Summary
Vi presenterer en protokoll for å isolere fettvevs-avledet mikrovaskulære fragmenter som representerer lovende vaskularisering enheter. De kan isoleres hurtig, ikke krever in vitro bearbeiding, og således kan anvendes for ett-trinns prevascularization innenfor forskjellige vev engineering.
Abstract
Et funksjonelt mikrovaskulær nettverk er av dreibar betydning for overlevelse og integrering av konstruerte vev konstruksjoner. For dette formålet, er det etablert flere angiogene og prevascularization strategier. Imidlertid er de fleste cellebaserte tilnærminger inkluderer tidkrevende in vitro fremgangsmåten for dannelse av en mikrovaskulær nettverk. Derfor, er de ikke egnet for intra ett-trinnsprosedyrer. Adipose tissue-avledet mikrovaskulære fragmenter (ad-MVF) representerer lovende vaskularisering enheter. De kan lett isoleres fra fettvevet og utviser en funksjonell microvessel morfologi. Videre må de raskt montere inn nye mikrovaskulære nettverk etter implantering in vivo. I tillegg har ad-MVF vist å indusere lymphangiogenesis. Til slutt, de er en rik kilde av mesenchymale stamceller, som ytterligere kan bidra til deres høye vaskularisering potensial. I tidligere studier har vi vist bemerkelsesverdig vascularizatipå kapasitet på ad-MVF i konstruerte bein og hud substitutter. I den foreliggende undersøkelse rapporterer vi på en standardisert protokoll for den enzymatiske isolering av ad-MVF fra murine fettvev.
Introduction
Tissue teknikk fokuserer på fremstilling av vevs- og organ substitutter som opprettholder, restaurere eller forsterke funksjonen av inoperable in vivo motstykker 1, 2. Skjebnen av konstruerte vev konstruksjoner avgjørende avhengig av tilstrekkelig vaskularisering tre. Mikrovaskulære nettverk innen disse konstruksjonene bør hierarkisk organisert med arterioler, kapillærer og venules å tillate effektiv blod perfusjon etter inosculation til mottakerens blodkar 4. Generering av slike nettverk er blant de viktigste utfordringene i tissue engineering. For dette formålet, har et bredt spekter av eksperimentelle vaskularisering strategier blitt introdusert i løpet av de siste to tiårene 5, 6.
Angiogene tilnærminger stimulere innvekst av mottaker microvessels inn konstruert tissues ved hjelp av strukturell eller fysikalsk-kjemisk modifikasjon stillas, slik som inkorporering av vekstfaktorer til 7. Men for vaskularisering av store tredimensjonale konstruksjoner, angiogenese-avhengige strategier er markert begrenset av lave vekstrater for å utvikle microvessels 8.
I motsetning til dette begrepet prevascularization mål for frembringelse av funksjonelle mikrovaskulære nettverk innen vev konstruerer før implantering 9. Konvensjonell prevascularization omfatter ko-kulturen av fartøy-dannende celler, slik som endotelceller, celler eller vegg stamceller 10, innen stillasene. Etter at mikrovaskulær nettverkdannelse, kan de prevascularized konstruksjonene deretter implanteres i vevsdefekter. Verdt å merke seg, er dette prevascularization tilnærmingen vanskelig å anvende i en klinisk setting, fordi den er basert på komplekse og tidkrevende in vitro </ em> prosedyrer, som er begrenset av store regulatoriske hindringer 9. Følgelig er det fortsatt behov for utvikling av nye prevascularization strategier som er mer egnet for en bred klinisk anvendelse.
En slik strategi kan være prevascularization anvendelsen av adipose tissue-avledet mikrovaskulære fragmenter (ad-MVF). ad-MVF representere potent vaskularisering heter som kan høstes i store mengder fra fettvev hos rotter 11, 12 og 13 mus. De består av arteriolar, kapillær, og venular kar-segmenter, som oppviser en fysiologisk microvessel morfologi med en lumen og stabiliserende perivaskulære celler 14, 15. Denne unike egenskap tillater den umiddelbare implantasjon av ad-MVF foret stillasene inn i vevsdefekter uten precultivation. Der ad-MVF raskt montere itil funksjonelle mikrovaskulære nettverk. Videre ad-MVF representere en rik kilde av stamceller 16, som i tillegg kan bidra til deres slående evne til reproduksjon. Følgelig er ad-MVF stadig mer brukt i ulike områder av vevsteknologi 14, 15, 17, 18, 19, 20, 21.
Isoleringen av ad-MVF har opprinnelig blitt fastslått i rotter 11, 12. Heri beskriver vi en protokoll som gjør det mulig standardisert isolering av muse-ad-MVF fra epididymalvekt fett pads. Dette kan gi ytterligere innsikt i molekylære mekanismer som ligger til grunn ad-MVF funksjon ved anvendelse av transgene musemodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer ble utført i henhold til National Institute of Health retningslinjer for bruk av forsøksdyr og fulgt institusjonelle retningslinjer (Landesamt für Soziales, Gesundheit und Verbraucherschutz, Abt. Lebensmittel- und Veterinärwesen, Zentralstelle, Saarbrücken, Tyskland).
1. Fremstilling av kirurgiske instrumenter
- Hold klar disseksjon saks, kirurgisk tang, små fremstillings saks, fin pinsett og en steril petriskål med 15 ml Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM, 10% føtalt kalveserum (FCS), 100 U / ml penicillin, 0,1 mg / ml streptomycin ) for høsting epididymal fett pads.
- Utsette den kirurgiske instrumenter til en desinfeksjonsløsning i 5 min. Alternativt kan steriliseringen (dampsterilisering, 121 ° C, 20 min).
2. Dyr og Anesthesia
- Velg nøye belastningen av musene som angitt for studien og lagt under etterforskning.
MERK: I denne studien brukte vi male villtype C57BL / 6 mus som givere for høsting av epididymal fett. Av interesse, kan ad-MVF kan også isoleres fra transgene grønt fluorescerende protein (GFP) -positive donordyr (C57BL / 6-Tg (CAG-EGFP) 1Osb / J) 22. Dette bærer den store fordelen at fragmentene er lett påvisbar ved immunhistokjemisk farging av GFP etter implantasjon i GFP-negative villtype mus 14. - Bedøve dyrene med en intraperitoneal injeksjon av xylazin (15 mg / kg) og ketamin (75 mg / kg). Sørg for at dyrene er dypt bedøvet ved å utføre en tå klype uten svar. Eye smøremiddel er ikke angitt som donordyrene avlivet etter fett høsting.
MERK: Pass på at analgesi og kirurgisk sterilitet er i overensstemmelse med de respektive retningslinjene i landet og institusjonen der forsøkene er planlagt.
- Overfør dyret til et operasjonsbord. Plasser dyret i liggende stilling under et kirurgisk stereo og bekrefte dyp anestesi ved hjelp tå klype.
- Immobilisere potene ved taping dem til et kirurgisk drapere og desinfisere magen med desinfiserende løsning.
- Separer bukhuden fri for det underliggende muskellaget med disseksjon saks.
- Utføre en midtlinje laparotomi med disseksjon saks og sideveis brette klaffene i bukveggen.
- Bilateralt identifisere testikkel, epididymis og epididymal fett puten ved hjelp av de fine tang (figur 1). Ikke skade tarm strukturer for å hindre fekal forurensning av fett pads.
- Høste epididymalvekt fett pads med små forberedelser saks og fin pinsett under stereomikroskop. Hold en sikkerhetsmargin på flere mm mellom bitestikkelen og fett for åredusere risikoen for utilsiktet epididymal høsting.
MERK: Denne prosedyren kan også utføres uten et stereomikroskop. Dette kan imidlertid ytterligere øke risikoen for utilsiktet skade i bitestikkelen og sædstrenger. - Overfør epididymal fettputer i en petriskål inneholdende 15 ml av DMEM forvarmet ved 37 ° C, for transport til cellen laboratoriet.
- Offer dyret ved innsnitt fra den abdominale aorta eller cervikal dislokasjon.
4. Isolering av ad-MVF
- Forbered tre sterile petriskåler med 15 ml fosfat-bufret saltvann (PBS), sterile 14-ml polypropylen (PP) rør, en steril 50-mL Erlenmeyer-kolbe, sterile 1,5 ml konisk mikrosentrifugerør og steriliserte av fine sakser.
- Vask de fettputer tre ganger i Petri-skåler med 15 ml PBS under en laminær strømningshette.
- Overfør fettet inn i en 14 ml PP rør. Bestemme volumet av høstet fettvev (i ml) ved hjelp av tHan tube skala. Hakk fettvev mekanisk med de fine sakser inntil en homogen suspensjon oppnås vev.
- Overfør det hakkede vev med to volumer av kollagenase NB4G (0,5 U / ml PBS) i en 50 mL Erlenmeyer-kolbe ved hjelp av 10-ml måle pipette. Det totale volum blir tre ganger volumet av fettvev målt i trinn 4.3. Utføre vev fordøyelse i en inkubator i 10 minutter under kraftig omrøring ved hjelp av en automatisert omrører (størrelse på magnetisk rørestav: 25 mm) ved 37 ° C og fuktige atmosfæriske betingelser med 5% CO2.
- Observere en liten del (10 ul) av den fordøyde vevet under et mikroskop for å bedømme hvorvidt fordøyelsen kan stoppes. Konstatere at digestate inneholder hovedsakelig "gratis" ad-MVF ved siden av enkle celler, noe som indikerer et passende punkt for å stoppe den enzymatiske fordøyelsesprosessen (figur 2).
MERK: Dette trinnet krever erfaring med prosedyre og er avgjørende for kvalitetenav isolerte ad-MVF. Langvarig fett fordøyelsen resulterer i en enkeltcellesuspensjon uten ad-MVF. - Nøytraliser enzymet med to volumer av PBS / 20% FCS. Det totale volum blir tre ganger volumet av cellesuspensjon fartøyet i trinn 4.4. Overfør cellesuspensjonen fartøyet tilbake til ny PP-rør.
- Inkuber i suspensjonen i 5 min ved 37 ° C for å skille ad-MVF fra gjenværende fett ved hjelp av gravitasjon. Deretter forsiktig fjerne hoved fett supernatanten med en 1 ml pipette presisjon. Gjenta denne syklusen flere ganger med en 100-mL presisjonspipette til suspensjon synes å være fettfri.
- Sette en 500-um filter på toppen av en 50 ml konisk sentrifugerør. Overfør cellebeholderen suspensjon med en 10-ml måle pipette fra de 14-ml PP-rør på filtermembranen for å fjerne gjenværende fettklumper. Overfør den filtrerte suspensjon i nye 14-ml PP-rør i henhold til antallet av individuelle ad-isolater MVF for de planlagte eksperimenter.
MERK: For i vitro assays fokuserer på mikrovaskulær nettverkdannelse, kan det være fordelaktig for ytterligere å rense den cellesuspensjon fartøyet for å forbedre bildekvalitet i løpet av mikroskopiske analyser. For dette formål kan suspensjonen filtreres i tillegg en gang med en 20 um filter for å fjerne enkle celler fra den ad-MVF samlet på filteret. - Sentrifuger cellesuspensjon fartøyet (600 x g, 5 minutter, romtemperatur) for å oppnå en pellet inneholdende ad-MVF.
- Etter sentrifugering, fjern supernatanten inntil 1 mg blir startet. Resuspender pellet med ad-MVF i denne 1 ml og overfører suspensjonen til en 1,5-ml konisk mikrosentrifugerør.
- Sentrifuger ad-MVF suspensjon i mikrosentrifugerør (600 x g, 5 min) for å oppnå en pellet.
- Fjern supernatanten for å resuspendere pelleten i den ønskede sluttvolum av PBS / 20% FCS.
MERK: Antallet av ad-MVF per isolat kan bestemmes ved mikroskopisk telling. For dette formålet, 1/10 av den endelige celle vessel suspensjonen blir fortynnet 1:10 i PBS og 100 ul av denne fortynningen blir overført til en brønn i en 96-brønners plate. Det hele tallet av ad-MVF oppviser en kar-lignende morfologi blir deretter tellet, og ekstrapolert til hele isolatet. Den nødvendige ad-MVF konsentrering og rensing kan tilpasses individuelt til de respektive in vitro eller in vivo anvendelse av de ad-MVF. Dette kan omfatte innebygging av ad-MVF i kollagen geler for in vitro analyse av mikrovaskulær nettverkdannelse eller såing av ad-MVF på stillasene for in vivo implantasjon i vev defekter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I den foreliggende undersøkelse utført vi seks ad-MVF isoleringsprosedyrer med fettvev fra 7- til 12-måneder gamle hann villtype C57BL / 6-mus (gjennomsnittlig kroppsvekt: 35 ± 1 g). Figur 1 illustrerer den høsting av murine epididymal fettputer, med etterfølgende mekanisk og enzymatisk ad-MVF isolasjon. Den tid som er nødvendig for innhøsting av fett var 30 minutter og for isolering av ad-MVF var 120 min. Totalt ble prosedyren tok 150 min.
Vi høstet 1,2 ± 0,1 ml av adipose vev pr donordyr. Denne mengden av fett tillot isolering av 42.000 ± 2.000 ad-MVF per ml. Den midlere lengde av den isolerte ad-MVF var 42 ± 1 pm (figur 2A). Varigheten av enzymatisk nedbrytning ble bestemt ved hjelp av mikroskopisk kontroll som vist i figur 2B. ad-MVF viste en typisk microvessel morfologi med hierarkiske vesSel segmenter (figur 2C).
Vi har i tillegg karakterisert ad-MVF ved hjelp av strømningscytometri. For dette formål ble det ad-MVF videre kuttet i celle løsgjøring løsning i 30 min inn i enkeltceller 15. Den strømningscytometriske analyser avslørte at ad-MVF inneholde 26 ± 2% CD31-positive endotelialceller, 17 ± 2% α-glattmuskel aktin (SMA) -positive perivaskulære celler, og 9 ± 1% celler som er positive for den mesenchymal stamcelle markør CD117 (figur 3A-C). Etter poding på en dermal kunstig hud, som ble fiksert og seksjonert umiddelbart for histologiske analyser, større ad-MVF var hovedsakelig lokalisert på implantatoverflaten (figur 3D). Imidlertid kapillære kar-segmenter kan også påvises i sine porer. Immunhistokjemisk farging av podet ad-MVF viste videre fysiologisk microvessel konfigurasjon med arteriolar, venularog kapillær-lignende fragmenter (figur 3E).
Figur 1: ad-MVF isolasjon. A) Etter midtlinjen laparotomi, er epididymal fettputer (stjernetegn) identifisert. Fettvev blir høstet med en liten saks forberedelse og dyret avlivet ved innsnitt i den abdominale aorta (pilspiss). B) mekanisk hakking av fettputer med av fine sakser til vevsuspensjonen som homogen. C) For enzymatisk oppslutning, blir kollagenase tilsettes til vevsuspensjonen. D) Den cellebeholder suspensjonen inkuberes og supernatanten fettlaget blir kastet. E) Etter sentrifugering ble pelleten inneholdende ad-MVF resuspendert og kan brukes for forskjellige anvendelser, for eksempel in vitro-analyse av Microvascular nettverkdannelse eller såing av ad-MVF på stillasene for in vivo implantering i vevsdefekter (F). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Morfologiske Karakteristika for ad-MVF. A) Lengde fordeling av nylig isolerte ad-MVF. Gjennomsnitt ± standardavvik av gjennomsnittet (n = 6). B) Mikroskopisk bilde av en celle-suspensjon kar smøre med store (pil), mellomstore (doble piler) og små (sorte pilspisser) ad-MVF, så vel som enkeltceller (hvite pilhoder). Skala bar = 110 um. Høyere forstørrelse viser at ad-MVF oppviser en moden microvessel morfologi med hierarkisk microvessel segmenter (C,
Figur 3: Flowcytometriske, histologisk og Immunohistokjemiske Karakteristika for ad-MVF. AC) Flow-cytometrisk analyse av nylig isolerte ad-MVF illustrerer CD31-positive endotelcelle (A), α-SMA-positive perivaskulære celler (B) og CD117-positive mesenchymal stamcelle (C) fraksjoner. Passende isotype-identisk kontroller ble anvendt for å justere terskelnivåer. Gjennomsnitt ± standardavvik av gjennomsnittet (n = 6). D) Hematoxylin og eosin-fargede snitt av en seeded dermal kunstig hud. Et par kapillære kar-segmenter plassert i implantatet &# 39; s porer (pilhoder). Større mikrokar med venular (dobbel pil) eller arteriolar (pil) morfologi er lokalisert på overflaten. Skala bar = 40 mikrometer. Stiplet linje = implantat grensen. E) Karakterisering av ad-MVF ved hjelp av immunohistokjemisk påvisning av den endoteliale cellemarkøren CD31 (rød) og perivaskulær cellemarkøren α-SMA (grønn). Cellekjerner ble farget med et DNA-bindende fluorescerende fargestoff (blå). Arteriolær ad-MVF (pil) er kjennetegnet ved en tykkere α-SMA-positive cellelaget i forhold til venular fragmenter med et større lumen (dobbel pil). Pilspisser = kapillær ad-MVF. Skala bar = 25 pm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne studien presenterer vi en godt etablert protokoll for isolering av ad-MVF. Innhenting av ad-MVF fra murine fettvev er en enkel prosedyre med noen kritiske trinn. Mus som utviser forskjellig subkutan og intraabdominale fettdepoter. Som tidligere beskrevet for rotter, mest egnet fettkilde for isolering av ad-MVF er de epididymale fettputer på grunn av sin størrelse, homogen struktur og minimal forurensning med større blodkar 11, 12. I motsetning til dette, subkutane fettlagre i mus er mye mindre og mer vedheftende til det omgivende vev. Imidlertid eksisjon av epididymalvekt fettputer, har risikoen for utilsiktet skade av epididymis og sædstrenger, hvilket resulterer i forurensning av det høstet vev med sperma. Derfor, identifisering av bitestikkelen, testikkel og spermatic ledningen er av stor betydning i denne prosedyren. Videre bør de fettputer være rapidly behandlet etter høsting for å minimalisere ex vivo vevsskade. Til slutt bør det tas i betraktning at det er store aldersavhengige variasjoner i vaskularisering av murine epididymalvekt fett pads 23. I vår erfaring, ved bruk av 6- til 12-måneder-gamle hann donormus gir tilstrekkelige mengder av ad-MVF for in vitro og in vivo studier. Det kan imidlertid også være mulig å isolere ad-MVF fra yngre mus, som oppviser mindre, men svært vaskulariserte fettputer 24.
Enzymatisk nedbrytning av de høstede epididymalvekt fettputer i avgjørende grad bestemmer den endelige kvaliteten av isolert ad-MVF. For kort redegjørelse for kollagenase fører til ufullstendig separasjon av ad-MVF fra omkringliggende adipocytter. På den annen side er forlenget fordøyelsen resulterer i ødeleggelse av ad-MVF til en enkeltcellesuspensjon, den såkalte stromal vaskulær fraksjon (SVF). Den SVF er en heterogen cellepopulasjon som inneholder mesenchymal stamceller, endotelceller, pericytter, makrofager og mange andre celletyper med regenerativ potensial gjennom paracrine og differensieringsmekanismer 25. Bruken av ad-MVF oppviser betydelige fordeler sammenlignet med SVF-baserte metoder. Den fullt funksjonell microvessel morfologi av ad-MVF tillater deres umiddelbare implantasjon for in vivo eksperimenter uten tidkrevende og kompleks in vitro kultiveringen. Videre isolering av SVF vanligvis krever fordøyelse av vevet med kollagenase opp til 90 min 26. I motsetning til dette, bør vevsnedbrytning ikke overstige 10 min for isolering av ad-MVF. Dette støtter ideen om intra ett-trinns anvendelser av ad-MVF 9. For dette formål kan ad-MVF automatisk bli isolert fra autologe lipoaspirates og overført tilbake til en vevsdeffekt av pasienten uten å forlate operasjon teater. Dette er en realistisk goal betraktning det faktum at den automatiske isolering av SVF fra lipoaspirates er allerede en klinisk etablert fremgangsmåte i plastisk kirurgi 27, 28, 29.
Nylig har vi vist en sterk effekt av ad-MVF på in vivo vaskularisering av bein 14 og hud 15 substitutter. Av interesse, har vi funnet at det er gunstig å ikke fjerne enkeltceller fra ad-MVF isolere, fordi de kan gi en mer fysiologisk miljø som bidrar til den høye vaskularisering kapasitet på ad-MVF 13. Derfor har vi bare brukte en 500-um filter under isoleringen av ad-MVF for fjerning av større ikke-spaltet fett klumper. Videre fant vi at ad-MVF indusere lymphangiogenesis i implantert huden erstatter 15. Derfor kan ad-MVF også være lovende byggesteiner for lymphatic tissue engineering og lymfødemer terapi.
For vellykket translasjon av disse eksperimentelle resultatene i klinisk praksis, er det neste logiske trinn for å klargjøre hvorvidt humant fettvev er like godt egnet for isolering av ad-MVF som gnager fett. I denne sammenheng, er et kritisk problem mengden av fett som er nødvendig for å isolere store mengder av ad-MVF. Den her beskrevne protokoll ga omtrent 40.000 ad-MVF per ml fettvev. Følgelig vil 3 ml fettvev være nødvendig å prevascularize en cm2 av dermal huderstatningen 15. Derfor vil denne fremgangsmåten være mulig for behandlingen av større sår eller alvorlig syke pasienter på grunn av en begrenset mengde av tilgjengelig fettvev for ad-MVF isolasjon.
Ved siden av et bredt spektrum av potensiell in vivo anvendelser i vevsteknologi og regenerativ medisin, ad-MVF er også egnet for in vitro modellering av angiogen procideias. For eksempel har rotte ad-MVF blitt dyrket i tre-dimensjonale kollagen hydrogeler for å studere dannelsen av nye mikrovaskulære nettverk 30. Lignende metoder er blitt anvendt til å evaluere avanserte bildeteknikker for visualisering av neovessel vekst 13 eller interstitial matrise remodellering under angiogenese 31.
Samlet utgjør disse funnene tyder på at ad-MVF er ikke bare lovende vaskularisering og lymphangiogenic enheter for fremtidige terapeutiske strategier, men også for grunnleggende forskning innen angiogenese og vaskulær fysiologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi er takknemlige for utmerket teknisk assistanse av Janine Becker, Caroline Bickelmann og Ruth Nickels. Denne studien ble finansiert av et stipend fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG - Tysk Research Foundation) - LA 2682 / 7-1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5-mL conical microcentrifuge tube | VWR, Kelsterbach, Germany | 700-5239 | |
| 100-µL precision pipette | Eppendorf, Hamburg, Germany | 4920000059 | |
| 10-mL measuring pipette | Costar, Corning Inc., New York, USA | 4488 | |
| 14-mL PP tubes | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 187261 | |
| 1-mL precision pipette | Eppendorf, Hamburg, Germany | 4920000083 | |
| 500-µm filter (pluriStrainer 500 µm) | HISS Diagnostics, Freiburg, Germany | 43-50500-03 | |
| 50-mL conical centrifuge tube | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 227261 | |
| 50-mL Erlenmeyer flask | VWR, Kelsterbach, Germany | 214-0211 | |
| 96-well plate | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 65518 | |
| cell detachment solution (Accutase) | eBioscience, San Diego, CA USA | 00-4555-56 | |
| C57BL/6 mice | Charles River, Cologne, Germany | 027 | |
| C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)1Osb/J mice | The Jackson Laboratory, Bar Harbor, USA | 003291 | |
| CD117-FITC | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553373 | |
| CD31-PE | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553354 | |
| Collagenase NB4G | Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany | 17465.02 | Lot tested by manufacturer for enzymatic activity |
| Dissection scissors | Braun Aesculap AG &CoKG, Melsungen, Germany | BC 601 | |
| DNA-binding dye (Bisbenzimide H33342) | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | B2261 | |
| Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) | PAN Biotech, Rickenbach, Germany | P04-03600 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Biochrom GmbH, Berlin, Germany | S0615 | |
| Fine forceps | S&T AG, Neuhausen, Switzerland | FRS-15 RM-8 | |
| Fine scissors | World Precision Instrumets, Sarasota, FL, USA | 503261 | |
| Dermal skin substitute (Integra) | Integra Life Sciences, Sain Priest, France | 62021 | |
| Ketamine | Serumwerk Bernburg AG, Bernburg, Germany | 7005294 | |
| M-IgG2akAL488 | eBioscience, San Diego, CA USA | 53-4724-80 | |
| Octeniderm (disinfecting solution) | Schülke & Mayer, Norderstedt, Germany | 118211 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom, Berlin, Germany | A2213 | |
| Petri dish | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 664160 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Lonza Group, Basel, Switzerland | 17-516F | |
| pluriStrainer 20-µm (20 µm filter) | HISS Diagnostics, Freiburg, Germany | 43-50020-03 | |
| Rat-IgG2akFITC | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553988 | |
| Rat-IgG2akPE | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553930 | |
| Small preparation scissors | S&T AG, Neuhausen, Switzerland | SDC-15 R-8S | |
| Surgical forceps | Braun Aesculap AG &CoKG, Melsungen, Germany | BD510R | |
| Tape (Heftpflaster Seide) 1.25 cm | Fink & Walter GmbH, Mechweiler, Germany | 1671801 | |
| Xylazine | Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany | 1320422 | |
| α-SMA-AL488 | eBioscience, San Diego, CA USA | 53-9760-82 | Intracellular labeling additionally requires Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences, Heidelberg, Germany; #554722) |
References
- Langer, R., Vacanti, J. P. Tissue engineering. Science. 260 (5110), 920-926 (1993).
- Khademhosseini, A., Langer, R. A decade of progress in tissue engineering. Nat Protoc. 11 (10), 1775-1781 (2016).
- Novosel, E. C., Kleinhans, C., Kluger, P. J. Vascularization is the key challenge in tissue engineering. Adv Drug Deliv Rev. 63 (4-5), 300-311 (2011).
- Rouwkema, J., Khademhosseini, A. Vascularization and Angiogenesis in Tissue Engineering: Beyond Creating Static Networks. Trends Biotechnol. 34 (9), 733-745 (2016).
- Laschke, M. W., Menger, M. D. Vascularization in tissue engineering: angiogenesis versus inosculation. Eur Surg Res. 48 (2), 85-92 (2012).
- Sarker, M., Chen, X. B., Schreyer, D. J. Experimental approaches to vascularisation within tissue engineering constructs. J Biomater Sci Polym Ed. 26 (12), 683-734 (2015).
- Frueh, F. S., Menger, M. D., Lindenblatt, N., Giovanoli, P., Laschke, M. W. Current and emerging vascularization strategies in skin tissue engineering. Crit Rev Biotechnol. 20, 1-13 (2016).
- Utzinger, U., Baggett, B., Weiss, J. A., Hoying, J. B., Edgar, L. T. Large-scale time series microscopy of neovessel growth during angiogenesis. Angiogenesis. 18 (3), 219-232 (2015).
- Laschke, M. W., Menger, M. D. Prevascularization in tissue engineering: Current concepts and future directions. Biotechnol Adv. 34 (2), 112-121 (2016).
- Baiguera, S., Ribatti, D. Endothelialization approaches for viable engineered tissues. Angiogenesis. 16 (1), 1-14 (2013).
- Wagner, R. C., Kreiner, P., Barrnett, R. J., Bitensky, M. W. Biochemical characterization and cytochemical localization of a catecholamine-sensitive adenylate cyclase in isolated capillary endothelium. Proc Natl Acad Sci U S A. 69 (11), 3175-3179 (1972).
- Wagner, R. C., Matthews, M. A. The isolation and culture of capillary endothelium from epididymal fat. Microvasc Res. 10 (3), 286-297 (1975).
- Laschke, M. W., Menger, M. D. Adipose tissue-derived microvascular fragments: natural vascularization units for regenerative medicine. Trends Biotechnol. 33 (8), 442-448 (2015).
- Laschke, M. W., et al. Vascularisation of porous scaffolds is improved by incorporation of adipose tissue-derived microvascular fragments. Eur Cell Mater. 24, 266-277 (2012).
- Frueh, F. S., et al. Adipose tissue-derived microvascular fragments improve vascularization, lymphangiogenesis and integration of dermal skin substitutes. J Invest Dermatol. 137 (1), 217-227 (2017).
- McDaniel, J. S., Pilia, M., Ward, C. L., Pollot, B. E., Rathbone, C. R. Characterization and multilineage potential of cells derived from isolated microvascular fragments. J Surg Res. 192 (1), 214-222 (2014).
- Nakano, M., et al. Effect of autotransplantation of microvessel fragments on experimental random-pattern flaps in the rat. Eur Surg Res. 30 (3), 149-160 (1998).
- Nakano, M., et al. Successful autotransplantation of microvessel fragments into the rat heart. Eur Surg Res. 31 (3), 240-248 (1999).
- Shepherd, B. R., Hoying, J. B., Williams, S. K. Microvascular transplantation after acute myocardial infarction. Tissue Eng. 13 (12), 2871-2879 (2007).
- Pilia, M., et al. Transplantation and perfusion of microvascular fragments in a rodent model of volumetric muscle loss injury. Eur Cell Mater. 28, 11-23 (2014).
- Laschke, M. W., et al. Adipose tissue-derived microvascular fragments from aged donors exhibit an impaired vascularisation capacity. Eur Cell Mater. 28, 287-298 (2015).
- Okabe, M., Ikawa, M., Kominami, K., Nakanishi, T., Nishimune, Y. 'Green mice' as a source of ubiquitous green cells. FEBS Lett. 407 (3), 313-319 (1997).
- Honek, J., et al. Modulation of age-related insulin sensitivity by VEGF-dependent vascular plasticity in adipose tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (41), 14906-14911 (2014).
- Cho, C. H., et al. Angiogenic role of LYVE-1-positive macrophages in adipose tissue. Circ Res. 100 (4), e47-e57 (2007).
- Han, S., Sun, H. M., Hwang, K. C., Kim, S. W. Adipose-Derived Stromal Vascular Fraction Cells: Update on Clinical Utility and Efficacy. Crit Rev Eukaryot Gene Expr. 25 (2), 145-152 (2015).
- Chen, Y. J., et al. Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues. J Vis Exp. (109), e53886 (2016).
- Guillaume-Jugnot, P., et al. Autologous adipose-derived stromal vascular fraction in patients with systemic sclerosis: 12-month follow-up. Rheumatology (Oxford). 55 (2), 301-306 (2016).
- Tissiani, L. A., Alonso, N. A Prospective and Controlled Clinical Trial on Stromal Vascular Fraction Enriched Fat Grafts in Secondary Breast Reconstruction. Stem Cells Int. , 2636454 (2016).
- Calcagni, M., et al. The novel treatment of SVF-enriched fat grafting for painful end-neuromas of superficial radial nerve. Microsurgery. , (2016).
- Hoying, J. B., Boswell, C. A., Williams, S. K. Angiogenic potential of microvessel fragments established in three-dimensional collagen gels. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 32 (7), 409-419 (1996).
- Kirkpatrick, N. D., Andreou, S., Hoying, J. B., Utzinger, U. Live imaging of collagen remodeling during angiogenesis. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 292 (6), H3198-H3206 (2007).
