Summary
Vi presenterar ett protokoll för att isolera adipos vävnad mikrovaskulära fragment som representerar lovande vaskularisering enheter. De snabbt kan isoleras, inte kräver bearbetning in vitro och sålunda kan användas för ett steg prevaskularise inom olika områden av vävnadsteknik.
Abstract
En funktionell mikrovaskulära nätverket är av avgörande betydelse för överlevnad och integrering av konstruerade vävnadskonstruktioner. För detta ändamål har flera angiogena och prevaskularisering strategier fastställts. Dock de flesta cellbaserade tillvägagångssätt inkluderar tidskrävande in vitro stegen för bildningen av en mikrovaskulär nätverk. Därför är de inte lämpliga för intraoperativa ett steg förfaranden. Adipos vävnad mikrovaskulära fragment (ad-MVF) representerar lovande vaskularisering enheter. De kan lätt isoleras från fettvävnad och uppvisar en funktionell mikrokärls morfologi. Dessutom är de snabbt ihop till nya mikrovaskulära nätverk efter in vivo implantation. Dessutom har ad-MVF visats inducera lymfangiogenes. Slutligen, de är en rik källa till mesenkymala stamceller, vilket ytterligare kan bidra till deras höga vaskularisering potential. I tidigare studier har vi visat den anmärkningsvärda vascularizatipå kapaciteten hos ad-MVF i manipulerade ben och hud substitut. I den aktuella studien, vi rapporterar om ett standardiserat protokoll för enzymatisk isolering av ad-MVF från mus fettvävnad.
Introduction
Vävnadsteknik är inriktat på tillverkning av vävnads- och organersättning som upprätthålla, återställa eller förstärker funktionen av inoperabel in vivo motsvarigheter 1, 2. Ödet av konstruerade vävnadskonstrukten beror ytterst på en tillräcklig vaskularisering 3. Mikrovaskulära nätverk inom dessa konstruktioner bör hierarkiskt organiserad med arterioler, kapillärer och venoler att möjliggöra en effektiv blod perfusion efter inosculation till mottagarens kärl 4. Alstringen av sådana nät är bland de viktigaste utmaningarna i vävnadsteknik. För detta ändamål har ett brett spektrum av experimentella vaskularisering strategier införts under de senaste två decennierna 5, 6.
Angiogena metoder stimulera inväxt av mottagande mikrokärl i konstruerade tissUE: er med hjälp av strukturella eller fysikalisk-kemisk scaffold modifiering, såsom inkorporeringen av tillväxtfaktorerna 7. Men för vaskularisering av stora tredimensionella konstruktioner, angiogenesberoende strategier markant begränsas av långsamma tillväxttakten för att utveckla mikrokärl 8.
I kontrast, begreppet prevaskularise syftar för generering av funktionella mikrovaskulära nätverk inom vävnad konstruktioner före deras implantering 9. Konventionell prevaskularise involverar samodling av kärlbildande celler, såsom endotelceller, väggmålning celler eller stamceller 10, inom byggnadsställningar. Efter mikrovaskulära nätverksbildning, kan de prevascularized konstruktioner sedan implanteras i vävnadsdefekter. Anmärkningsvärt är detta prevaskularisering metod svårt att tillämpa i en klinisk miljö, eftersom det bygger på komplexa och tidskrävande in vitro </ em> förfaranden, som är begränsade av stora regleringshinder 9. Följaktligen finns det fortfarande ett behov av utveckling av nya prevaskularisering strategier som är mer lämpade för en bred klinisk tillämpning.
Sådan prevaskularise strategi kan vara appliceringen av adipos vävnad mikrovaskulära fragment (ad-MVf) framåt. ad-MVF representerar potenta vaskularisering heter som kan skördas i stora mängder från fettvävnad hos råttor 11, 12 och möss 13. De består av arteriolär, kapillär, och venular fartygssegment, vilka uppvisar en fysiologisk mikrokärls morfologi med en lumen och stabiliserande perivaskulära celler 14, 15. Denna unika funktion gör det möjligt att omedelbart implantation av ad-MVF-seedade ställningar i vävnadsdefekter utan precultivation. Där ad-MVF snabbt ihop ifunktionella mikrovaskulära nätverk. Vidare ad-MVF representerar en rik källa av mesenkymala stamceller 16, som dessutom kan bidra till deras slående regenerativ kapacitet. Följaktligen är ad-MVF används alltmer inom olika områden av vävnadsteknik 14, 15, 17, 18, 19, 20, 21.
Isoleringen av ad-MVF har ursprungligen etablerats i råttor 11, 12. Häri beskriver vi ett protokoll som gör det möjligt att standardiserade isoleringen av mus ad-MVF från epididymis fettkuddar. Detta kan ge ytterligare insikter i molekylära mekanismerna bakom ad-MVF-funktion genom att använda transgena musmodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden utfördes i enlighet med National Institute of Health riktlinjer för användning av försöksdjur och följde institutionella riktlinjer (Landesamt für Soziales, Gesundheit und Verbraucherschutz, Abt. Lebensmittel- und Veterinärwesen, Zentralstelle, Saarbrücken, Tyskland).
1. Framställning av kirurgiska instrument
- Hålla redo de dissektion sax, kirurgiska pincetter, små framställnings sax, fin pincett och en steril petriskål med 15 ml Dulbeccos modifierade Eagle-medium (DMEM; 10% fetalt kalvserum (FCS), 100 U / ml penicillin, 0,1 mg / ml streptomycin ) för skörd epididymal fettkuddarna.
- Utsätta kirurgiska instrument till en desinficerande lösning för 5 min. Alternativt sterilisera dem (ångsterilisering; 121 ° C, 20 min).
2. Djur och Anestesi
- Välj noga stam av möss som visas för studien och ämne under utredning.
OBS: I denna studie använde vi manliga vildtyp C57BL / 6 möss som donatorer för skörd av epididymal fett. Av intresse, kan ad-MVF vara också isoleras från transgena gröna fluorescerande protein (GFP) -positiva donatordjur (C57BL / 6-Tg (CAG-EGFP) 1Osb / J) 22. Detta bär den stora fördelen att fragmenten är lätt detekterbar genom immunhistokemisk färgning av GFP efter implantation i GFP-negativ vildtyp möss 14. - Söva djuren med en intraperitoneal injektion av xylazin (15 mg / kg) och ketamin (75 mg / kg). Se till att djuren är djupt sövd genom att utföra en tå nypa med inget svar. Ögon smörjmedel inte anges som donatordjuren avlivas efter fett skörd.
OBS: Se till att smärtlindring och kirurgisk sterilitet är i överensstämmelse med de respektive riktlinjerna för landet och institution där experimenten planeras.
- Överför djuret till ett operationsbord. Placera djuret i ryggläge under ett kirurgiskt stereo och bekräfta djup anestesi med hjälp av tå nypa.
- Immobilisera tassarna genom att tejpa dem till en operationsduk och desinficera buken med desinficerande lösning.
- Separera bukhuden fri från underliggande muskellagret med dissektion sax.
- Gör en mittlinjen laparotomi med dissektion sax och sidled vika flikarna i bukväggen.
- Bilateralt identifiera testikel, epididymis och epididymal fettkudden med hjälp av fin pincett (Figur 1). Skadar inte tarm strukturer för att förhindra fekal kontaminering av fettkuddar.
- Skörda epididymala fettkuddar med de små berednings sax och fin pincett under stereomikroskop. Håll en säkerhetsmarginal på flera mm mellan bitestiklarna och fettminska risken för oavsiktlig epididymal skörd.
OBS: Denna procedur kan även utföras utan ett stereomikroskop. Detta kan dock ytterligare öka risken för olycksfall i bitestiklarna och SPERMA-sladdar. - Överföra epididymal fettkuddarna i en petriskål innehållande 15 ml DMEM för-värmdes vid 37 ° C för transport till cell laboratoriet.
- Offra djuret genom snittet av den abdominala aortan eller cervikal dislokation.
4. Isolering av ad-MVF
- Förbereda tre sterila petriskålar med 15 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS), sterilt 14-ml polypropylen (PP) rör, en steril 50-mL Erlenmeyer kolv, sterila 1,5-ml koniska mikrocentrifugrör och steriliserade fina saxar.
- Tvätta fettkuddar tre gånger i petriskålar med 15 mL PBS under ett dragskåp med laminärt flöde.
- Överföra fett till en 14-ml PP-röret. Bestämma volymen av skördade fettvävnad (i ml) med hjälp av than rör skala. Finhacka fettvävnad mekaniskt med de fina saxar tills en homogen vävnadssuspension erhålles.
- Överföra malda vävnaden med två volymer kollagenas NB4G (0,5 U / ml PBS) i en 50-mL Erlenmeyer kolv med hjälp av 10-ml mäter pipett. Den totala volymen blir tre gånger volymen av fettvävnad mäts i steg 4,3. Utföra vävnads digestion i en inkubator under 10 minuter under kraftig omröring med hjälp av en automatiserad omrörare (storleken av en magnetisk omrörarstav: 25 mm) vid 37 ° C och fuktade atmosfäriska förhållanden med 5% CO2.
- Observera en liten fraktion (10 | il) av det digererade vävnaden i mikroskop för att bedöma om digestionen kan stoppas. Försäkra sig om att biogödsel innehåller huvudsakligen "fria" ad-MVF bredvid enskilda celler, vilket indikerar den lämpliga punkten för att stoppa den enzymatiska rötningsprocessen (Figur 2).
OBS: Detta steg kräver erfarenhet med förfarandet och är avgörande för kvalitetenav isolerad ad-MVF. Långvarig fettdigerering resulterar i en enkelcellsuspension utan ad-MVF. - Neutralisera enzymet med två volymer PBS / 20% FCS. Den totala volymen blir tre gånger volymen av det cellkärlet suspension i steg 4,4. Överföra cellkärlet suspension tillbaka in nya PP-rör.
- Inkubera suspensionen under 5 min vid 37 ° C för att separera ad-MVF från återstående fett genom tyngdkraften. Därefter försiktigt bort på fat supernatanten med en 1-ml precisionspipett. Upprepa denna cykel flera gånger med en 100-mikroliter precisionspipett tills suspensionen verkar vara fettfri.
- Sätta en 500-pm filter på toppen av en 50-ml koniskt centrifugrör. Överföra cellkärlet suspension med en 10-ml mätning pipett från de 14-ml PP-rör på filtermembranet för att avlägsna kvarvarande fettproppar. Överföra den filtrerade suspensionen in i nya 14-mL PP rör enligt antalet enskilda ad-MVF isolat för de planerade experimenten.
OBS: För in Lifeo-analyser med fokus på mikrovaskulär nätverksbildning, kan det vara fördelaktigt att ytterligare rena det cellkärlet suspension för att förbättra bildkvaliteten under mikroskopiska analyser. För detta ändamål, kan suspensionen dessutom filtreras en gång med en 20-im filter för att avlägsna enstaka celler från ad-MVF uppsamlade på filtret. - Centrifugera cellkärlet suspension (600 xg, 5 min, rumstemperatur) för erhållande av en pellet innehållande ad-MVF.
- Efter centrifugering, avlägsna supernatanten tills en ml återstår. Suspendera pelleten med ad-MVF i denna 1 ml och överför suspensionen till en 1,5-ml koniskt mikrocentrifugrör.
- Centrifugera ad-MVF suspension i mikrocentrifugrör (600 xg, 5 min) för att erhålla en pellet.
- Avlägsna supernatanten för att resuspendera pelleten i den erforderliga slutvolym av PBS / 20% FCS.
OBS: Antalet ad-MVF per isolat kan bedömas genom mikroskopisk räkning. För detta ändamål 1/10 av den slutliga cell Vessel suspensionen späds 1:10 i PBS och 100 mikroliter av denna utspädning överförs till en brunn i en 96-brunnsplatta. Hela antalet ad-MVF uppvisar ett kärl-liknande morfologi sedan räknas och extrapoleras till hela isolat. Den erforderliga ad-MVF koncentrering och rening kan anpassas individuellt till respektive in vitro eller in vivo tillämpning av ad-MVF. Detta kan inkludera inbäddning av ad-MVF i kollagengeler för analys in vitro av mikrovaskulär nätverksbildning eller sådd av ad-MVF på ställningar för in vivo-implantation i vävnadsdefekter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I föreliggande studie utförde vi sex ad-MVF isoleringsförfaranden med fettvävnad från 7- till 12-månader gammal hane av vildtyp C57BL / 6-möss (genomsnittlig kroppsvikt: 35 ± 1 g). Figur 1 illustrerar skörd av murina epididymal fettkuddar med efterföljande mekanisk och enzymatisk ad-MVF isolering. Den tid som krävs för skörd av fett var 30 min och för isolering av ad-MVF var 120 min. Totalt tog förfarandet 150 min.
Vi skördade 1,2 ± 0,1 ml av adipös vävnad per donatordjuret. Denna mängd fett tillät isoleringen av 42 tusen ± 2000 ad-MVF per ml. Medellängden för den isolerade ad-MVF var 42 ± 1 | im (figur 2A). Varaktigheten av enzymatisk digerering bestämdes med hjälp av mikroskopisk kontroll, såsom visas i figur 2B. ad-MVF uppvisade en typisk mikrokärl morfologi med hierarkiska Vessel segment (Figur 2C).
Vi dessutom karakteriserade ad-MVF genom flödescytometri. För detta ändamål, var ad-MVF spjälkades vidare i celllösgör lösning för 30 minuter till enskilda celler 15. Den flödescytometriska analyser avslöjade att ad-MVF innehåller 26 ± 2% CD31-positiva endotelceller, 17 ± 2% α-glattmuskelaktin (SMA) -positiva perivaskulära celler och 9 ± 1% celler positiva för den mesenkymala stamcellen markör CD117 (Figur 3A-C). Efter ympning på en dermal hudsubstitut, som var fast och snittades omedelbart för histologiska analyser, större ad-MVF var huvudsakligen lokaliserade på implantatets yta (Figur 3D). Däremot kan kapillär fartygssegment även detekteras inom sina porer. Immunhistokemisk färgning av seeded ad-MVF avslöjade konfiguration fysiologisk mikrokärl med arteriolär, venular ytterligareoch kapillära liknande fragment (figur 3E).
Figur 1: ad-MVF Isolering. A) Efter mittlinjen laparotomi är epididymal fettkuddar (asterisker) identifieras. Fettvävnad skördas med en liten förberedelse sax och djuret avlivades genom inskärning av bukaorta (pilspets). B) Mekanisk malas fettkuddarna med fina saxar tills vävnadssuspension förefaller homogen. C) För enzymatisk spjälkning, är kollagenas tillsätts till vävnadssuspension. D) Den cellkärlet Suspensionen inkuberas och supernatanten fettskiktet kastas. E) Efter centrifugering, pelleten innehållande ad-MVF återsuspenderas och kan användas för olika applikationer, såsom analysen av Microvasc in vitroular nätverksbildning eller sådd av ad-MVF på ställningar för in vivo-implantation i vävnadsdefekter (F). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Morfologiska Kännetecken för ad-MVF. A) Längd distribution av nyligen isolerade ad-MVF. Medelvärde ± standardfel av medelvärdet (n = 6). B) Mikroskopisk bild av ett cellkärl suspension utstryket med stora (pil), medelstora (dubbla pilar) och små (svarta pilhuvuden) ad-MVF såväl som enskilda celler (vita pilspetsar). Scale bar = 110 | im. Högre förstoring avslöjar att ad-MVF uppvisar en mogen mikrokärls morfologi med hierarkisk mikrokärl segment (C,
Figur 3: Flödescytometrisk, Histologisk och Immunohistokemiska Kännetecken för ad-MVF. AC) Flödescytometrisk analyser av nyligen isolerade ad-MVF illustrerar CD31-positiva endotelceller (A), α-SMA-positiva perivaskulär cell (B) och CD117-positiva mesenkymal stamcell (C) fraktioner. Lämpliga isotyp-identiska kontroller användes för att justera tröskelnivåer. Medelvärde ± standardfel av medelvärdet (n = 6). D) hematoxylin och eosin-färgade delen av en seedade dermal hud substitut. Några kapillär fartygssegment är belägna i implantatet &# 39; s porer (pilspetsar). Större mikrokärl med venular (dubbelpilen) eller arteriolär (pil) morfologi är lokaliserade på dess yta. Scale bar = 40 | im. Streckad linje = implantat gränsen. E) Karakterisering av ad-MVF medelst immunhistokemisk detektion av den endoteliala cellmarkören CD31 (röd) och perivaskulära cellmarkör α-SMA (grön). Cellkärnorna färgades med ett DNA-bindande fluorescerande färgämne (blå). Arteriolär ad-MVF (pil) kännetecknas av en tjockare α-SMA-positiva cellskikt jämfört med venular fragment med större lumen (dubbel pil). Pilspetsar = kapillär ad-MVF. Scale bar = 25 | im. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna studie presenterar vi ett väletablerat protokoll för isolering av ad-MVF. Att få ad-MVF från mus fettvävnad är en enkel procedur med några viktiga steg. Möss uppvisar olika subkutan och intraabdominella fettdepåer. Som tidigare beskrivits för råttor, den mest lämpliga fettkällan för isoleringen av ad-MVF är de epididymala fettkuddarna grund av sin storlek, homogen struktur och minimal förorening med större blodkärl 11, 12. I kontrast, subkutana fettdepåer i möss är mycket mindre och mera vidhäftande till den omgivande vävnaden. Men excision av epididymala fettkuddar bär risken för olycksfallsskada i bitestiklarna och SPERMA-sladdar, vilket resulterar i kontaminering av den skördade vävnaden med spermier. Därför är identifieringen av bitestiklarna, testiklar och SPERMA-sladdar av stor betydelse i detta förfarande. Dessutom bör fettkuddar vara rapidly behandlas efter skörd för att minimera ex vivo vävnadsskada. Slutligen bör det övervägas att det finns stora åldersberoende variationer i vaskularisering av murin epididymala fettkuddar 23. I vår erfarenhet, användning av 6- till 12 månader gamla manliga donatormöss ger tillräckliga mängder av ad-MVF för in vitro och in vivo-studier. Dock kan det också vara möjligt att isolera ad-MVF från yngre möss, som uppvisar mindre men mycket kärlfettkuddar 24.
Den enzymatiska nedbrytning av de skördade epididymala fettkuddar bestämmer avgörande den slutliga kvaliteten av isolerade ad-MVF. För kort exponering för kollagenas leder till ofullständig separation av ad-MVF från omgivande adipocyter. Å andra sidan, förlängda digerering resulterar i destruktion av ad-MVF till en enkelcellsuspension, den så kallade stromal vaskulär fraktion (SVF). SVF är en heterogen cellpopulation innehållande mesenchymal stamceller, endotelceller, pericyter, makrofager och många andra celltyper med regenerativ potential genom parakrina och differentieringsmekanismer 25. Användningen av ad-MVF uppvisar betydande fördelar jämfört med SVF-baserade metoder. Den fullt fungerande mikrokärls morfologi ad-MVF gör deras omedelbara implantation för in vivo experiment utan tidsödande och komplicerad in vitro odling. Dessutom, isoleringen av den SVF kräver vanligen uppslutning av vävnaden med kollagenas upp till 90 min 26. I kontrast, bör vävnadsnedbrytning inte överstiga 10 min för isolering av ad-MVF. Detta stöder tanken på intraoperativa ett steg tillämpningar av ad-MVF 9. För detta ändamål, kan ad-MVF automatiskt isoleras från autologa lipoaspirates och överfördes tillbaka till en vävnadsdefekt hos patienten utan att lämna operationssalen. Detta är en realistisk goal med tanke på att den automatiserade isoleringen av SVF från lipoaspirates är redan ett kliniskt etablerat förfarande i plastikkirurgi 27, 28, 29.
Nyligen har vi visat en stark effekt av ad-MVF på vaskularisering av benet 14 och hud 15 substitut in vivo. Av intresse, fann vi att det är fördelaktigt att inte ta bort enstaka celler från ad-MVF isolera, eftersom de kan ge en mer fysiologisk miljö som bidrar till den höga kärlkapaciteten för ad-MVF 13. Därför använde vi endast en 500-im filter under isoleringen av ad-MVF för avlägsnande av större icke-smält fettproppar. Dessutom fann vi att ad-MVF inducerar lymfangiogenes i implanterade hud ersätter 15. Därför kan ad-MVF också lovande byggstenar för lymphatic vävnadsteknik och lymfödem terapi.
För den framgångsrika översättningen av dessa experimentella upptäckter i klinisk praxis, är nästa logiska steg att klargöra om mänsklig fettvävnad är lika lämpad för isolering av ad-MVF som gnagare fett. I detta sammanhang är en kritisk fråga mängden fett som krävs för att isolera stora mängder av ad-MVF. Den häri beskrivna protokollet gav approximativt 40 tusen ad-MVF per ml fettvävnad. Följaktligen skulle 3 ml fettvävnad vara nödvändigt att prevascularize 1 cm 2 av dermal hudsubstitut 15. Därför kan detta tillvägagångssätt inte vara möjligt för behandling av större sår eller svårt sjuka patienter på grund av en begränsad mängd tillgängligt fettvävnad för ad-MVF isolering.
Bredvid ett brett spektrum av potentiella in vivo applikationer i vävnadsteknik och regenerativ medicin, ad-MVF är också lämpliga för in vitro-modellering av angiogen processes. Exempelvis har råtta ad-MVF odlats i tredimensionella kollagen hydrogeler att studera bildandet av nya mikrovaskulära nätverk 30. Liknande tillvägagångssätt har använts för att utvärdera sofistikerad avbildningstekniker för visualisering av neovessel tillväxt 13 eller interstitiell matrix remodeling under angiogenes 31.
Sammantaget dessa fynd tyder på att ad-MVF inte bara lovande vaskularisering och lymphangiogenic enheter för framtida behandlingsstrategier, men även för grundforskning inom angiogenes och vaskulär fysiologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Vi är tacksamma för det utmärkta teknisk assistans av Janine Becker, Caroline Bickelmann och Ruth Nickels. Denna studie har finansierats av ett bidrag på Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG - German Research Foundation) - LA 2682 / 7-1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5-mL conical microcentrifuge tube | VWR, Kelsterbach, Germany | 700-5239 | |
| 100-µL precision pipette | Eppendorf, Hamburg, Germany | 4920000059 | |
| 10-mL measuring pipette | Costar, Corning Inc., New York, USA | 4488 | |
| 14-mL PP tubes | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 187261 | |
| 1-mL precision pipette | Eppendorf, Hamburg, Germany | 4920000083 | |
| 500-µm filter (pluriStrainer 500 µm) | HISS Diagnostics, Freiburg, Germany | 43-50500-03 | |
| 50-mL conical centrifuge tube | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 227261 | |
| 50-mL Erlenmeyer flask | VWR, Kelsterbach, Germany | 214-0211 | |
| 96-well plate | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 65518 | |
| cell detachment solution (Accutase) | eBioscience, San Diego, CA USA | 00-4555-56 | |
| C57BL/6 mice | Charles River, Cologne, Germany | 027 | |
| C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)1Osb/J mice | The Jackson Laboratory, Bar Harbor, USA | 003291 | |
| CD117-FITC | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553373 | |
| CD31-PE | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553354 | |
| Collagenase NB4G | Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany | 17465.02 | Lot tested by manufacturer for enzymatic activity |
| Dissection scissors | Braun Aesculap AG &CoKG, Melsungen, Germany | BC 601 | |
| DNA-binding dye (Bisbenzimide H33342) | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | B2261 | |
| Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) | PAN Biotech, Rickenbach, Germany | P04-03600 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Biochrom GmbH, Berlin, Germany | S0615 | |
| Fine forceps | S&T AG, Neuhausen, Switzerland | FRS-15 RM-8 | |
| Fine scissors | World Precision Instrumets, Sarasota, FL, USA | 503261 | |
| Dermal skin substitute (Integra) | Integra Life Sciences, Sain Priest, France | 62021 | |
| Ketamine | Serumwerk Bernburg AG, Bernburg, Germany | 7005294 | |
| M-IgG2akAL488 | eBioscience, San Diego, CA USA | 53-4724-80 | |
| Octeniderm (disinfecting solution) | Schülke & Mayer, Norderstedt, Germany | 118211 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom, Berlin, Germany | A2213 | |
| Petri dish | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 664160 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Lonza Group, Basel, Switzerland | 17-516F | |
| pluriStrainer 20-µm (20 µm filter) | HISS Diagnostics, Freiburg, Germany | 43-50020-03 | |
| Rat-IgG2akFITC | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553988 | |
| Rat-IgG2akPE | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553930 | |
| Small preparation scissors | S&T AG, Neuhausen, Switzerland | SDC-15 R-8S | |
| Surgical forceps | Braun Aesculap AG &CoKG, Melsungen, Germany | BD510R | |
| Tape (Heftpflaster Seide) 1.25 cm | Fink & Walter GmbH, Mechweiler, Germany | 1671801 | |
| Xylazine | Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany | 1320422 | |
| α-SMA-AL488 | eBioscience, San Diego, CA USA | 53-9760-82 | Intracellular labeling additionally requires Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences, Heidelberg, Germany; #554722) |
References
- Langer, R., Vacanti, J. P. Tissue engineering. Science. 260 (5110), 920-926 (1993).
- Khademhosseini, A., Langer, R. A decade of progress in tissue engineering. Nat Protoc. 11 (10), 1775-1781 (2016).
- Novosel, E. C., Kleinhans, C., Kluger, P. J. Vascularization is the key challenge in tissue engineering. Adv Drug Deliv Rev. 63 (4-5), 300-311 (2011).
- Rouwkema, J., Khademhosseini, A. Vascularization and Angiogenesis in Tissue Engineering: Beyond Creating Static Networks. Trends Biotechnol. 34 (9), 733-745 (2016).
- Laschke, M. W., Menger, M. D. Vascularization in tissue engineering: angiogenesis versus inosculation. Eur Surg Res. 48 (2), 85-92 (2012).
- Sarker, M., Chen, X. B., Schreyer, D. J. Experimental approaches to vascularisation within tissue engineering constructs. J Biomater Sci Polym Ed. 26 (12), 683-734 (2015).
- Frueh, F. S., Menger, M. D., Lindenblatt, N., Giovanoli, P., Laschke, M. W. Current and emerging vascularization strategies in skin tissue engineering. Crit Rev Biotechnol. 20, 1-13 (2016).
- Utzinger, U., Baggett, B., Weiss, J. A., Hoying, J. B., Edgar, L. T. Large-scale time series microscopy of neovessel growth during angiogenesis. Angiogenesis. 18 (3), 219-232 (2015).
- Laschke, M. W., Menger, M. D. Prevascularization in tissue engineering: Current concepts and future directions. Biotechnol Adv. 34 (2), 112-121 (2016).
- Baiguera, S., Ribatti, D. Endothelialization approaches for viable engineered tissues. Angiogenesis. 16 (1), 1-14 (2013).
- Wagner, R. C., Kreiner, P., Barrnett, R. J., Bitensky, M. W. Biochemical characterization and cytochemical localization of a catecholamine-sensitive adenylate cyclase in isolated capillary endothelium. Proc Natl Acad Sci U S A. 69 (11), 3175-3179 (1972).
- Wagner, R. C., Matthews, M. A. The isolation and culture of capillary endothelium from epididymal fat. Microvasc Res. 10 (3), 286-297 (1975).
- Laschke, M. W., Menger, M. D. Adipose tissue-derived microvascular fragments: natural vascularization units for regenerative medicine. Trends Biotechnol. 33 (8), 442-448 (2015).
- Laschke, M. W., et al. Vascularisation of porous scaffolds is improved by incorporation of adipose tissue-derived microvascular fragments. Eur Cell Mater. 24, 266-277 (2012).
- Frueh, F. S., et al. Adipose tissue-derived microvascular fragments improve vascularization, lymphangiogenesis and integration of dermal skin substitutes. J Invest Dermatol. 137 (1), 217-227 (2017).
- McDaniel, J. S., Pilia, M., Ward, C. L., Pollot, B. E., Rathbone, C. R. Characterization and multilineage potential of cells derived from isolated microvascular fragments. J Surg Res. 192 (1), 214-222 (2014).
- Nakano, M., et al. Effect of autotransplantation of microvessel fragments on experimental random-pattern flaps in the rat. Eur Surg Res. 30 (3), 149-160 (1998).
- Nakano, M., et al. Successful autotransplantation of microvessel fragments into the rat heart. Eur Surg Res. 31 (3), 240-248 (1999).
- Shepherd, B. R., Hoying, J. B., Williams, S. K. Microvascular transplantation after acute myocardial infarction. Tissue Eng. 13 (12), 2871-2879 (2007).
- Pilia, M., et al. Transplantation and perfusion of microvascular fragments in a rodent model of volumetric muscle loss injury. Eur Cell Mater. 28, 11-23 (2014).
- Laschke, M. W., et al. Adipose tissue-derived microvascular fragments from aged donors exhibit an impaired vascularisation capacity. Eur Cell Mater. 28, 287-298 (2015).
- Okabe, M., Ikawa, M., Kominami, K., Nakanishi, T., Nishimune, Y. 'Green mice' as a source of ubiquitous green cells. FEBS Lett. 407 (3), 313-319 (1997).
- Honek, J., et al. Modulation of age-related insulin sensitivity by VEGF-dependent vascular plasticity in adipose tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (41), 14906-14911 (2014).
- Cho, C. H., et al. Angiogenic role of LYVE-1-positive macrophages in adipose tissue. Circ Res. 100 (4), e47-e57 (2007).
- Han, S., Sun, H. M., Hwang, K. C., Kim, S. W. Adipose-Derived Stromal Vascular Fraction Cells: Update on Clinical Utility and Efficacy. Crit Rev Eukaryot Gene Expr. 25 (2), 145-152 (2015).
- Chen, Y. J., et al. Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues. J Vis Exp. (109), e53886 (2016).
- Guillaume-Jugnot, P., et al. Autologous adipose-derived stromal vascular fraction in patients with systemic sclerosis: 12-month follow-up. Rheumatology (Oxford). 55 (2), 301-306 (2016).
- Tissiani, L. A., Alonso, N. A Prospective and Controlled Clinical Trial on Stromal Vascular Fraction Enriched Fat Grafts in Secondary Breast Reconstruction. Stem Cells Int. , 2636454 (2016).
- Calcagni, M., et al. The novel treatment of SVF-enriched fat grafting for painful end-neuromas of superficial radial nerve. Microsurgery. , (2016).
- Hoying, J. B., Boswell, C. A., Williams, S. K. Angiogenic potential of microvessel fragments established in three-dimensional collagen gels. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 32 (7), 409-419 (1996).
- Kirkpatrick, N. D., Andreou, S., Hoying, J. B., Utzinger, U. Live imaging of collagen remodeling during angiogenesis. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 292 (6), H3198-H3206 (2007).
