Summary
Dieses Protokoll beschreibt Verfahren zur Bewertung der Heilung sehnen in Ratten, die mit allogenen Platelet rich Plasma (PRP) oder Kochsalzlösung injiziert wurde, nach dem entfernen Teil der Achillessehne. Der Fortschritt der Heilung der Sehne zu mehreren Zeitpunkten mit verschiedenen Arten von Analysen ausgewertet.
Abstract
Dieser Artikel beschreibt die experimentellen Verfahren zu beobachten, wenn PRP positiv Sehne Heilung beeinflussen kann. Es gibt 4 wichtigsten Schritten zu folgen: induzieren eine Läsion in der Achillessehne; Vorbereiten von PRP und injizieren es (oder die Kochsalzlösung); Entfernen Sie die Sehne; und biomechanischen, molekulare und histologischen Auswertungen. Bei jedem Schritt werden alle Verfahren und Methoden detailliert beschrieben, so dass sie leicht reproduziert werden können.
Achillessehnen wurden chirurgisch geschnitten (Entfernung von einen 5 mm langen Abschnitt). Danach wurde PRP oder Kochsalzlösung injiziert, um zu untersuchen ob PRP einen positiven Effekt hat auf die Heilung der Sehne. Drei Gruppen von 40 Tieren (insgesamt 120 Ratten in dieser Studie verwendet wurden) wurden in 2 Gruppen unterteilt: PRP-Injektion-Gruppe und eine Kochsalzlösung Injektion Gruppe steuern. Ratten wurden geopfert, bei zunehmender Zeitpunkten (Gruppe A: 5 Tage; Gruppe B: 15 Tage; Gruppe C: 30 Tage) und Sehnen entfernt wurden. 90 sehnen unterzog sich biomechanische Tests vor der Ausführung transkriptomischen Analyse und 30 verbleibenden Spannglieder wurden histologische Analyse vorgelegt.
Introduction
Koagulation, entzündliche Prozesse und die Immunität Modulation Rollen der Thrombozyten sind bekannt1. Vor kurzem wurde nachgewiesen, dass sie auch stärkenden Eigenschaften2,3. In der Tat verschiedene Zytokine und Wachstum Faktoren (VEGF, PDGF, TGF-B, IGF-I und HGF) während Degranulation von Blutplättchen freigesetzt werden. Diese Wachstumsfaktoren fördern Angiogenese, Gewebe Umbau und Wunde heilen (Knochen, Haut, Muskel, Sehne)2. Autologem Blut Zentrifugieren produziert Thrombozyten rich Plasma (PRP) enthält hohe Thrombozyten-Konzentrationen abhängig von der Isolierung-Methode (zwischen 3 und 10 Mal Blut Grundlinie Konzentrationen). In der Tat können nicht verschiedenen PRP Präparationstechniken eine identische Endprodukt zur Verfügung stellen. Bis jetzt gab es keine internationale Einigkeit zu diesem Thema. Insgesamt konnte PRP eine attraktive Therapieoption für die Behandlung von chronischen Muskel-Skelett-Erkrankungen, wie Sehnenerkrankung, Plantarfasziitis, Arthrose und Pseudarthrose4sein. Es wurde zum ersten Mal in orale Chirurgie und Implantologie4 verwendet, zur Verbesserung und Beschleunigung der Knochenheilung nach dem Platzieren eines Zahnimplantats. In dieser Studie beschreiben wir eine reproduzierbare Methode, die den Erwerb von PRP für Tierversuche4ermöglicht.
Da Verletzungen von Sehnen häufig bei Sportlern und körperliche Arbeiter beobachtet werden, den Heilungsprozess und reduziert die Zeit zur Erholung zu verstärken sind von großem Interesse5. Neue Behandlungsmethoden, die oft entwickeln beinhalten die Verwendung von Wachstumsfaktoren und die Verwaltung der PRP ist eine einfache und minimal-invasive Möglichkeit, eine Mischung aus endogene Wachstumsfaktoren4liefern.
Mehrere in-vitro- oder Tier-Studien haben gezeigt, dass die Gabe von Plasma, enthält ein hohes Maß an Thrombozyten, durch biologische Mediatoren lösen Sehnen- und Bänderverletzungen Reparatur anregen kann, durch die Freigabe biologische Mediatoren6 ,7,8,9. Darüber hinaus haben andere Studien gezeigt, dass PRP Typ I und III Kollagen-Synthese in Sehne Zellen9,10,11, stimulieren kann. Es wurde auch vermutet, dass PRP kann die Aktivierung der Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) zu verringern und verringern somit den Abbau der Matrix. Zellen, die den Entzündungsprozess beteiligt sind können MMP-9, produzieren, die in Gewebe Umbau (physiologische und pathologische) durch Entzündung12induziert eine Rolle spielt.
Basierend auf diesen Informationen, vermutet wir, dass eine einzige PRP-Injektion in den geschnittenen Achillessehnen von Ratten die Recovery-Prozess und die mechanische Festigkeit des reparierten Gewebes verbessert werden könnte. Dies wird durch die Messung der biomechanischen Eigenschaften der Heilung sehnen während des Wiederherstellungsprozesses und durch histologische und molekularbiologische Analysen zur Bewertung von Kollagen Umbau in das neu gebildete Gewebe getestet. Ziel der Studie war zu beobachten, wenn die Heilung der geschnittenen Achillessehnen eine einmalige Injektion von allogenen PRP beeinflussen könnten.
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Protocol
Pflege und Umgang mit den Tieren durchgeführt wurden, gemäß dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren zubereitet von der National Academy of Sciences und vom National Institute of Health (USA) veröffentlicht. Europäische und nationale Gesetzgebung wurden sorgfältig befolgt.
(1) tierische Vorbereitung
- Verwenden Sie 132 2 - Monate alte männliche Sprague-Dawley Ratten mit einem Gewicht von 320-450 g (120 Ratten für Experimente) und 12 Ratten für die Blutabnahme, Abbildung 1. Basierend auf Dell13, 15 Ratten für jede Gruppe war genug für eine Leistung von 0,8 (80 % Chance auf statistischen Signifikanz zu finden, wenn die angegebene Wirkung vorhanden ist).
- Haus alle Ratten in klassischen Käfigen unter Isolierung Bedingungen in einer konventionellen Anlage ausgestattet mit eine Wechselstation. Anstiften Sie Zucht in einem Rack IVC (individuell belüfteten Käfig) mit SPF (spezifische Erreger frei) Ratten speziell gekauft wird.
- Verwenden Sie die folgenden Wohnverhältnisse: Temperaturbereich von 19-24 ° C; Relative Luftfeuchtigkeit: 40-60 %; Belüftung: Häufigkeit der Lufterneuerung: 10-15 pro h; Hell/Dunkel-Zyklus: 12 h - 12 h.
- Sterilisieren Sie alle festsetzende Ausrüstung und verwenden Sie bestrahlten Bettwäsche. Systemisch implementieren Sie Käfig Bereicherung durch die Platzierung von sterilen Karton Tabletts und Handtücher in den Käfigen.
- Zugriff auf die Zone unter beengten Verhältnissen: neue Labor Mantel, Maske, Handschuhe, Schuhe und Haare Motorhaube am Eingang.
- Führen Sie Kolonie Systemüberwachung auf Sentinel Tiere auf schmutzige Bettwäsche auf Jahresbasis gemäß der Felasa14 Empfehlungen für konventionelle Anlagen untergebracht. Halten Sie vier bis fünf Tiere pro Käfig, mit dem entsprechenden bestrahlt Diät und bieten angesäuert Wasser Ad Libitum. Täglich zu überwachen.
- Übertragen Sie Ratten für chirurgische Eingriffe bei der Filterung Top Käfige zu den chirurgischen Zimmern 2 h vor der Operation gewählt.
2. chirurgische Verfahren
- Vorbereiten der chirurgischen Instrumente: feine Schere, eine Zange, blutstillende Klemmen und einen Nadelhalter. Im Verlauf der Verfahren tragen Sie Handschuhe, Maske, eine Kapuze und einen Laborkittel.
- Teilen Sie die Ratten nach dem Zufallsprinzip in zwei Gruppen (PRP und Kochsalzlösung).
- Nehmen Sie die Ratte aus seinem Käfig und wiegen Sie es. Verwenden Sie nummerierten Ohrmarken, um die Ratten zu identifizieren. Um Austrocknung der Augen zu vermeiden, legen Sie Wassertropfen auf der Hornhaut.
- Betäuben Sie die Ratte intraperitoneal mit Xylazin (10 mg/kg Körpergewicht) und Ketamin (80 mg/kg Körpergewicht). Um Anesthetization zu bestätigen, legen Sie die Tiere unter kardiorespiratorischer überwachen und prüfen, ob Augenreflexe.
- 50 µL von Buprenorphin subkutan zu injizieren (0,01-0,05 mg/kg alle 8-12 h) im Halsbereich als Schmerzmittel.
- Rasieren Sie linken hinteren Gliedmaßen mit einen elektrischen Rasierer zu, mit 3 abwechselnd Peelings von Iso-Betadine / (verdünnte 01:10) Alkohollösung desinfizieren Sie und legen Sie die Ratte auf einer warmen Unterlage (20 ° C) unter dem sezierenden Mikroskop. Legen Sie die Ratte auf seitlichen Dekubitus mit dem Bein in eine überlegene Position betrieben werden. Halten Sie die Pfote mit chirurgischen Zangen.
- Mit der Schere, machen Sie einen kleinen seitlichen Einschnitt (20-25 mm) in der Haut rund um die linke Achillessehne und sezieren Sie die Faszie mit einer feinen Schere die Achillessehne Komplex (Abbildung 2a) aussetzen.
- Entfernen Sie die Plantaris Sehne mit einer Schere (Abb. 2 b).
- Schneiden Sie die Achillessehne transversal 5 mm proximal zu seiner schließen einsetzen und entfernen Sie einen 5 mm langen Teil mit einer Schere. Die Sehne (Abbildung 2 c, 2d) nicht Naht.
- Naht der Faszie und dann die Haut mit resorbierbaren Faden eine overjet Naht (fortlaufende Naht) zu tun. Monofile Fäden einsetzbar sowie Feuchtigkeitstransport von der Haut in den chirurgischen Eingriff zu verhindern.
- Legen Sie die Ratte unter einer Wärmelampe bis wach und legen Sie dann die Ratte zurück in einen Käfig (58 x 38 cm) (Nota Bene: keine Immobilisierung verhängt).
(3) PRP Vorbereitung15
- Die Spender-Ratten mit Xylazin (10 mg/kg Körpergewicht) und Ketamin (80 mg/kg Körpergewicht) durch intraperitoneale Injektion zu betäuben. Die PRP-Injektion wird 2 h postoperativ ohne jede Re-Narkose durchgeführt.
- Subkutan, 50 µL von Buprenorphin als Schmerzmittel zu injizieren.
- Vollblut zu sammeln (20 mL pro Ratte, letzte Blutung) durch Herzpunktion in sterilen Röhrchen mit 3,2 % Natriumcitrat gepuffert (0,109 M Antikoagulans). Dann einschläfern Sie die Ratte durch intrakardiale Injektion.
- Zentrifugieren Sie um PRP zu erhalten, das Blut für 10 min bei 150 x g und Raumtemperatur. Diese geringe Anfangsgeschwindigkeit Zentrifugationsschritt ergibt zwei Phasen: eine untere Phase, bestehend aus roten Blutkörperchen (Erythrozyten), die ca. 80-90 % des Gesamtvolumens ausmacht und eine obere Phase, bestehend aus Platelet-Rich Plasma (PRP) (in der Regel 10-20 % des Blutes (Beispiel).
- Sammeln Sie sanft PRP (obere Phase) in eine sekundäre Plastikschlauch mit einer Pipette aus Kunststoff übertragen. Da die Schnittstelle zwischen PRP und roten Blutkörperchen sehr locker ist, nicht zu nah an die Schnittstelle pipette. Bei sachgerechter Handhabung, verunreinigen RBCs in PRP soll unter 0,05 x 103 Zellen / µL. verwerfen die restliche untere Phase und das primäre Blutsammelröhrchen.
- Bestimmen Sie das Volumen der gesammelten PRP und Messen Sie die Thrombozytenzahl auf einem Hämatologie-Analysator. Diese Werte sind erforderlich für Berechnungen, Thrombozyten Konzentration im nächsten Schritt einzustellen. Ein Blutbild ist auch nützlich, bewerten mögliche Kontamination mit Erythrozyten und Leukozyten. Thrombozyten Konzentration in PRP in diesem Stadium ist in der Regel 1 – 1,5 X106/µL.
- Führen Sie eine zweite Zentrifugation des PRP für 10 min bei 1.000 x g und Raumtemperatur. Dieses High-Speed-Zentrifugationsschritt ergibt eine lockere Thrombozyten-Pellet und einen Überstand bestehend aus autologen Thrombozyten-Armen Plasma (PPP). Verwendung in Schritt 3.6, ermittelten Werte berechnen das Volumen der Überstand verworfen werden, um die PRP konzentrieren und erreichen eine Endkonzentration von 2,5 X106/µL.
- Sanft sammeln des Überstands (PPP) in eine sekundäre Plastikschlauch mit einer Kunststoff Transferpipette, verlassen etwa zwei Drittel der das Endvolumen in Schritt 3.7 berechnet. Wie die Kugel locker ist, ist eine bedeutende Menge von Thrombozyten verloren, wenn PPP verworfen wird, daher potenziell reduzieren die gewünschte Endkonzentration.
- Sorgfältig Aufschwemmen der Thrombozyten-Pellet mit der restlichen Überstand durch sanfte wiederholte pipettieren. Messen Sie die Thrombozytenzahl auf diesem konzentrierten PRP. Falls erforderlich, fügen Sie das entsprechende Volumen der autologen PPP, die endgültige Zielkonzentration zu erreichen.
Hinweis: Verwenden Sie die PRP innerhalb von 3 Stunden der Vorbereitung. - Fügen Sie 50 µL CaCl2 (11 mmol 10 mL) pro mL PRP Plättchen aktivieren.
- Injizieren Sie 50 µL frische PRP oder Kochsalzlösung mit einer Nadel 21G direkt in den genähten Einsatzort ca. 1 h nach der Zubereitung. Während dieser Zeit aufbewahren Sie PRP bei Zimmertemperatur.
- Verfolgen Sie die funktionelle Wiederherstellung der Ratten aufmerksam in den Tagen nach der Operation und vor der Entnahme der Achillessehne.
4. Entfernung der Achillessehne und biomechanische Tests16
- 5, 15 oder 30 Tage später5, wiegen die Ratte. Dann, mit Xylazin (10 mg/kg Körpergewicht) und Ketamin (80 mg/kg Körpergewicht) durch intraperitoneale Injektion zu betäuben.
- Subkutan, 50 µL von Buprenorphin als Schmerzmittel zu injizieren. Entfernen Sie die Sehne vor Einbußen bei dem Tier um die physiologischen Voraussetzungen für so lange wie möglich zu halten.
- Linken hinteren Gliedmaßen zu rasieren und die Ratte unter dem sezierenden Mikroskop zu platzieren. Legen Sie die Ratte auf seitlichen Dekubitus mit dem Bein in eine überlegene Position betrieben werden. Halten Sie die Pfote mit den Fingern.
- Machen Sie einen kleinen Schnitt (10 mm) in der vorherigen Einsatzstelle und verlängern Sie, bis die Triceps Suralis ausgesetzt ist.
- Um die heilende Achillessehne zu entfernen, schneiden Sie schließen Knochen transversal 5-10 mm distale auf seine Achillessehne Befestigung. Dann sezieren Sie einen Teil des Triceps Suralis, die an der Achillessehne (Abb. 3 b) angebracht ist. Der Muskel-Teil muss groß genug sein, in den Cryo-Kiefer (Abb. 3 c-d) passen. Legen Sie die Probe sofort in den Cryo-Kiefer mit Pinzette (Abbildung 3e).
- Nach dem Entfernen des Muskel-Sehnen-Knochen-komplexes, einschläfern Sie die Ratte durch intrakardiale Injektion mit Nembutal (200 mg/kg). Bestätigen Sie Tod durch das Fehlen von Herzrhythmus und Atmung für 15 min Bewertung.
- Legen Sie die Muskel-Einheit in der Oberkiefer (Abbildung 3e), schließen Sie es und legen Sie es vertikal in eine Universal-Prüfmaschine (106,2 kN, Abbildung 3a). Fixieren Sie dann die Knochen zwischen den unteren Klemmen der Maschine (Abbildung 3f).
- Fügen Sie flüssigen Stickstoff in beiden Oberkiefer Becken Muskel, Einfrieren, so dass es ein Vielfaches stabiler als die Sehne und sich nicht während der Zugversuch verformt hinzu.
- Wenn die eiskalte Zone die Metallklemme Grenze erreicht, beginnen Sie Zugversuch, also die Sehne wird seine Struktur bewahren. Legen Sie die Verschiebung bei der Maschine mit einer konstanten Geschwindigkeit von 1 mm/s bis zum Bruch. Notieren Sie die Zugfestigkeit (UTS) in Newton (N) auf einem Computer gegeben.
- Berechnung der Querschnittsfläche, zwei Kameras senkrecht aufeinander, bilden eine elliptische Form, und fotografieren.
- Um den Unterschied in der Querschnittsfläche der Heilung sehnen berücksichtigen, normalisieren Sie sich die UTS auf eine Flächeneinheit (N pro Quadratmillimeter), die die mechanische Beanspruchung durch das Gewebe erlebt darstellt.
(5) histologische Analyse
Hinweis: 15 Sehnen der einzelnen Gruppen wurden histologische Analyse.
- Nach der Entnahme, tauchen die Achillessehne sofort in 4 % Paraformaldehyd, seine Struktur zu bewahren (1 mm des Gewebes ist pro Stunde, fixiert, so dass die Zeit der Fixierung je nach Größe der Sehne variiert).
- Ersetzen Sie die Paraformaldehyd durch 70 % igem Ethanol, und lassen Sie die Probe für mindestens eine Nacht in dieser Lösung.
- Legen Sie die Sehne in einem kleinen Plastikbehälter mit Löchern und stellen Sie die Behälter in eine frische 70 % Ethanol-Lösung für 1 h.
- Ort der Container in 95 % igem Ethanol für 1 h wiederholen.
- Ort der Container in 100 % igem Ethanol für 1 h wiederholen.
- Ort der Container in 100 % Xylol für 1 h wiederholen.
- Nun legen Sie die Kunststoff-Behälter, der die Sehne enthält, in flüssigem Paraffin (56 ° C) und lasse es über Nacht.
- Eine Einbettung Station (ausgestattet mit flüssigem Wachs, eine Herdplatte und eine kalte Platte) verwenden, wählen Sie eine metallische Form, die am besten die Gewebeprobe, und füllen Sie ihn mit ein wenig flüssiges Paraffin, so dass der Boden bedeckt ist.
Hinweis: Richten Sie die Probe um vertikale Abschnitte am Mikrotom zu erhalten. - Wenn die Probe korrekt positioniert ist, füllen Sie die Form mit flüssigem Paraffin und platzieren Sie es auf die Kältemaschine. Lassen Sie für mindestens 15 min. abkühlen.
- Entfernen Sie aus der Paraffinblock und legen Sie es für mindestens 30 min auf Eis.
- Mehrere saubere Objektträger vorbereiten und ihnen einige Tröpfchen deionisiertes Wasser aufsetzen.
- Am Mikrotom schneiden Sie die Blöcke in Abschnitten von 5 µm (nur Nutzung Abschnitte aus dem mittleren Teil der Sehne) und platzieren Sie Abschnitt auf einer Folie.
- Legen Sie die Folien in einem Trockenschrank bei 65 ° C für mehrere Minuten, so dass das Paraffin gerade anfängt zu schmelzen, um das Gewebe auf das Glas kleben.
- Legen Sie die Folien mit Paraffin Abschnitte in einem Stück Halter.
- Jetzt deparaffinize und das Gewebe zu rehydrieren, indem man sie in den folgenden aufeinanderfolgenden Bädern:
8 min in Xylol (Bad 1)
4 Minuten in Xylol (Bad 2)
2 min in 100 % igem ethanol
2 min in 95 % igem ethanol
2 min in 70 % igem ethanol
2 min in entionisiertem Wasser - Legen Sie für Hämatoxylin-Eosin-Färbung das Gewebe in die folgenden Lösungen.
- Tauchen Sie das Gewebe für 8 min. in Hämatoxylin-Lösung (1 g Hämatoxylin Monohydrat, 0,2 g KIO3, 50 g AIK (SO4)2.12h2O; 200 mL Glycerin; mit destilliertem Wasser auf 1 L einzustellen).
- Tauchen Sie das Gewebe für 8 Minuten unter fließendem Leitungswasser.
- Tauchen Sie das Gewebe für 30 s in Eosin-Lösung (0,25 % Eosin in 100 mL destilliertem Wasser mit 200 µL unverdünnte Essigsäure).
- Tauchen Sie das Gewebe für 2 Minuten unter fließendem Leitungswasser.
- Gehen Sie für die Masson Trichrome Färbung folgendermaßen vor.
- Legen Sie nach Rehydratation die Abschnitte in einem Behälter mit Eisen Alaun (0,5 g (NH4) Fe (SO4)2.12h2O 10 mL H2O) und schließen Sie den Container. Für 3 min bei 280 W in der Mikrowelle erhitzen.
- Lassen Sie es für eine Minute abkühlen und anschließend mit entionisiertem Wasser spülen.
- Legen Sie die Abschnitte in einem geschlossenen Behälter mit Regaud Hämatoxylin Lösung (0,5 g Hämatoxylin gelöst in 50 mL H2O bei 50 ° C, fügen Sie 5 mL 95 % Ethanol und 5 mL Glycerin), erhitzen Sie es für 90 s bei 280 w.
- Mit entionisiertem Wasser spülen.
- Legen Sie die Abschnitte in einer Lösung von Pikrinsäure (bei Sättigung in Methanol) für 3 min, 5 min unter fließendem Leitungswasser spülen Sie aus und legen Sie es in entionisiertem Wasser für ein paar Sekunden.
- Jetzt legen Sie die Abschnitte in saures Fuchsin (0,5 g in 50 mL H2O enthaltend 0,25 mL der unverdünnten Essigsäure) für 5 s und spülen unter fließendem Wasser, bis die Farbe verschwindet.
- Inkubieren Sie in den Abschnitten Phosphomolybdic Säurelösung (0,5 g in 50 mL H2O) für 5 min, legen sie für ein paar Sekunden in entionisiertem Wasser.
- Legen Sie die Abschnitte in hellgrün (0,5 g in 50 mL H2O enthaltend 0,25 mL der unverdünnten Essigsäure) Lösung für weitere 5 min und legen Sie sie unter fließendem Wasser, bis die Farbe verschwindet.
- Jetzt wieder das Gewebe zu entwässern.
- Tauchen Sie den Abschnitt für 1 min in 70 % igem Ethanol.
- Tauchen Sie den Abschnitt für 1 min in 95 % igem Ethanol.
- Tauchen Sie den Abschnitt für 1 min in 100 % igem Ethanol.
- Tauchen Sie den Abschnitt für 1 min in Xylol (Bad 1).
- Tauchen Sie den Abschnitt für 1 min in Xylol (Bad 2).
- Entfernen Sie, die Abschnitte ohne zuviel Xylol und geben Sie einen Tropfen Eindeckmittel auf die Probe.
- Ein Deckglas an der Spitze (ohne Bläschen) und lassen Sie es mindestens 2 h aushärten.
- Hydrolyseneigung 5 histologische Abschnitte (jeweils einer anderen Sehne) der einzelnen Gruppen in 6 N HCl für 3 h und bestimmen die Konzentration von Kollagen durch die Messung von Hydroxyprolin als Index in 5 µm ungefärbten Abschnitten.
- Die Ergebnisse von den Abschnitt Bereich mit der Software des Herstellers zu normalisieren.
- Einige der Abschnitte mit Licht grün färben, zu visualisieren und zu quantifizieren fibrillären Kollagen durch Computer-gestützte Analyse zu beflecken.
- Scannen Sie in den Abschnitten zu und konvertieren Sie die Bilder in Nuancen von Grau über die Software IrfanView. Verwenden Sie die Software für semi-Quantifizierung (z.B.eine Menge).
(6) molekulare Bewertung
- Nach Sehnenriss, die während der mechanischen Tests auftritt, nehmen Sie die Proben, Snap Einfrieren in flüssigem Stickstoff und bei-80 ° C (PRP und Kochsalzlösung)17lagern.
- Verwenden Sie eine kommerzielle Gesamt-RNS-Kit, um total RNA17zu isolieren.
- Messen Sie die Expression von Kollagen (Col I und Col III), Matrix-Metalloproteinasen (MMP 3, MMP-2 und MMP-9) und Tenomodulin (TNMD) durch RT-PCR17,18.
- Der Ausdruck Niveaus der mRNA auf das Niveau von 28 s19zu normalisieren.
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Representative Results
Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardabweichung des Mittelwerts ausgedrückt und mit Varianzanalyse (ANOVA) verglichen. Ein zwei-Wege-ANOVA und post-Hoc test de Scheffé, das ist ein parametrischer Test, verwendet wurden.
Die Zugfestigkeit (UTS) erforderlich, um einen Bruch der nicht verletzten Achillessehnen von Ratten provozieren betrug 42,0 ± 5,7 N (n = 10). Die Zugfestigkeit deutlich erhöht (p < 0,0001) in beiden Gruppen nach Tag 5. Vergleicht man beide Gruppen, die UTS lag in der PRP-Gruppe jederzeit gemessen, vor allem am Tag 15 und 30. Durch die Messung der Querschnittsfläche der Sehnen, die entfernt wurden, bevor Sie irgend biomechanische Auswertung (11,4 ± 5,5 mm2 für nicht verletzten Sehnen), wurde festgestellt, dass am 5. Tag, es in der Kochsalzlösung behandelten Gruppe größer war. Aber am Tag 15 und 30, die Querschnittsfläche war größer in der PRP-Gruppe, obwohl diese Menge variabler im Vergleich zu der Kochsalzlösung behandelten Gruppe (Abbildung 4 und Abbildung 5).
Die histologische Auswertung der Sehnen, mit Hämatoxylin-Eosin-Färbung, zeigte eine hohe Zellularität an Tag 5, die danach gesunken (kein signifikanter Unterschied wurde zwischen Kochsalzlösung und PRP-Gruppe beobachtet). Die Masson Trichrome Färbung zeigte eine höhere Präsenz von fibrillären Kollagen in der PRP-Gruppe am Tag 5 und 15. Aber die Intensität der Färbung war ähnlich in beiden Gruppen 30 Tage nach der Injektion (Abbildung 6). Die semi-Quantifizierung durch die Färbung der Proben mit Licht grün zeigte, dass bei Tag 5 und 15, die Intensität höher in der PRP-Gruppe (statistisch nicht signifikant), aber am 30. Tag, gab es keinen Unterschied zwischen den beiden Gruppen beobachtet.
Die Daten wurde durch Messung der Menge an eine Aminosäure Hydroxyprolin, die spezifisch für Kollagen, bestätigt die histologische semi-Quantifizierung ist normiert (5.Tag: größeren Wert in PRP-Gruppe). Die Kollagen-Konzentration war nicht stabil in der PRP-Gruppe aber stabilisierte sich auf 30 Tage in den beiden Gruppen. Das Volumen der Kallus wurde gemessen und wurde festgestellt, dass in den ersten Phasen des Heilungsprozesses PRP-behandelten Tieren deutlich größer werden. Zusammengenommen bedeuten diese Ergebnisse, dass die PRP-Injektion in die verletzte Sehne bewirkt, eine bedeutende Anzahl von fibrillären Kollagen dass zu hinterlegen.
Messung die Expression von mehreren Molekülen, die zeigten, dass in nicht-verletzte sehnen, Col III und TNMD wurden heute in geringerem betragen (2,5 - 3,0 Mal) als in Heilung Sehnen am 15. Tag, aber es gab keinen Unterschied in Col ich Ausdruck zwischen den Gruppen. MMPs waren ebenfalls anwesend 12-fold höherer Konzentration in der Heilung sehnen. Darüber hinaus am 30. Tag, gab es ein deutlichen Anstieg des COL1A1 der PRP-Gruppe, und eine positive Korrelation zwischen COL1A1 Ausdruck und die UTS wurde gefunden. In beiden Gruppen wurde festgestellt, dass Col III zum Ausdruck kam, in einer hohen Menge von Tag 1 bis Tag 14, bevor es sank (für beide Gruppen gleich). MMP-9-Konzentration in beiden Gruppen nicht ändern aber MMP-2 und MMP-3 waren anwesend bei höheren Konzentrationen während der Einheilphase. Am Tag 5, TNDM drückte sich in einen höheren Betrag in die PRP (p < 0,03) aber dann zwischen 15 und 30 Tage verringert.
Abbildung 1: experimentelles Design der Studie. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Chirurgischer Eingriff.
(a) die Sehne nach der Entfernung der umgebenden Faszie Komplex.
(b) Entfernung der Sehne Plantaris.
(c) Entfernung eines Teils der Achillessehne.
(d) die 2 sehnen, die entfernt wurden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Biomechanische Tests
(a) Universalprüfmaschine (106,2 kN).
(b) die Muskel-Sehnen-Knochen-Komplex, die in den Cryo-Kiefer befestigt wird.
(c) obere und Cryo-Unterkiefer
(d) oben und Cryo-Unterkiefer
(e) der Komplex setzen in den Cryo-Kiefer
(f) die geschlossenen Cryo-Kiefer mit der Muskel-Sehnen-Knochen-Komplex in der Maschine befestigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Biomechanische Testergebnisse
Zugfestigkeit, ausgedrückt in Newton (N) in Steuerung und PRP-Gruppen zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Operation. Es war ein Anstieg von UTS beide Gruppen im Laufe der Zeit mit der PRP-Gruppe zeigen deutlich höhere Werte bei 15 bis 30 Tage nach der Operation.
Fehlerbalken definiert die Standardabweichung (SD). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: Biomechanische Testergebnisse
Transversale Bereich der Sehne in Quadratmillimeter (mm2) ausgedrückt. Die Querschnittsfläche war bis 15. Tag in der PRP-Gruppe deutlich größer. Danach war der Abschnitt in beiden Gruppen ähnlich.
Fehlerbalken definiert die Standardabweichung (SD). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6: Histologische Ergebnisse
Repräsentative Längsprofile der Achillessehne aus Kontrolle und PRP-Gruppen, befleckt mit Masson Trichrome. Maßstabsleiste = 100 µm. Gibt es eine stärkere grüne Färbung in der Sehne der PRP-Gruppe am 5. Tag. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Thrombozyten sind wichtig für die frühen entzündlichen Phase der Heilungsprozess Sehne. Wenn diese Plättchen verbindlich Gewebe oder Faktoren, die Gerinnung induzieren ausgesetzt sind, werden sie Wachstumsfaktoren freigesetzt, die in α-Granulat gefüllt sind. Durch diese Interaktion extrazelluläre Matrix Makromoleküle sind dazu und mesenchymale Zellen vermehren. Thrombozyten haben auch eine chemotaktische Aktivität auf Vorläuferzellen in der Durchblutung, Verbesserung der Angiogenese und anregende zellulare Unterscheidung6,20.
Biomechanische Tests durchgeführt mit einer Klemmvorrichtung speziell für ex-Vivo Zugprüfung von der Achillessehne in Ratten15. Die Cryo-Kiefer ermöglicht das Einfrieren des Muskels durch Zugabe von flüssigem Stickstoff und schließen Knochen, die den unteren Teil der Probe ist, direkt in der Maschine befestigt ist. Es ist sehr wichtig für den Zugversuch zu starten, wenn der Muskel völlig starr, aber die Sehne immer noch flexibel ist. Diese Technik vermeidet Gewebeschäden und bewahrt die mechanische Integrität. Auch ist diese Technik einfach, sicher, nicht kompressive und nachweislich reproduzierbar, wie mehrere Studien haben diese Methode4,15verwendet.
Um die mechanische Ergebnisse zu unterstützen, wurde einige sehnen histologische Bewertung unterzogen. Die Hämatoxylin-Eosin-Färbung zeigt einen tollen Überblick über das vernarbte Gewebe und gibt allgemeine Informationen über die Menge der Zellen und Kollagen vorhanden. Auch die Messung von Hydroxyprolin ist nützlich, da es eine Aminosäure, die nur im Kollagen ist und die Objektivierung der histologischen Daten ermöglicht. Allerdings ist es notwendig eine Masson Trichrome Färbung, zu tun, da es sehr viel genauere Informationen über die Abscheidung und Konzentration von Kollagen Fasern4zeigt.
Obwohl das Niveau von Kollagen III mRNA in PRP behandelt sehnen wurde nicht verändert, am 30. Tag mRNA von Col ich in einer höheren Konzentration in den verletzten Sehnen mit PRP behandelt war. Zuvor hatte sich gezeigt, dass PRP mischt sich mit der Verbreitung von Makrophagen und die Produktion von IL-121, die somit eine übermäßige entzündliche Reaktion in den frühen Phasen der heilende Prozess11vermeiden konnte. Es ist möglich, dass PRP stimuliert die Proliferation, Aktivierung der Stoffwechselwege und die Umwandlung von mesenchymalen Zellen in Tenocytes, die aktiv sind.
Hohe Konzentrationen von TNDM in den Sehnen der PRP-Gruppe zeigen, dass die injizierten Moleküle könnten gewinnen Zellen in der Blutbahn zirkulierenden und eine Differenzierung gegenüber den Tenocyte Phänotyp11 induzieren. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass nur eine Injektion von PRP in einem gerissenen Achillessehne einen positiven Effekt auf die frühen Heilungsphase hat und zu eine höhere mechanische Festigkeit führt.
Mehreren präklinische Studien haben bereits gezeigt, dass PRP verbessert den Heilungsprozess und die verschiedenen Wachstumsfaktoren haben spezifische Maßnahmen während dieses Prozesses22. Mazzocca und sein Team zeigten, dass PRP stimuliert die Zellproliferation in Muskeln, Knochen und sehnen. Aus verschiedenen Zubereitungen stark konzentrierten PRP ohne irgendwelche weißen Blutkörperchen erwies sich als die effektivste Behandlung23. McCarrell Et Al. haben Sie ein ähnliches Experiment, testen verschiedene Zubereitungen von PRP mit verschiedenen Konzentrationen von PRP und weißen Blutkörperchen auf Pferd sehnen. Zubereitungen, die eine mittlere Konzentration von Thrombozyten und eine hohe Konzentration von weißen Blutkörperchen führte zu eine höhere Freisetzung von Pro-inflammatorischen Zytokinen wie IL-1ß und TNFa und unteren Kollagen-Synthese. Mischungen mit einer hohen Konzentration von Blutplättchen und weißen Blutkörperchen führte auch zu einer Erhöhung von inflammatorischen Zytokinen aber gehemmt Kollagen-Synthese. Zusammenfassend bedeutet dies, dass wenn die Thrombozyten Konzentration zu hoch ist, Kollagen-Synthese und Zelle Stoffwechsel verlangsamt sind24. Boswell Et Al. bestätigt diese Ergebnisse25. Die effizienteste PRP-Vorbereitung würde somit eine Thrombozyten Konzentration niedriger als 106 Thrombozyten/µL und keine weißen Blutkörperchen enthalten.
Ein großer Vorteil der Verwendung von PRP ist Autogenity. Obwohl in unserer Studie haben wir allogene PRP durch Verzicht auf Spender Ratten um eine ausreichende Menge Blut zu haben. Darüber hinaus würde Blutentnahme aus der betriebenen Ratten sie zuviel zu schwächen. Eine weitere Einschränkung dieser Studie ist, dass die Brüche akute und durchgeführten auf gesunde sehnen, das ist nicht immer der Fall bei Menschen, wie die Sehnen oft wegen vorheriger Degeneration Bruch. Dieses Modell basiert auf scharfe Sehnenverletzungen, können für degenerative Sehnenpathologien keine endgültigen Schlüsse gezogen werden.
Mit dieser Methode gibt es einige wichtige Schritte zu erinnern, die erste Option wird die Vorbereitung der PRP, die als reproduzierbar sein sollte wie möglich. Ein weiterer wichtiger Schritt ist das chirurgische Vorgehen: das Entfernen von Sehnen und Muskeln und Sehnen Komplex sollte getan werden, reproduzierbar, Verzerrungen zu vermeiden. Zu guter Letzt die Testvorbereitung biomechanische: Flüssigstickstoff wird hinzugefügt, um den Muskel zu frieren, und es ist sehr wichtig, dass die Sehne nicht in diesem Prozess eingefroren ist weil es zu verzerrten Ergebnissen führen kann wie die Steifigkeit der Sehne verändert werden würde. Dies ist auch eine Einschränkung der Studie, da gibt es kein standardisiertes Protokoll zu gewährleisten, dass die Sehne Elastizität nicht geändert wird.
Wir Basis unsere Methode auf der Methode von Virchenko Et al.entwickelt. 26, sondern es mit der Cryo-Kiefer schützt die Sehne gegen äußere Aggressionen induziert durch Klemmen angepasst. Der große Vorteil dieser Methode ist, dass es reproduzierbar ist, auch wenn es noch nicht standardisiert ist. Es gibt eine Vorstellung davon, wie Sehnenverletzungen beim Menschen behandelt werden konnten, obwohl Experimente mit Ratten nicht immer gut auf die Behandlung von menschlichen Verletzungen zu übersetzen. Es ist wahrscheinlich, dass eine angepasste Version dieser Methode nützlich ist bei der Behandlung dieser Verletzungen in der Zukunft, unterstützt durch die Tatsache, dass es einfach zu bedienen ist, einen relativ niedrigen Kosten hat und weniger invasiv als andere Methoden ist.
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Disclosures
Keine Interessenkonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Studie wurde unterstützt durch Standard de Liège und Lejeune - Lechien gewährt der Leon Frédéricq Mittel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xylazine (Xyl-M) | VMD | none | anesthetic |
| Ketamin (Jétamine 1000 CEVA) | CEVA Santé Animale | none | anesthetic |
| Buprenorphin (Vetergésic Multidosis) | ALSTOE | none | Painkiller |
| iso-Betadine | MEDA-Pharma | none | Desinfectant |
| resorbable yarn Vicryl 6/0 | Johnson & Johnson | ||
| Nembutal | CEVA Santé Animale | none | Anesthetic |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Preserves structure of the tissue |
| Isopropanol 100% | VWR | 20,922,364 | |
| Ethanol 95% | VWR | 20,823,362 | |
| Xylene | VWR | 28973.363 | |
| Paraffin | VWR | LEIC3950.1006 | |
| Hematoxylin | Millipore | 1.15938.0025 | Colorant |
| Eosin | Millipore | 1.15935.0100 | Colorant |
| Eukitt | Sigma-Aldrich | 3989 | Mounting Medium |
| CaCl2 |
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