Summary
इस प्रोटोकॉल का वर्णन है कि चूहों में tendons चिकित्सा के मूल्यांकन की प्रक्रिया है कि allogeneic प्लेटलेट रिच प्लाज्मा (पीआरपी) के साथ इंजेक्शन किया गया है या दुखती पट्टा के भाग को हटाने के बाद खारा समाधान । पट्टा चिकित्सा की प्रगति का विश्लेषण के विभिंन प्रकारों का उपयोग कई समय बिंदुओं पर मूल्यांकन किया है ।
Abstract
इस लेख का वर्णन प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं अगर पीआरपी सकारात्मक पट्टा चिकित्सा को प्रभावित कर सकते है निरीक्षण करते थे । वहाँ 4 मुख्य चरणों का पालन करने के लिए कर रहे हैं: दुखती tendons में एक घाव प्रेरित; पीआरपी तैयार है और यह सुई (या खारा समाधान); पट्टा निकालें; और यांत्रिक, आणविक, और ऊतकवैज्ञानिक मूल्यांकन प्रदर्शन करते हैं । हर कदम पर, सभी प्रक्रियाओं और विधियों में विस्तार से वर्णित हैं, ताकि वे आसानी से reproduced किया जा सकता है ।
दुखती tendons शल्य चिकित्सा (एक 5 मिमी लंबे अनुभाग के हटाने) खोदी गई है । बाद में, पीआरपी या खारा समाधान का अध्ययन है कि पीआरपी पट्टा की चिकित्सा पर सकारात्मक प्रभाव पड़ता है इंजेक्शन था । इस अध्ययन में 40 पशुओं के तीन समूह (कुल 120 चूहों का उपयोग किया गया) 2 उपसमूहों में विभाजित किए गए थे: पीआरपी इंजेक्शन समूह और एक खारा इंजेक्शन नियंत्रण समूह । चूहों को बढ़ती समय अंक (समूह एक: 5 दिन में बलिदान किया गया; ग्रुप बी: 15 दिन; समूह सी: 30 दिन) और tendons हटा दिया गया । 90 tendons transcriptomic विश्लेषण प्रदर्शन करने से पहले यांत्रिक परीक्षण किया गया और 30 शेष tendons ऊतकवैज्ञानिक विश्लेषण करने के लिए प्रस्तुत किए गए ।
Introduction
जमावट, भड़काऊ प्रक्रियाओं, और प्लेटलेट्स की उन्मुक्ति मॉडुलन भूमिकाओं को अच्छी तरह से जाना जाता है1. हाल ही में, यह प्रदर्शित किया गया है कि वे भी दृढ संपत्तियों2,3है । वास्तव में, विभिंन साइटोकिंस और वृद्धि कारकों (वीईजीएफ़, PDGF, TGF-बी, IGF-I, और एचजीएफ) प्लेटलेट्स द्वारा दानेदार के दौरान जारी कर रहे हैं । इन विकास कारकों angiogenesis को बढ़ावा देने, ऊतक remodeling, और घाव भरने (हड्डी, त्वचा, मांसपेशी, पट्टा)2। केंद्रापसारक ऑटोलॉगस रक्त प्लेटलेट रिच प्लाज्मा (पीआरपी) जो अलगाव विधि के आधार पर उच्च प्लेटलेट सांद्रता शामिल पैदा करता है (3 और 10 बार रक्त आधारभूत सांद्रता के बीच) । दरअसल, विभिंन पीआरपी तैयारी तकनीक एक समान अंतिम उत्पाद प्रदान नहीं कर सकते । अब तक, इस मुद्दे पर कोई अंतर्राष्ट्रीय सामांय समझौता नहीं किया गया है । कुल मिलाकर, पीआरपी ऐसी tendinopathy, तल fasciitis, पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस के रूप में पुरानी, पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस के इलाज के लिए एक आकर्षक चिकित्सीय विकल्प हो सकता है, और4संघ । यह मौखिक सर्जरी में पहली बार के लिए इस्तेमाल किया गया था और implantology4 में सुधार लाने और एक दंत प्रत्यारोपण रखने के बाद हड्डी चिकित्सा में तेजी लाने के लिए । इस अध्ययन में, हम एक reproducible विधि का वर्णन करते हैं जो पशु प्रयोग4के लिए पीआरपी के अधिग्रहण की अनुमति देता है ।
tendons के घावों के बाद से अक्सर खिलाड़ियों और शारीरिक कार्यकर्ताओं में मनाया जाता है, चिकित्सा की प्रक्रिया को बढ़ाने और इस तरह वसूली के लिए समय को कम करने के महान ब्याज की कर रहे हैं5. नई उपचार विधियों कि विकसित कर रहे है अक्सर विकास कारकों का उपयोग शामिल है, और प्रशासन पीआरपी के एक सरल और ंयूनतम इनवेसिव तरीका है अंतर्जात विकास कारकों की एक मिश्रण देने के लिए4।
इन विट्रो या पशु अध्ययन में कई का प्रदर्शन किया है कि प्लाज्मा के प्रशासन के प्लेटलेट्स के एक उच्च स्तर से युक्त, जैविक मध्यस्थों को रिहा करके, पट्टा और बंधन की मरंमत जैविक मध्यस्थों को रिहा करके उत्तेजित कर सकते है6 ,7,8,9. इसके अलावा, अंय अध्ययनों से पता चला है कि पीआरपी प्रकार मैं और III tendons कोशिकाओं9में कोलेजन संश्लेषण को उत्तेजित कर सकते है,10,11। यह भी सुझाव दिया गया है कि पीआरपी मैट्रिक्स metalloproteinases (MMPs) के सक्रियण में कमी कर सकते है और इसलिए मैट्रिक्स के क्षरण को कम । कोशिकाओं है कि सूजन की प्रक्रिया में शामिल कर रहे हैं एमएमपी-9, जो ऊतक remodeling में एक भूमिका निभाता है उत्पादन कर सकते हैं (शारीरिक और रोग)12सूजन से प्रेरित.
इस जानकारी के आधार पर, हम की कल्पना की है कि चूहों की खोदी दुखती tendons में एक भी पीआरपी इंजेक्शन वसूली की प्रक्रिया में सुधार और मरंमत ऊतक के यांत्रिक शक्ति सकता है । इस वसूली की प्रक्रिया के दौरान उपचार tendons की यांत्रिक गुणों को मापने और ऊतकवैज्ञानिक और आणविक विश्लेषण प्रदर्शन के द्वारा परीक्षण के लिए नए गठन ऊतक में कोलेजन remodeling का मूल्यांकन है । अध्ययन का उद्देश्य अगर allogeneic पीआरपी का एक इंजेक्शन खोदी दुखती tendons की चिकित्सा को प्रभावित कर सकता निरीक्षण था ।
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Protocol
देखभाल और पशुओं की हैंडलिंग देखभाल और प्रयोगशाला जानवरों के राष्ट्रीय विज्ञान अकादमी द्वारा तैयार और स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों (यूएसए) द्वारा प्रकाशित के उपयोग के लिए गाइड के अनुसार प्रदर्शन किया गया । यूरोपीय और राष्ट्रीय कानून का ध्यानपूर्वक पालन किया गया ।
1. पशु तैयारी
- प्रयोग १३२ २ महीने पुराने पुरुष Sprague-Dawley 320-450 जी वजन चूहों (प्रयोग के लिए 120 चूहों और रक्त नमूने के लिए 12 चूहों, चित्रा1) । Dell13के आधार पर, प्रत्येक समूह के लिए 15 चूहों के एक शक्ति के लिए पर्याप्त था 0.8 (80% सांख्यिकीय महत्व को खोजने की संभावना है, अगर निर्दिष्ट प्रभाव मौजूद है) ।
- घर के सभी चूहों शास्त्रीय पिंजरों में अलगाव की स्थिति के तहत एक पारंपरिक एक बदलती स्टेशन से सुसज्जित सुविधा में । एक IVC में प्रजनन भड़काने (व्यक्तिगत हवादार पिंजरे), SPF के साथ (विशिष्ट रोगज़नक़ नि: शुल्क) चूहों विशेष रूप से खरीदा जा रहा है.
- निम्न आवास स्थितियों का उपयोग करें: तापमान सीमा से 19-24 ° c; सापेक्षिक आर्द्रता: 40-60%; वेंटिलेशन: वायु नवीकरण की आवृत्ति: 10-15 प्रति एच; प्रकाश अंधेरे चक्र: 12 ज-12 एच ।
- सभी caging उपकरण निष्फल और विकिरणित बिस्तर का उपयोग करें । प्रणालीबद्ध पिंजरों के अंदर बाँझ गत्ता ट्रे और तौलिए रखकर पिंजरे संवर्धन लागू ।
- प्रतिबंधित शर्तों के तहत क्षेत्र के लिए उपयोग की अनुमति दें: प्रवेश द्वार पर नई लैब कोट, मुखौटा, दस्ताने, जूते, और बाल बोनट ।
- एक वार्षिक आधार पर गंदे बिस्तर पर रखे प्रहरी जानवरों पर कॉलोनी स्वास्थ्य निगरानी कैर्री, पारंपरिक सुविधाओं के लिए Felasa14 सिफारिशों के अनुसार । प्रति पिंजरे में चार से पांच पशु रखें, उपयुक्त विकिरणित आहार के साथ और acidified वाटर एड libitumप्रदान करें । दैनिक निगरानी ।
- सर्जरी से पहले सर्जिकल कमरे 2 एच के लिए शीर्ष पिंजरों को छानने में शल्य चिकित्सा हस्तक्षेप के लिए चुने गए चूहों स्थानांतरण ।
2. शल्य प्रक्रिया
- ठीक कैंची, एक क्लैंप, दो hemostatic clamps, और एक सुई धारक: सर्जिकल उपकरण तैयार करें । सभी प्रक्रियाओं के दौरान, दस्ताने, एक मुखौटा, एक डाकू पहनते हैं, और एक प्रयोगशाला कोट ।
- बेतरतीब ढंग से दो समूहों (पीआरपी और खारा समाधान) में चूहों विभाजित ।
- चूहे को अपने पिंजरे से बाहर निकालकर उसका वजन करें । चूहों को पहचानने के लिए क्रमांकित कान टैग का उपयोग करें । आंखों के सुखाना से बचने के लिए कॉर्निया पर waterdrops लगाएं ।
- Anesthetize चूहा intraperitoneally के साथ xylazine (10 मिलीग्राम/किलो वजन के शरीर) और ketamine (80 मिलीग्राम/ anesthetization की पुष्टि करने के लिए, कार्डियो-श्वसन निगरानी के तहत जानवरों की जगह और किसी भी आंख सजगता के लिए जाँच करें ।
- एक दर्द निवारक के रूप में गर्दन के क्षेत्र में 50 µ एल buprenorphine के चमड़े के नीचे (0.01-0.05 मिलीग्राम/
- एक बिजली की हजामत बनाने का यंत्र के साथ छोड़ दिया हिंद अंग दाढ़ी, यह आईएसओ-betadine के 3 बारी सफ़ाई के साथ संक्रमित/शराब (1:10) समाधान और एक विदारक खुर्दबीन के नीचे एक गर्म पैड (20 डिग्री सेल्सियस) पर चूहे की जगह । पार्श्व decubitus पर पैर के साथ चूहा एक बेहतर स्थिति में संचालित होने के लिए जगह है । सर्जिकल संदंश के साथ पंजा पकड़ो ।
- कैंची का प्रयोग, एक छोटा सा पार्श्व चीरा (20-25 mm) बाईं दुखती tendons के आसपास की त्वचा में बनाने के लिए, और काटना ठीक कैंची का उपयोग करने के लिए दुखती पट्टा परिसर (चित्र 2a) का पर्दाफाश प्रावरणी ।
- कैंची की एक जोड़ी (चित्रा बी) के साथ plantaris पट्टा निकालें ।
- अपनी एड़ी प्रविष्टि को 5 मिमी समीपस्थ दुखती transversally काट और एक 5 मिमी लंबे भाग कैंची का उपयोग कर हटा दें । पट्टा टांका नहीं (चित्रा 2c2d) ।
- प्रावरणी टांका और फिर resorbable यार्न के साथ त्वचा एक overjet टांका (सतत सीवन) कर रही है । Monofilament टांके के रूप में अच्छी तरह से इस्तेमाल किया जा सकता है शल्य चीरा में बाती त्वचा से रोकने के लिए ।
- जागे होने तक एक हीटिंग लैंप के नीचे चूहा रखें और फिर एक पिंजरे में चूहे को पीछे की जगह (58 x 38 सेमी) (नोटा बेणे: कोई स्थिरीकरण नहीं लगाया जाता है) ।
3. पीआरपी की तैयारी15
- Anesthetize xylazine के साथ दाता चूहों intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा (10 मिलीग्राम/किलोग्राम शरीर के वजन) और ketamine (80 मिलीग्राम/ बिना किसी री-संवेदनाहारी के पीआरपी इंजेक्शन को 2 एच के बाहर किया जाता है ।
- एक दर्द निवारक के रूप में buprenorphine के 50 µ एल सुई ।
- पूरे रक्त (20 चूहे प्रति मिलीलीटर, अंतिम रक्तस्राव) हृदय पंचर से बाँझ ट्यूबों जिसमें 3.2% बफ़र्ड सोडियम साइट्रेट (०.१०९ मीटर, थक्कारोधी) ले लीजिए । इसके बाद intracardiac इंजेक्शन द्वारा चूहे को euthanize ।
- पीआरपी प्राप्त करने के लिए, 150 x जी और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए रक्त केंद्रापसारक । यह प्रारंभिक कम गति केंद्रापसारक कदम दो अलग चरणों पैदावार: एक कम लाल रक्त कोशिकाओं (RBCs) से मिलकर चरण है कि कुल मात्रा के बारे में 80-90% के लिए खातों, और एक ऊपरी प्लेटलेट युक्त प्लाज्मा (पीआरपी) से मिलकर चरण (आमतौर पर रक्त का 10-20% नमूना) ।
- धीरे एक प्लास्टिक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग कर एक माध्यमिक प्लास्टिक ट्यूब में पीआरपी (ऊपरी चरण) इकट्ठा । के रूप में पीआरपी और लाल रक्त कोशिकाओं के बीच इंटरफेस बहुत ढीला है, नहीं पिपेट भी अंतरफलक के पास । जब ठीक से संभाला, पीआरपी में दूषित RBCs 0.05 x 103 कोशिकाओं/µ l शेष निचले चरण और प्राथमिक रक्त संग्रह ट्यूब त्यागें ।
- एकत्र पीआरपी की मात्रा का निर्धारण और एक रुधिर विश्लेषक पर प्लेटलेट काउंट को मापने । इन मूल्यों के अगले चरण में प्लेटलेट एकाग्रता समायोजित करने के लिए गणना के लिए आवश्यक हैं । एक रक्त कोशिका गिनती भी RBCs और WBCs के साथ संभावित संदूषण का मूल्यांकन करने के लिए उपयोगी है । इस स्तर पर पीआरपी में प्लेटलेट एकाग्रता सामान्यतया 1 – 1.5 x106/µ l
- 1,000 x g और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए पीआरपी की एक दूसरी केंद्रापसारक प्रदर्शन । इस उच्च गति के केंद्रापसारक कदम एक ढीला प्लेटलेट गोली और एक ऑटोलॉगस प्लेटलेट गरीब प्लाज्मा (पीपीपी) से मिलकर एक supernatant पैदावार । चरण 3.6 में निर्धारित मूल्यों का उपयोग करना, supernatant की मात्रा की गणना करने के लिए पीआरपी ध्यान छोड़ दिया और 2.5 x10 के एक अंतिम एकाग्रता तक पहुंचने के लिए6/µ l
- धीरे supernatant (पीपीपी) एक माध्यमिक प्लास्टिक ट्यूब में एक प्लास्टिक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग कर ले लीजिए, अंतिम 3.7 चरण में गणना की मात्रा के दो तिहाई के बारे में जा रहा है । गोली ढीला है, जब पीपीपी छोड़ दिया है, प्लेटलेट्स की एक महत्वपूर्ण मात्रा खो जाता है, इसलिए संभावित अंतिम वांछित एकाग्रता को कम करने ।
- ध्यान से कोमल दोहराया pipetting द्वारा शेष supernatant के साथ प्लेटलेट गोली reसस्पेंड । इस केंद्रित पीआरपी पर प्लेटलेट काउंट को मापने । यदि आवश्यक हो, अंतिम लक्ष्य एकाग्रता तक पहुंचने के लिए ऑटोलॉगस पीपीपी के उचित मात्रा में जोड़ें ।
नोट: तैयारी के 3 ज के भीतर पीआरपी का प्रयोग करें । - प्लेटलेट्स सक्रिय करने के लिए पीआरपी के 50 µ l को CaCl2 (11 mEq 10 एमएल) के प्रति मिलीलीटर जोड़ें ।
- तैयार करने के बाद 1 ज के बारे में टांका आपरेशन साइट में सीधे एक 21G सुई के साथ ताजा पीआरपी या खारा समाधान के 50 µ एल इंजेक्षन । इस समय के दौरान, कमरे के तापमान पर पीआरपी रखें ।
- सर्जरी के बाद के दिनों के दौरान बारीकी से चूहों के कार्यात्मक वसूली की निगरानी और दुखती tendons को हटाने से पहले.
4. दुखती में से हटाना पट्टा और यांत्रिक परीक्षण16
- 5, 15, या 30 दिन बाद5, चूहे को तौलना । फिर, xylazine के साथ anesthetize (10 मिलीग्राम/शरीर के वजन के किलोग्राम) और ketamine (80 मिलीग्राम/किलोग्राम शरीर के वजन) द्वारा intraperitoneal इंजेक्शन ।
- एक दर्द निवारक के रूप में buprenorphine के 50 µ एल सुई । पशु त्याग करने से पहले के रूप में संभव के रूप में लंबे समय के लिए शारीरिक स्थितियों रखने के लिए पट्टा निकालें ।
- वाम हिंद अंग दाढ़ी और एक विदारक खुर्दबीन के नीचे चूहे की जगह । पार्श्व decubitus पर पैर के साथ चूहा एक बेहतर स्थिति में संचालित होने के लिए जगह है । पंजा को उँगलियों से पकड़ो ।
- पिछले आपरेशन साइट में एक छोटा सा चीरा (10 मिमी) बनाओ और triceps suralis उजागर होने तक विस्तार ।
- के लिए चिकित्सा दुखती tendons को हटाने के लिए, एड़ी हड्डी transversally 5-10 मिमी अपनी दुखती tendons लगाव के लिए बाहर कट । फिर काटना triceps suralis का एक हिस्सा है, जो दुखती पट्टा (चित्र बी) से जुड़ा हुआ है । मांसपेशी हिस्सा काफी बड़ा करने के लिए क्रायो-जबड़े में फिट हो गया है (आंकड़ा 3सी-डी) । नमूना क्रायो-जबड़े में तुरंत जगह संदंश का उपयोग (चित्रा 3e) ।
- मांसपेशी-पट्टा हड्डी परिसर को हटाने के बाद, Nembutal के साथ intracardiac इंजेक्शन द्वारा चूहे euthanize (200 मिलीग्राम/ दिल ताल और 15 मिनट के लिए श्वसन के अभाव का आकलन करके मौत की पुष्टि करें ।
- ऊपरी जबड़े में मांसपेशी इकाई प्लेस (चित्रा 3e), इसे बंद करो और यह एक सार्वभौमिक परीक्षण मशीन (१०६.२ केएन, चित्रा 3) में खड़ी जगह है । इसके बाद मशीन के निचले clamps (फिगर 3f) के बीच की हड्डी को ठीक करें ।
- मांसपेशियों को फ्रीज करने के लिए ऊपरी जबड़े घाटियों के दोनों में तरल नाइट्रोजन जोड़ें, इतना है कि यह tendons से कड़ी परिमाण के एक आदेश है और तन्यता परीक्षण के दौरान ख़राब नहीं है ।
- जब ठंड क्षेत्र धातु दबाना सीमा तक पहुंच जाता है, तन्यता परीक्षण शुरू, तो पट्टा अपनी संरचना की रक्षा करेगा । मशीन की विस्थापन दर को टूटना जब तक 1 मिमी की एक निरंतर गति पर सेट करें । एक कंप्यूटर पर ंयूटन (N) में दी गई अंतिम तंयता ताकत (यूटीएस) रिकॉर्ड ।
- पार अनुभागीय क्षेत्र की गणना करने के लिए, दो कैमरों एक दूसरे के लिए सीधा जगह, एक अंडाकार आकार बनाने, और तस्वीरें ले लो ।
- उपचार tendons के पार-अनुभागीय क्षेत्र में अंतर के लिए खाते में, एक इकाई क्षेत्र (N प्रति वर्ग मिलीमीटर), जो यांत्रिक ऊतकों द्वारा अनुभवी तनाव का प्रतिनिधित्व करता है यूटीएस सामान्य ।
5. ऊतकवैज्ञानिक विश्लेषण
नोट: प्रत्येक समूह के 15 tendons ऊतकवैज्ञानिक विश्लेषण से गुजरा ।
- इसके हटाने के बाद, दुखती tendons को तुरंत 4% paraformaldehyde में जलमग्न अपनी संरचना की रक्षा के लिए (ऊतक के 1 मिमी प्रति घंटे तय है, तो निर्धारण के समय पट्टा के आकार के आधार पर बदलता है) ।
- paraformaldehyde को 70% इथेनॉल से बदलें, और इस समाधान में कम से एक रात के लिए नमूना छोड़ दें ।
- छेद और जगह है कि एक ताजा 70% इथेनॉल समाधान में कंटेनर के साथ एक छोटे प्लास्टिक कंटेनर में पट्टा प्लेस 1 एच ।
- 1 ज. दोहराने के लिए 95% इथेनॉल में कंटेनर प्लेस ।
- 1 ज. दोहराने के लिए 100% इथेनॉल में कंटेनर प्लेस ।
- कंटेनर को 1 h. दोहराव के लिए 100% xylene में रखें ।
- अब प्लास्टिक कंटेनर, जो तरल तेल (56 डिग्री सेल्सियस) में पट्टा शामिल है, और यह रात भर छोड़ दें ।
- एक एंबेडिंग स्टेशन का उपयोग करना (पिघला हुआ मोम, एक गर्म प्लेट, और एक ठंडी थाली के साथ सुसज्जित), एक धातु मोल्ड का चयन करें कि सबसे अच्छा ऊतक नमूने फिट बैठता है, और यह एक छोटे तरल तेल के साथ इतना भर है कि आधार कवर किया जाता है ।
नोट: मालूम microtome पर अनुलंब अनुभागों को प्राप्त करने के लिए नमूना है । - जब नमूना सही ढंग से तैनात है, तरल तेल के साथ मोल्ड भरें और यह प्रशीतन मशीन पर जगह है । चलो इसे नीचे से कम 15 मिनट के लिए ठंडा ।
- आयल ब्लॉक से निकालें और यह बर्फ पर कम से कम 30 मिनट के लिए जगह है ।
- कई साफ गिलास स्लाइड तैयार करें और उन पर पानी की कुछ बूंदें डाल दिया ।
- microtome में, 5 µm के वर्गों में ब्लॉक काट (केवल पट्टा के मध्य भाग से वर्गों का उपयोग करें) और एक स्लाइड पर अनुभाग जगह है ।
- कई मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर एक हीटिंग ओवन में स्लाइड प्लेस, ताकि तेल सिर्फ कांच के लिए ऊतक बंधन को पिघलने के लिए शुरू होता है ।
- एक स्लाइस धारक में आयल सेक्शन युक्त स्लाइड रखें ।
- अब deparaffinize और यह निम्नलिखित क्रमिक स्नान में रखकर ऊतक reहाइड्रेट:
Xylene में 8 मिनट (स्नान 1)
Xylene में 4 मिनट (स्नान 2)
100% इथेनॉल में 2 मिनट
95% इथेनॉल में 2 मिनट
70% इथेनॉल में 2 मिनट
पानी में 2 मिनट - Hematoxylin-Eosin धुंधला के लिए, निम्न समाधानों में ऊतक रखें ।
- hematoxylin समाधान में 8 मिनट के लिए ऊतक विसर्जित (1 g hematoxylin मोनोहाइडे, 0.2 g किो3, 50 g AIK (सू4)2. 12घं2O; 200 मिलीलीटर ग्लिसरीन; आसुत जल के साथ 1 L को समायोजित करें) ।
- नल का पानी चल रहा है के तहत 8 मिनट के लिए ऊतक विसर्जित ।
- eosin समाधान में 30 एस के लिए ऊतक विसर्जित (पतला एसिटिक एसिड की 200 µ एल युक्त आसुत जल के 100 मिलीलीटर में 0.25% eosin) ।
- नल का पानी चलाने के तहत 2 मिनट के लिए ऊतक विसर्जित कर दिया ।
- Masson के Trichrome धुंधला के लिए, इन चरणों का पालन करें ।
- निर्जलीकरण के बाद, अनुभागों को एक कंटेनर में लौह फिटकिरी (0.5 g (NH4) Fe (इतना4)2. 12घं2o में 10 मिलीलीटर एच2o) में रखें और कंटेनर को बंद करें । यह एक माइक्रोवेव में 280 डब्ल्यू में 3 मिनट के लिए हीट ।
- यह एक मिनट के लिए शांत हो जाओ और फिर यह पानी के साथ कुल्ला ।
- Regaud के hematoxylin सॉल्यूशन के साथ एक बंद कंटेनर में सेक्शन रखें (0.5 g hematoxylin को 50 एमएल में 50 ml H2में भंग करें, फिर 5 मिलीलीटर 95% इथेनॉल और 5 मिलीलीटर ग्लिसरीन डालें), 90 एस के लिए इसे गरम करें 280 W पर ।
- यह पानी के साथ कुल्ला ।
- एक picric एसिड समाधान में वर्गों प्लेस (मेथनॉल में संतृप्ति पर) 3 मिनट के लिए, नल का पानी चलाने के तहत 5 मिनट के लिए कुल्ला और फिर यह कुछ सेकंड के लिए जल में जगह है ।
- अब एसिड fuchsin में खंड (0.5 जी में 50 मिलीलीटर एच2O में 0.25 मिलीलीटर पतला एसिटिक एसिड) 5 एस के लिए जगह और कुल्ला के तहत नल का पानी चलाने तक डाई गायब हो जाता है ।
- phosphomolybdic एसिड समाधान में वर्गों की मशीन (0.5 g में 50 एमएल एच2O) 5 मिनट के लिए, यह कुछ सेकंड के लिए जगह में पानी ।
- वर्गों को हल्के हरे रंग में रखें (0.5 g में 50 एमएल एच2O पतला एसिटिक एसिड की 0.25 मिलीलीटर युक्त) एक और 5 मिनट के लिए समाधान और डाई गायब हो जाता है जब तक नल का पानी चलाने के तहत यह जगह है ।
- अब ऊतक फिर से निर्जलीकरण ।
- 70% इथेनॉल में 1 मिनट के लिए अनुभाग विसर्जित कर दिया ।
- 95% इथेनॉल में 1 मिनट के लिए अनुभाग विसर्जित कर दिया ।
- 100% इथेनॉल में 1 मिनट के लिए अनुभाग विसर्जित कर दिया ।
- Xylene (स्नान 1) में 1 मिनट के लिए अनुभाग विसर्जित कर दिया ।
- Xylene (स्नान 2) में 1 मिनट के लिए अनुभाग विसर्जित कर दिया ।
- बहुत अधिक xylene को हटाने और नमूने पर बढ़ते मध्यम की एक बूंद डाल के बिना वर्गों निकालें ।
- शीर्ष पर एक coverslip रखो (किसी भी बुलबुले भड़काने के बिना) और इसे करने के लिए कठोर कम से 2 ज ।
- Hydrolyze 5 ऊतकवैज्ञानिक वर्गों (एक अलग पट्टा के प्रत्येक) 6 एन एचसीएल में प्रत्येक समूह के 3 एच के लिए और 5 µm unसना हुआ वर्गों में एक सूचकांक के रूप में hydroxyproline को मापने के द्वारा कोलेजन की एकाग्रता का निर्धारण ।
- निर्माता के सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके अनुभाग क्षेत्र द्वारा परिणामों को सामान्य करना.
- प्रकाश हरे रंग के साथ कुछ वर्गों के दाग को कल्पना और कंप्यूटर असिस्टेड विश्लेषण से fibrillar कोलेजन यों ।
- वर्गों को स्कैन और IrfanView सॉफ्टवेयर का उपयोग कर ग्रे की बारीकियों में चित्रों को परिवर्तित. अर्द्ध-ठहराव के लिए सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें (उदा., मात्रा एक) ।
6. आणविक मूल्यांकन
- पट्टा टूटना के बाद, जो यांत्रिक परीक्षण के दौरान होता है, नमूने लेने, स्नैप उन्हें तरल नाइट्रोजन में फ्रीज, और उन पर स्टोर-80 डिग्री सेल्सियस (पीआरपी और खारा समाधान)17.
- कुल आरएनए17को अलग करने के लिए एक वाणिज्यिक कुल आरएनए किट का उपयोग करें ।
- उपाय कोलेजन की अभिव्यक्ति (कर्नल मैं और कर्नल III), मैट्रिक्स Metalloproteinases (एमएमपी-2, एमएमपी-3 और एमएमपी-9), और tenomodulin (TNMD) द्वारा आरटी-पीसीआर17,18।
- 28S19के स्तर तक mRNA के व्यंजक स्तरों को सामान्य करें ।
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Representative Results
परिणाम मतलब के अर्थ ± मानक विचलन के रूप में व्यक्त कर रहे हैं और प्रसरण (ANOVA) के विश्लेषण के साथ तुलना की गई । एक दो तरह की ANOVA और पोस्ट हॉक टेस् ट डे Scheffé, जो कि एक पैरामीट्रिक टेस् ट है, का इस् तेमाल किया गया ।
चूहों की गैर घायल दुखती tendons का टूटना भड़काने के लिए आवश्यक अंतिम तंयता ताकत (यूटीएस) ४२.० ± 5.7 n (n = 10) था । तन्य शक्ति काफी बढ़ गई (p < 0.0001) दिन 5 के बाद दोनों समूहों में । दोनों समूहों की तुलना, यूटीएस पीआरपी समूह में किसी भी समय मापा, विशेष रूप से दिन में उच्च था 15 और 30 । इस पार से मापने के लिए tendons कि यांत्रिक मूल्यांकन के दौर से गुजर से पहले हटा दिया गया के अनुभागीय क्षेत्र (11.4 ± 5.5 mm2 गैर के लिए-घायल tendons), यह पाया गया कि 5 दिन, यह खारा इलाज समूह में बड़ा था । लेकिन दिन में 15 और 30, क्रॉस-अनुभागीय क्षेत्र पीआरपी समूह में बड़ा था, हालांकि यह मात्रा खारा इलाज समूह (चित्रा 4 और चित्रा 5) की तुलना में अधिक चर रहा था.
tendons की ऊतकवैज्ञानिक मूल्यांकन, hematoxylin-eosin धुंधला का उपयोग कर, 5 दिन में एक उच्च सेलुलर का पता चला है, जो बाद में कमी आई (कोई महत्वपूर्ण अंतर खारा समाधान और पीआरपी समूह के बीच मनाया गया) । Masson के Trichrome धुंधला ने पीआरपी ग्रुप में 5 और 15 दिन में fibrillar कोलेजन की अधिक उपस्थिति दिखाई । हालांकि दाग की तीव्रता दोनों समूहों में समान रूप से 30 दिनों के इंजेक्शन के बाद (चित्रा 6) था । अर्द्ध हल्के हरे रंग के साथ नमूने धुंधला द्वारा प्राप्त ठहराव से पता चला कि 5 दिन और 15, तीव्रता पीआरपी समूह में उच्च था (सांख्यिकीय महत्वपूर्ण नहीं), लेकिन 30 दिन में, वहां कोई अंतर नहीं था दो समूहों के बीच मनाया ।
डेटा एक एमिनो एसिड की मात्रा को मापने के द्वारा सामान्यीकृत किया गया था, hydroxyproline, जो कोलेजन के लिए विशिष्ट है, ऊतकवैज्ञानिक अर्द्ध ठहराव (दिन 5: पीआरपी समूह में बड़ा मूल्य) की पुष्टि. कोलेजन एकाग्रता पीआरपी समूह में स्थिर नहीं था, लेकिन दो समूहों में 30 दिन में स्थिर था । घट्टा की मात्रा मापा गया था और उपचार की प्रक्रिया के पहले चरण के दौरान पीआरपी का इलाज पशुओं में काफी बड़ा हो पाया गया था । एक साथ ले लिया, इन परिणामों का मतलब है कि घायल tendons में पीआरपी इंजेक्शन fibrillar कोलेजन का एक महत्वपूर्ण राशि जमा करने के लिए कारण बनता है ।
कई अणुओं की अभिव्यक्ति स्तर को मापने से पता चला कि गैर में घायल tendons, कर्नल III और TNMD एक कम राशि में मौजूद थे (2.5-3.0 टाइंस) 15 दिन में उपचार tendons में से, लेकिन वहां कर्नल मैं समूहों के बीच अभिव्यक्ति में कोई फर्क नहीं था । MMPs एक 12 में मौजूद थे उपचार tendons में उच्च एकाग्रता गुना । इसके अलावा, 30 दिन में, पीआरपी समूह में COL1A1 की एक महत्वपूर्ण वृद्धि हुई थी, और COL1A1 अभिव्यक्ति और यूटीएस के बीच एक सकारात्मक संबंध पाया गया । दोनों समूहों में, यह पाया गया कि कर्नल III 1 दिन से एक उच्च मात्रा में 14 दिन तक व्यक्त किया गया था, इससे पहले कि यह कम (दोनों समूहों के लिए एक ही) । एमएमपी-9 एकाग्रता दोनों समूहों में परिवर्तन नहीं किया, लेकिन एमएमपी-2 और एमएमपी-3 चिकित्सा अवधि के दौरान उच्च सांद्रता में मौजूद थे । 5 दिन में, TNDM पीआरपी (p < 0.03) में एक उच्च राशि में व्यक्त किया गया था लेकिन फिर दिन 15 और 30 के बीच में कमी आई ।
चित्रा 1: अध्ययन के प्रायोगिक डिजाइन. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2: शल्य प्रक्रिया ।
(क) आसपास के प्रावरणी को हटाने के बाद पट्टा परिसर ।
(ख) plantaris पट्टा के हटाने ।
(ग) की दुखती लकीर के एक वर्ग को हटाना ।
(घ) 2 tendons कि हटा दिया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 3: यांत्रिक परीक्षण
(a) यूनिवर्सल परीक्षण मशीन (१०६.२ केएन) ।
(ख) मांसपेशी-पट्टा-हड्डी जटिल है कि क्रायो-जबड़े में तय हो जाएगा ।
(ग) ऊपरी और निचले क्रायो जबड़ा
(घ) ऊपरी और निचले क्रायो-जबड़ा
(ङ) क्रायो जबड़े में रखा परिसर
(च) बंद क्रायो-मांसपेशियों से युक्त जबड़े-पट्टा हड्डी जटिल मशीन में तय की । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 4: यांत्रिक परीक्षण के परिणाम
तन्यता शक्ति ंयूटन में व्यक्त (एन) नियंत्रण और पीआरपी समूहों में अलग समय पर सर्जरी के बाद अंक । वहां समय के साथ दोनों समूहों में यूटीएस की वृद्धि हुई, पीआरपी 15 और 30 दिनों में सर्जरी के बाद काफी अधिक मूल्य दिखा समूह के साथ ।
त्रुटि पट्टी मानक विचलन (SD) को परिभाषित करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 5: यांत्रिक परीक्षण के परिणाम
पट्टा के अनुप्रस्थ क्षेत्र वर्ग मिलीमीटर में व्यक्त (मिमी2) । 15 दिन तक पीआरपी समूह में क्रॉस-सेक्शनल एरिया काफी अधिक था. बाद में, अनुभाग दोनों समूहों में समान था ।
त्रुटि पट्टी मानक विचलन (SD) को परिभाषित करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 6: ऊतकवैज्ञानिक परिणाम
प्रतिनिधि नियंत्रण और पीआरपी समूहों से दुखती tendons की अनुदैर्ध्य वर्गों, Masson Trichrome के साथ सना हुआ । स्केल बार = 100 µm । 5 दिन में पीआरपी समूह के tendons में मजबूत हरी दाग है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
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Discussion
प्लेटलेट्स पट्टा चिकित्सा प्रक्रिया के प्रारंभिक भड़काऊ चरण के लिए आवश्यक हैं । जब इन प्लेटलेट्स बाध्यकारी ऊतक या कारक है कि जमावट प्रेरित करने के लिए उजागर कर रहे हैं, वे विकास कारक है कि α granules में स्टॉक कर रहे है जारी करेंगे । इस बातचीत के कारण extracellular मैट्रिक्स अणुओं synthetized और mesenchymal कोशिकाएँ पैदा करना हैं. प्लेटलेट्स भी रक्त परिसंचरण में जनक कोशिकाओं पर एक chemotactic गतिविधि है, बढ़ाने angiogenesis और उत्तेजक सेलुलर भेदभाव6,20।
यांत्रिक परीक्षण विशेष रूप से चूहों में दुखती tendons के पूर्व vivo तन्यता परीक्षण के लिए बनाया गया एक clamping डिवाइस का उपयोग किया गया था15. क्रायो-जबड़े तरल नाइट्रोजन जोड़कर मांसपेशियों की ठंड की अनुमति देता है, और एड़ी हड्डी, जो नमूना के निचले हिस्से है, सीधे मशीन में तय की है । यह बहुत महत्वपूर्ण है तंयता परीक्षण शुरू जब मांसपेशी पूरी तरह से कठोर है, लेकिन पट्टा अभी भी लचीला है । इस तकनीक ऊतक नुकसान से बचा जाता है और यांत्रिक अखंडता को बरकरार रखता है । इसके अलावा इस तकनीक सरल, सुरक्षित, गैर संपीड़न है, और प्रदर्शन reproducible, के रूप में कई अध्ययनों से इस विधि का इस्तेमाल किया है4,15।
यांत्रिक परिणामों का समर्थन करने के लिए, कुछ tendons ऊतकवैज्ञानिक मूल्यांकन से गुजरा । hematoxylin-eosin धुंधला चंगा ऊतक के एक महान सिंहावलोकन से पता चलता है और कोशिकाओं और कोलेजन वर्तमान की मात्रा के बारे में सामांय जानकारी देता है । इसके अलावा, hydroxyprolin के माप के रूप में यह एक एमिनो एसिड ही कोलेजन में पाया जाता है और ऊतकवैज्ञानिक डेटा के objectivation की अनुमति देता है उपयोगी है । हालांकि, यह एक Masson Trichrome धुंधला करना आवश्यक है, के रूप में यह जमाव और कोलेजन फाइबर की एकाग्रता के बारे में बहुत अधिक विस्तृत जानकारी से पता चलता है4।
हालांकि कोलेजन III mRNA के पीआरपी का इलाज tendons में स्तर को बदल नहीं था, 30 दिन में कर्नल के mRNA मैं घायल tendons पीआरपी के साथ इलाज में एक उच्च एकाग्रता में उपस्थित थे । पहले यह दिखाया गया था कि पीआरपी मैक्रोफेज के प्रसार और IL-121है, जो इस प्रकार उपचार प्रक्रिया11के प्रारंभिक दौर के दौरान एक अत्यधिक भड़काऊ प्रतिक्रिया से बचने सकता है के उत्पादन के साथ हस्तक्षेप । यह संभव है कि पीआरपी प्रसार को उत्तेजित करता है, चयापचय मार्ग के सक्रियकरण, और tenocytes में mesenchymal कोशिकाओं के परिवर्तन है कि सक्रिय हैं ।
TNDM के पीआरपी समूह के tendons में उच्च सांद्रता संकेत मिलता है कि इंजेक्शन अणुओं रक्त प्रवाह में परिचालित कोशिकाओं को आकर्षित करने और tenocyte phenotype की ओर एक भेदभाव प्रेरित सकता है11। एक साथ ले लिया, इन परिणामों का प्रदर्शन है कि एक उठी हुई दुखती tendons में केवल एक पीआरपी का इंजेक्शन जल्दी चिकित्सा चरण पर एक सकारात्मक प्रभाव पड़ता है और एक उच्च यांत्रिक शक्ति की ओर जाता है ।
कई पूर्व नैदानिक अध्ययनों से पहले ही पता चला है कि पीआरपी चिकित्सा प्रक्रिया में सुधार, और है कि विभिंन विकास कारकों इस प्रक्रिया के दौरान22विशिष्ट क्रिया है । Mazzocca और उनकी टीम का प्रदर्शन किया है कि पीआरपी मांसपेशियों, हड्डियों में सेल प्रसार को उत्तेजित करता है, और tendons । अलग तैयारी से, किसी भी सफेद रक्त कोशिकाओं के बिना दृढ़ता से ध्यान केंद्रित पीआरपी सबसे प्रभावी उपचार23साबित हुआ । McCarrell एट अल. एक समान प्रयोग किया था, पीआरपी के कई तैयारियों और घोड़े tendons पर सफेद रक्त कोशिकाओं के विभिंन सांद्रता युक्त परीक्षण । प्लेटलेट्स की एक मध्यवर्ती एकाग्रता और सफेद रक्त कोशिकाओं के एक उच्च एकाग्रता युक्त समर्थक भड़काऊ साइटोकिंस, जैसे IL-1ß और TNFa, और कम कोलेजन संश्लेषण के एक उच्च रिहाई के लिए नेतृत्व की तैयारी । प्लेटलेट्स और सफेद रक्त कोशिकाओं की एक उच्च एकाग्रता के साथ मिश्रण भी भड़काऊ साइटोकिंस की वृद्धि हुई है लेकिन हिचक कोलेजन संश्लेषण के लिए नेतृत्व किया । अंत में इसका मतलब यह है कि अगर प्लेटलेट एकाग्रता बहुत अधिक है, कोलेजन संश्लेषण और सेल चयापचय धीमा कर रहे हैं24. Boswell एट अल. इन निष्कर्षों की पुष्टि की25। सबसे कुशल पीआरपी तैयारी इस प्रकार एक प्लेटलेट एकाग्रता से कम शामिल होगा 106 प्लेटलेट्स/µ l और कोई सफेद रक्त कोशिकाओं.
पीआरपी का उपयोग करने का एक बड़ा लाभ autogenity है । हालांकि हमारे अध्ययन में हमने दाता चूहों को त्याग कर allogeneic पीआरपी का इस्तेमाल किया जिससे पर्याप्त मात्रा में खून पहुंच रहा है । इसके अलावा, संचालित चूहों से खून ले उंहें बहुत ज्यादा कमजोर होगा । इस अध्ययन की एक और सीमा है कि सभी टूटना गंभीर है और स्वस्थ tendons है, जो हमेशा मनुष्य में मामला नहीं है पर प्रदर्शन किया, के रूप में tendons अक्सर क्योंकि पहले अध: पतन के टूटना । इस मॉडल तेज tendons चोटों के आधार पर किया जा रहा है, कोई निश्चित निष्कर्ष अपक्षयी tendinopathies के लिए तैयार किया जा सकता है ।
इस विधि का प्रयोग, वहां कुछ महत्वपूर्ण कदम को याद है, पहले एक पीआरपी की तैयारी की जा रही है, जो के रूप में संभव के रूप में reproducible होना चाहिए रहे हैं । एक और महत्वपूर्ण कदम शल्य प्रक्रिया है: पट्टा और मांसपेशी के हटाने-पट्टा जटिल एक reproducible तरह से किसी भी पूर्वाग्रह से बचने के लिए किया जाना चाहिए । अंत में, यांत्रिक परीक्षण के लिए तैयारी: तरल नाइट्रोजन मांसपेशी फ्रीज करने के लिए जोड़ा गया है, और यह काफी महत्वपूर्ण है कि इस प्रक्रिया में पट्टा जम नहीं है, क्योंकि यह पक्षपातपूर्ण परिणाम के लिए नेतृत्व कर सकता है, के रूप में पट्टा कठोरता बदल जाएगा । यह भी अध्ययन की एक सीमा है, के बाद से वहां कोई मानकीकृत प्रोटोकॉल को सुनिश्चित करना है कि है tendons लोच संशोधित नहीं है ।
हम Virchenko एट अलद्वारा विकसित विधि पर हमारे विधि आधारित है । 26, लेकिन यह क्रायो-जबड़े जो बाहरी clamps द्वारा प्रेरित आक्रामकता के खिलाफ पट्टा की रक्षा का उपयोग कर अनुकूलित । इस विधि का प्रमुख लाभ यह है कि यह reproducible है भले ही यह अभी तक मानकीकृत नहीं है । यह कैसे tendons चोटों के बारे में एक विचार देता है मनुष्यों में इलाज किया जा सकता है, हालांकि चूहों के साथ प्रयोग हमेशा अच्छी तरह से अनुवाद नहीं मानव चोटों के इलाज के लिए । यह संभावना है कि इस विधि के एक अनुकूलित संस्करण भविष्य में उन चोटों के इलाज में उपयोगी हो सकता है, तथ्य यह है कि यह प्रयोग करने में आसान है द्वारा समर्थित है, एक अपेक्षाकृत कम लागत है, और अंय तरीकों की तुलना में कम आक्रामक है ।
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Disclosures
ब्याज का कोई विरोध नहीं घोषित ।
Acknowledgments
इस अध्ययन को लियोन Frédéricq फंड के स्टैंडर्ड डि Liège और Lejeune-Lechien पलाश ने सपोर्ट किया था ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xylazine (Xyl-M) | VMD | none | anesthetic |
| Ketamin (Jétamine 1000 CEVA) | CEVA Santé Animale | none | anesthetic |
| Buprenorphin (Vetergésic Multidosis) | ALSTOE | none | Painkiller |
| iso-Betadine | MEDA-Pharma | none | Desinfectant |
| resorbable yarn Vicryl 6/0 | Johnson & Johnson | ||
| Nembutal | CEVA Santé Animale | none | Anesthetic |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Preserves structure of the tissue |
| Isopropanol 100% | VWR | 20,922,364 | |
| Ethanol 95% | VWR | 20,823,362 | |
| Xylene | VWR | 28973.363 | |
| Paraffin | VWR | LEIC3950.1006 | |
| Hematoxylin | Millipore | 1.15938.0025 | Colorant |
| Eosin | Millipore | 1.15935.0100 | Colorant |
| Eukitt | Sigma-Aldrich | 3989 | Mounting Medium |
| CaCl2 |
References
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