Summary
Denne protokol beskriver evalueringsprocessen healing sener i rotter, der har været injiceres med allogen trombocyt rige plasma (PRP) eller saltvandsopløsning efter at fjerne en del af achillessenen. Forløbet af senen healing der evalueres på flere tidspunkter ved hjælp af forskellige typer af analyser.
Abstract
I denne artikel beskrives de eksperimentelle procedurer bruges til at observere, hvis PRP positivt kan påvirke senen healing. Der er 4 vigtigste skridt til at følge: inducerer en læsion i achillessenen; forberede PRP og injicere det (eller at saltvandsopløsning); Fjern sener; og udføre biomekaniske, molekylære og histologiske evalueringer. På hvert trin, alle de procedurer og metoder er beskrevet i detaljer, så de kan blive gengivet nemt.
Achillessenen har været kirurgisk sektioneret (fjernelse af en 5 mm lange afsnit). Bagefter, PRP eller saltvandsopløsning blev sprøjtet for at undersøge, om PRP har en positiv virkning på heling af senen. Tre grupper af 40 dyr (ialt 120 rotter blev brugt i denne undersøgelse) blev opdelt i 2 undergrupper: PRP injektion gruppe og en saltvand injektion styre gruppen. Rotter blev ofret på at øge tiden point (gruppe A: 5 dage; Gruppe B: 15 dage; Gruppe C: 30 dage) og sener blev fjernet. 90 sener undergik biomekaniske test før du udfører transkriptom analyse og 30 resterende sener blev forelagt for histologiske analyse.
Introduction
Koagulation, inflammatoriske processer, og rollerne immunitet graduering af blodplader er velkendt1. Det er for nylig påvist, at de også har genoprettende egenskaber2,3. Faktisk, forskellige cytokiner og vækst faktorer (VEGF, PDGF, TGF-B, IGF-I, og HGF) er udgivet af trombocytter under degranulering. Disse vækstfaktorer fremme angiogenese, væv remodellering og sår healing (knogler, hud, muskel, sene)2. Centrifugering autologt blod producerer trombocyt rige plasma (PRP) som indeholder høj trombocyt koncentrationer afhængigt af metoden isolation (mellem 3 og 10 gange blod baseline koncentrationer). Faktisk, forskellige PRP forberedelse teknikker kan ikke give en identisk slutproduktet. Indtil nu, er der ingen internationale generel enighed om dette spørgsmål. Samlet set kunne PRP være en attraktiv terapeutiske mulighed for behandling af kroniske bevægeapparatet betingelser, såsom tendinopati, plantar fasciitis, slidgigt og ophelet4. Det blev brugt for første gang i oral kirurgi og implantologi4 til at forbedre og fremskynde knogle heling efter at placere et tandimplantat. I denne undersøgelse beskriver vi en reproducerbar metode, der giver mulighed for erhvervelse af PRP for dyreforsøg4.
Da læsioner af sener er ofte observeret i sportsfolk og fysiske arbejdstagere, øge den helbredende proces og dermed reducere tid til nyttiggørelse er af stor interesse5. Nye behandlingsmetoder, der udvikler ofte indebærer brug af vækstfaktorer, og administrationen af PRP er en enkel og minimalt invasiv måde at levere en blanding af endogene vækstfaktorer4.
Flere in vitro- eller dyre undersøgelser har vist, at administrationen af plasma, der indeholder et højt niveau af blodplader, ved at frigive biologiske mæglere, kan stimulere sener og ledbånd reparation ved at frigive biologiske mæglere6 ,7,8,9. Andre undersøgelser har desuden vist, at PRP kan stimulere type I og III kollagen syntese i senen celler9,10,11. Det er også blevet foreslået, at PRP kan mindske aktivering af matrix metalloproteinases (MMPs) og derfor reducere nedbrydningen af matrixen. Celler, der er involveret i inflammation proces kan producere MMP-9, som spiller en rolle i væv remodellering (fysiologiske og patologiske) forårsaget af betændelse12.
Baseret på disse oplysninger, antager vi at en enkelt PRP injektion i sektioneret Achilles sener af rotter kan forbedre opsving oparbejde og den mekaniske styrke af den reparerede væv. Dette er testet ved at måle de biomekaniske egenskaber af de helbredende sener under gendannelsesprocessen og udfører histologiske og molekylære analyser for at evaluere kollagen remodellering i den nydannede væv. Formålet med undersøgelsen var at observere, hvis en enkelt injektion af allogene PRP kunne påvirke heling af sektioneret Achilles sener.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Pleje og håndtering af dyr blev udført i overensstemmelse med retningslinjer for pleje og anvendelse af forsøgsdyr udarbejdet af National Academy of Sciences og offentliggjort af nationale Institutes of Health (USA). Europæiske og nationale lovgivning blev fulgt nøje.
1. animalsk forberedelse
- Bruge 132 2 - måneder gamle mand Sprague-Dawley rotter vejer 320-450 g (120 rotter for eksperimenter) og 12 rotter til udtagning af blodprøve, figur 1. Baseret på Dell13, 15 rotter for hver gruppe var nok til en strøm af 0,8 (80% chance for at finde Statistisk signifikans, hvis den angivne effekt findes).
- Hus alle rotter i klassisk bure under isolation betingelser i en konventionel facilitet udstyret med en skiftende station. Anstifte avl i en IVC (individuelt ventileret bur) rack, med SPF (specifikke patogen gratis) rotter er specielt købt.
- Brug de følgende boligforhold: temperaturområde fra 19-24 ° C; relativ fugtighed: 40-60%; ventilation: hyppigheden af air fornyelse: 10-15 per Hansen; lys/mørke cyklus: 12 h - 12 h.
- Sterilisere alle anbringelse i bur udstyr og bruge bestrålede sengetøj. Systemisk gennemføre bur berigelse ved at placere sterile pap plader og håndklæder inde i bure.
- Tillad adgang til zonen under begrænsede betingelser: nye lab coat, maske, handsker, fodtøj og hår bonnet ved indgangen.
- Udføre koloni sundhedsovervågning på kontroldyr opstaldet på beskidt sengetøj på årsbasis, ifølge Felasa14 anbefalinger for konventionelle faciliteter. Holde fire til fem dyr pr. bur med den relevante bestrålet kost og give Forsuret vand ad libitum. Overvåge dagligt.
- Overføre rotter valgt for kirurgisk indgreb i filtrering top bure til de kirurgiske værelser 2 h før operation.
2. kirurgisk Procedure
- Forberede de kirurgiske instrumenter: fine saks, en klemme, to hæmostatisk klemmer og indehaver af en nål. Under alle procedurerne, bære handsker, en maske, en hætte, og en lab coat.
- Tilfældigt opdele rotter i to grupper (PRP og saltvandsopløsning).
- Tage rotten ud af sit bur og vejer det. Bruge nummererede øremærker til identifikation af rotter. For at undgå udtørring af øjnene, skal du placere waterdrops på hornhinden.
- Bedøver rotte intraperitoneal med xylazin (10 mg/kg legemsvægt) og ketamin (80 mg/kg legemsvægt). For at bekræfte anesthetization, placere dyr under hjerte-respiratorisk overvågning og tjek for eventuelle øje reflekser.
- Injicér 50 µL af buprenorphin subkutant (0,01-0,05 mg/kg hver 8-12 h) i hals-området som et smertestillende middel.
- Barbere den venstre bagben lemmer med en elektrisk barbermaskine, desinficere det med 3 skiftevis scrubs af iso-betadine/alkohol (fortyndet 1:10) løsning og placere rotten på en varm pad (20 ° C) under et dissekere mikroskop. Placere rotten på lateral decubitus med ben at blive opereret i en overlegen position. Hold pote med kirurgisk pincet.
- Ved hjælp af saks, gøre en lille lateral snit (20-25 mm) i huden omkring venstre achillessenen, og dissekere fascia ved hjælp af fine saks til at eksponere achillessenen komplekse (figur 2a).
- Fjerne plantaris senen med en saks (figur 2b).
- Skær achillessenen sprængsnorene 5 mm proksimalt for sin calcaneus indsættelse og fjern en 5 mm lang del ved hjælp af saks. Ikke sutur senen (figur 2 c, 2d).
- Sutur fascia og derefter huden med resorberbare garn gør en overjet sutur (løbende sutur). Monofilamenter suturer kan bruges også til at forhindre fugtspredende fra huden i den kirurgiske indsnit.
- Placere rotten under en varme lampe indtil vågen og derefter placere rotten tilbage i et bur (58 x 38 cm) (NB: ingen immobilisering er pålagt).
3. PRP forberedelse15
- Bedøver donor rotter med xylazin (10 mg/kg legemsvægt) og ketamin (80 mg/kg legemsvægt) ved intraperitoneal injektion. PRP injektionen udføres 2 timer efter operationen uden nogen re-anæstesi.
- Injicér 50 µL af buprenorphin subkutant som en smertestillende.
- Indsamle fuldblod (20 mL pr. rotte, endelige blødning) af hjertets punktering i sterile rør indeholdende 3,2% buffered natriumcitrat (0.109 M, antikoagulans). Derefter aflive rotten ved intracardiac injektion.
- For at opnå PRP, centrifugeres blod i 10 min ved 150 x g og stuetemperatur. Dette lav begyndelseshastighed centrifugering trin giver to forskellige faser: en lavere bestående af røde blodlegemer (RBC), der tegner sig for omkring 80-90% af det samlede volumen, og en øverste fase bestående af trombocyt-rich plasma (PRP) (typisk 10-20% af blodet prøve).
- Forsigtigt indsamle PRP (øverste fase) i en sekundær plast rør ved hjælp af en plastik overførsel pipette. Som grænseflade mellem PRP og røde blodlegemer er meget løs, ikke afpipetteres for tæt til grænsefladen. Når de håndteres korrekt, kontaminerende røde blodlegemer i PRP bør være under 0,05 x 103 celler / µL. kassér den resterende lavere fase og primære blod collection tube.
- Bestemme mængden af indsamlede PRP og måle trombocyttal på en hæmatologi analyzer. Disse værdier er nødvendige for beregningerne at justere trombocyt koncentration i næste trin. En blodlegemer er også nyttige til at vurdere risikoen for kontaminering med røde blodlegemer og WBCs. trombocyt koncentration i PRP på dette stadium er typisk 1 – 1,5 x106/µL.
- Udføre en anden centrifugering af PRP i 10 min på 1.000 x g og stuetemperatur. Trinnet højhastigheds centrifugering udbytter en løs trombocyt pellet og en supernatanten bestående af autologe trombocyt-fattige plasma (PPP). Ved hjælp af de værdier, der er fastlagt i trin 3.6, beregne mængden af supernatanten til at blive kasseret for at koncentrere PRP og nå frem til en endelig koncentration på 2,5 x106/µL.
- Forsigtigt indsamle supernatanten (PPP) i en sekundær plast rør ved hjælp af en plastik overførsel pipette, forlader omkring to tredjedele af det endelige rumfang beregnet i trin 3.7. Som pellet er løs, er en betydelig mængde af blodplader tabt, når PPP er kasseret, dermed potentielt reducere den ønskede slutkoncentration.
- Omhyggeligt resuspenderes trombocyt med de resterende supernatanten af blid gentagne pipettering. Måle trombocyttal på dette koncentrerede PRP. Hvis det er påkrævet, tilføje den passende mængde af autologe PPP at nå den endelige destination koncentration.
Bemærk: Brug PRP inden for 3 timer på forberedelse. - Tilsæt 50 µL af CaCl2 (11 mEq 10 mL) pr. mL af PRP hen til aktivere blodpladerne.
- Indsprøjtes 50 µL af frisk PRP eller saltopløsning med en 21G nål direkte i syet operation site om 1 h efter tilberedning. I løbet af denne tid, skal du holde PRP ved stuetemperatur.
- Nøje funktionel genopretning af rotter i dagene efter operationen og før fjernelse af achillessenen.
4. fjernelse af achillessenen og biomekaniske test16
- 5, 15 eller 30 dage senere5, vejer rotten. Derefter bedøver med xylazin (10 mg/kg legemsvægt) og ketamin (80 mg/kg legemsvægt) ved intraperitoneal injektion.
- Injicér 50 µL af buprenorphin subkutant som en smertestillende. Fjerne senen før at ofre dyr for at holde de fysiologiske betingelser for så længe som muligt.
- Barbere den venstre bagben lemmer og placere rotten i et dissekere mikroskop. Placere rotten på lateral decubitus med ben at blive opereret i en overlegen position. Hold pote med fingrene.
- Gør et lille snit (10 mm) i den tidligere operation site og udvide indtil triceps suralis er eksponeret.
- Hvis du vil fjerne den helbredende achillessenen, skære calcaneus knoglen sprængsnorene 5-10 mm distale til fastgøring achillessenen. Derefter dissekere en del af triceps suralis, som er knyttet til achillessenen (figur 3b). Muskel del må være stor nok til at passe i cryo-kæbe (figur 3 c-d). Prøven anbringes umiddelbart i cryo-kæben ved hjælp af pincet (figur 3).
- Efter fjernelse af muskel-sene-bone kompleks, aflive rotten ved intracardiac injektion med Nembutal (200 mg/kg). Bekræft død ved vurdering af mangel af hjerterytme og respiration i 15 min.
- Læg muskel enhed i overkæben (figur 3), lukke den og læg det lodret i en universal test maskine (106.2 kN, figur 3a). Derefter lave ben mellem de nederste klemmer maskine (figur 3f).
- Tilføj flydende kvælstof i begge af overkæben bassiner at fastfryse muskel, så det er en størrelsesorden stivere end senen og ikke deformeres under den traekproevningen.
- Når zonen indefrysning når grænsen metal clamp, starte traekproevningen, så senen vil bevare sin struktur. Indstille forskydning satsen af maskinen med en konstant hastighed på 1 mm/s indtil brud. Optage den trækstyrke (UTS) givet i Newton (N) på en computer.
- At beregne tværsnitsareal, placere to kameraer vinkelret på hinanden, danner en elliptisk form, og tage billeder.
- For at tage hensyn til forskellen i tværsnitsareal af de helbredende sener, normalisere UTS til en arealenhed (N pr. kvadrat millimeter), som repræsenterer mekanisk stress opleves af vævet.
5. histologiske analyse
Bemærk: 15 sener af hver gruppe undergik histologiske analyse.
- Efter sin afsked, dykke achillessenen straks i 4% PARAFORMALDEHYD at bevare sin struktur (1 mm af væv er fast pr. time, så tidspunktet for fiksering varierer afhængigt af størrelsen af senen).
- Erstatte PARAFORMALDEHYD af 70% ethanol, og forlader prøven for mindst én nat i denne løsning.
- Placer senen i en lille plastic container med huller og placere denne beholder i en frisk 70% ethanol løsning for 1 h.
- Sted container i 95% ethanol for 1 h. gentage.
- Sted container i 100% ethanol for 1 h. gentage.
- Sted container i 100% xylen til 1 h. gentage.
- Nu placere plastikbeholder, der indeholder senen, i flydende paraffin (56 ° C) og lad det natten over.
- Bruger en indlejring station (udstyret med smeltet voks, en varmeplade, og en kold tallerken), vælge en metallisk mug, der passer bedst til vævsprøve, og fyld den med lidt flydende paraffin, således at bunden er dækket.
Bemærk: Orientere prøven for at opnå lodrette sektioner på mikrotomen. - Når prøven er korrekt placeret, fylde formen med flydende paraffin og placere den på den kølemaskiner maskine. Lad det køle ned til mindst 15 min.
- Fjern fra paraffin blok og placere den på køl i mindst 30 min.
- Forbered flere rene glas lysbilleder og iføre dem nogle dråber af deioniseret vand.
- På mikrotomen, skæres blokke i sektioner på 5 µm (kun bruge dele fra den midterste del af senen), og Placer den på et dias.
- Placer dias i en varme ovn ved 65 ° C for flere min, så paraffin bare begynder at smelte for at obligation væv til glasset.
- Marker de dias, der indeholder paraffinsnit i en skive indehaveren.
- Nu deparaffinize og rehydrere væv ved at placere det i de følgende successive bade:
8 min i xylen (bad 1)
4 min i xylen (bad 2)
2 min i 100% ethanol
2 min i 95% ethanol
2 min i 70% ethanol
2 min i ionbyttet vand - Hæmatoxylin-Eosin pletter, læg væv i følgende løsninger.
- Fordyb væv for 8 min i hæmatoxylin løsning (1 g hæmatoxylin monohydrat, 0,2 g KIO3, 50 g AIK (SO4)2.12H2O; 200 mL glycerin; Juster til 1 L med destilleret vand).
- Fordyb væv i 8 min. under rindende vand.
- Fordyb væv til 30 s i eosin løsning (0,25% eosin i 100 mL destilleret vand indeholdende 200 µL af ufortyndet eddikesyre).
- Fordyb væv i 2 min. under rindende vand.
- Følg disse trin for Masson Trichrome farvning.
- Efter rehydrering, placere sektionerne i en beholder med jern alun (0,5 g (NH4) Fe (SO4)2.12H2O i 10 mL H2O) og lukke beholderen. Varme det op 3 min på 280 W i en mikrobølgeovn.
- Lad det køle ned til et minut og skyl det med deioniseret vand.
- Placer sektionerne i en lukket beholder med Regauds hæmatoxylin løsning (0,5 g hæmatoxylin opløses i 50 mL H2O ved 50 ° C, derefter tilsættes 5 mL 95% ethanol og 5 mL glycerin), varme den op til 90 s på 280 W.
- Skyl det med deioniseret vand.
- Anbring sektionerne i en picrinsyre syre (på mætning i methanol) i 3 min., skyl i 5 min under rindende vand og derefter placere den i ionbyttet vand i et par sekunder.
- Nu placere afsnittene i syre fuchsin (0,5 g i 50 mL H2O indeholdende 0,25 mL af ufortyndet eddikesyre) i 5 s og skyl under rindende vand, indtil farvefronten forsvinder.
- Inkuber sektioner i phosphormolybdæn syre (0,5 g i 50 mL H2O) i 5 min, læg den i et par sekunder i ionbyttet vand.
- Placer sektionerne i lys grøn (0,5 g i 50 mL H2O indeholdende 0,25 mL af ufortyndet eddikesyre) løsning for en anden 5 min og placere den under rindende vand, indtil farvefronten forsvinder.
- Nu dehydrere vævet igen.
- Fordyb sektion for 1 min i 70% ethanol.
- Fordyb sektion for 1 min i 95% ethanol.
- Fordyb sektion for 1 min i 100% ethanol.
- Fordyb sektion for 1 min i xylen (bad 1).
- Fordyb sektion for 1 min i xylen (bad 2).
- Fjerne afsnittene uden at fjerne for meget xylen og sætte en dråbe af montering medium på prøve.
- Sætte en coverslip på toppen (uden at provokere nogen bobler) og lad det hærde i mindst 2 timer.
- Hydrolysere 5 histologiske sektioner, (hver af en forskellig senen) i hver gruppe i 6 N HCl for 3 h og bestemme koncentrationen af kollagen ved at måle hydroxyprolin som et indeks i 5 µm unstained sektioner.
- Normalisere resultater af området afsnit bruger producentens software.
- Pletten nogle af sektionerne med lys grøn Stain at visualisere og kvantificere fibrillar kollagen af computer assisteret analyser.
- Skan afsnittene og konvertere billeder i nuancer af grå bruger IrfanView software. Bruge softwaren til semi-kvantificering (f.eks.antal én).
6. molekylære evaluering
- Efter seneruptur, som opstår under mekanisk testning, udtage, snap fryse dem i flydende kvælstof, og gemme dem på-80 ° C (PRP og saltvandsopløsning)17.
- Brug en kommerciel Total RNA kit for at isolere total RNA17.
- Måle udtryk af kollagen (Col I og Col III), Matrix Metalloproteinases (MMP-2, MMP-3 og MMP-9) og tenomodulin (TNMD) af RT-PCR17,18.
- Normalisere udtryk niveauer af mRNA niveau af 28S19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultaterne udtrykkes som gennemsnit ± standardafvigelse for middelværdien og blev sammenlignet med variansanalyse (ANOVA). En to-vejs ANOVA og post hoc test de Scheffé, som er en parametrisk test, anvendtes.
Det trækstyrke (UTS) kræves for at provokere en Bristning af achillessenen ikke skadet af rotter blev 42.0 ± 5.7 N (n = 10). Trækstyrke steg betydeligt (p < 0,0001) i begge grupper efter dag 5. Sammenligne begge grupper, UTS var højere i gruppen PRP når som helst målt, især på dag 15 og 30. Ved at måle tværsnitsareal af senerne, der blev fjernet, før det gennemgår biomekaniske evaluering (11,4 ± 5,5 mm2 til ikke-skadet sener), konstateredes det, at på dag 5, var større i de saltholdige behandlede gruppe. Men på dag 15 og 30, tværsnitsareal var større i gruppen PRP, selv om denne mængde var mere variabel i forhold til den saltholdige behandlede gruppe (figur 4 og figur 5).
Histologisk vurdering af sener, ved hjælp af hæmatoxylin-eosin pletter, viste en høj celleforandringer på dag 5, som faldt bagefter (ingen signifikant forskel blev observeret mellem at saltvandsopløsning og PRP gruppe). Den Masson Trichrome farvning viste en højere forekomst af fibrillar kollagen i gruppen PRP på dag 5 og 15. Men intensiteten af farvning var ens i begge grupper 30 dage efter injektion (figur 6). Den semi-kvantificering opnås ved farvning af prøver med lysegrøn viste, at på dag 5 og 15, intensiteten var højere i gruppen PRP (ikke statistisk signifikant) men på dag 30, der var ingen forskel mellem de to grupper.
Dataene blev normaliseret ved at måle mængden af en aminosyre, hydroxyprolin, som er specifikke for kollagen, bekræfter den histologiske semi-kvantificering (dag 5: større værdi i PRP gruppe). Kollagen koncentrationen var ikke stabile i gruppen PRP men var stabiliseret ved dag 30 i de to grupper. Omfanget af callus blev målt og fandtes for at være betydeligt større i PRP-behandlede dyr under de første faser af helingsprocessen. Tilsammen, betyder disse resultater, at PRP indsprøjtning i den skadede senen forårsager en stor mængde af fibrillar kollagen til at deponere.
Måling af udtryk niveau af flere molekyler viste, at i ikke-skadet sener, Col III og TNMD var til stede i et mindre beløb (2.5 - 3.0 gange) end i healing sener på dag 15, men der var ingen forskel i Col jeg udtryk mellem grupperne. MMPs var til stede ved 12-fold højere koncentration i de helbredende sener. Derudover på dag 30, der var en betydelig stigning af COL1A1 i gruppen PRP, og en positiv korrelation mellem COL1A1 udtryk og UTS blev fundet. I begge grupper, blev det konstateret, at Col III blev udtrykt i en høj mængde fra dag 1 til dag 14, før det faldt (ens for begge grupper). MMP-9-koncentration ændre ikke i begge grupper men MMP-2 og MMP-3 var til stede i højere koncentrationer i den helbredende periode. På dag 5, TNDM kom til udtryk i en større beløb i PRP (p < 0,03) men derefter faldt mellem dag 15 og 30.
Figur 1: eksperimenterende design undersøgelsens. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Kirurgisk Procedure.
(a) senen komplekse efter fjernelse af de omkringliggende fascia.
(b) fjernelse af plantaris senen.
(c) fjernelse af en del af achillessenen.
(d) den 2 sener, der er blevet fjernet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Biomekaniske test
(a) Universal test maskine (106.2 kN).
(b) den muskel-sene-bone kompleks, der vil blive fastsat i cryo-kæben.
(c) øvre og lavere cryo kæbe
(d) øvre og lavere cryo-kæbe
(e) de komplekse sat i cryo kæbe
(f) lukkede cryo-kæben indeholdende muskel-sene-bone komplekset fast i maskinen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Biomekaniske test resultater
Trækstyrke udtrykt i Newton (N) i kontrol og PRP grupper på de forskellige tidspunkter efter operationen. Der var en stigning på UTS i begge grupper over tid, med gruppen PRP viser betydeligt højere værdier på 15 og 30 dage efter operationen.
Fejllinje definerer standardafvigelse (SD). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Biomekaniske test resultater
Tværgående område af senen udtrykt i kvadrat millimeter (mm2). Tværsnitsareal var væsentligt større i gruppen PRP indtil dag 15. Bagefter, afsnittet var ens i begge grupper.
Fejllinje definerer standardafvigelse (SD). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Histologisk resultater
Repræsentative længdesnit af achillessenen fra kontrol og PRP grupper, farves med Masson's Trichrome. Skalalinjen = 100 µm. Der er en stærkere grønne pletter i senen af PRP-gruppen på dag 5. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Blodplader er afgørende for den tidlige inflammatoriske fase af senen helingsproces. Når disse blodplader er udsat for bindende væv eller faktorer, der inducerer koagulation, vil de frigive vækstfaktorer, der lagerføres i α granulat. På grund af denne interaktion, ekstracellulære matrix makromolekyler er synthetized og mesenchymale celler formere. Blodplader har også en kemotaktisk aktivitet på stamceller i blodcirkulationen, øge angiogenese og stimulere celledifferentiering6,20.
Biomekaniske test blev udført ved hjælp af en klemmer enhed specielt lavet til ex vivo trækstyrke afprøvning af achillessenen i rotter15. Cryo-kæbe tillader indefrysning af musklen ved at tilføje flydende kvælstof, og calcaneus knoglen, som er den nederste del af modellen, er direkte fast i maskinen. Det er meget vigtigt at begynde de traekproevningen, når musklen er helt stiv, men senen er stadig fleksibel. Denne teknik undgår vævsskader og bevarer den mekaniske integritet. Også er denne teknik simpel, sikker, ikke-trykstyrke og beviseligt reproducerbar, som flere undersøgelser har brugt denne metode4,15.
For at støtte de mekaniske resultater, undergik nogle sener histologisk vurdering. Hæmatoxylin-eosin pletter viser en stor oversigt over det helede væv og giver generelle oplysninger om mængden af celler og kollagen stede. Også, måling af hydroxyprolin er nyttigt, da det er en aminosyre, der er kun fundet i kollagen og giver mulighed for objectivation af de histologiske. Det er dog nødvendigt at gøre en Masson Trichrome farvning, da det viser mere detaljerede oplysninger om deposition og koncentration af kollagen fibre4.
Selv om niveauet af kollagen III mRNA i PRP behandlet sener blev ikke ændret, i dag 30 mRNA af Col jeg var til stede i højere koncentrationer i skadet sener behandlet med PRP. Tidligere havde været vist, at PRP forstyrrer spredning af makrofager og produktion af IL-121, som dermed kunne undgå en overdreven betændelsesreaktion i de tidlige faser af den helbredende proces11. Det er muligt, at PRP stimulerer udbredelsen, aktivering af metaboliske reaktionsveje og omdannelsen af mesenchymale celler til tenocytes, der er aktive.
Høje koncentrationer af TNDM i sener af gruppen PRP indikere at de injicerede molekyler kunne tiltrække celler cirkulerer i blodet og fremkalde en differentiering mod tenocyte fænotype11. Taget sammen, viser disse resultater, at kun én injektion af PRP i en bristet achillessenen har en positiv effekt på den tidlige helbredende fase og fører til en højere mekanisk styrke.
Flere præ-kliniske undersøgelser har allerede vist, at PRP forbedrer den helbredende proces, og at de forskellige vækstfaktorer har specifikke aktioner under denne proces22. Mazzocca og hans team vist, at PRP stimulerer celledelingen i muskler, knogler og sener. Ud af forskellige præparater, stærkt koncentreret PRP uden nogen hvide blodlegemer viste sig for at være den mest effektive behandling23. McCarrell mfl. gjorde et lignende eksperiment, test flere præparater af PRP indeholdende forskellige koncentrationer af PRP og hvide blodlegemer på hest sener. Præparater, der indeholder en mellemliggende koncentration af blodplader og en høj koncentration af hvide blodlegemer ført til en højere version af pro-inflammatoriske cytokiner som IL-1ß og TNFa og lavere kollagen syntese. Blandinger med en høj koncentration af blodplader og hvide blodlegemer også ført til en stigning af inflammatoriske cytokiner, men hæmmet kollagen syntese. Afslutningsvis betyder det, at hvis trombocyttal koncentration er for høj, kollagen syntese og celle metabolisme er bremset ned24. Boswell mfl. bekræftet disse resultater25. Den mest effektive PRP forberedelse vil således indeholde et trombocyttal koncentration lavere end 106 blodplader/µL og ingen hvide blodlegemer.
En stor fordel ved hjælp af PRP er autogenity. Selv om i vores undersøgelse, brugte vi allogene PRP ved at ofre donor rotter til at have en tilstrækkelig mængde af blod. Desuden ville at tage blod fra den opererede rats svække dem for meget. En anden begrænsning af denne undersøgelse er, at alle brud er akut og udført på sunde sener, der er ikke altid tilfældet hos mennesker, som sener ofte brud på grund af forudgående degeneration. Denne model er baseret på skarpe senen skader, kan ingen endegyldige konklusioner drages for degenerative tendinopathies.
Brug denne metode, er der nogle vigtige skridt til at huske, den første ene er forberedelsen af PRP, som bør være så reproducerbare som muligt. En anden kritisk trin er den kirurgiske procedure: fjernelse af de sene og muskel-sene kompleks bør ske på en reproducerbar måde at undgå enhver form for partiskhed. Endelig forberedelse til biomekaniske test: flydende nitrogen er føjet til fryse musklen, og det er ganske vigtigt, at senen ikke er frosset i denne proces, fordi det kunne føre til partisk resultater, som senen stivhed ville blive ændret. Dette er også en begrænsning af undersøgelsen, da der ikke er nogen standardiseret protokol at sikre, at den sene elasticitet ikke er ændret.
Vi baserede vores metode på den metode, udviklet af Virchenko mfl. 26, tilpasset men det ved hjælp af cryo-kæben, som beskytter senen mod udvendige aggressioner induceret af klemmer. Den største fordel ved denne metode er, at det er reproducerbare, selv om det ikke er endnu standardiseret. Det giver en idé om hvordan senen skader kan behandles i mennesker, selv om forsøg med rotter ikke altid oversætte godt til behandling af menneskelige skader. Det er sandsynligt, at en tilpasset version af denne metode kan være nyttig i behandling af disse personskader i fremtiden, understøttes af, at det er let at bruge, har en forholdsvis lav pris, og er mindre indgribende end andre metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af Standard de Liège og Lejeune - Lechien tilskud af Leon Frédéricq midler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xylazine (Xyl-M) | VMD | none | anesthetic |
| Ketamin (Jétamine 1000 CEVA) | CEVA Santé Animale | none | anesthetic |
| Buprenorphin (Vetergésic Multidosis) | ALSTOE | none | Painkiller |
| iso-Betadine | MEDA-Pharma | none | Desinfectant |
| resorbable yarn Vicryl 6/0 | Johnson & Johnson | ||
| Nembutal | CEVA Santé Animale | none | Anesthetic |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Preserves structure of the tissue |
| Isopropanol 100% | VWR | 20,922,364 | |
| Ethanol 95% | VWR | 20,823,362 | |
| Xylene | VWR | 28973.363 | |
| Paraffin | VWR | LEIC3950.1006 | |
| Hematoxylin | Millipore | 1.15938.0025 | Colorant |
| Eosin | Millipore | 1.15935.0100 | Colorant |
| Eukitt | Sigma-Aldrich | 3989 | Mounting Medium |
| CaCl2 |
References
- Kaux, J., Degrave, N., Crielaard, J. Platelet rich plasma traitement des tendinopathies chroniques? Revue de la littérature. Platelet rich plasma treatment of chronic tendinopathies? Review of literature. J. Traumatol. du Sport. 24, 99-102 (2007).
- Anitua, E., et al. Autologous preparations rich in growth factors promote proliferation and induce VEGF and HGF production by human tendon cells in culture. J. Orthop. Res. 23, 281-286 (2005).
- Bosch, G., et al. Effects of platelet-rich plasma on the quality of repair of mechanically induced core lesions in equine superficial digital flexor tendons: A placebo-controlled experimental study. J. Orthop. Res. 28, 211-217 (2010).
- Kaux, J. F., Drion, P., Croisier, J. L., Crielaard, J. M. Tendinopathies and platelet-rich plasma (PRP): From pre-clinical experiments to therapeutic use. J. Stem Cells Regen. Med. 11, P7-P17 (2015).
- Maffulli, N., Wong, J., Almekinders, L. C.
- Molloy, T., Wang, Y., Murrell, G. The roles of growth factors in tendon and ligament healing. Sports Med. 33, 381-394 (2003).
- Lyras, D. N., et al. The effect of platelet-rich plasma gel in the early phase of patellar tendon healing. Arch. Orthop. Trauma Surg. 129, 1577-1582 (2009).
- Aspenberg, P., Virchenko, O. Platelet concentrate injection improves Achilles tendon repair in rats. Acta Orthop. Scand. 75, 93-99 (2004).
- Visser, L. C., et al. Growth Factor-Rich Plasma Increases Tendon Cell Proliferation and Matrix Synthesis on a Synthetic Scaffold: An In Vitro Study. Tissue Eng. Part A. 16, 1021-1029 (2010).
- Zhang, J., Wang, J. H. -C. Platelet-Rich Plasma Releasate Promotes Differentiation of Tendon Stem Cells Into Active Tenocytes. Am. J. Sports Med. 38, 2477-2486 (2010).
- Kajikawa, Y., et al. Platelet-rich plasma enhances the initial mobilization of circulation-derived cells for tendon healing. J. Cell. Physiol. 215, 837-845 (2008).
- Pasternak, B., Aspenberg, P. Metalloproteinases and their inhibitors-diagnostic and therapeutic opportunities in orthopedics. Acta Orthop. 80, 693-703 (2009).
- Dell, R. B., Holleran, S., Ramakrishnan, R.
- Mähler Convenor, M., et al. FELASA recommendations for the health monitoring of mouse, rat, hamster, guinea pig and rabbit colonies in breeding and experimental units. Lab. Anim. 48, 178-192 (2014).
- Kaux, J. -F., et al. Étude comparative de cinq techniques de préparation plaquettaire (platelet-rich plasma). Pathol. Biol. 59, 157-160 (2011).
- Wieloch, P., Buchmann, G., Roth, W., Rickert, M. A cryo-jaw designed for in vitro tensile testing of the healing Achilles tendons in rats. J. Biomech. 37, 1719-1722 (2004).
- Kaux, J. -F., et al. Vascular Endothelial Growth Factor-111 (VEGF-111) and tendon healing: preliminary results in a rat model of tendon injury. Muscles. Ligaments Tendons J. 4, 24-28 (2014).
- Docheva, D., Hunziker, E. B., Fässler, R., Brandau, O. Tenomodulin is necessary for tenocyte proliferation and tendon maturation. Mol. Cell. Biol. 25, 699-705 (2005).
- Lambert, C. A., Colige, A. C., Munaut, C., Lapière, C. M., Nusgens, B. V. Distinct pathways in the over-expression of matrix metalloproteinases in human fibroblasts by relaxation of mechanical tension. Matrix Biol. 20, 397-408 (2001).
- Nurden, A. T., Nurden, P., Sanchez, M., Andia, I., Anitua, E.
- Woodall, J., Tucci, M., Mishra, A., Benghuzzi, H. Cellular effects of platelet rich plasma: a study on HL-60 macrophage-like cells. Biomed. Sci. Instrum. 43, 266-271 (2007).
- Taylor, D. W., Petrera, M., Hendry, M., Theodoropoulos, J. S. A systematic review of the use of platelet-rich plasma in sports medicine as a new treatment for tendon and ligament injuries. Clin. J. Sport Med. 21, 344-352 (2011).
- Mazzocca, A. D., et al. The positive effects of different platelet-rich plasma methods on human muscle, bone, and tendon cells. Am. J. Sports Med. 40, 1742-1749 (2012).
- McCarrel, T. M., Minas, T., Fortier, L. A. Optimization of leukocyte concentration in platelet-rich plasma for the treatment of tendinopathy. J. Bone Joint Surg. Am. 94 (1-8), e143 (2012).
- Boswell, S. G., et al. Increasing platelet concentrations in leukocyte-reduced platelet-rich plasma decrease collagen gene synthesis in tendons. Am. J. Sports Med. 42, 42-49 (2014).
- Virchenko, O., Aspenberg, P. How can one platelet injection after tendon injury lead to a stronger tendon after 4 weeks?: Interplay between early regeneration and mechanical stimulation. Acta Orthop. 77, 806-812 (2006).
