Summary
이 프로토콜 아 킬 레 스 힘 줄의 일부를 제거한 후 수용자 혈소판 풍부 혈장 (PRP) 또는 염 분 해결책 주입 되어 쥐에 있는 힘 줄 치유의 평가 과정을 설명 합니다. 힘 줄 치유의 진행은 분석의 다른 종류를 사용 하 여 여러 개의 시간 지점에서 계산 됩니다.
Abstract
이 문서에서는 PRP 긍정적으로 영향을 미칠 수 힘 줄 치유를 관찰 하는 데 사용 하는 실험 절차를 설명 합니다. 따라 4 주요 단계가 있다: 킬;에서 병 변 유발 PRP를 준비 하 고 주사 (또는 염 분 해결책); 제거 힘; 그리고 수행 평가 biomechanical, 분자, 그리고 조직학. 각 단계에서 모든 절차와 방법을 설명 세부 사항, 그래서 그들은 쉽게 재생 될 수 있다 합니다.
아 킬 레 스 힘 줄 수술 sectioned 5-m m 긴 섹션의 (제거) 되었습니다. 이후에, PRP 또는 염 류 용액 공부 PRP에 힘 줄의 치료에 긍정적인 영향을 주입 했다. (총 120 쥐가이 연구에 사용 되었다) 40 동물의 3 개 그룹 2 하위 그룹으로 세분화 했다: PRP 주사 그룹 및 식 염 수 주입 제어 그룹. 쥐가 증가 하는 시간 포인트 (그룹 a: 5 일;에 희생 했다 그룹 b: 15 일; 그룹 c: 30 일)와 힘 줄이 제거 되었습니다. 90 힘 줄 수술 biomechanical transcriptomic 분석을 수행 하기 전에 테스트 하 고 30 나머지 힘 줄 조직학 분석을 제출 했다.
Introduction
응고, 염증 성 프로세스 및 혈소판의 면역 변조 역할은 잘 알려진1입니다. 최근에, 그들은 또한 회복 속성2,3는 증명 되었습니다. 실제로, 다양 한 cytokines 및 성장 요인 (VEGF, PDGF, TGF B, IGF-난, 그리고 HGF) degranulation 동안 혈소판에 의해 발표. 이러한 성장 요인 홍보 신생, 조직 리 모델링, 그리고 상처 치유 (뼈, 피부, 근육, 힘 줄)2. 격리 방법 높은 혈소판 농도 포함 된 혈소판 리치 플라즈마 (PRP)을 생성 centrifuging 혈액 헌 혈 (3 사이 10 시간 기준 농도 혈액). 실제로, 다양 한 PRP 준비 기술 동일한 최종 제품을 제공할 수 없습니다. 지금 까지는,이 문제에 아무 국제 일반 계약이 되었습니다. 전반적으로, PRP 치료 tendinopathy, 발바닥의 근 막 염, 관절염, 등 없앤4만성 musculoskeletal 조건에 대 한 매력적인 치료 옵션 일 수 있었다. 그것은 개선 하 고 뼈 임 플 란 트 삽입 후 치유를 가속 구강 수술 및 implantology4 에서 처음으로 사용 되었다. 이 연구에서 우리는 동물 실험4에 대 한 PRP의 수집 수 있는 재연 가능한 방법도 설명 합니다.
힘 줄의 병 변을 자주 운동과 육체 노동자에서 관찰 된다, 이후 큰 관심5는 치유 과정와 따라서 복구 시간을 단축. 자주 개발 하는 새로운 치료 방법을 성장 인자를 사용 하 여 포함 하 고 PRP의 내 인 성 성장 요인4의 조화를 제공 하는 간단 하 고 최소한 침략 적 방법 이다.
여러 생체 외에서 또는 동물 연구 생물학 중재자를 방출 하 여 혈소판, 높은 수준의 포함 된 플라즈마의 생물학 중재자6 를 방출 하 여 힘 줄과 인 대 복구를 자극 수 증명 7,,89. 또한, 다른 연구 PRP 유형 I 및 III 콜라겐 합성 힘 줄에9,,1011세포 자극 수 있습니다 나타났습니다. 그것은 또한 건의 되었다 PRP 매트릭스 metalloproteinases (MMPs)의 활성화를 감소 하 고 따라서 매트릭스의 저하를 줄일 수 있습니다. 염증 과정에 관련 된 셀 MMP-9, 조직 리 모델링 (생리와 pathologic) 염증12에 의해 유도 된에서 역할을 생성할 수 있습니다.
이 정보를 바탕으로, 우리가 쥐의 sectioned 아 킬 레 스 힘 줄에 단일 PRP 주사 복구 과정과 복구 조직의 기계적 강도 향상 시킬 수 있을 것을 가정 했다. 이 복구 프로세스 동안 치유 힘 줄의 biomechanical 속성을 측정 하 여 및 새로 형성된 된 조직에서 개장 하는 콜라겐을 평가 하는 조직학 및 분자 분석을 수행 하 여 테스트 됩니다. 연구의 목표는 경우 수용자 PRP의 단일 주사를 영향을 미칠 수 sectioned 아 킬 레 스 힘 줄의 치유를 관찰 했다.
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Protocol
배려 및 처리는 동물의 배려를 위한 가이드에 따라 수행 된 실험 동물의 사용 국립 과학 아카데미의에 의해 준비 하 고 출판에 의해 국립 연구소의 건강 (미국). 유럽 및 국가 입법 신중 하 게 따라 했다.
1. 동물 준비
- 132 2 개월 된 남성 Sprague-Dawley 쥐 320-450 g (120 쥐 실험에 대 한) 및 12 쥐 혈액 샘플링, 그림 1에 대 한 무게를 사용 합니다. Dell13을 바탕으로, 각 그룹에 대 한 15 쥐 0.8 (80% 지정된 효과 있으면 통계적 의미를 찾는 기회)의 힘에 대 한 충분 했다.
- 변화 역을 갖춘 기존 시설에 격리 상태에서 고아 한 장에 모든 쥐를 집. 특히 구매 되는 SPF (특정 병원 체 무료) 쥐와 IVC (개별적으로 통풍이 케이지) 랙, 번 식 선동.
- 사용 다음 주택 조건: 19-24 ° C에서 온도 범위 상대 습도: 40-60%; 환기: 공기 갱신의 주파수: h; 당 10-15 명암 주기: 12h-12 h.
- 모든 배우면 장비를 소독 하 고 비친된 침구를 사용 합니다. 체계적으로 감 금 소 안쪽 살 균 종이 쟁반, 수건을 배치 하 여 케이지 농축을 구현 합니다.
- 제한 된 조건 하에서 영역에 대 한 액세스 허용: 입구에 새 실험실 외 투, 마스크, 장갑, 신발, 및 머리 모자.
- 기존 시설에 대 한 Felasa14 권장 사항에 따라 연간 기준 더러운 침구에 지 내게 하는 센 티 넬 동물에 식민지 상태 모니터링 실시 합니다. 유지 적절 한 조사와 감 금 소 당 4 ~ 5 동물 다이어트 제공 물 광고 libitum산성화. 매일 모니터링 합니다.
- 쥐 외 과적 수술 방에 수술 전에 2 h 최고의 새 장을 필터링에 대 한 선출을 전송 합니다.
2. 수술
- 수술 기구 준비:가 위, 클램프, 2 개의 hemostatic 클램프 및 바늘 홀더. 모든 절차 동안 장갑, 마스크, 후드, 그리고 실험실 코트를 착용.
- 무작위로 두 그룹 (PRP와 염 분 해결책)으로 쥐를 나눕니다.
- 그것의 감 금 소에서 쥐를가지고 고 그것의 무게. 쥐를 식별 하기 위해 번호가 매겨진된 귀 태그를 사용 합니다. 눈의 건조를 방지 하려면 각 막에 물방울을 배치 합니다.
- Intraperitoneally xylazine (체중의 10mg/kg)과 케 타 민 (몸 무게의 80 mg/kg)와 쥐 anesthetize Anesthetization 확인, 심장-호흡 모니터링 및 어떤 눈 반사에 대 한 확인에서 동물을 배치 합니다.
- Buprenorphine의 50 µ L를 피하 주사 (0.01-0.05 mg/kg 매 8-12 h) 진통제로 목 부분에.
- 전기 면도기로 왼쪽된 뒷 다리를 면도 하 고 3 iso-betadine/알코올 (희석된 1:10) 솔루션의 스크럽을 번갈아 소독 해 현미경 따뜻한 패드 (20 ° C)에 쥐를 놓습니다. 우량한 위치에서 작동 될 다리와 옆 decubitus에 쥐를 놓습니다. 발 수술 집게로 잡으십시오.
- 가 위를 사용 하 여 왼쪽된 아 킬 레 스 힘 줄을 둘러싼 피부에 작은 측면 절 개 (20-25 m m)를 확인 하 고 아 킬 레 스 힘 줄 복잡 한 (그림 2a)를 노출 하도록 좋은 위를 사용 하 여 근 막 해 부.
- 가 위 (그림 2b)와 plantaris 힘 줄을 제거 합니다.
- 아 킬 레 스 힘 줄 종횡 5mm의 발뒤꿈치 뼈 삽입 인접 고가 위를 사용 하 여 5-m m의 긴 부분을 제거. (그림 2c, 2d) 힘 줄을 봉합 하지 마십시오.
- Overjet 봉합 (연속 봉합) 하 고 resorbable 원사로 근 막과 피부를 봉합. Monofilament 봉합 수술 절 개에 피부에서 wicking 방지 하기 위해 뿐만 아니라 사용할 수 있습니다.
- 깨어 때까지 열 램프에서 쥐를 놓고 케이지 (58 x 38 cm) 다시 쥐를 배치 (Nota 베네: 없음 immobilization 부과).
3. PRP 준비15
- Xylazine (10 mg/kg의 몸 무게)와 케 타 민 (몸 무게의 80 mg/kg) 기증자 쥐 복 주입에 의해 anesthetize. PRP 주사 2 h postoperatively 어떤 다시 마 취 없이 수행 됩니다.
- 진통제로 buprenorphine의 50 µ L를 피하 주사.
- 전체 혈액 수집 (쥐, 당 20 mL 최종 출혈) 심장 찔린 무 균 튜브에 의해 나트륨 시트르산 버퍼링 포함 된 3.2% (0.109 M, 응고 제). 다음 intracardiac 주입 하 여 쥐를 안락사.
- PRP를, 150 x g 및 실 온에서 10 분 동안 혈액을 원심. 두 가지 단계를 산출 하는이 초기 저속 원심 분리 단계: 적혈구 (Rbc) 전체 볼륨의 약 80-90%를 차지 하는 구성 된 낮은 위상 및 혈소판이 풍부한 혈장 (PRP) (일반적으로 10-20%는 혈액의 구성 된 위 단계 샘플)입니다.
- 부드럽게 PRP (상위 단계) 플라스틱 전송 피 펫을 사용 하 여 보조 플라스틱 튜브에 수집 합니다. PRP와 적혈구 사이의 인터페이스는 매우 느슨한, 할 하지 플라스틱 너무 가까이 인터페이스. 103 셀 x 0.05 미만 이어야 제대로 처리, PRP에 Rbc 오염 / µ L. 버리고 나머지 낮은 단계와 기본 혈액 컬렉션 튜브.
- 혈액학 분석기에 혈소판 수를 측정 및 수집된 PRP의 볼륨을 결정 합니다. 이러한 값은 다음 단계에서 혈소판 농도 조정 계산에 대 한 필요. 혈액 세포 수 Rbc와 잠재적인 오염 평가에 유용 하 고이 단계에서 PRP에 Wbc 혈소판 농도 일반적으로 1-1.5 x106/µL.
- 1000 x g 및 실 온에서 10 분에 대 한 PRP의 두 번째 원심 분리를 수행 합니다. 이 고속 원심 분리 단계 생성 느슨한 혈소판 펠 릿과 상쾌한 헌 혈소판 가난한 플라스마 (PPP) 구성 된 합니다. 3.6, 단계에서 결정 하는 값을 사용 하 여 계산 하는 PRP를 집중 하 고 2.5의 최종 농도 도달 삭제 됩니다 상쾌한의 볼륨 x106/µL.
- 부드럽게 단계 3.7에서에서 계산한 최종 볼륨의 약 2/3를 떠나 플라스틱 전송 피 펫을 사용 하 여 보조 플라스틱 튜브에 상쾌한 (PPP)를 수집 합니다. 펠 릿은 느슨한, PPP 삭제, 따라서 잠재적으로 최종 원하는 농도 감소 하면 혈소판의 상당한 수량을 손실 됩니다.
- 신중 하 게 부드러운 반복 pipetting으로 나머지 상쾌한와 혈소판 펠 릿 resuspend. 이 집중된 PRP의 혈소판 수를 측정 합니다. 필요한 경우 최종 대상 농도 도달 헌 PPP의 적절 한 볼륨을 추가 합니다.
참고: 준비의 3 h 이내 PRP를 사용 합니다. - CaCl2 의 50 µ L 추가 (11 mEq 10 mL) PRP는 혈소판 활성화의 mL 당.
- 준비 후 봉합 작업 사이트 약 1 시간에 직접 21g 바늘으로 50 µ L 신선한 PRP 또는 생리 식 염 수 주사. 이 시간 동안 실 온에서 PRP를 유지.
- 및 모니터링 하는 쥐의 기능 복구 밀접 하 게 일 동안 수술 후 아 킬 레 스 힘 줄의 제거 하기 전에.
4. 아 킬 레 스 힘 줄과 Biomechanical 테스트16 의 제거
- 5, 15, 또는 30 일 이후의5, 쥐의 무게. 그런 다음, 복 주입에 의해 xylazine (10 mg/kg의 몸 무게)와 케 타 민 (몸 무게의 80 mg/kg) anesthetize.
- 진통제로 buprenorphine의 50 µ L를 피하 주사. 가능한 오래 위한 생리 조건을 유지 하는 동물을 희생 하기 전에 힘 줄을 제거 합니다.
- 왼쪽된 뒷 다리를 면도 하 고 해 현미경으로 쥐를 놓습니다. 우량한 위치에서 작동 될 다리와 옆 decubitus에 쥐를 놓습니다. 손가락으로 발을 잡으십시오.
- 이전 작업 사이트에 작은 절 개 (10mm)를 확인 하 고 삼 두 근 suralis 노출 될 때까지 확장.
- 치유 아 킬 레 스 힘 줄을 제거 하려면 잘라 발뒤꿈치 뼈 뼈 5-10 mm 종횡 원심 킬 첨부 파일. 다음 아 킬 레 스 힘 줄 (그림 3b)에 붙어 있는 삼 두 근 suralis의 일부를 해 부. 근육 부분 cryo-턱 (그림 3 c-d)에 맞게 충분히 큰 있다. 곳을 알아내는-턱에 샘플을 즉시 배치 집게 (그림 3e)를 사용 하 여.
- 제거한 후에 근육 힘 줄 뼈 단지, Nembutal (200 mg/kg)로 intracardiac 주입 하 여 쥐를 안락사. 심장 리듬과 15 분 동안 호흡의 부재를 평가 하 여 죽음을 확인 합니다.
- (그림 3e) 위 턱에 근육 단위를 배치, 그것을 닫고 보편적인 시험기에 수직으로 배치 (106.2 kN, 그림 3a). 다음 (그림 3 층)의 더 낮은 클램프 사이의 뼈를 수정 합니다.
- 모두 위 턱 분 지 근육, 힘 줄 보다 엄격한 크기 순서 이며 인장 시험 동안 변형 하지 않습니다 있도록 동결에 액체 질소를 추가 합니다.
- 냉동 영역에 금속 클램프 테두리를 도달 하는 때, 그래서 힘 줄 구조 유지 됩니다 인장 시험을 시작 합니다. 파열까지 1 m m/s의 일정 한 속도로 컴퓨터의 변위 속도 설정 합니다. 뉴턴 (N)에 컴퓨터에 주어진 궁극 장력 강도 (UTS)를 기록 합니다.
- 단면적을 계산 하려면 두 개의 카메라, 서로 게 수직 타원형 모양 형성 놓고 사진을 찍을.
- 치유 힘 줄의 단면적에 차이 담당 하는 조직에 의해 발생 하는 기계적 스트레스를 나타내는 단위 지역 (제곱 밀리미터 당 N), UTS 정상화.
5. 조직학 분석
참고: 각 그룹의 15 힘 줄 조직학 분석을 받았다.
- 그것의 제거 후, 잠수함의 구조를 유지 하기 위해 4 %paraformaldehyde 즉시 아 킬 레 스 힘 줄 (조직의 1 mm은 시간, 그래서 고정 고정 시간은 힘의 크기에 따라 다릅니다).
- paraformaldehyde 70% 에탄올으로 대체 하 고이 솔루션에서 최소한 1 박 샘플을 둡니다.
- 구멍으로 작은 플라스틱 용기에 힘 줄을 놓고 1 시간을 위한 신선한 70% 에탄올 솔루션에서 해당 컨테이너를 배치 합니다.
- 장소 1 헤에 대 한 95% 에탄올에 컨테이너를 반복 합니다.
- 장소 1 헤에 대 한 100% 에탄올에 컨테이너를 반복 합니다.
- 장소 1 헤에 대 한 100% 크 실 렌에서 컨테이너를 반복 합니다.
- 지금 힘 줄을 포함 하는 플라스틱 컨테이너, 액체 파라핀 (56 ° C)에 놓고 그것을 떠나 하룻밤.
- 포함 역 (녹은 왁 스, 핫 플레이트, 그리고 감기 플레이트 장착)를 사용 하 여 조직 샘플에 가장 적합 한 금속 형을 선택 하 고 그렇게 기지 덮여 있다 약간 액체 파라핀 그것을 채워.
참고:는 톰에서 수직 섹션을 샘플을 찾으시는. - 샘플 위치에 올바르게 때 액체 파라핀을 가진 형을와 냉장 기계에 그것을 배치. 그것은 적어도 15 분 동안 진정 하자.
- 파라핀 블록에서 제거 하 고 적어도 30 분 동안 얼음에 그것을 배치.
- 여러 깨끗 한 유리 슬라이드를 준비 하 고 그들에 이온된 물이 몇 방울을 넣어.
- 톰에서 5 µ m (힘 줄의 중간 부분에서만 사용 섹션)의 섹션에 블록을 잘라 하 고 슬라이드에 섹션을 놓습니다.
- 파라핀 그냥 유리에 조직 본드 녹기 시작 몇 분, 65 ° C에서가 열 오븐에서 슬라이드를 놓습니다.
- 파라핀 섹션에 슬라이스 홀더를 포함 하는 슬라이드를 놓습니다.
- 지금 deparaffinize 하 고 다음 연속 욕조에 그것을 배치 하 여 조직 rehydrate:
크 실 렌 (욕실 1) 8 분
크 실 렌 (욕조 2) 4 분
100% 에탄올에 2 분
95% 에탄올에 2 분
70% 에탄올에 2 분
이온된 수에 2 분 - 되며 오신 얼룩, 다음 솔루션에는 조직 장소.
- 젖어 되며 솔루션 (1 g 되며 토스, 0.2 g KIO3, 50 g AIK (이렇게4)2.12H2O; 200 mL 글 리세 린; 증류수 1 l 조정)에서 8 분 조직.
- 젖어 수돗물을 실행 하는 아래의 8 분에 대 한 조직.
- 30에 대 한 조직 담가 오신 솔루션 (undiluted 아세트산의 200 µ L을 포함 하는 증류수 100 mL에 0.25% 오신) s.
- 젖어 수돗물을 실행 하는 아래 2 분에 대 한 조직.
- Masson의 Trichrome 얼룩에 대 한 다음이 단계를 따르십시오.
- 재, 후 철 졸업생 (0.5 g (NH4) Fe (이렇게4)2.12H2O 10 mL H2O)와 컨테이너에 섹션을 배치 하 고 컨테이너를 닫습니다. 280 W 전자 레인지에 3 분 위해 그것을 열.
- 잠시 진정 하 고 이온을 제거 된 물으로 그것을 씻어 보자.
- Regaud의 되며 솔루션 닫힌된 컨테이너에 섹션을 배치 (0.5 g 되며 50 mL H2O에서 50 ° C에에서 용 해 후 추가 5 mL 95% 에탄올 및 글 리세 린 5 mL), 90 대 열에서 W. 280 s
- 이온된 수로 그것을 씻어.
- 섹션 3 분 (에서 메탄올에 채도) picric 산 솔루션, 수돗물을 실행 하는 아래 5 분 동안 씻어 놓고 몇 초 동안 이온된 수에 배치.
- 지금 5 s와 린스 산 fuchsin (0.5 g 50 mL H2O undiluted 아세트산의 0.25 mL를 포함)에 섹션을 배치 염료 사라질 때까지 수돗물을 실행.
- Phosphomolybdic 산 성 솔루션 (0.5 g 50 mL H2O) 5 분에 대 한 섹션을 품 어, 이온된 수에 몇 초 동안 그것을 배치.
- 또 다른 5 분에 대 한 밝은 녹색 (0.5 g 50 mL H2O undiluted 아세트산의 0.25 mL를 포함) 솔루션 섹션을 놓고 염료 사라질 때까지 수돗물을 실행 하는 아래에 배치 합니다.
- 이제는 조직 다시 탈수.
- 1 분에 70% 에탄올에 대 한 섹션을 젖어.
- 95% 에탄올에 1 분에 대 한 섹션을 젖어.
- 100% 에탄올에 1 분에 대 한 섹션을 젖어.
- 크 실 렌 (욕실 1)에서 1 분에 대 한 섹션을 젖어.
- 크 실 렌 (욕조 2)에서 1 분에 대 한 섹션을 젖어.
- 너무 많이 크 실 렌을 제거 하지 않고 섹션을 제거 하 고 샘플 설치 매체의 한 방울을 넣어.
- (어떤 거품 도발) 없이 coverslip 상단에 넣어 하 고 적어도 2 시간에 대 한 강화 하자.
- 5 조직학 (각각 다른 힘 줄)의 섹션 3 h 6 N HCl에 각 그룹은 고 5 µ m 흠 없는 섹션에서 인덱스 하이드를 측정 하 여 콜라겐의 농도 결정 합니다.
- 제조업체의 소프트웨어를 사용 하 여 섹션 영역에 의해 결과 정상화.
- 빛 그린 시각화 하 고 컴퓨터를 이용한 분석에 의해 원 콜라겐 계량 얼룩과 얼룩 섹션의 일부.
- 섹션을 검사 하 고 변환 IrfanView 소프트웨어를 사용 하 여 회색의 뉘앙스에 그림. 소프트웨어를 사용 하 여 반 정량화 (예를 들어, 수량 1 개)에 대 한.
6. 분자 평가
- 힘 줄 파열, 기계적인 테스트 하는 동안 발생 후 샘플, 스냅 액체 질소에 그들을 동결-80 ° C (PRP와 염 분 해결책)17에 그들을 저장 하 고.
- 상업 총 RNA 키트를 사용 하 여 전체 RNA17분리.
- 콜라겐의 식 측정 (열 나 고 열 III), 매트릭스 Metalloproteinases (MMP-2, MMP-3 및 MMP-9), 및 RT-PCR17,18여 tenomodulin (TNMD).
- 정상화 28S19의 수준에 mRNA의 식 수준.
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Representative Results
결과 뜻의 평균 ± 표준 편차로 표현 하 고 분산 분석 (ANOVA)와 비교 했다. 양방향의 ANOVA와 임시 게시 테스트 데 있어, 파라메트릭 테스트, 사용 되었다.
쥐의 비 부상 아 킬 레 스 힘 줄의 파열을 자극 하는 데 필요한 궁극 장력 강도 (UTS)는 42.0 ± 5.7 N (n = 10). 인장 강도 크게 증가 (p < 0.0001) 5 일 후 두 그룹에서. 두 그룹을 비교는 UTS 높았다 PRP 그룹에서 언제 든 지 측정, 특히 15-30 일. Biomechanical 평가 (11.4 ± 5.5 m m2 에 대 한 부상 아닌 힘 줄)을 진행 하기 전에 제거 된 힘 줄의 단면적을 측정 하 여 5 일에 했다 염 분 처리 그룹에서 더 큰 발견 했다. 하지만 하루 15와 30, 단면적 PRP 그룹에서 큰이 염 치료 그룹 (그림 4 및 그림 5)에 비해 더 많은 변수를 했지만.
되며 오신 얼룩를 사용 하 여 힘 줄의 조직학 평가 이후에 감소 하루 5, 높은 cellularity 보였다 (큰 차이 생리 식 염 수와 PRP 그룹 사이 관찰 되었다). Masson의 Trichrome 하루 5와 15에 PRP 그룹에서 원 콜라겐의 더 높은 존재 했다 얼룩. 그러나 주사 (그림 6) 후 30 일 그룹은 얼룩의 강도 둘 다에서 유사 했다. 빛 녹색 샘플 얼룩이 여 반 정량화 보여주었다 5-15, 하루에 강도 높은 PRP 그룹 (통계적으로 중요 한)에 하지만 30 일에 차이가 두 그룹 사이 관찰 되었다.
아미노산, 콜라겐, 조직학 반 정량화를 확인 하는 하이드의 양을 측정 하 여 데이터 정규화 되었는지 (5 일: PRP 그룹에서 더 큰 값). 콜라겐 농도 PRP 그룹에 안정 하지만 두 그룹에서 하루 30에서 안정 되었다. 굳은 살의 볼륨 측정 하 고 치유 과정의 첫 번째 단계 동안 PRP 치료 동물에서 상당히 큰 것으로 판명 되었습니다. 함께 찍은, 이러한 결과 힘 줄 부상된에 PRP 주사 하면 입금 원 콜라겐의 중요 한 금액을 의미 합니다.
그러나 식 수준 아닌 부상 힘 줄, 열 III TNMD에서에서 보여주는 여러 가지 분자의 측정 했다 현재에는 낮은 금액 (2.5-3.0 배)에 비해 열에 차이가 없었다 하루 15에서 힘 줄을 치유 나 그룹 사이 식. MMPs 치유 힘 줄에 12-fold 더 높은 농도에 참석 했다. 또한, 30 일에 PRP 그룹에 COL1A1의 상당한 증가 그리고 COL1A1 표현과 UTS 사이 긍정적인 상관 관계가 발견 됐다. 두 그룹에서 그것 (동일한 두 그룹에 대 한)을 감소 하기 전에 열 III까지 하루 14, 1 일에서 높은 수량에서 표현 했다 발견. MMP-9 농도 두 그룹에서 변경 하지 않은 하지만 MMP-2 및 MMP-3 치료 기간 동안 높은 농도에 참석 했다. 5 일에 TNDM는 PRP에 더 높은 금액에 표현 되었다 (p < 0.03) 하지만 다음 날 15와 30 사이 감소.
그림 1: 연구의 실험적인 디자인. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 외과 절차입니다.
(a) 힘 줄 주변 근 막의 제거 후 복잡 한.
(b) 제거 plantaris 힘 줄의.
(c) 아 킬 레 스 힘 줄의 섹션의 제거.
(d)는 2 힘 줄 제거 된. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: Biomechanical 테스트
(a) 보편적인 시험기 (106.2 kN).
(b) 곳을 알아내는-턱 뼈에 고정 될 것 이다 그는 근육 힘 줄 뼈 복잡.
(c) 위 낮은 곳을 알아내는 턱
(d) 위 낮은 곳을 알아내는-턱
(e) 복잡 한 곳을 알아내는 턱에 넣어
(f) 폐쇄 cryo-턱 근육 힘 줄 뼈 복잡 한 기계로 고정을 포함. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: Biomechanical 테스트 결과
수술 후 관리 및 다른 시간 지점에서 PRP 그룹에 뉴턴 (N)를 표현 하는 인장 강도. 시간이 지남에, 수술 후 15 ~ 30 일에서 상당히 높은 값을 보여주는 PRP 그룹 두 그룹 UTS의 증가 했다.
오차 막대는 표준 편차 (SD)를 정의합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: Biomechanical 테스트 결과
제곱 밀리미터 (m m2)에 표현 하는 힘 줄의 가로 영역입니다. 단면적 15 일까 상당히 PRP 그룹에 큰 했다. 이후에, 섹션 두 그룹 전부에서 유사 했다.
오차 막대는 표준 편차 (SD)를 정의합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: 조직학 결과
제어 및 PRP 그룹에서 아 킬 레 스 힘 줄의 대표적인 경도 섹션 Masson의 Trichrome와 스테인드. 눈금 막대 = 100 µ m. 강한 녹색 얼룩 PRP 그룹의 힘 줄에 하루 5에 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
혈소판은 프로세스를 치유 하는 힘 줄의 염증 초기 단계에 대 한 필수적입니다. 이러한 혈소판 바인딩 조직이 나 응고 유발 요인에 노출 되는 때 그들은 α과 립에 방류 하는 성장 인자를 발표할 예정 이다. 이 상호 작용으로 인해 세포 외 매트릭스 고분자 synthetized 고 중간 엽 세포 증식. 혈소판에는 또한 신생 및 세포질 감 별 법6,20을 자극, 혈액 순환 조상 셀에 혈 활동이 있다.
이루어졌다 biomechanical 테스트 테스트용 비보 전 인장 쥐15킬의 특별히 만든 클램핑 장치를 사용 하 여. Cryo-턱 액체 질소를 추가 하 여 근육의 수 고는 시료의 아래쪽은, 발뒤꿈치 뼈 뼈, 직접 컴퓨터에 고정 됩니다. 그것은 매우 때 근육이 완전히 엄밀한, 그러나 힘 줄은 여전히 유연 인장 시험을 시작 하는 것이 중요입니다. 이 기술은 조직 손상 방지 하며 기계적 무결성을 유지 합니다. 또한이 기술은 이다, 보안, 압축, 간단 하 고 명백 하 게 재현할 수로15에이 방법4,사용 하는 여러 연구.
기계적 결과 지원 하기 위해 일부 힘 줄 조직학 평가 받았다. 얼룩이 지는 hematoxylin에 오신 치유 조직에 대 한 훌륭한 개요를 표시 하 고 셀과 콜라겐 존재의 수량에 대 한 일반 정보를 제공. 또한, hydroxyprolin의 측정만 콜라겐에서 발견 아미노산으로 유용 하며 조직학 데이터의 objectivation 그러나, 그것은 증 착 및 콜라겐 섬유4의 농도 대 한 훨씬 더 상세한 정보를 보여줍니다 Masson의 Trichrome 얼룩, 할 필요가 있다.
콜라겐의 수준 III mRNA에는 PRP 치료 비록 힘 줄 변경, 하루 30 열 PRP로 치료 부상된 힘 줄에 더 높은 농도에 존재 했다의 mRNA. 이전 그것은 PRP 세포의 확산 및 일리노이-121, 따라서 치유 과정11의 초기 단계에서 과도 한 염증 반응을 피할 수 있는의 생산을 방해 표시 되었습니다 했다. PRP 확산, 변화 통로의 활성화 및 활성 tenocytes로 중간 엽 세포의 변화를 자극 하는 것이 가능 하다.
PRP 그룹의 힘 줄에 TNDM의 높은 농도 주입된 분자 세포 혈 류에서 순환 유치을 하 tenocyte 표현 형11으로 분화를 유도 수 나타냅니다. 함께 찍은, 이러한 결과 파열된 아 킬 레 스 힘 줄에 PRP의 단 하나 주입 초기 치료 단계에 긍정적인 영향 및 높은 기계적 강도를 리드를 보여 줍니다.
PRP 치료 과정을 향상 그리고 다른 성장 인자가 과정22동안 특정 작업을가지고 여러 전 임상 연구 이미 나타났습니다. Mazzocca와 그의 팀 PRP 근육, 뼈, 힘 줄 세포 증식을 자극 한다는 것을 보여주었다. 다른 준비에서 모든 백혈구 없이 강하게 집중된 PRP 가장 효과적인 치료23입증. McCarrell 외. 말 힘 줄에 PRP와 백혈구의 다른 농도 포함 하는 PRP의 여러 준비 테스트 비슷한 실험을 했 어. 혈소판의 중간 농도 및 백혈구의 높은 농도 포함 하는 준비 IL 1ß TNFa, 및 낮은 콜라겐 합성 같은 프로 염증 성 cytokines의 더 높은 버전으로 이끌어 냈다. 혈소판과 백혈구의 높은 농도 가진 혼합물 또한 염증 성 cytokines의 저해 콜라겐 합성 증가를 이끌었다. 결론적으로 혈소판 농도가 너무 높은 경우, 콜라겐 합성 및 세포 물질 대사는 감속24하는 것이 즉. 보즈 웰 외. 이러한 연구 결과25를 확인 했다. 따라서 가장 효율적인 PRP 준비 없는 백혈구 106 혈소판 / µ L 보다 낮은 혈소판 농도 포함 됩니다.
PRP를 사용 하 여의 주요 장점은 autogenity입니다. 우리의 연구에서 우리는 충분 한 양의 혈액 기증자 쥐를 희생 하 여 수용자 PRP 사용. 또한, 운영된 쥐에서 혈액을 복용 것 약하게 그들 너무 많이. 이 연구의 또 다른 한계는 모든 파열 급성 그리고 건강 한 힘 줄에는 항상 인간의 경우 힘 줄은 종종 이전 변성으로 인해 파열로. 이 모델은 날카로운 힘 줄 부상에 기반으로, 아니 확실 한 결론 퇴행 성 tendinopathies에 대 한 그릴 수 있습니다.
이 메서드를 사용 하 여 기억, prp로 재현할 수 있어야 준비 가능한 되 고 첫 번째 몇 가지 중요 한 단계가 있습니다. 또 다른 중요 한 단계는 수술: 제거 힘 줄과 근육-힘 줄의 복잡 한 어떤 편견을 피하기 위해 재현 방식에서 수행 합니다. 마지막으로, biomechanical 테스트를 위한 준비: 액체 질소 동결, 근육에 추가 되 고 그 힘 줄은 동결 되지이 과정에서 한쪽으로 치우친된 결과 가져올 수 있기 때문에 힘 줄 경직 변경 될 것으로 매우 중요 하다. 이 힘 줄의 탄력은 수정 되지 않습니다 보장 하기 위해 더 표준화 된 프로토콜 이므로 연구의 한계 이기도 합니다.
우리 Virchenko 외에의해 개발 하는 방법을 우리의 방법을 기반으로 합니다. 26, 하지만 클램프에 의해 유도 된 외부 침략에 대 한 힘을 보호 하는 곳을 알아내는 턱을 사용 하 여 적응. 이 방법의 주요 장점은 그것이 재현할 수 경우에 그것은 아직 표준화 되지입니다. 비록 실험 쥐로 항상 인간의 부상 치료에 잘 번역 하지 않습니다 그것은 인간, 힘 줄 부상 수 처리 하는 방법에 대 한 아이디어를 제공 합니다. 그것은이 방법의 적응 시킨된 버전 그 부상 치료 미래에, 사실 그것은 사용 하기 쉽고가 상대적으로 저렴 한 비용, 다른 방법 보다 적게 침략 적 지원에 유용할 수 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언.
Acknowledgments
이 연구는 스탕다르 드 리에주에 의해 지원 되었다 고 Lejeune-Lechien 레온 Frédéricq 자금 부여 합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xylazine (Xyl-M) | VMD | none | anesthetic |
| Ketamin (Jétamine 1000 CEVA) | CEVA Santé Animale | none | anesthetic |
| Buprenorphin (Vetergésic Multidosis) | ALSTOE | none | Painkiller |
| iso-Betadine | MEDA-Pharma | none | Desinfectant |
| resorbable yarn Vicryl 6/0 | Johnson & Johnson | ||
| Nembutal | CEVA Santé Animale | none | Anesthetic |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Preserves structure of the tissue |
| Isopropanol 100% | VWR | 20,922,364 | |
| Ethanol 95% | VWR | 20,823,362 | |
| Xylene | VWR | 28973.363 | |
| Paraffin | VWR | LEIC3950.1006 | |
| Hematoxylin | Millipore | 1.15938.0025 | Colorant |
| Eosin | Millipore | 1.15935.0100 | Colorant |
| Eukitt | Sigma-Aldrich | 3989 | Mounting Medium |
| CaCl2 |
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