdominale aorta (pilespids). B) Mekanisk hakning af de fedtpuder med fine sakse, indtil vævet suspensionen virker homogen. C) For enzymatisk fordøjelse, er collagenase tilsættes til vævet suspension. D) Suspensionen celle-fartøj inkuberes og supernatanten fedt lag kasseres. E) Efter centrifugering pelleten indeholdende ad-MVF resuspenderet og kan bruges til forskellige applikationer, såsom in vitro-analyse af Microvascular netværksdannelse eller podningen af ad-MVF på stillads til in vivo implantation i vævsdefekter (F). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Morfologiske kendetegn ad-MVF. A) Længde distribution af frisk isolerede ad-MVF. Gennemsnit ± standardfejl på middelværdien (n = 6). B) Mikroskopisk billede af en celle-fartøj suspension smear med store (pil), mellemstore (dobbelt pile) og små (sorte pilespidser) ad-MVF samt enkelte celler (hvide pilespidser). Skala bar = 110 um. Højere forstørrelse afslører, at ad-MVF udviser en moden mikrokar morfologi med hierarkisk mikrokarpericytter segmenter (C,
Figur 3: Flowcytometrisk, Histologisk og Immunhistokemiske Karakteristik af ad-MVF. AC) Flowcytometrisk analyse af frisk isoleret ad-MVF illustrerer CD31-positive endotelcelle (A), α-SMA-positive perivaskulær celle (B) og CD117-positive mesenchymal stamcelle (C) fraktioner. Passende isotype-identiske kontroller blev anvendt til at justere tærskelniveauer. Gennemsnit ± standardfejl på middelværdien (n = 6). D) Hematoxylin og eosin-farvet snit af en podet dermal hudsubstitut. Enkelte kapillær skibssegmenter er placeret i implantatet &# 39; s porer (pilespidser). Større mikrokar med venular (dobbeltpil) eller arteriolær (pil) morfologi er lokaliseret på overfladen. Målestokken = 40 um. Broken linje = implantat grænse. E) Karakterisering af ad-MVF ved hjælp af immunhistokemisk detektion af endotelcelle markør CD31 (rød) og den perivaskulære celle markør α-SMA (grøn). Cellekerner blev farvet med en DNA-bindende fluorescerende farve (blå). Arteriolær ad-MVF (pil) er karakteriseret ved en tykkere α-SMA-positive cellelag i sammenligning med venular fragmenter med en større lumen (dobbelt pil). Pilespidser = kapillær ad-MVF. Målestokken = 25 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne undersøgelse præsenterer vi en veletableret protokol til isolering af ad-MVF. Indhentning ad-MVF fra murine fedtvæv er en enkel procedure med et par kritiske trin. Mus udviser forskellig subkutan og intraabdominale fedtdepoter. Som tidligere beskrevet for rotter, den mest egnede fedtkilde til isolering af ad-MVF er epididymisfedtpuderne grund af deres størrelse, homogen struktur og minimal kontaminering med større blodkar 11, 12. I modsætning hertil subkutane fedtdepoter hos mus er meget mindre og mere klæbende til det omgivende væv. Imidlertid udskæringen af epididymale fedtpuder bærer risikoen for utilsigtet skade i epididymis og spermatic snore, hvilket resulterer i kontaminering af den høstede væv med sperms. Derfor identificering af epididymis, testis og sædstrenge er af stor betydning i denne procedure. Endvidere bør fedtpuder være rapidly forarbejdes efter høst at undgå ex vivo vævsbeskadigelse. Endelig bør det overvejes, at der er store aldersafhængige variationer i vaskularisering af murine epididymale fedtpuder 23. Det er vores erfaring, brug af 6 til 12 måneder gamle mandlige donor mus giver tilstrækkelige mængder af ad-MVF for in vitro og in vivo-undersøgelser. Det kan dog også være muligt at isolere ad-MVF fra yngre mus, der udviser mindre men yderst vaskulariserede fedtpuder 24.
Den enzymatiske fordøjelse af de høstede epididymale fedtpuder afgørende bestemmer den endelige kvalitet af isoleret ad-MVF. For kort redegørelse for collagenase fører til ufuldstændig adskillelse af ad-MVF fra omgivende adipocytter. På den anden side, forlængede fordøjelse resulterer i destruktion af ad-MVF til en enkelt cellesuspension, den såkaldte stromale vaskulære fraktion (SVF). SVF er en heterogen cellepopulation indeholdende mesenchymal stamceller, endotelceller, pericytter, makrofager og mange andre celletyper med regenererende potentiale gennem parakrine og differentieringsmekanismer 25. Anvendelsen af ad-MVF udviser betydelige fordele i sammenligning med SVF-tilgange. Den fuldt funktionelle mikrokar morfologien af ad-MVF tillader deres umiddelbare implantation til in vivo eksperimenter uden tidskrævende og komplekset in vitro dyrkning. Desuden er isoleringen af SVF kræver sædvanligvis fordøjelsen af vævet med collagenase op til 90 min 26. Derimod bør vævsnedbrydning ikke overstige 10 min til isolering af ad-MVF. Dette understøtter ideen om intraoperative én-trins anvendelser af annonce-MVF 9. Til dette formål kan ad-MVF automatisk kobles fra autologe lipoaspirates og ført tilbage til en vævsdefekt af patienten uden at forlade operationsstuen. Dette er en realistisk goal betragtning af, at den automatiserede isolering af SVF fra lipoaspirates er allerede en klinisk etableret procedure i plastikkirurgi 27, 28, 29.
For nylig har vi vist en stærk effekt af ad-MVF på in vivo-vaskularisering af knogle 14 og huden 15 suppleanter. Af interesse, fandt vi, at det er fordelagtigt ikke at fjerne enkelte celler fra ad-MVF isolat, fordi de kan give en mere fysiologisk miljø, der bidrager til den høje vaskularisering kapacitet af ad-MVF 13. Derfor, vi kun bruges en 500-um filter under isoleringen af ad-MVF til fjernelse af større ikke-fordøjet fedt blodpropper. Desuden fandt vi, at ad-MVF fremkalde lymfangiogenese i implanteret hud erstatter 15. Derfor kan ad-MVF også lovende byggesten for lymphatic vævskonstruktion og lymfeødem terapi.
For en vellykket oversættelse af disse eksperimentelle resultater i klinisk praksis, det næste logiske skridt er at afklare, om den menneskelige fedtvæv er lige velegnet til isolering af ad-MVF som gnaver fedt. I denne sammenhæng er et kritisk spørgsmål er mængden af fedt der kræves for at isolere store mængder ad-MVF. Den beskrevne protokol heri medførte ca. 40.000 ad-MVF pr ml fedtvæv. Følgelig ville 3 ml fedtvæv være nødvendigt at prevascularize 1 cm2 dermal hudsubstitut 15. Derfor kan denne fremgangsmåde ikke være muligt for behandling af større sår eller alvorligt syge patienter på grund af en begrænset mængde tilgængelig fedtvæv til ad MVF isolation.
Ved siden af et bredt spektrum af potentielle in vivo-anvendelser i vævsmanipulering og regenerativ medicin, ad-MVF er også egnede til in vitro modellering af angiogen processes. For eksempel har rotte ad-MVF blevet dyrket i tredimensionale collagen hydrogeler til at studere dannelsen af nye mikrovaskulære netværk 30. Lignende fremgangsmåder er blevet anvendt til at evaluere avancerede billeddannende teknikker til visualisering af neovessel vækst 13 eller interstitiel matrix remodellering under angiogenese 31.
Tilsammen disse resultater tyder på, at ad-MVF er ikke kun lovende vaskularisering og lymfangiogene enheder for fremtidige terapeutiske strategier, men også til grundforskning inden for angiogenese og vaskulær fysiologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi er taknemmelige for den fremragende teknisk bistand fra Janine Becker, Caroline Bickelmann og Ruth Nickels. Denne undersøgelse blev finansieret af en bevilling på Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG - German Research Foundation) - LA 2682 / 7-1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5-mL conical microcentrifuge tube | VWR, Kelsterbach, Germany | 700-5239 | |
| 100-µL precision pipette | Eppendorf, Hamburg, Germany | 4920000059 | |
| 10-mL measuring pipette | Costar, Corning Inc., New York, USA | 4488 | |
| 14-mL PP tubes | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 187261 | |
| 1-mL precision pipette | Eppendorf, Hamburg, Germany | 4920000083 | |
| 500-µm filter (pluriStrainer 500 µm) | HISS Diagnostics, Freiburg, Germany | 43-50500-03 | |
| 50-mL conical centrifuge tube | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 227261 | |
| 50-mL Erlenmeyer flask | VWR, Kelsterbach, Germany | 214-0211 | |
| 96-well plate | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 65518 | |
| cell detachment solution (Accutase) | eBioscience, San Diego, CA USA | 00-4555-56 | |
| C57BL/6 mice | Charles River, Cologne, Germany | 027 | |
| C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)1Osb/J mice | The Jackson Laboratory, Bar Harbor, USA | 003291 | |
| CD117-FITC | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553373 | |
| CD31-PE | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553354 | |
| Collagenase NB4G | Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany | 17465.02 | Lot tested by manufacturer for enzymatic activity |
| Dissection scissors | Braun Aesculap AG &CoKG, Melsungen, Germany | BC 601 | |
| DNA-binding dye (Bisbenzimide H33342) | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | B2261 | |
| Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) | PAN Biotech, Rickenbach, Germany | P04-03600 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Biochrom GmbH, Berlin, Germany | S0615 | |
| Fine forceps | S&T AG, Neuhausen, Switzerland | FRS-15 RM-8 | |
| Fine scissors | World Precision Instrumets, Sarasota, FL, USA | 503261 | |
| Dermal skin substitute (Integra) | Integra Life Sciences, Sain Priest, France | 62021 | |
| Ketamine | Serumwerk Bernburg AG, Bernburg, Germany | 7005294 | |
| M-IgG2akAL488 | eBioscience, San Diego, CA USA | 53-4724-80 | |
| Octeniderm (disinfecting solution) | Schülke & Mayer, Norderstedt, Germany | 118211 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom, Berlin, Germany | A2213 | |
| Petri dish | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 664160 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Lonza Group, Basel, Switzerland | 17-516F | |
| pluriStrainer 20-µm (20 µm filter) | HISS Diagnostics, Freiburg, Germany | 43-50020-03 | |
| Rat-IgG2akFITC | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553988 | |
| Rat-IgG2akPE | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553930 | |
| Small preparation scissors | S&T AG, Neuhausen, Switzerland | SDC-15 R-8S | |
| Surgical forceps | Braun Aesculap AG &CoKG, Melsungen, Germany | BD510R | |
| Tape (Heftpflaster Seide) 1.25 cm | Fink & Walter GmbH, Mechweiler, Germany | 1671801 | |
| Xylazine | Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany | 1320422 | |
| α-SMA-AL488 | eBioscience, San Diego, CA USA | 53-9760-82 | Intracellular labeling additionally requires Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences, Heidelberg, Germany; #554722) |
References
- Langer, R., Vacanti, J. P. Tissue engineering. Science. 260 (5110), 920-926 (1993).
- Khademhosseini, A., Langer, R. A decade of progress in tissue engineering. Nat Protoc. 11 (10), 1775-1781 (2016).
- Novosel, E. C., Kleinhans, C., Kluger, P. J. Vascularization is the key challenge in tissue engineering. Adv Drug Deliv Rev. 63 (4-5), 300-311 (2011).
- Rouwkema, J., Khademhosseini, A. Vascularization and Angiogenesis in Tissue Engineering: Beyond Creating Static Networks. Trends Biotechnol. 34 (9), 733-745 (2016).
- Laschke, M. W., Menger, M. D. Vascularization in tissue engineering: angiogenesis versus inosculation. Eur Surg Res. 48 (2), 85-92 (2012).
- Sarker, M., Chen, X. B., Schreyer, D. J. Experimental approaches to vascularisation within tissue engineering constructs. J Biomater Sci Polym Ed. 26 (12), 683-734 (2015).
- Frueh, F. S., Menger, M. D., Lindenblatt, N., Giovanoli, P., Laschke, M. W. Current and emerging vascularization strategies in skin tissue engineering. Crit Rev Biotechnol. 20, 1-13 (2016).
- Utzinger, U., Baggett, B., Weiss, J. A., Hoying, J. B., Edgar, L. T. Large-scale time series microscopy of neovessel growth during angiogenesis. Angiogenesis. 18 (3), 219-232 (2015).
- Laschke, M. W., Menger, M. D. Prevascularization in tissue engineering: Current concepts and future directions. Biotechnol Adv. 34 (2), 112-121 (2016).
- Baiguera, S., Ribatti, D. Endothelialization approaches for viable engineered tissues. Angiogenesis. 16 (1), 1-14 (2013).
- Wagner, R. C., Kreiner, P., Barrnett, R. J., Bitensky, M. W. Biochemical characterization and cytochemical localization of a catecholamine-sensitive adenylate cyclase in isolated capillary endothelium. Proc Natl Acad Sci U S A. 69 (11), 3175-3179 (1972).
- Wagner, R. C., Matthews, M. A. The isolation and culture of capillary endothelium from epididymal fat. Microvasc Res. 10 (3), 286-297 (1975).
- Laschke, M. W., Menger, M. D. Adipose tissue-derived microvascular fragments: natural vascularization units for regenerative medicine. Trends Biotechnol. 33 (8), 442-448 (2015).
- Laschke, M. W., et al. Vascularisation of porous scaffolds is improved by incorporation of adipose tissue-derived microvascular fragments. Eur Cell Mater. 24, 266-277 (2012).
- Frueh, F. S., et al. Adipose tissue-derived microvascular fragments improve vascularization, lymphangiogenesis and integration of dermal skin substitutes. J Invest Dermatol. 137 (1), 217-227 (2017).
- McDaniel, J. S., Pilia, M., Ward, C. L., Pollot, B. E., Rathbone, C. R. Characterization and multilineage potential of cells derived from isolated microvascular fragments. J Surg Res. 192 (1), 214-222 (2014).
- Nakano, M., et al. Effect of autotransplantation of microvessel fragments on experimental random-pattern flaps in the rat. Eur Surg Res. 30 (3), 149-160 (1998).
- Nakano, M., et al. Successful autotransplantation of microvessel fragments into the rat heart. Eur Surg Res. 31 (3), 240-248 (1999).
- Shepherd, B. R., Hoying, J. B., Williams, S. K. Microvascular transplantation after acute myocardial infarction. Tissue Eng. 13 (12), 2871-2879 (2007).
- Pilia, M., et al. Transplantation and perfusion of microvascular fragments in a rodent model of volumetric muscle loss injury. Eur Cell Mater. 28, 11-23 (2014).
- Laschke, M. W., et al. Adipose tissue-derived microvascular fragments from aged donors exhibit an impaired vascularisation capacity. Eur Cell Mater. 28, 287-298 (2015).
- Okabe, M., Ikawa, M., Kominami, K., Nakanishi, T., Nishimune, Y. 'Green mice' as a source of ubiquitous green cells. FEBS Lett. 407 (3), 313-319 (1997).
- Honek, J., et al. Modulation of age-related insulin sensitivity by VEGF-dependent vascular plasticity in adipose tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (41), 14906-14911 (2014).
- Cho, C. H., et al. Angiogenic role of LYVE-1-positive macrophages in adipose tissue. Circ Res. 100 (4), e47-e57 (2007).
- Han, S., Sun, H. M., Hwang, K. C., Kim, S. W. Adipose-Derived Stromal Vascular Fraction Cells: Update on Clinical Utility and Efficacy. Crit Rev Eukaryot Gene Expr. 25 (2), 145-152 (2015).
- Chen, Y. J., et al. Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues. J Vis Exp. (109), e53886 (2016).
- Guillaume-Jugnot, P., et al. Autologous adipose-derived stromal vascular fraction in patients with systemic sclerosis: 12-month follow-up. Rheumatology (Oxford). 55 (2), 301-306 (2016).
- Tissiani, L. A., Alonso, N. A Prospective and Controlled Clinical Trial on Stromal Vascular Fraction Enriched Fat Grafts in Secondary Breast Reconstruction. Stem Cells Int. , 2636454 (2016).
- Calcagni, M., et al. The novel treatment of SVF-enriched fat grafting for painful end-neuromas of superficial radial nerve. Microsurgery. , (2016).
- Hoying, J. B., Boswell, C. A., Williams, S. K. Angiogenic potential of microvessel fragments established in three-dimensional collagen gels. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 32 (7), 409-419 (1996).
- Kirkpatrick, N. D., Andreou, S., Hoying, J. B., Utzinger, U. Live imaging of collagen remodeling during angiogenesis. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 292 (6), H3198-H3206 (2007).
