Summary
Denne protokollen beskriver evalueringsprosessen healing sener i rotter som har blitt injisert med allogene Platederivert rik plasma (PRP) eller saltvann etter fjerner en del av akillessene. Fremdriften av sene healing evalueres på flere tidspunkt bruker ulike typer analyser.
Abstract
Denne artikkelen beskriver de eksperimentelle prosedyrene brukes til å observere hvis PRP kan positivt påvirke sene healing. Det er 4 viktigste trinn å følge: indusere en leksjonen i akillessene; forberede PRP og injisere den (eller saltvann); fjerne senen; og utføre biomekaniske molekylære og histologiske evalueringer. På hvert trinn, er alle prosedyrer og metoder beskrevet i detalj, slik at de kan gjengis lett.
Achilles sener har vært kirurgisk inndelte (fjerning av en 5 mm lang del). Etterpå ble PRP eller saltvann injisert for å studere om PRP har en positiv effekt på helbredelse av senen. Tre grupper av 40 dyr (totalt 120 rotter ble brukt i denne studien) var delt inn i 2 undergrupper: PRP injeksjon gruppe og en saltvann injeksjon kontroll gruppe. Rotter ble ofret øke tidspunkt (gruppe A: 5 dager. Gruppe B: 15 dager. Gruppe C: 30 dager) og sener fjernet. 90 sener gjennomgikk biomekaniske testing før transcriptomic analyse og 30 gjenværende sener ble sendt til histologiske analyse.
Introduction
Koagulering og inflammatoriske prosesser immunitet modulering rollene blodplater er kjente1. Nylig har det vært vist at de har også restorative egenskaper2,3. Faktisk ulike cytokiner og vekst faktorer (VEGF, PDGF, TGF-B, IGF-jeg og HGF) er utgitt av blodplater under omfatter degranulering. Disse vekstfaktorer fremme angiogenese, vev remodeling og sår helbredelse (bein, hud, muskler, sene)2. Sentrifugering autologous blod produserer Platederivert rik plasma (PRP) som inneholder høy blodplater konsentrasjoner avhengig av metoden isolasjon (mellom 3 og 10 ganger blod planlagte konsentrasjoner). Ulike PRP forberedelser teknikker kan faktisk gi en identisk sluttprodukt. Til nå, har det vært ingen internasjonale generell enighet om denne saken. Samlet kan PRP være et attraktivt terapeutisk alternativ for behandling av kroniske muskel forhold, som tendinopathy, plantar fasciitis, slitasjegikt og nonunion4. Det ble brukt for første gang i oral kirurgi og implantologi4 å forbedre og akselerere bein healing etter gjør et tannimplantat. I denne studien beskriver vi en reproduserbar metode som tillater oppkjøpet PRP for dyr eksperimentering4.
Siden lesjoner av sener er ofte observert i idrettsutøvere og fysisk arbeidere, styrke helbredelsesprosessen og dermed reduserer utvinning er av stor interesse5. Nye behandlingsmetoder som utvikler ofte innebærer bruk av vekstfaktorer, og administrasjonen av PRP er en enkel og minimal invasiv måte å levere en blanding av endogene vekstfaktorer4.
Flere i vitro eller dyr studier har vist at administrasjonen av plasma med et høyt nivå av blodplater, av frigir biologiske meglere, kan stimulere sene og ligament reparasjon av frigir biologiske meglere6 ,7,8,9. Videre har andre studier vist at PRP kan stimulere type jeg og III kollagen syntese i sene celler9,10,11. Det har også blitt foreslått at PRP kan redusere aktivering av matrise metalloproteinases (MMPs) og dermed redusere nedbrytning av matrisen. Celler som er involvert i betennelsen prosessen kan produsere MMP-9, som spiller en rolle i vev remodeling (fysiologiske og patologisk) av betennelse12.
Basert på denne informasjonen hypotese vi at en enkelt PRP injeksjon i inndelte Achilles sener rotter kunne forbedre gjenopprettingen og mekanisk styrke av reparerte vev. Dette er testet ved å måle egenskapene biomekaniske helbredende sener under gjenopprettingsprosessen og utføre histologiske og molekylære analyser for å evaluere kollagen remodeling i nyopprettede vev. Målet med undersøkelsen var å observere hvis en enkelt injeksjon allogene PRP kan påvirke helbredelse av appa Achilles sener.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Pleie og håndtering av dyrene ble utført i samsvar med veiledningen for omsorg og bruk av forsøksdyr utarbeidet av National Academy of Sciences og publisert av nasjonale institutter for helse (USA). Europeiske og nasjonale lovgivning ble fulgt nøye.
1. dyr forberedelse
- Bruk 132 2 - måned gamle Sprague-Dawley hannrotter veiing 320-450 g (120 rotter eksperimentering) og 12 rotter for blod prøvetaking, figur 1. Basert på Dell13, 15 rotter for hver gruppe var nok for en effekt på 0,8 (80% sjanse for å finne statistiske betydning, hvis den angitte effekten).
- Huset alle rotter i klassisk bur under isolasjon forhold i konvensjonelle anlegg utstyrt med en endring stasjon. Egge oppdrett i et IVC (individuelt ventilert cage) rack med SPF (bestemt patogen gratis) rotter er spesielt kjøpt.
- Bruk følgende bolig: temperaturområde fra 19-24 ° C; relativ fuktighet: 40-60%. ventilasjon: frekvens av luft fornyelse: 10-15 per t; lys/mørke syklus: 12 h - 12 h.
- Sterilisere alle caging utstyr og bruke bestrålt sengetøy. Systemisk implementere bur berikelse ved å plassere sterilt papp skuffer og håndklær i merdene.
- Gir tilgang til sonen under begrensede forhold: nye lab frakk, maske, hansker, sko og hår panseret ved inngangen.
- Utføre kolonien helseovervåking sentinel dyr på skitne sengetøy årlig, i henhold til Felasa14 anbefalingene for konvensjonelle fasiliteter. Holde fire til fem dyr per bur, med den aktuelle bestrålt kosthold og gir sur vann ad libitum. Overvåke daglig.
- Overføre rotter valgt for kirurgiske inngrep i filtrering topp burene kirurgisk rom 2 timer før operasjonen.
2. kirurgisk prosedyre
- Forberede de kirurgiske instrumentene: sakser, en klemme, to hemostatic klemmer og en nål holder. Under alle prosedyrer, slitasje hansker, en maske, hette og en labfrakk.
- Tilfeldig del rotter i to grupper (PRP og saltvann).
- Ta rotta ut av buret sitt og veie den. Bruke nummererte øret koder for å identifisere rotter. For å unngå uttørking av øynene, plassere vanndråper på hornhinnen.
- Bedøve rotte intraperitoneally med xylazine (10 mg/kg kroppsvekt) og ketamin (80 mg/kg kroppsvekt). For å bekrefte anesthetization, plasser dyrene under kardio-respiratorisk overvåking og se etter noen øye reflekser.
- Injisere 50 µL av buprenorfin subcutaneously (0.01 til 0.05 mg/kg hver 8-12 h) i nakke-området som smertestillende middel.
- Barbere venstre bakben lem med en barbermaskin, Desinfiser det med 3 vekslende scrubs iso-betadine/alkohol (fortynnes 1:10) løsning og plasser rotta på en varm pad (20 ° C) under dissecting mikroskop. Plass rotta på lateral liggesår med benet til drives på en bedre posisjon. Hold labben med kirurgisk tang.
- Ved hjelp av saks, lag et lite innsnitt lateral (20-25 mm) i huden rundt venstre akillessene og dissekere fascia med fine saks for å avsløre akillessene komplekse (figur 2a).
- Fjern plantaris senen med en saks (figur 2b).
- Skjær på akillessene tverrgående 5 mm proksimale til sin calcaneal innsetting og fjern en 5 mm lang del med saks. Ikke Sutur senen (figur 2 c, 2d).
- Sutur fascia og huden med resorbable garn gjør en overjet Sutur (Sutur kontinuerlig). Monofilament suturer kan brukes også til å hindre wicking fra huden i kirurgiske innsnitt.
- Plasser rotta under en varme lampe til våken og plasser rotta tilbake i et bur (58 x 38 cm) (Nota bene: ingen immobilisering er pålagt).
3. PRP forberedelse15
- Bedøve donor rotter med xylazine (10 mg/kg kroppsvekt) og ketamin (80 mg/kg kroppsvekt) ved intraperitoneal injeksjon. PRP injeksjon utføres 2t postoperatively uten noen re-bedøvelse.
- Sette inn 50 µL av buprenorfin subcutaneously som smertestillende middel.
- Samle hele blod (20 mL per rotte, siste blødning) av cardiac punktering i sterilt rør som inneholder 3,2% bufret natriumsitrat (0.109 M, antikoagulerende). Deretter euthanize rotta ved intracardiac injeksjon.
- For å få PRP, sentrifuge blodet for 10 min på 150 x g og romtemperatur. Dette første lav hastighet sentrifugering trinnet gir to distinkte faser: en lavere fase bestående av røde blodlegemer (RBCs) som ca 80-90% av det totale volumet, og en øvre fase bestående av blodplater-rich plasma (PRP) (vanligvis 10-20% av blodet utvalget).
- Forsiktig samle PRP (øvre fase) i en sekundær plastrør bruker en plast overføring pipette. Grensesnittet mellom PRP og røde blodlegemer er veldig løs, ikke Pipetter for nær til grensesnittet. Når håndteres riktig, forurensende RBCs i PRP bør være under 0,05 x 103 celler / µL. forkaste gjenværende lavere fasen og den primære blod samling rør.
- Bestemme mengden innsamlede PRP og måle antall blodplater på en hematologi analysator. Disse verdiene er nødvendige for beregninger for å justere Platederivert konsentrasjon i neste trinn. En blodlegemer er også nyttig å vurdere potensielle forurensning med RBCs WBCs. Platederivert konsentrasjon i PRP på dette stadiet er vanligvis 1-1,5 x106/µL.
- Utføre en andre sentrifugering PRP for 10 min på 1000 x g og romtemperatur. Dette høyhastighets sentrifugering trinnet gir løs Platederivert pellets og en nedbryting bestående av autologous blodplater-fattige plasma (PPP). Ved hjelp av verdiene i trinn 3.6, beregne volumet av nedbryting forkastes for å konsentrere seg på PRP og nå en siste konsentrasjon av 2.5 x106/µL.
- Forsiktig samle nedbryting (PPP) i en sekundær plastrør bruker en plast overføring pipette, etterlot to tredeler av det siste bindet beregnet i trinn 3.7. Pellet er løs, er mengde blodplater tapt når PPP forkastes derfor potensielt redusere den endelige ønskede konsentrasjonen.
- Nøye resuspend Platederivert pellets med gjenværende nedbryting av mild gjentatte pipettering. Måle antall blodplater på denne konsentrert PRP. Om nødvendig kan du legge til riktige volumet av autologous PPP å nå den endelige målet konsentrasjonen.
Merk: Bruk PRP innen 3t forberedelser. - Legge til 50 µL av CaCl2 (11 mEq 10 mL) per mL PRP å aktivere blodplater.
- Injisere 50 µL av fersk PRP eller saltvann med en 21G nål direkte i området sutured operasjonen ca 1 time etter forberedelse. Samtidig holde PRP ved romtemperatur.
- Overvåke funksjonelle utvinning av rotter tett i løpet av dager etter operasjonen og før fjerning av akillessene.
4. fjerning av akillessene og biomekaniske Testing16
- 5, 15 eller 30 dager senere5, veie rotta. Deretter bedøve med xylazine (10 mg/kg kroppsvekt) og ketamin (80 mg/kg kroppsvekt) ved intraperitoneal injeksjon.
- Sette inn 50 µL av buprenorfin subcutaneously som smertestillende middel. Fjern senen før å ofre dyr for å holde de fysiologiske forholdene så lenge som mulig.
- Barbere venstre bakben lem og plasser rotta under dissecting mikroskop. Plass rotta på lateral liggesår med benet til drives på en bedre posisjon. Hold labben med fingrene.
- Lag et lite innsnitt (10 mm) i forrige operasjon område og utvide til triceps-suralis er utsatt.
- Hvis du vil fjerne den helbredende akillessene, kuttet calcaneal benet tverrgående 5-10 mm distale sin akillessene vedlegget. Deretter dissekere en del av triceps-suralis, som er festet til akillessene (figur 3b). Delen muskel må være stor nok til å passe i cryo-kjeven (Figur 3 cd). Plasser prøven umiddelbart i cryo-kjeven ved hjelp av pinsett (figur 3e).
- Etter fjerner muskel-sene-Ben komplekset, euthanize rotta ved intracardiac injeksjon med Nembutal (200 mg/kg). Bekreft død ved å vurdere fravær av hjerterytmen og respirasjon i 15 min.
- Plasser muskel-enheten inn i overkjeven (figur 3e), lukke det og legg den loddrett i en universal tester maskinen (106.2 kN, figur 3a). Deretter ordne benet mellom de nedre klemmer på maskinen (figur 3f).
- Legge til flytende nitrogen i begge overkjeven bassenger å fryse muskler, slik at det er en størrelsesorden stivere enn sene og ikke deformeres under strekk testen.
- Når sonen frysing når metall klemmen grensen, starte strekk testen, så senen vil bevare strukturen. Angi forskyvning frekvensen av maskinen med en konstant hastighet på 1 mm/s til brudd. Registrere den ultimate strekkfasthet (UTS) gitt i Newton (N) på en datamaskin.
- Beregne tverrsnitt område, plassere to kameraer står vinkelrett på hverandre, danner en elliptisk form og ta bilder.
- Kontoen for forskjellen i tverrsnitt område av healing sener, normalisere UTS til en enhet-området (N per kvadrat millimeter), som representerer mekanisk stress oppleves av vev.
5. histologiske analyse
Merk: 15 sener i hver gruppe gjennomgikk histologiske analyse.
- Etter fjerning, senke akillessene umiddelbart i 4% paraformaldehyde å bevare strukturen (1 mm av vev er fast per time, så da fiksering varierer avhengig av senen).
- Erstatte paraformaldehyde med 70% etanol, og la prøven for minst én natt i denne løsningen.
- Plasser sene i en liten plastboks med hull og Plasser beholderen i en fersk 70% etanol løsning 1t.
- Sted beholderen i 95% etanol for 1 h. Gjenta.
- Sted beholderen i 100% etanol for 1 h. Gjenta.
- Sted beholderen i 100% xylen for 1 h. Gjenta.
- Nå plasserer plast beholderen, som inneholder senen, i flytende parafin (56 ° C) og la den over natten.
- Bruker en innebygging stasjon (utstyrt med flytende voks, en kokeplate og en kald plate), Velg en metallisk mold som best passer til Vevsprøve, og fyll den med litt flytende parafin slik at basen er dekket.
Merk: Orientere prøven for å få loddrette områder på mikrotomen. - Når prøven er riktig plassert, fylle opp formen med flytende parafin og plassere den på refrigerating maskinen. La det avkjøles i minst 15 min.
- Fjern fra parafin blokken og plassere den på is minst 30 min.
- Forbered flere rene glass lysbilder og sette noen dråper av deionisert vann på dem.
- På mikrotomen, skjær blokker i deler av 5 µm (bare bruk inndelinger fra den midtre delen av senen) og plasser den på et lysbilde.
- Plass lysbildene i en varme ovn ved 65 ° C i flere minutter, slik at parafinen bare begynner å smelte for å obligasjonslån vevet til glasset.
- Plass lysbildene inneholder parafinsnitt i en sektor holder.
- Nå deparaffinize og rehydrate vev ved å plassere den i følgende påfølgende bad:
8 min i xylen (bad 1)
4 min i xylen (bad 2)
2 minutter i 100% etanol
2 minutter i 95% etanol
2 min med 70% etanol
2 minutter i deionisert vann - For Hematoxylin-Eosin flekker, plassere vevet i følgende løsninger.
- Fordype vevet i 8 min i hematoxylin løsning (1 g hematoxylin monohydrat, 0.2 g KIO3, 50 g AIK (SO4)2.12H2O, 200 mL glyserin; justere 1 L med destillert vann).
- Fordype vevet i 8 min under rennende vann.
- Fordype vev for 30 s i eosin løsning (0,25% eosin i 100 mL destillert vann som inneholder 200 µL av ufortynnet eddiksyre).
- Fordype vevet i 2 minutter under rennende vann.
- Bruk følgende fremgangsmåte for Masson Trichrome flekker.
- Etter rehydration, Legg delene i en container med jern Alun (0,5 g (NH4) Fe (SO4)2.12H2O i 10 mL H2O) og Lukk beholderen. Varme den opp 3 min på 280 W i en mikrobølgeovn.
- La den avkjøles litt og deretter skylle den med deionisert vann.
- Plasser delene i en lukket beholder med Regaud's hematoxylin løsning (0,5 g hematoxylin oppløst i 50 mL H2O ved 50 ° C, deretter legge 5 mL 95% etanol og 5 mL glyserin), varme den opp 90 s på 280 W.
- Skyll den med deionisert vann.
- Plasser delene i en pikrinsyre løsning (på metning i metanol) for 3 min, skyll i 5 minutter under rennende vann og deretter plassere den i deionisert vann i noen sekunder.
- Nå plasserer delene i syre fuchsin (0,5 g i 50 mL H2O inneholder 0,25 mL ufortynnet eddiksyre) i 5 s og skyll under rennende vann fra springen til fargebad forsvinner.
- Inkuber avsnittene i phosphomolybdic sur løsning (0,5 g i 50 mL H2O) i 5 min, plasserer den i noen sekunder i deionisert vann.
- Plasser delene i lys grønn (0,5 g i 50 mL H2O inneholder 0,25 mL ufortynnet eddiksyre) løsning for en annen 5 min og plassere den under rennende vann fra springen til fargebad forsvinner.
- Nå tørke vevet igjen.
- Fordype delen for 1 min med 70% etanol.
- Fordype delen i 1 min i 95% etanol.
- Fordype delen i 1 min i 100% etanol.
- Fordype delen i 1 min i xylen (bad 1).
- Fordype delen i 1 min i xylen (bad 2).
- Fjern snittene uten å fjerne mye xylen og sette en dråpe montering medium på prøven.
- Sette en dekkglassvæske på toppen (uten provoserte bobler) og la den stivne i minst 2 timer.
- Hydrolyze 5 histologiske deler (hver av en annen sene) av hver gruppe i 6 N HCl for 3t og bestemme konsentrasjonen av kollagen ved å måle hydroksyprolin som en indeks i 5 µm unstained kvinne deler.
- Normalisere resultatene etter inndelingsområdet bruke produsentens programvare.
- Stain noen av delene med lys grønn flekken å visualisere og kvantifisere fibrillar kollagen dataassistert analysen.
- Skanne delene og konvertere bildene i nyanser av grått programmvre IrfanView. Bruke programvaren for semi kvantifisering (f.eksantall ett).
6. molekylær evaluering
- Etter sene brudd, som oppstår under mekanisk testing, ta prøvene, fest fryse dem i flytende nitrogen, og lagre dem på-80 ° C (PRP og saltvann)17.
- Bruk en kommersiell totale RNA kit for å isolere totale RNA17.
- Måle uttrykket av kollagen (Col I og Col III), matrise Metalloproteinases (MMP-2, MMP-3 og MMP-9) og tenomodulin (TNMD) av RT PCR17,18.
- Normalisere uttrykk nivåer av mRNA nivåer 28S19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultatene er uttrykt som gjennomsnittlig ± standardavviket for gjennomsnittet og ble sammenlignet med variansanalyse (ANOVA). En toveis VARIANSANALYSE og legge hoc test de Scheffé, som er en parametrisk test ble brukt.
Den ultimate strekkfasthet (UTS) kreves for å provosere en ruptur av ikke-skadde Achilles sener rotter var 42.0 ± 5.7 N (n = 10). Strekkfasthet betraktelig (p < 0,0001) i begge grupper etter dag 5. Sammenlignende begge grupper, til UTS var høyere i gruppen PRP helst måles særlig på dag 15 og 30. Ved å måle tverrsnitt område av sener som ble fjernet før under biomekaniske evaluering (11.4 ± 5,52 for ikke-skadde sener), ble det funnet at på dag 5, det var større i saltvann behandlet gruppen. Men på dag 15 og 30 tverrsnitt område var større gruppen PRP, selv om dette antallet var mer variabel sammenlignet med saltvann behandlet gruppen (Figur 4 og figur 5).
Histologiske evalueringen av sener, bruker hematoxylin-eosin flekker, viste en høy cellularity på dag 5, som sank etterpå (ingen signifikant forskjell ble observert mellom saltvann og PRP gruppe). Masson's Trichrome flekker viste en høyere tilstedeværelse av fibrillar kollagen i gruppen PRP på dag 5 og 15. Men intensiteten av den flekker var like i begge grupper 30 dager etter injeksjon (figur 6). Semi kvantifiseringen oppnås ved farging prøvene med lys grønn viste at på dag 5 og 15 intensiteten var høyere i gruppen PRP (ikke statistisk signifikant) men på dag 30, det var ingen forskjell observert mellom de to gruppene.
Dataene ble normalisert ved å måle hvor mye en aminosyre, hydroksyprolin, som er spesifikk for kollagen, bekrefter den histologiske semi kvantifiseringen (dag 5: større verdi i PRP-gruppen). Kollagen konsentrasjonen var ikke stabilt i gruppen PRP men ble stabilisert på dag 30 i de to gruppene. Volumet av callus ble målt og ble funnet for å være betydelig større i PRP-behandlede dyr under den første fasen av helbredelsesprosessen. Til sammen antyde disse resultatene at PRP injeksjon i skadet senen forårsaker en viktig mengde fibrillar kollagen innskudd.
Måle hvilket uttrykk flere molekyler viste at i ikke-skadde sener, Col III og TNMD var tilstede i mindre beløp (2,5 - 3,0 ganger) enn i healing sener på dag 15, men det var ingen forskjell i Col jeg uttrykk mellom gruppene. MMPs var tilstede på en 12-fold høyere konsentrasjon i helbredende sener. I tillegg på dag 30, var det en betydelig økning av COL1A1 i gruppen PRP, og en positiv korrelasjon mellom COL1A1 uttrykk og UTS ble funnet. I begge grupper, ble det funnet at Col III ble uttrykt i et høyt antall fra dag 1 inntil dag 14, før den reduserte (samme for begge grupper). MMP-9-konsentrasjon endre ikke i begge gruppene men MMP-2 og MMP-3 var tilstede på høyere konsentrasjoner i helbredende perioden. På dag 5, TNDM ble uttrykt i et høyere beløp i PRP (p < 0,03) men deretter redusert mellom dag 15 og 30.
Figur 1: eksperimentell design av studien. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Kirurgisk prosedyre.
(a) senen komplekse etter fjerning av omkringliggende fascia.
(b) fjerning av plantaris senen.
(c) fjerning av en del av akillessene.
(d) The 2 sener som er fjernet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Biomekaniske Testing
(a) Universal prøvingen apparat (106.2 kN).
(b) det muskel-sene-Ben komplekset som skal fast inn cryo-kjeven.
(c) øvre og lavere cryo kjeven
(d) øvre og lavere cryo-kjeve
(e) komplekset inn cryo kjeven
(f) lukket cryo-kjeven med muskel-sene-Ben komplekset fast inn i maskinen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Biomekaniske Testing resultater
Strekkfasthet uttrykt i Newton (N) i kontroll og PRP grupper på ulike tidspunkt etter operasjonen. Det var en økning på UTS i begge grupper over tid, med gruppen PRP viser betydelig høyere verdier på 15 og 30 dager etter operasjonen.
Feilfelt definerer standardavviket (SD). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Biomekaniske Testing resultater
Tverrgående området av senen uttrykt i kvadratmillimeter (mm2). Tverrsnitt område var betydelig større i gruppen PRP til dag 15. Etterpå var delen lik i begge gruppene.
Feilfelt definerer standardavviket (SD). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: Histologiske resultater
Representant langsgående deler av akillessene av kontroll og PRP grupper, farget med Masson's Trichrome. Skala bar = 100 µm. Det er en sterkere grønne farging i senen av gruppen PRP på dag 5. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Blodplater er avgjørende for tidlig inflammatorisk fase av senen helbredelsesprosessen. Når disse blodplater er utsatt for bindende vev eller faktorer som induserer koagulering, slipper de vekstfaktorer som lager i α granulat. Denne samhandlingen, ekstracellulær matrix makromolekyler er synthetized og sprer mesenchymal celler. Blodplater har også en chemotactic aktivitet på progenitor celler i blodsirkulasjonen, styrke angiogenese og stimulerende cellulære differensiering6,20.
Biomekaniske testing ble gjort ved hjelp av en spennanordningen spesiallaget for ex vivo strekk testing av akillessene i rotter15. Cryo-kjeven kan frysing av muskelen ved å legge til flytende nitrogen, og calcaneal bein, som er den nedre delen av prøven, er direkte fast inn i maskinen. Det er svært viktig å starte strekk testen når muskelen er helt stiv, men sene er fortsatt fleksibel. Denne teknikken unngår skade på vev og beholder mekanisk integriteten. Også er denne teknikken enkel, sikker, ikke-kompresjons og påviselig reproduserbare, som flere studier har brukt denne metoden4,15.
For å støtte mekanisk resultatene, gjennomgikk noen sener histologiske evaluering. Den hematoxylin-eosin flekker viser en god oversikt over helbredet vev og gir generell informasjon om antall celler og kollagen finnes. Også måling av hydroxyprolin er nyttig som det er en aminosyre som bare finnes i kollagen og lar objectivation av histologiske dataene. Det er imidlertid nødvendig å gjøre en Masson Trichrome flekker, som det viser mye mer detaljert informasjon om avsettelse og konsentrasjonen av kollagen fibrene4.
Selv om nivået av kollagen III mRNA i PRP behandlet sener ble ikke endret, på dag 30 mRNA av Col var jeg til stede i en høyere konsentrasjon i skadet sener behandlet med PRP. Tidligere hadde det vært vist at PRP forstyrrer spredning av makrofager og produksjon av IL-121, som dermed kunne unngå en overdreven inflammatorisk reaksjon i den tidlige fasen av den helbredende prosessen11. Det er mulig at PRP stimulerer spredning, aktivering av metabolske veier og transformasjonen av mesenchymal celler i tenocytes som er aktive.
Høye konsentrasjoner av TNDM i sener av gruppen PRP indikerer at de injiserte molekylene kan tiltrekke celler i blodet og indusere en differensiering mot tenocyte fenotypen11. Til sammen viser disse resultatene at bare en injeksjon PRP i en sprukket akillessene har en positiv effekt på den tidlige helbredende fasen og fører til en høyere mekanisk styrke.
Flere pre kliniske studier har allerede vist at PRP forbedrer helbredelsesprosessen, og at de ulike vekstfaktorer har bestemte handlinger under denne prosessen22. Mazzocca og hans team vist at PRP stimulerer celle spredning i muskler, bein og sener. Av forskjellige preparater, sterkt konsentrert PRP uten noen hvite blodlegemer viste seg for å være den mest effektive behandling23. McCarrell et al. gjorde et lignende eksperiment, teste flere preparater PRP som inneholder ulike konsentrasjoner PRP og hvite blodlegemer på hest sener. Preparater som inneholder en mellomliggende konsentrasjonen av blodplater og en høy konsentrasjon av hvite blodlegemer førte til en høyere versjon av pro-inflammatoriske cytokiner, IL-1ß, TNFa og lavere kollagen syntese. Blandinger med en høy konsentrasjon av blodplater og hvite blodlegemer førte til en økning av inflammatoriske cytokiner men hemmet kollagen syntese. Avslutningsvis betyr dette at hvis blodplater konsentrasjonen er for høy, kollagen syntese og celle metabolismen er bremset ned24. Boswell et al. bekreftet disse funnene25. Den mest effektive PRP forberedelsen dermed inneholder en blodplater konsentrasjon lavere enn 106 blodplater/µL og ingen hvite blodlegemer.
En stor fordel med å bruke PRP er autogenity. Selv om vår studie brukte vi allogene PRP med å ofre donor rotter ha en tilstrekkelig mengde blod. Videre ville tar blod fra styres rotter svekke dem for mye. En annen begrensning av denne studien er at alle brudd som akutt og utføres på sunn sener, hvilke er ikke alltid tilfelle i mennesker, sener ofte brudd på grunn av tidligere degenerasjon. Denne modellen er basert på skarpe sene skader, kan ingen definitive konklusjoner trekkes for degenerative tendinopathies.
Bruker denne metoden, finnes det noen viktige trinn å huske, den første som blir utarbeidelse av PRP, som bør være så reproduserbare som mulig. Et annet viktig skritt er den kirurgiske prosedyren: fjerning av sene og muskel-sene komplekse bør gjøres i en reproduserbar måte å unngå skjevheter. Til slutt, forberedelse til biomekaniske testing: flytende nitrogen legges fryse muskler, og er ganske viktig at sene ikke er frosset i denne prosessen fordi det kan føre til forutinntatte resultater, som sene stivhet ville bli endret. Dette er også en begrensning av studien, siden det er ingen standardisert protokoll slik at den sene elastisitet ikke er endret.
Vi har basert vår metode på metoden utviklet av Virchenko et al. 26, tilpasset men med cryo-kjeven som beskytter sene mot ytre aggresjon forårsaket av klemmer. Hovedfordelen med denne metoden er at det er reproduserbare selv om det ennå ikke er standardisert. Det gir en idé om hvordan sene skader kan behandles hos mennesker, men eksperimenter med rotter ikke oversetter alltid godt til behandling av menneskelige skader. Det er sannsynlig at en tilpasset versjon av denne metoden kan være nyttig i behandling av de skadene i fremtiden, støttet av det faktum at det er enkelt å bruke, har en relativt lav kostnad, og er mindre invasiv enn andre metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av Standard de Liège og Lejeune - Lechien gir av Leon Frédéricq midlene.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xylazine (Xyl-M) | VMD | none | anesthetic |
| Ketamin (Jétamine 1000 CEVA) | CEVA Santé Animale | none | anesthetic |
| Buprenorphin (Vetergésic Multidosis) | ALSTOE | none | Painkiller |
| iso-Betadine | MEDA-Pharma | none | Desinfectant |
| resorbable yarn Vicryl 6/0 | Johnson & Johnson | ||
| Nembutal | CEVA Santé Animale | none | Anesthetic |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Preserves structure of the tissue |
| Isopropanol 100% | VWR | 20,922,364 | |
| Ethanol 95% | VWR | 20,823,362 | |
| Xylene | VWR | 28973.363 | |
| Paraffin | VWR | LEIC3950.1006 | |
| Hematoxylin | Millipore | 1.15938.0025 | Colorant |
| Eosin | Millipore | 1.15935.0100 | Colorant |
| Eukitt | Sigma-Aldrich | 3989 | Mounting Medium |
| CaCl2 |
References
- Kaux, J., Degrave, N., Crielaard, J. Platelet rich plasma traitement des tendinopathies chroniques? Revue de la littérature. Platelet rich plasma treatment of chronic tendinopathies? Review of literature. J. Traumatol. du Sport. 24, 99-102 (2007).
- Anitua, E., et al. Autologous preparations rich in growth factors promote proliferation and induce VEGF and HGF production by human tendon cells in culture. J. Orthop. Res. 23, 281-286 (2005).
- Bosch, G., et al. Effects of platelet-rich plasma on the quality of repair of mechanically induced core lesions in equine superficial digital flexor tendons: A placebo-controlled experimental study. J. Orthop. Res. 28, 211-217 (2010).
- Kaux, J. F., Drion, P., Croisier, J. L., Crielaard, J. M. Tendinopathies and platelet-rich plasma (PRP): From pre-clinical experiments to therapeutic use. J. Stem Cells Regen. Med. 11, P7-P17 (2015).
- Maffulli, N., Wong, J., Almekinders, L. C.
- Molloy, T., Wang, Y., Murrell, G. The roles of growth factors in tendon and ligament healing. Sports Med. 33, 381-394 (2003).
- Lyras, D. N., et al. The effect of platelet-rich plasma gel in the early phase of patellar tendon healing. Arch. Orthop. Trauma Surg. 129, 1577-1582 (2009).
- Aspenberg, P., Virchenko, O. Platelet concentrate injection improves Achilles tendon repair in rats. Acta Orthop. Scand. 75, 93-99 (2004).
- Visser, L. C., et al. Growth Factor-Rich Plasma Increases Tendon Cell Proliferation and Matrix Synthesis on a Synthetic Scaffold: An In Vitro Study. Tissue Eng. Part A. 16, 1021-1029 (2010).
- Zhang, J., Wang, J. H. -C. Platelet-Rich Plasma Releasate Promotes Differentiation of Tendon Stem Cells Into Active Tenocytes. Am. J. Sports Med. 38, 2477-2486 (2010).
- Kajikawa, Y., et al. Platelet-rich plasma enhances the initial mobilization of circulation-derived cells for tendon healing. J. Cell. Physiol. 215, 837-845 (2008).
- Pasternak, B., Aspenberg, P. Metalloproteinases and their inhibitors-diagnostic and therapeutic opportunities in orthopedics. Acta Orthop. 80, 693-703 (2009).
- Dell, R. B., Holleran, S., Ramakrishnan, R.
- Mähler Convenor, M., et al. FELASA recommendations for the health monitoring of mouse, rat, hamster, guinea pig and rabbit colonies in breeding and experimental units. Lab. Anim. 48, 178-192 (2014).
- Kaux, J. -F., et al. Étude comparative de cinq techniques de préparation plaquettaire (platelet-rich plasma). Pathol. Biol. 59, 157-160 (2011).
- Wieloch, P., Buchmann, G., Roth, W., Rickert, M. A cryo-jaw designed for in vitro tensile testing of the healing Achilles tendons in rats. J. Biomech. 37, 1719-1722 (2004).
- Kaux, J. -F., et al. Vascular Endothelial Growth Factor-111 (VEGF-111) and tendon healing: preliminary results in a rat model of tendon injury. Muscles. Ligaments Tendons J. 4, 24-28 (2014).
- Docheva, D., Hunziker, E. B., Fässler, R., Brandau, O. Tenomodulin is necessary for tenocyte proliferation and tendon maturation. Mol. Cell. Biol. 25, 699-705 (2005).
- Lambert, C. A., Colige, A. C., Munaut, C., Lapière, C. M., Nusgens, B. V. Distinct pathways in the over-expression of matrix metalloproteinases in human fibroblasts by relaxation of mechanical tension. Matrix Biol. 20, 397-408 (2001).
- Nurden, A. T., Nurden, P., Sanchez, M., Andia, I., Anitua, E.
- Woodall, J., Tucci, M., Mishra, A., Benghuzzi, H. Cellular effects of platelet rich plasma: a study on HL-60 macrophage-like cells. Biomed. Sci. Instrum. 43, 266-271 (2007).
- Taylor, D. W., Petrera, M., Hendry, M., Theodoropoulos, J. S. A systematic review of the use of platelet-rich plasma in sports medicine as a new treatment for tendon and ligament injuries. Clin. J. Sport Med. 21, 344-352 (2011).
- Mazzocca, A. D., et al. The positive effects of different platelet-rich plasma methods on human muscle, bone, and tendon cells. Am. J. Sports Med. 40, 1742-1749 (2012).
- McCarrel, T. M., Minas, T., Fortier, L. A. Optimization of leukocyte concentration in platelet-rich plasma for the treatment of tendinopathy. J. Bone Joint Surg. Am. 94 (1-8), e143 (2012).
- Boswell, S. G., et al. Increasing platelet concentrations in leukocyte-reduced platelet-rich plasma decrease collagen gene synthesis in tendons. Am. J. Sports Med. 42, 42-49 (2014).
- Virchenko, O., Aspenberg, P. How can one platelet injection after tendon injury lead to a stronger tendon after 4 weeks?: Interplay between early regeneration and mechanical stimulation. Acta Orthop. 77, 806-812 (2006).
