Summary
ويصف هذا البروتوكول عملية التقييم لشفاء الأوتار في الفئران التي قد تم حقن البلازما الغنية متمكنة الصفائح الدموية (PRP) أو المحلول الملحي بعد إزالة جزء من وتر أخيل. يتم تقييم التقدم المحرز في شفاء الأربطة في العديد من النقاط الزمنية باستخدام أنواع مختلفة من التحليل.
Abstract
توضح هذه المقالة الإجراءات التجريبية المستخدمة لمراقبة إذا كان الحزب الثوري يمكن أن تؤثر تأثيراً إيجابيا على وتر الشفاء. هناك 4 خطوات رئيسية لمتابعة: الحث على آفة في وتر أخيل؛ إعداد الحزب الثوري وحقن عليه (أو المحلول الملحي)؛ إزالة الوتر؛ وإجراء تقييمات خاصة بالنشاط الحيوي والجزيئية وغذائها. في كل خطوة، وجميع الإجراءات والأساليب يرد بالتفصيل، حيث أنها يمكن أن تتكرر بسهولة.
وكانت الأوتار أخيل مقطعة جراحيا (إزالة مقطع طويل 5 مم). وبعد ذلك، تم حقن الحزب الثوري أو المحلول الملحي لدراسة ما إذا كان الحزب الثوري له أثر إيجابي على الشفاء من الوتر. ثلاث مجموعات من الحيوانات 40 (استخدمت في هذه الدراسة مجموعة فئران 120) تم تقسيمها إلى مجموعات فرعية 2: مجموعة حقن PRP وحقنه مالحة التحكم في المجموعة. كانت التضحية الفئران في زيادة النقاط الزمنية (المجموعة ج: 5 أيام؛ المجموعة الثانية: 15 يوما؛ المجموعة جيم: 30 يوما)، وأزيلت الأوتار. 90 الأوتار خضع لاختبار النشاط الحيوي قبل إجراء تحليل ترانسكريبتوميك وقدمت 30 الأوتار المتبقية إلى التحليل النسيجي.
Introduction
تخثر الدم والعمليات التحريضية وأدوار التحوير الحصانة من الصفائح الدموية هي معروفة جيدا1. في الآونة الأخيرة، وقد ثبت أن لها أيضا خصائص التصالحية2،3. والواقع أن مختلف العوامل السيتوكينات والنمو (VEGF، PDGF، TGF-ب، ومنتدى إدارة الإنترنت-الأول، وهجف) تم إصدارها من الصفائح الدموية أثناء تحبب. تعزيز عوامل النمو هذه الأوعية والأنسجة يعيد البناء، والجرح الشفاء (العظام، الجلد، والعضلات، ووتر)2. سينتريفوجينج الدم الذاتي تنتج الصفيحات الغنية البلازما (PRP) التي تحتوي على تركيزات عالية من الصفائح الدموية تبعاً لأسلوب العزل (بين 3 و 10 مرات الدم تركيزات خط الأساس). وفي الواقع، لا يمكن توفير مختلف تقنيات إعداد الحزب الثوري منتج نهائي متطابقة. وحتى الآن، كان هناك لا الدولي الاتفاق العام بشأن هذه المسألة. عموما، يمكن أن يكون الحزب الثوري خياراً جذاباً علاجية لعلاج الحالات العضلية الهيكلية المزمنة، مثل تيندينوباثي، والتهاب اللفافة، وهشاشة العظام، و نقابية4. أنها استخدمت للمرة الأولى في جراحة الفم وزراعة الأسنان4 تحسين وتسريع العظام الشفاء بعد وضع زرع الأسنان. في هذه الدراسة، ونحن تصف أسلوب استنساخه يسمح اكتساب الحزب الثوري للتجارب الحيوانية4.
منذ آفات الأوتار هي كثيرا ما لوحظ في الرياضيين والعمال المادية، تعزيز عملية الشفاء ومما يقلل من الوقت للتعافي باهتمام كبير5. طرق العلاج الجديدة التي تقوم بتطوير وكثيراً ما تنطوي على استخدام عوامل النمو، وإدارة الحزب الثوري وسيلة بسيطة وكسبها لتقديم مزيج من عوامل النمو الذاتية4.
أظهرت العديد من الدراسات في المختبر أو الحيوان أن إدارة بلازما تحتوي على مستوى عال من الصفائح الدموية، عن طريق الإفراج عن الوسطاء البيولوجية، يمكن أن تحفز إصلاح الوتر والرباط بالإفراج عن الوسطاء البيولوجي6 ،7،،من89. وعلاوة على ذلك، أظهرت دراسات أخرى أن الحزب الثوري الشعبي يمكن أن تحفز النوع الأول والثالث الكولاجين التوليف في وتر الخلايا9،،من1011. كما قيل أن الحزب الثوري الشعبي يمكن إنقاص تفعيل مصفوفة ميتالوبروتيناسيس (يتولى) وللحد من تدهور المصفوفة. يمكن أن تنتج الخلايا التي تشارك في عملية التهاب MMP-9، التي تلعب دوراً في إعادة الأنسجة عرض (الفسيولوجية وباثولوجي) الناجم عن التهاب12.
وبناء على هذه المعلومات، افترضنا أن حقنه PRP واحد في مقطعة الأوتار أخيل من الفئران يمكن أن يحسن عملية الانتعاش والقوة الميكانيكية لإصلاح الأنسجة. هذا هو اختبار قياس خصائص النشاط الحيوي الأوتار الشفاء أثناء عملية الاسترداد، وإجراء التحليلات الجزيئية والنسيجي لتقييم الكولاجين يعيد البناء في الأنسجة المكونة حديثا. وكان هدف الدراسة لمراقبة إذا حقنه واحدة من الحزب الثوري متمكنة يمكن أن تؤثر على الشفاء من مقطعة الأوتار أخيل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
الرعاية والمعالجة للحيوانات أجريت وفقا لدليل للرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية أعدتها "الأكاديمية الوطنية للعلوم"، ونشرت بالمعاهد الوطنية للصحة (USA). وتلت التشريعات الأوروبية والوطنية بعناية.
1-إعداد الحيوان
- استخدام 132 الفئران سبراغ داولي شهرا 2-الذكور وزنها 320-450 غ (120 الفئران للتجريب) و 12 من الفئران لأخذ عينات من الدم، الرقم 1. استناداً إلى ديل13، 15 من الفئران لكل مجموعة كان كافياً بالنسبة قوة 0.8 (80% فرصة إيجاد دلالة إحصائية، في حالة وجود تأثير المحدد).
- منزل جميع الفئران في أقفاص الكلاسيكية في ظروف عزلة في منشأة تقليدية مزودة بمحطة متغيرة. التحريض على تربية في رف IVC (قفص فردي التهوية)، مع منتدى جنوب المحيط الهادئ (الحرة محددة الممرض) الفئران المشتراة على وجه التحديد.
- استخدام الشروط السكنية التالية: تتراوح درجة الحرارة بين 19-24 درجة مئوية؛ الرطوبة النسبية: 40-60 في المائة؛ التهوية: التردد لتجديد الهواء: 10-15 كل ح؛ دورة الضوء/الظلام: ح 12-12 ح.
- تعقيم جميع المعدات كاجينج واستخدام الأسرة المشع. عناصره تنفيذ تخصيب القفص عن طريق وضع علب الكرتون العقيمة والمناشف داخل الأقفاص.
- السماح بالوصول إلى المنطقة تحت شروط مقيدة: جديدة مختبر بونيه معطف، قناع، والقفازات، والأحذية، والشعر عند المدخل.
- القيام برصد الصحة مستعمرة على الحيوانات الحارس محبوسين في الفراش القذرة على أساس سنوي، وفقا للتوصيات14 فيلاسا للمرافق التقليدية. المحمضة إبقاء الحيوانات أربع أو خمس في قفص، مع المناسبة المشع النظام الغذائي وتوفير المياه libitum الإعلانية. رصد يوميا.
- نقل الفئران التي انتخبت للتدخل الجراحي في تصفية الأقفاص أعلى في غرف العمليات الجراحية ح 2 قبل الجراحة.
2-الجراحة
- إعداد الأدوات الجراحية: مقص، المشبك والمشابك مرقئ اثنين وحامل إبرة بشكل جيد. وخلال جميع الإجراءات، ارتداء قفازات وقناع وغطاء محرك السيارة ومعطف معمل.
- تقسيم الفئران عشوائياً إلى مجموعتين (الحزب الثوري والمحلول الملحي).
- إخراج الفئران من قفصة وتزن عليه. استخدام ترقيم العلامات الإذن للتعرف على الفئران. لتجنب جفاف العينين، ضع واتيردروبس على القرنية.
- تخدير الفئران إينترابيريتونيلي مع إكسيلازيني (10 مغ/كغ وزن الجسم) والكيتامين (80 ملغ/كغ وزن الجسم). لتأكيد أنيسثيتيزيشن، وضع الحيوانات تحت الرصد والتحقق من وجود أي ردود الفعل العين القلب والجهاز التنفسي.
- حقن 50 ميليلتر من البوبرينورفين تحت الجلد (0.01-0.05 مغ/كغ كل ح 8-12) في منطقة الرقبة كمسكن لألم.
- يحلق أطرافهم هند الأيسر مع ماكينة حلاقة كهربائية وتطهير أنه مع 3 دعك حل إيزو-تدين/الكحول (المخفف 01:10) بالتناوب ومكان الفئران على وسادة دافئة (20 درجة مئوية) تحت مجهر تشريح. وضع الفئران في استلقاء جانبية مع المحطة ليتم تشغيلها في وضع متفوقة. يجري في مخلب مع الملقط الجراحي.
- باستخدام المقص، جعل شق جانبية صغيرة (20-25 مم) في الجلد المحيطة بوتر أخيل الأيسر، وتشريح اللفافة استخدام مقص جيد لفضح وتر أخيل المعقدة (الشكل 2a).
- إزالة وتر بلانتاريس مع زوج من المقص (الشكل 2).
- قطع وتر أخيل مستعرضة 5 مم الدانية للإدراج الشوكة وإزالة جزء طويل 5 ملم باستخدام مقص. لا خياطة الوتر (الشكل 2 ج، 2d).
- خياطة اللفافة ثم الجلد مع الغزل ريسوربابل القيام خياطة عفريت (خياطة مستمرة). يمكن استخدام خيوط شعيرات، فضلا عن منع فتل من الجلد في الشق الجراحي.
- ضع الفئران تحت مصباح تدفئة حتى استيقظ ثم ثم ضع الفئران مرة أخرى في قفص (58 × 38 سم) (بيني الملاحظة: تفرض لا التثبيت).
3-PRP إعداد15
- تخدير الفئران المانحين مع إكسيلازيني (10 مغ/كغ وزن الجسم) والكيتامين (80 ملغ/كغ وزن الجسم) عن طريق الحقن داخل. ويتم حقن PRP ح 2 بعد دون أي إعادة-مخدر.
- حقن 50 ميليلتر من البوبرينورفين تحت الجلد كمسكن لألم.
- جمع الدم كله (20 مل كل فأر، ونزيف النهائي) بثقب القلب في أنابيب معقمة تحتوي على 3.2% مخزنة سترات الصوديوم (م 0.109، تخثر الدم). ثم euthanize في الفئران بحقن إينتراكاردياك.
- للحصول على الحزب الثوري، الطرد المركزي الدم لمدة 10 دقيقة في 150 × ز ودرجة حرارة الغرفة. تؤدي هذه الخطوة الأولية انخفاض سرعة الطرد المركزي مرحلتين متميزتين: مرحلة أقل تتألف من خلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء) التي تستأثر بنحو 80-90 في المائة الحجم الإجمالي، ومرحلة أعلى يتألف من البلازما الغنية بالصفائح الدموية (PRP) (عادة 10-20% الدم عينة).
- جمع الحزب الثوري (المرحلة العليا) في أنبوب بلاستيكي ثانوية استخدام ماصة نقل بلاستيك لطف. كما الواجهة بين الحزب الثوري وخلايا الدم الحمراء فضفاضة جداً، لا "الماصة؛" قريبة جداً إلى الواجهة. عند التعامل معها بشكل صحيح، تلويث كرات الدم الحمراء في الحزب الثوري ينبغي أن يكون أقل 0.05 × 103 خلايا/ميليلتر. تجاهل المرحلة الدنيا المتبقية وأنابيب جمع الدم الأولية.
- تحديد حجم تجمع الحزب الثوري وقياس الصفيحات في هو محلل الدم. تكون هذه القيم المطلوبة لإجراء العمليات الحسابية لضبط تركيز الصفائح الدموية في الخطوة التالية. عدد خلايا الدم أيضا مفيدة لتقييم التلوث المحتملة مع كرات الدم الحمراء وتركيز الكريات البيضاء. الصفائح الدموية في الحزب الثوري في هذه المرحلة هو عادة 1 – 1.5 x106/µL.
- إجراء الطرد المركزي ثاني للحزب الثوري الشعبي لمدة 10 دقيقة في 1,000 س ز ودرجة حرارة الغرفة. تؤدي هذه الخطوة الطرد المركزي عالية السرعة بيليه الصفيحات فضفاضة والمادة طافية يتألف من البلازما الصفائح الدموية-الفقراء ذاتي (تعادل القوة الشرائية). استخدام القيم التي تم تحديدها في الخطوة 3، 6، حساب حجم المادة طافية لإهمالها للتركيز الحزب الثوري والتوصل إلى تركيز نهائي 2.5 x106/µL.
- بلطف بجمع المادة طافية (تعادل القوة الشرائية) في أنبوب بلاستيكي ثانوية استخدام ماصة نقل بلاستيك، ترك حوالي ثلثي حجم النهائي المحسوبة في الخطوة 3، 7. كما بيليه فضفاض، كمية كبيرة من الصفائح الدموية يتم فقدان عندما يتم تجاهل تعادل القوة الشرائية، ومن ثم يحتمل أن يقلل التركيز النهائي المطلوب.
- ريسوسبيند بيليه الصفيحات مع المادة طافية المتبقية بعناية قبل لطيف بيبيتينج المتكررة. قياس عدد الصفائح الدموية في هذا الحزب الثوري مركزة. إذا لزم الأمر، إضافة إلى حجم مناسب ذاتي تعادل القوة الشرائية للوصول إلى تركيز الهدف النهائي.
ملاحظة: استخدم PRP ضمن ح 3 من إعداد. - إضافة 50 ميليلتر من كاكل2 (11 mEq 10 مل) كل مل من الحزب الثوري لتنشيط الصفائح الدموية.
- حقن 50 ميليلتر من الحزب الثوري الطازجة أو المحلول الملحي بإبرة ز 21 مباشرة في موقع خياطة العملية حوالي 1 ساعة بعد إعداد. وخلال هذا الوقت، يبقى الحزب الثوري في درجة حرارة الغرفة.
- رصد الانتعاش وظيفية من الفئران عن كثب خلال الأيام بعد الجراحة، وقبل إزالة وتر أخيل.
4-إزالة العرقوب واختبار النشاط الحيوي16
- 5 أو 15 أو 30 يوما بعد5، وزن الفئران. ثم تخدير مع إكسيلازيني (10 مغ/كغ وزن الجسم) والكيتامين (80 ملغ/كغ وزن الجسم) عن طريق الحقن داخل.
- حقن 50 ميليلتر من البوبرينورفين تحت الجلد كمسكن لألم. إزالة الوتر قبل التضحية بالحيوان للحفاظ على الظروف الفسيولوجية لأطول فترة ممكنة.
- يحلق أطرافهم هند الأيسر ومكان الفئران تحت مجهر تشريح. وضع الفئران في استلقاء جانبية مع المحطة ليتم تشغيلها في وضع متفوقة. عقد الكف مع الأصابع.
- إجراء شق صغير (10 مم) في موقع العملية السابقة ويمدد حتى يتم كشف سوراليس الرؤوس.
- لإزالة العرقوب الشفاء، قص عظم العقب مستعرضة 5-10 ملم القاصي إلى تمسكه العرقوب. ثم تشريح جزء من سوراليس الرؤوس، التي أرفقت بوتر أخيل (الشكل 3b). الجزء العضلات قد تكون كبيرة بما يكفي لتناسب في البرد-الفك (الشكل 3 ج-د). ضع العينة فورا في البرد-الفك باستخدام الملقط (3e الشكل).
- بعد إزالة مجمع العضلات والعظام-وتر، euthanize الفئران بحقن إينتراكاردياك مع نيمبوتال (200 مغ/كغ). تأكيد وفاة بتقدير عدم وجود ضربات القلب والتنفس لمدة 15 دقيقة.
- ضع وحدة العضلات في الفك العلوي (3e الشكل) وإغلاقه ووضعه رأسياً في عالمي اختبار الجهاز (106.2 kN، الشكل 3 ألف). ثم إصلاح العظام بين المشابك أقل من الجهاز (3f الشكل).
- إضافة النيتروجين السائل في كلا من أحواض الفك العلوي تجميد العضلات، حتى وهو أمر من حجم أغلظ من الوتر ولا تشوه أثناء اختبار الشد.
- عندما تصل إلى منطقة تجميد الحدود المشبك المعدني، وبدء اختبار الشد، حتى الوتر سوف تحافظ على هيكلها. تعيين معدل النزوح من الجهاز بسرعة ثابتة من 1 مم/s حتى تمزق. سجل في نهاية المطاف قوة الشد (إقليم اتحادي) النظر في نيوتن (N) على جهاز كمبيوتر.
- لحساب مساحة مقطعية، مكان اثنين من الكاميرات متعامدة على بعضها البعض، تشكل على شكل بيضاوي الشكل، والتقاط الصور.
- لحساب الفرق في مساحة مقطعية الأوتار الشفاء، تطبيع إقليم اتحادي لوحدة مساحة (ن كل ملليمتر مربع)، الذي يمثل الضغط الميكانيكي من ذوي الخبرة بالانسجة.
5. تحليل النسيجي
ملاحظة: الأوتار 15 لكل مجموعة خضعت للتحليل النسيجي.
- بعد إزالتها، تغرق العرقوب فورا في بارافورمالدهيد 4% للحفاظ على هيكلها (1 مم أنسجة يتم إصلاح كل ساعة، حتى وقت التثبيت يختلف تبعاً لحجم الوتر).
- استبدال بارافورمالدهيد واسطة الإيثانول 70% وتترك العينة لليلة واحدة على الأقل في هذا الحل.
- ضع الوتر في حاوية بلاستيكية صغيرة ذات ثقوب ومكان تلك الحاوية في محلول إيثانول 70% طازجة ح 1.
- كرر مكان الحاوية في الإيثانول 95% حاء – 1.
- كرر مكان الحاوية في الإيثانول 100% حاء – 1.
- كرر مكان الحاوية في زيلين نفط 100% حاء – 1.
- الآن مكان الحاوية البلاستيكية، التي تحتوي على الوتر، في البارافين السائل (56 درجة مئوية) وترك الأمر بين عشية وضحاها.
- باستخدام محطة تضمين (مجهزة بالشمع المنصهر وصفيحة ساخنة، وصفيحة باردة)، اختر قالب معدني الذي يناسب عينة الأنسجة، وملء مع البارافين السائل قليلاً حيث أنه يغطي القاعدة.
ملاحظة: توجيه العينة للحصول على المقاطع العمودية في مبضع. - عندما يتم وضع العينة بشكل صحيح، تملأ القالب مع البارافين السائل ووضعه على آلة التبريد. ندعه يبرد لمدة 15 دقيقة على الأقل.
- إزالة من كتلة البارافين ووضعه على الجليد لمدة 30 دقيقة على الأقل.
- إعداد العديد من الشرائح الزجاجية النظيفة ووضع بعض قطرات من المياه عليها.
- في مبضع، قص القطع في الأقسام من 5 ميكرومتر (فقط استخدام مقاطع من الجزء الأوسط من الوتر) ووضع المقطع على شريحة.
- ضع الشرائح في فرن تدفئة في 65 درجة مئوية لعدة دقائق، حتى البارافين يبدأ فقط لإذابة للسندات الأنسجة للزجاج.
- ضع الشرائح التي تحتوي على مقاطع البارافين في حامل شريحة.
- الآن ديبارافينيزي وترطيب الأنسجة بوضعه في الحمامات المتعاقبة التالية:
8 دقيقة في زيلين نفط (حمام 1)
4 دقيقة في زيلين نفط (حمام 2)
2 دقيقة في الإيثانول 100%
2 دقيقة في الإيثانول 95%
2 دقيقة في الإيثانول 70%
2 دقيقة في المياه. - الهيماتوكسيلين ويوزين تلطيخ، وضع الأنسجة في الحلول التالية.
- تزج الأنسجة ل 8 دقيقة في حل الهيماتوكسيلين (مونوهيدرات الهيماتوكسيلين ز 1، ز 0.2 الكويتي3، 50 غ AIK (هكذا4)2.12H2س؛ الغليسرين 200 مل؛ ضبط إلى 1 لتر بالماء المقطر).
- تزج الأنسجة لمدة 8 دقائق تحت ماء الصنبور الجاري.
- تزج الأنسجة لمدة 30 ق في حل ويوزين (0.25% ثم في 100 مل ماء المقطر الذي يحتوي على 200 ميليلتر من حمض الخليك غير مخفف).
- تزج الأنسجة لمدة 2 دقيقة تحت ماء الصنبور الجاري.
- "تلوين" ماسون تريتشرومي، اتبع الخطوات التالية.
- بعد الإماهة، وضع المقاطع في حاوية مع الشب الحديد (0.5 غ (NH4) Fe (هكذا4)2.12H2س في 10 مل ح2س) وإغلاق الحاوية. الحرارة التسجيل 3 دقيقة في 280 ث في فرن ميكروويف.
- ندعه يبرد لمدة دقيقة وثم شطفة بالمياه.
- وضع المقاطع في حاوية مغلقة مع الحل توضع في ريجو (0.5 ز توضع حله في 50 مل ح2س عند 50 درجة مئوية، ثم إضافة الإيثانول 95% 5 مل و 5 مل الغليسرين)، الحرارة النسبة 90 s في 280 جورج
- شطفة بالمياه.
- وضع المقاطع في محلول حمض البكريك (في درجة الإشباع في الميثانول) لمدة 3 دقائق، وشطف لمدة 5 دقائق تحت ماء الصنبور الجاري وثم وضعه في المياه لبضع ثوان.
- الآن وضع المقاطع في فوكسين حمض (0.5 ز في 50 مل ح2س يحتوي على 0.25 مل حمض الخليك غير مخفف) 5 s وشطف تحت حنفية الماء الجاري حتى تختفي الصبغة.
- احتضان المقاطع في حل حامض فوسفوموليبديك (0.5 ز في 50 مل ح2س) لمدة 5 دقائق، ووضعها لبضع ثوان في المياه.
- وضع المقاطع في حل الضوء الأخضر (0.5 ز في 50 مل ح2س يحتوي على 0.25 مل حمض الخليك غير مخفف) لمدة 5 دقائق أخرى ووضعه تحت حنفية الماء الجاري حتى تختفي الصبغة.
- الآن يذوي الأنسجة مرة أخرى.
- تزج القسم لمدة 1 دقيقة في الإيثانول 70%.
- تزج القسم لمدة 1 دقيقة في الإيثانول 95%.
- تزج القسم لمدة 1 دقيقة في الإيثانول 100%.
- تزج القسم لمدة 1 دقيقة في زيلين نفط (حمام 1).
- تزج القسم لمدة 1 دقيقة في زيلين نفط (حمام 2).
- إزالة المقاطع دون إزالة زيلين نفط أكثر من اللازم ووضع قطره من تصاعد المتوسطة العينة.
- وضع ساترة على أعلى (بدون إثارة أي فقاعات) وأتركها تتصلب على الأقل 2 ح.
- يتحلل 5 أقسام نسيجية (كل منها وتر مختلفة) لكل مجموعة في 6 N HCl ح 3 وتحديد تركيز الكولاجين عن طريق قياس برولين كمؤشر في 5 ميكرومتر أونستينيد أقسام.
- تطبيع النتائج حسب منطقة مقطع باستخدام البرنامج الخاص بالشركة المصنعة.
- وصمة بعض الأبواب مع "الضوء الأخضر وصمة عار" لتصور وتحديد كمية الكولاجين فيبريلار بمساعدة الحاسوب التحليل.
- مسح المقاطع وتحويل الصور في ظلال رمادي باستخدام البرمجيات [ايرفنفيو]. استخدام البرنامج لشبه الكمي (مثلاً، واحد الكمية).
6-الجزيئية التقييم
- بعد تمزق وتر، التي تحدث أثناء اختبار الميكانيكية، أخذ العينات، والأداة تجميدها في نيتروجين سائل، وتخزينها في-80 درجة مئوية (الحزب الثوري والمحلول الملحي)17.
- استخدام أدوات "مجموع الجيش الملكي النيبالي" تجارية لعزل الحمض النووي الريبي إجمالي17.
- قياس التعبير عن الكولاجين (العمود الأول والعمود الثالث)، "ميتالوبروتيناسيس مصفوفة" (MMP-2 ونظام التمثيل التناسبي المختلط-3 ونظام التمثيل التناسبي المختلط-9)، وتينومودولين (تنمد) RT-PCR17،18.
- تطبيع مستويات التعبير مرناً لمستويات 28S19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
النتائج التي يتم التعبير عنها ك ± متوسط الانحراف المعياري للوسط وقورنت مع تحليل التباين (ANOVA). اتجاهين ANOVA و وظيفة المخصص اختبار دي Scheffé، وهو اختبار حدودي، واستخدمت.
كانت قوة الشد النهائي (إقليم اتحادي) المطلوبة لإثارة تمزق الأوتار أخيل غير مضرورة من الفئران ± 42.0 5.7 N (n = 10). قوة الشد زيادة كبيرة (ف < 0.0001) في كلتا المجموعتين بعد يوم 5. المقارنة بين كلا الفريقين، إقليم اتحادي كان أعلى في مجموعة الحزب الثوري في أي وقت يقاس، لا سيما في يوم 15 و 30. عن طريق قياس مساحة مقطعية الأوتار التي تم إزالتها قبل أن يخضع تقييم النشاط الحيوي (11.4 ± 5.5 مم2 لعدم إصابة الأوتار)، وجد أنه في يوم 5، من أكبر في المجموعة المعالجة المالحة. ولكن في يوم 15 و 30، منطقة مستعرضة كان أكبر في مجموعة الحزب الثوري، على الرغم من أن هذه الكمية كانت أكثر تنوعاً بالمقارنة مع المجموعة المعالجة المالحة (الشكل 4 و الشكل 5).
أظهر التقييم النسيجي الأوتار، استخدام الهيماتوكسيلين-ويوزين تلطيخ، سيلولاريتي عالية في اليوم الخامس، الذي انخفض بعد ذلك (لوحظ لا يوجد فرق كبير بين المحلول الملحي ومجموعة الحزب الثوري). تريتشرومي ماسون تلطيخ أظهرت وجود أعلى من الكولاجين فيبريلار في مجموعة الحزب الثوري الشعبي في يوم 5 و 15. لكن كثافة تلطيخ كانت مماثلة في كل من مجموعات 30 يوما بعد الحقن (الشكل 6). شبه القياس الكمي التي حصل عليها تلطيخ العينات مع "الضوء الأخضر" أظهرت أنه في يوم 5 و 15، الكثافة أعلى في مجموعة الحزب الثوري (لا يعتد به إحصائيا) لكن في يوم 30، لم يكن هناك فرق بين المجموعتين.
كان تطبيع البيانات بقياس كمية حمض أميني، برولين، ومحددة بالكولاجين، مما يؤكد التقدير الكمي شبه نسيجية (يوم 5: أكبر قيمة في مجموعة الحزب الثوري). لم تكن مستقرة في المجموعة PRP تركيز الكولاجين لكن قد استقرت في يوم 30 في هاتين المجموعتين. تم قياس حجم دشبذ وتم العثور على أن تكون أكبر بكثير في الحيوانات المعالجة بالحزب الثوري المراحل الأولى من عملية الشفاء. أخذت معا، تعني هذه النتائج أن يسبب حقن الحزب الثوري في الوتر المصاب مبلغ هام من الكولاجين فيبريلار بإيداع.
قياس مستوى التعبير العديد من الجزيئات التي أظهرت أنه في الأوتار غير مضرورة، العمود الثالث وتنمد كانت موجودة في أقل مبلغ (2.5-3.0 مرات) مما ورد في شفاء الأوتار في يوم 15، ومع ذلك لم يكن هناك فرق في عمود أنا التعبير بين الجماعات. يتولى حاضرين في عرض أعلى تركيز في الأوتار الشفاء. وبالإضافة إلى ذلك، في يوم 30، كانت هناك زيادة كبيرة في COL1A1 في مجموعة الحزب الثوري، وتم العثور على ارتباط إيجابي بين التعبير COL1A1 وإقليم اتحادي. في كلتا المجموعتين، اتضح أن "العقيد الثالث" أعرب في كمية عالية من يوم 1 حتى يوم 14، قبل فانخفضت (نفسها لكلا الفريقين). تركيز نظام التمثيل التناسبي المختلط-9 لم تتغير في كلا الفريقين ولكن MMP-2 ونظام التمثيل التناسبي المختلط-3 كانت موجودة بتركيزات أعلى خلال فترة الشفاء. في يوم 5، أعرب تندم في مبلغ أكبر في الحزب الثوري الشعبي (ف < 0.03) ولكنها انخفضت بعد ذلك بين 15 و 30 يوما.
رقم 1: التصميم التجريبي للدراسة- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2: الإجراءات الجراحية.
(أ) وتر مجمع بعد إزالة اللفافة المحيطة بها.
(ب) إزالة من وتر بلانتاريس.
(ج) إزالة قسم من وتر أخيل.
(د) 2 الأوتار التي تم إزالتها. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: اختبار النشاط الحيوي
(أ) آلة الاختبار الشامل (106.2 كيلونيوتن).
(ب) المجمع الأربطة والعضلات-العظام التي سوف تكون ثابتة في البرد-الفك.
(ج) العلوي وانخفاض الفك البرد
(د) العلوي والبرد-الفك السفلي
(ه) المجمع وضع الفك البرد
(و) مغلقة cryo-الفك الذي يحتوي على المجمع العضلات والعظام-وتر ثابت في الجهاز. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: نتائج اختبار النشاط الحيوي
مقاومة الشد المعرب عنها في نيوتن (N) في السيطرة ومجموعات الحزب الثوري في نقاط زمنية مختلفة بعد الجراحة. كانت هناك زيادة في إقليم اتحادي في كلا الفريقين على مر الزمن، مع مجموعة PRP عرض قيم أعلى بكثير في 15 و 30 يوما بعد الجراحة.
ويعرف شريط خطأ الانحراف المعياري (SD). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5: نتائج اختبار النشاط الحيوي
منطقة عرضية لوتر المعرب عنها في ملليمتر مربعة (مم2). منطقة مستعرضة كان أكبر بكثير في مجموعة الحزب الثوري حتى يوم 15. وبعد ذلك، كان القسم مماثلة في كلا الفريقين.
ويعرف شريط خطأ الانحراف المعياري (SD). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 6: نتائج النسيجي
مقاطع طولية الممثل لوتر أخيل من التحكم ومجموعات الحزب الثوري، ملطخة Masson's Trichrome. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. وهناك الأخضر أقوى تلطيخ في الوتر مجموعة الحزب الثوري الشعبي في يوم 5. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الصفائح الدموية ضرورية للمرحلة المبكرة التحريضية لوتر عملية الشفاء. عند هذه الصفائح معرضة بربط الأنسجة أو العوامل التي تسبب تخثر الدم، أنها ستفرج عن عوامل النمو التي تخزن في حبيبات α. نتيجة لهذا التفاعل، والجزيئات المصفوفة خارج الخلية سينثيتيزيد وتتكاثر الخلايا الوسيطة. الصفائح الدموية لها أيضا بنشاط تشيموتاكتيك على خلايا السلف في الدورة الدموية، تعزيز الأوعية ويحفز التمايز الخلوي6،20.
تم اختبار النشاط الحيوي باستخدام جهاز لقط صنعت خصيصا السابقين فيفو اختبار الشد لوتر أخيل في الفئران15. Cryo-الفك يسمح بتجميد العضلات عن طريق إضافة النيتروجين السائل، وعظم العقب، وهو الجزء السفلي من العينة، يتم إصلاحها مباشرة إلى الجهاز. من المهم جداً لبدء اختبار الشد عند العضلات جامدة تماما، ولكن الوتر لا يزال مرناً. هذا الأسلوب يتجنب تلف الأنسجة ويحافظ على سلامة الميكانيكية. هذا الأسلوب أيضا بسيطة وآمنة وغير ضاغطة واستنساخه بشكل واضح، كما أن العديد من الدراسات قد استخدمت هذا الأسلوب4،15.
وخضع بعض الأوتار لدعم النتائج الميكانيكية، التقييم النسيجي. تلوين الهيماتوكسيلين ويوزين يبين نظرة كبيرة لتلتئم الأنسجة ويعطي معلومات عامة حول كمية الخلايا والكولاجين الحالية. أيضا، قياس هيدروكسيبرولين هو مفيد كما حمض أميني فقط وجدت في الكولاجين ويسمح objectivation البيانات النسيجي. بيد أنها ضرورية للقيام بتلوين Trichrome ماسون، كما أنه يظهر معلومات أكثر تفصيلاً عن ترسب وتركيز ألياف الكولاجين4.
على الرغم من أن مستوى الكولاجين مرناً الثالث في الحزب الثوري معاملة لم يتم تغييرها الأوتار، في يوم 30 مرناً العقيد كان حاضرا في أعلى تركيز في الأوتار الجرحى تعامل مع الحزب الثوري. سابقا فقد ثبت أن الحزب الثوري الشعبي يتداخل مع انتشار الضامة وإنتاج IL-121، التي يمكن أن تجنب هكذا فعل التهابية مفرطة خلال المراحل المبكرة من عملية شفاء11. فمن الممكن أن الحزب الثوري يحفز الانتشار وتفعيل الأيضية وتحول الخلايا الوسيطة إلى تينوسيتيس التي تعمل بنشاط.
تركيزات عالية من تندم في الأوتار مجموعة الحزب الثوري تشير إلى أن جزيئات حقن يمكن أن تجتذب خلايا المتداولة في مجرى الدم والحث على تفرقة تجاه النمط الظاهري تينوسيتي11. مجتمعة، تبين هذه النتائج أن حقن واحد فقط من الحزب الثوري الشعبي في العرقوب تمزق له أثر إيجابي في مرحلة الشفاء المبكر ويؤدي إلى قوة ميكانيكية أعلى.
وقد أثبتت عدة دراسات ما قبل السريرية أنه يحسن الحزب الثوري الشعبي في عملية الشفاء، وأن عوامل النمو المختلفة لديها إجراءات محددة خلال هذه العملية22. أظهرت أن الحزب الثوري يحفز تكاثر الخلايا في العضلات والعظام والاوتار مازوككا وفريقه. الخروج من الاستعدادات المختلفة، ثبت PRP مركزة بشدة دون أي خلايا الدم البيضاء العلاج الأكثر فعالية23. مككاريل وآخرون. ولم تجربة مماثلة، اختبار الاستعدادات عدة من الحزب الثوري الشعبي التي تحتوي على تركيزات مختلفة من الحزب الثوري الشعبي، وخلايا الدم البيضاء على الأوتار الحصان. المستحضرات المحتوية على بمتوسط تركيز الصفائح الدموية وتركيزات عالية من خلايا الدم البيضاء أدت إلى إصدار أعلى من السيتوكينات الموالية التحريضية، مثل تنفا، 1ß إيل وانخفاض الكولاجين التوليف. الخلائط التي تحتوي على تركيزات عالية من الصفائح الدموية وخلايا الدم البيضاء أدت أيضا إلى زيادة السيتوكينات الالتهابية ولكن تحول دون الكولاجين التوليف. وفي الختام وهذا يعني أنه إذا كان تركيز الصفيحات مرتفعة جداً، الكولاجين التوليف وخلية الأيض هي تباطأ24. بوزويل وآخرون. وأكدت هذه النتائج25. وهكذا سيتضمن إعداد PRP الأكثر كفاءة بتركيز الصفائح الدموية أقل من 106 الصفائح الدموية/ميليلتر ولا خلايا الدم البيضاء.
وميزة رئيسية لاستخدام الحزب الثوري أوتوجينيتي. على الرغم من أن في دراستنا، استخدمنا PRP متمكنة بالتضحية بالفئران الجهات المانحة للحصول على كمية كافية من الدم. وعلاوة على ذلك، أخذ الدم من الفئران تعمل من شأنه أن يضعف لهم كثيرا. قيد آخر من هذه الدراسة أن جميع تمزقات الحادة والمؤداة على الأوتار صحية، التي ليست دائماً حالة البشر، كما تمزق الأوتار غالباً بسبب انحطاط السابقة. هذا النموذج يستند إلى إصابات الأوتار الحادة، يمكن استخلاص لا استنتاجات نهائية للأمراض التنكسية تيندينوباثيس.
باستخدام هذا الأسلوب، وهناك بعض الخطوات الحاسمة لتذكر، تعد الأولى من نوعها يجري إعداد الحزب الثوري، الذي ينبغي استنساخه كما قدر الإمكان. خطوة حاسمة أخرى هي العملية الجراحية: الإزالة وتر ووتر العضلات المعقدة ينبغي أن يتم بطريقة استنساخه لتفادي أي تحيز. وأخيراً، التحضير لاختبار النشاط الحيوي: إضافة النيتروجين السائل لتجميد العضلات، وأنه من المهم جداً أن الوتر هو لم تجمد في هذه العملية لأنها يمكن أن تؤدي إلى نتائج متحيزة، كما أن تغيير صلابة وتر. هذا أيضا حد من هذه الدراسة، حيث أنه لا يوجد أي بروتوكول موحد لضمان أن لا يتم تعديل مرونة الوتر.
نحن لدينا طريقة على أساس الطريقة وضعتها فيرتشينكو et al. تكييفه 26، لكن استخدام cryo-الفك الذي يحمي وتر ضد العدوان الخارجي الناجم عن المشابك. والميزة الرئيسية لهذا الأسلوب أنه قابل لإعادة الإنتاج حتى ولو أنها ليست موحدة حتى الآن. أنه يعطي فكرة عن كيف يمكن أن تعالج إصابات وتر في البشر، وعلى الرغم من أن التجارب مع الفئران لا يترجم دائماً جيدا لعلاج الإصابات البشرية. ومن المرجح أن صيغة معدلة لهذا الأسلوب يمكن أن تكون مفيدة في علاج تلك الإصابات في المستقبل، تؤيدها حقيقة أنه سهل الاستخدام، بتكلفة منخفضة نسبيا، وهو أقل الغازية من أساليب أخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وأعلن لا تضارب في المصالح.
Acknowledgments
هذه الدراسة وأيده ستاندار دو لييج، ومنح لوجون-ليتشين الأموال Frédéricq ليون.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xylazine (Xyl-M) | VMD | none | anesthetic |
| Ketamin (Jétamine 1000 CEVA) | CEVA Santé Animale | none | anesthetic |
| Buprenorphin (Vetergésic Multidosis) | ALSTOE | none | Painkiller |
| iso-Betadine | MEDA-Pharma | none | Desinfectant |
| resorbable yarn Vicryl 6/0 | Johnson & Johnson | ||
| Nembutal | CEVA Santé Animale | none | Anesthetic |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Preserves structure of the tissue |
| Isopropanol 100% | VWR | 20,922,364 | |
| Ethanol 95% | VWR | 20,823,362 | |
| Xylene | VWR | 28973.363 | |
| Paraffin | VWR | LEIC3950.1006 | |
| Hematoxylin | Millipore | 1.15938.0025 | Colorant |
| Eosin | Millipore | 1.15935.0100 | Colorant |
| Eukitt | Sigma-Aldrich | 3989 | Mounting Medium |
| CaCl2 |
References
- Kaux, J., Degrave, N., Crielaard, J. Platelet rich plasma traitement des tendinopathies chroniques? Revue de la littérature. Platelet rich plasma treatment of chronic tendinopathies? Review of literature. J. Traumatol. du Sport. 24, 99-102 (2007).
- Anitua, E., et al. Autologous preparations rich in growth factors promote proliferation and induce VEGF and HGF production by human tendon cells in culture. J. Orthop. Res. 23, 281-286 (2005).
- Bosch, G., et al. Effects of platelet-rich plasma on the quality of repair of mechanically induced core lesions in equine superficial digital flexor tendons: A placebo-controlled experimental study. J. Orthop. Res. 28, 211-217 (2010).
- Kaux, J. F., Drion, P., Croisier, J. L., Crielaard, J. M. Tendinopathies and platelet-rich plasma (PRP): From pre-clinical experiments to therapeutic use. J. Stem Cells Regen. Med. 11, P7-P17 (2015).
- Maffulli, N., Wong, J., Almekinders, L. C.
- Molloy, T., Wang, Y., Murrell, G. The roles of growth factors in tendon and ligament healing. Sports Med. 33, 381-394 (2003).
- Lyras, D. N., et al. The effect of platelet-rich plasma gel in the early phase of patellar tendon healing. Arch. Orthop. Trauma Surg. 129, 1577-1582 (2009).
- Aspenberg, P., Virchenko, O. Platelet concentrate injection improves Achilles tendon repair in rats. Acta Orthop. Scand. 75, 93-99 (2004).
- Visser, L. C., et al. Growth Factor-Rich Plasma Increases Tendon Cell Proliferation and Matrix Synthesis on a Synthetic Scaffold: An In Vitro Study. Tissue Eng. Part A. 16, 1021-1029 (2010).
- Zhang, J., Wang, J. H. -C. Platelet-Rich Plasma Releasate Promotes Differentiation of Tendon Stem Cells Into Active Tenocytes. Am. J. Sports Med. 38, 2477-2486 (2010).
- Kajikawa, Y., et al. Platelet-rich plasma enhances the initial mobilization of circulation-derived cells for tendon healing. J. Cell. Physiol. 215, 837-845 (2008).
- Pasternak, B., Aspenberg, P. Metalloproteinases and their inhibitors-diagnostic and therapeutic opportunities in orthopedics. Acta Orthop. 80, 693-703 (2009).
- Dell, R. B., Holleran, S., Ramakrishnan, R.
- Mähler Convenor, M., et al. FELASA recommendations for the health monitoring of mouse, rat, hamster, guinea pig and rabbit colonies in breeding and experimental units. Lab. Anim. 48, 178-192 (2014).
- Kaux, J. -F., et al. Étude comparative de cinq techniques de préparation plaquettaire (platelet-rich plasma). Pathol. Biol. 59, 157-160 (2011).
- Wieloch, P., Buchmann, G., Roth, W., Rickert, M. A cryo-jaw designed for in vitro tensile testing of the healing Achilles tendons in rats. J. Biomech. 37, 1719-1722 (2004).
- Kaux, J. -F., et al. Vascular Endothelial Growth Factor-111 (VEGF-111) and tendon healing: preliminary results in a rat model of tendon injury. Muscles. Ligaments Tendons J. 4, 24-28 (2014).
- Docheva, D., Hunziker, E. B., Fässler, R., Brandau, O. Tenomodulin is necessary for tenocyte proliferation and tendon maturation. Mol. Cell. Biol. 25, 699-705 (2005).
- Lambert, C. A., Colige, A. C., Munaut, C., Lapière, C. M., Nusgens, B. V. Distinct pathways in the over-expression of matrix metalloproteinases in human fibroblasts by relaxation of mechanical tension. Matrix Biol. 20, 397-408 (2001).
- Nurden, A. T., Nurden, P., Sanchez, M., Andia, I., Anitua, E.
- Woodall, J., Tucci, M., Mishra, A., Benghuzzi, H. Cellular effects of platelet rich plasma: a study on HL-60 macrophage-like cells. Biomed. Sci. Instrum. 43, 266-271 (2007).
- Taylor, D. W., Petrera, M., Hendry, M., Theodoropoulos, J. S. A systematic review of the use of platelet-rich plasma in sports medicine as a new treatment for tendon and ligament injuries. Clin. J. Sport Med. 21, 344-352 (2011).
- Mazzocca, A. D., et al. The positive effects of different platelet-rich plasma methods on human muscle, bone, and tendon cells. Am. J. Sports Med. 40, 1742-1749 (2012).
- McCarrel, T. M., Minas, T., Fortier, L. A. Optimization of leukocyte concentration in platelet-rich plasma for the treatment of tendinopathy. J. Bone Joint Surg. Am. 94 (1-8), e143 (2012).
- Boswell, S. G., et al. Increasing platelet concentrations in leukocyte-reduced platelet-rich plasma decrease collagen gene synthesis in tendons. Am. J. Sports Med. 42, 42-49 (2014).
- Virchenko, O., Aspenberg, P. How can one platelet injection after tendon injury lead to a stronger tendon after 4 weeks?: Interplay between early regeneration and mechanical stimulation. Acta Orthop. 77, 806-812 (2006).
