Summary
פרוטוקול זה מתאר את תהליך ההערכה של ריפוי גידים אצל חולדות זה מוזרק עם טסיות allogeneic פלזמה עשיר (PRP) או תמיסת מלח לאחר הסרת חלק גיד אכילס. ההתקדמות של גיד ריפוי מוערך במספר נקודות זמן באמצעות סוגים שונים של ניתוחים.
Abstract
מאמר זה מתאר את ההליכים ניסיוני המשמש כדי לבחון אם PRP יכול בהחלט להשפיע על גיד ריפוי. ישנם 4 שלבים עיקריים לעקוב: לגרום פגיעה בגיד אכילס; להכין PRP ולהזריק אותו (או תמיסת מלח); להסיר את הגיד; ולבצע הערכות biomechanical מולקולרית, היסטולוגית. בכל שלב, כל הנהלים והשיטות מתוארים בפירוט, אז הם יכולים להיות מועתק בקלות.
אכילס הגידים כבר בניתוח משרטוטי (הסרת קטע ארוך 5 מ מ). לאחר מכן, PRP או תמיסת הוזרק ללמוד אם PRP יש השפעה חיובית על הריפוי של הגיד. שלוש קבוצות של בעלי חיים 40 (סה"כ 120 חולדות השתמשו במחקר זה) היו מחולק 2 קבוצות: קבוצה קבוצה הזרקת PRP ובקרת זריקה מלוחים. חולדות הוקרבו בהגברת נקודות זמן (קבוצה א': 5 ימים; קבוצה ב': 15 ימים; קבוצה ג': 30 ימים), גידים הוסרו. הגידים 90 עברה בדיקות ביו-מכני לפני ביצוע ניתוח transcriptomic, הגידים הנותרים 30 הוגשו ניתוח היסטולוגית.
Introduction
קרישה, תהליכים דלקתיים התפקידים אפנון חסינות של טסיות הינם ידועים1. לאחרונה, זה הוכח שיש להם גם מאפיינים מבריא2,3. אכן, ציטוקינים וצמיחה גורמים שונים (VEGF, PDGF, TGF-B, IGF-שאני, דבורה שחר) שפורסמו על ידי טסיות בתקופת degranulation. אלה גורמי גדילה לקדם אנגיוגנזה, רקמות ו פצע ריפוי (עצם, עור, שריר, גיד)2. צריך שתוציאו דם עצמיים מייצרת טסית דם עשיר פלזמה (PRP אשר מכיל ריכוזים טסיות גבוהה בהתאם לשיטת הבידוד) (בין 3 10 פעמים דם ריכוזים בסיסית). אכן, טכניקות שונות של הכנת PRP אינו יכול לספק מוצר סופי זהים. עד עכשיו, כבר אין הסכמה כללית הבינלאומי בנושא זה. בסך הכל, PRP יכול להיות אופציה טיפולית אטרקטיבי לטיפול בבעיות כרוניות השלד והשרירים, כגון tendinopathy, מחלת החיתולית הכפית, דלקת מפרקים ניוונית, התביעה4. הוא שימש בפעם הראשונה תוך ניתוח אוראלי implantology4 כדי לשפר ולהאיץ את עצם ריפוי לאחר הצבת שתל דנטלי. במחקר זה, אנו מתארים שיטה ישימה המאפשר רכישת PRP עבור ניסויים בבעלי חיים4.
מאז נגעים של הגידים הם נצפו לעתים קרובות ספורטאים ועובדי גופנית, שיפור את תהליך הריפוי, ובכך להקטין את זמן ההחלמה הם עניין רב5. שיטות טיפול חדשות זה מפתחים לעיתים קרובות כרוך השימוש של גורמי גדילה, הממשל של PRP דרך פשוטה ולא פולשנית לספק שילוב של גורמי גדילה אנדוגני4.
מספר מחקרים במבחנה או בעל חיים הראו כי המינהל של פלסמה המכילים רמה גבוהה של טסיות דם, על ידי שחרור מתווכים ביולוגי, יכול לעורר תיקון גיד, רצועה על ידי שחרור מתווכים ביולוגי6 ,7,8,9. יתר על כן, מחקרים אחרים הראו כי PRP יכול לעורר סוג III סינתזה קולגן גיד ואני תאים9,10,11. גם הוצע כי PRP יכול להקטין את ההפעלה של מטריקס metalloproteinases (MMPs), לכן להפחית את ההשפלה של המטריקס. התאים המעורבים בתהליך דלקת יכול לייצר MMP-9, אשר ממלא תפקיד רקמות (הפיזיולוגיות, פיפטות) הנגרמת על ידי דלקת12.
על סמך מידע זה, שיערנו זריקה אחת PRP לתוך הגידים אכילס המחולקת למקטעים של חולדות יכול לשפר את תהליך ההחלמה, חוזק מכני רב, הרקמה לתיקון. זה נבדק על ידי מדידת המאפיינים ביו-מכני של הגידים הריפוי במהלך תהליך ההחלמה, על ידי ביצוע ניתוחים היסטולוגית ומולקולרית להעריך קולגן שיפוץ בתוך הרקמה החדשה. מטרת המחקר הייתה לבחון אם זריקה אחת של allogeneic PRP להשפיע ריפוי של הגידים אכילס המחולקת למקטעים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
טיפוח וטיפול של החיות בוצעו על פי המדריך על הטיפול, השימוש של חיות מעבדה שהוכנו על ידי האקדמיה הלאומית למדעים ופורסמו על ידי מוסדות הלאומית לבריאות (ארה"ב). החקיקה האירופית ולאומיים עקבו בזהירות.
1. הכנה בעלי חיים
- השתמש 132 2 - חודש בן זכר ספראג-Dawley חולדות שקילה 320-450 גרם (120 חולדות לניסויים) וחולדות 12 עבור לקיחת דמים, איור 1. בהתבסס על Dell13, חולדות 15 עבור כל קבוצה הייתה מספיק כוח של 0.8 (80% הסיכוי למצוא מובהקות סטטיסטית, אם קיים האפקט שצוין).
- בית כל העכברושים בכלובים קלאסית בתנאים בידוד במתקן קונבנציונאלי מצוידים עם תחנת המשתנים. לעורר הרבייה בארון תקשורת IVC (כלוב בנפרד מאוורר), חולדות SPF (חינם ספציפי פתוגן) הנרכשים באופן ספציפי.
- להשתמש בתנאי דיור הבאים: טמפרטורת מ 19-24 מעלות צלזיוס; לחות יחסית: 40-60%; אוורור: תדירות של התחדשות אוויר: 10-15 לכל h; מחזור/כהה: 12 h - 12 שעות.
- לעקר את כל הציוד caging ולהשתמש מצעים לקרינה. מערכתית ליישם את הכלוב העשרה על-ידי הצבת מגשי קרטון סטרילי ומגבות בתוך הכלובים.
- לאפשר גישה לאזור בתנאים מוגבלים: המעבדה המעיל, מסכה, כפפות, נעליים, שיער המצנפת החדשה בכניסה.
- לבצע את המושבה לניטור תקינות בלוטת הזקיף בבעלי חיים שוכנו על מצעים מלוכלך על בסיס שנתי, על פי המלצות14 Felasa למתקנים קונבנציונליים. לשמור על ארבעה או חמישה בעלי חיים לכל כלוב, עם המתאים מוקרן דיאטה ולספק acidified מים ad libitum. צג מדי יום.
- העברת חולדות נבחר להתערבות כירורגית ב סינון הכלובים המובילים לחדרי ניתוח 2 h לפני הניתוח.
2. ניתוח
- הכנת מכשירי הניתוח: בסדר מספריים, מלחציים, שני תופסנים, בעל מחט. במהלך כל ההליכים, ללבוש כפפות, מסיכה, ברדס, חלוק מעבדה.
- באופן אקראי לחלק את החולדות לשתי קבוצות (PRP ותמיסת מלח).
- קח את החולדה מהכלוב, שוקל אותה. להשתמש בתגיות האוזן ממוספרים כדי לזהות את החולדות. כדי להימנע לייבוש של העיניים, במקום טיפות מים על הקרנית.
- עזים ומתנגד העכברוש intraperitoneally עם חריגות השירותים הווטרינריים (10 mg/kg של משקל גוף), קטמין (80 mg/kg של משקל גוף). כדי לאשר ההרדמה, במקום החיות תחת ניטור cardio-הנשימה של סימון עבור כל רפלקסים בעין.
- מזריקים µL 50 של הבופרנורפין subcutaneously (0.01-0.05 מ"ג/ק"ג כל h 8-12) באזור הצוואר כמשכך כאבים.
- לגלח את האיבר הינד השמאלי עם מכונת גילוח חשמלית, לחטא אותה עם 3 לסירוגין קרצוף של iso-betadine/אלכוהול (מדולל 1:10) פתרון ולמקם את החולדה על משטח חם (20 ° C) תחת מיקרוסקופ ויבתר. מניחים את החולדה על עגלות לרוחב עם הרגל צריכה לעבור ניתוח במצב מעולה. להחזיק את הכף עם מלקחיים כירורגיים.
- בעזרת המספריים, עושים חתך לרוחב קטן (20-25 מ מ) של העור סביב גיד אכילס השמאלי, ומנתחים fascia באמצעות מספריים בסדר לחשוף את גיד אכילס מורכבים (איור 2 א).
- הסר את הגיד plantaris עם זוג מספריים (איור 2b).
- חתך גיד אכילס ערמוני 5 מ מ מקורב אל הכניסה calcaneal שלה ולהסיר חלק ארוך 5 מ מ באמצעות מספריים. תפר לא הגיד (איור 2 c, 2d).
- תפר fascia ולאחר מכן העור עם חוט resorbable עושה עם תפר overjet (בתפר רצוף). התפרים monofilament יכול לשמש גם כדי למנוע הפתילה מן העור לתוך החתך כירורגי.
- למקם את החולדה תחת מנורת חימום עד ער ולאחר מכן מקם את החולדה בחזרה בכלוב (58, 38 ס מ) (Nota bene: אין קיבעון שהוטלה עליו).
3. PRP הכנה15
- עזים ומתנגד העכברושים תורם עם חריגות השירותים הווטרינריים (10 mg/kg של משקל גוף), קטמין (80 mg/kg של משקל גוף) על ידי הזרקת בקרום הבטן. PRP ההזרקה מבוצעת 2 h במשככי ללא re-הרדמה.
- מזריקים µL 50 של הבופרנורפין subcutaneously כמשכך כאבים.
- לאסוף דם מלא (20 מ לכל עכברוש, הדימום הסופי) על ידי ניקוב הלב לתוך צינורות סטרילי המכיל 3.2% buffered סודיום ציטרט (מ' 0.109, נוגד קרישה). ואז המתת חסד העכברוש על ידי זריקה intracardiac.
- כדי להשיג PRP, centrifuge הדם למשך 10 דקות ב 150 x g ובטמפרטורת החדר. שלב צנטריפוגה זו מהירות נמוכה הראשוני מניב בשני שלבים ברורים: שלב נמוך בהיקף של תאי דם אדומים (RBCs) מהווה כ- 80-90% מהנפח הכולל ולאחר שלב העליון המורכב של טסיות דם עשיר פלזמה (PRP) (בדרך כלל 10-20% של הדם דוגמה).
- בעדינות לאסוף את PRP (שלב העליון) צינור פלסטיק משני באמצעות פיפטה של העברת פלסטיק. כמו הממשק בין PRP תאי דם אדומים הוא מאוד רפוי, לא פיפטה קרוב מדי לממשק. כשמטפלים נכון, מזהם RBCs ב PRP צריך להיות מתחת 0.05 x 10 תאים3 / µL. להיפטר השלב התחתון הנותרים של הצינור אוסף דם ראשיים.
- לקבוע את עוצמת הקול של PRP שנאספו ולמדוד את ספירת טסיות על מנתח המטולוגיה. ערכים אלה דרושים עבור חישובים להתאים את ריכוז טסיות בשלב הבא. ספירת תאי הדם גם שימושי להעריך את פוטנציאל זיהום עם RBCs, ריכוז WBCs. טסיות ב PRP בשלב זה הוא בדרך כלל 1-1.5 x106/µL.
- לבצע צנטריפוגה השני של PRP 10 דקות-1000 g x ובטמפרטורת החדר. שלב זה צנטריפוגה במהירות גבוהה מניבה גלולה טסיות רופף, של תגובת שיקוע המורכב של טסית דם מסכן עצמיים פלזמה (PPP). שימוש בערכים נקבע בשלב 3.6, לחשב את עוצמת הקול של תגובת שיקוע כדי להיות מושלך לרכז את PRP ולהגיע ריכוז סופי של 2.5 x106/µL.
- בעדינות לאסוף את תגובת שיקוע (PPP) צינור פלסטיק משני באמצעות פיפטה של העברת פלסטיק, עוזב כשני שלישים של הכרך האחרון שחושבו בצעד 3.7. כמו בגדר הוא רופף, כמות משמעותית של טסיות אובדת כאשר PPP נמחקת, ולכן פוטנציאל להפחית את הריכוז הסופי הרצוי.
- בזהירות resuspend בגדר טסיות עם תגובת שיקוע הנותרים על-ידי pipetting חוזרות עדינה. למדוד את ספירת טסיות-PRP המרוכז הזה. אם יש צורך, להוסיף נפח מתאים של PPP עצמיים להגיע ריכוז היעד הסופי.
הערה: השתמש את PRP תוך 3 שעות של הכנה. - להוסיף µL 50 CaCl2 (11 mEq 10 מ ל) לכל מיליליטר PRP כדי להפעיל את טסיות הדם.
- מזריקים µL 50 PRP טריים או תמיסת עם מחט 21G ישירות לתוך האתר מבצע sutured בערך 1 h לאחר ההכנה. במהלך תקופה זו, תמשיך PRP בטמפרטורת החדר.
- לפקח התאוששות פונקציונליות של החולדות מקרוב במהלך הימים לאחר הניתוח ואת לפני ההסרה של גיד אכילס.
4. הסרה של גיד אכילס ובדיקות Biomechanical16
- 5, 15 או 30 ימים מאוחר יותר5, שוקל את החולדה. לאחר מכן, עזים ומתנגד עם חריגות השירותים הווטרינריים (10 mg/kg של משקל גוף), קטמין (80 mg/kg של משקל גוף) על ידי הזרקת בקרום הבטן.
- מזריקים µL 50 של הבופרנורפין subcutaneously כמשכך כאבים. הסר הגיד לפני הקרבת החיה כדי לשמור על התנאים הפיזיולוגיים זמן רב ככל האפשר.
- לגלח את האיבר השמאלי הינד ולמקם את החולדה תחת מיקרוסקופ ויבתר. מניחים את החולדה על עגלות לרוחב עם הרגל צריכה לעבור ניתוח במצב מעולה. החזק את פאו עם האצבעות.
- עושים חתך קטן (10 מ מ) באתר המבצע הקודם ולהרחיב עד suralis התלת חשוף.
- כדי להסיר את גיד אכילס הריפוי, לחתוך עצם calcaneal ערמוני 5-10 מ מ דיסטלי לקיצוץ גיד אכילס שלה. ואז לנתח חלק suralis התלת, שמחובר גיד אכילס (איור 3b). החלק שריר צריך להיות גדול מספיק כדי להתאים את הקפאה-הלסת (איור 3 c-d). למקם את הדגימה באופן מיידי הקפאה-הלסת בעזרת מלקחיים (איור 3e).
- לאחר הסרת המתחם גיד-שריר-עצם, המתת חסד העכברוש באמצעות הזרקת intracardiac מסקלין (200 מ"ג/ק"ג). לאשר מוות על-ידי הערכת העדר של קצב הלב ואת הנשימה למשך 15 דקות.
- למקם את יחידת שריר בלסת העליונה (איור 3e), לסגור או למקם אותו אנכית אוניברסלי בודקים מכונת (106.2 kN, איור 3a). אז תתקן את העצם בין התפסים התחתון של המכונה (איור 3f).
- להוסיף חנקן נוזלי לתוך שניהם בעיטור הלסת העליונה כדי להקפיא את השריר, כך היא בסדר גודל נוקשה מאשר הגיד, אינו עיוות במהלך הבחינה מתיחה.
- כאשר אזור הקפואים מגיע לגבול מהדק מתכת, להתחיל את בדיקת מתיחה, אז הגיד תשמר את המבנה שלו. הגדרת הקצב הזחה של המכונה במהירות קבועה של 1 מ מ/s עד קרע. להקליט את כוח מתיחה האולטימטיבי (UTS) בהתחשב ניוטונים (N) במחשב.
- כדי לחשב את האזור חתך הרוחב, במקום שתי מצלמות ניצבים זה לזה, ויוצרים צורה אליפטית, לצלם תמונות.
- כדי להסביר את ההבדל בין האזור חתך הרוחב של הגידים הריפוי, לנרמל את UTS לאזור יחידה (N לכל מילימטר מרובע), אשר מייצג את מכאניים מנוסים על ידי הרקמה.
5. ניתוח היסטולוגית
הערה: 15 גידים של כל קבוצה עברה ניתוח היסטולוגית.
- לאחר הוצאתה, להטביע את גיד אכילס מיד ב- 4% paraformaldehyde כדי לשמר את מבנהו (1 מ מ של רקמות הוא קבוע לשעה, כך הזמן של קיבעון משתנה בהתאם לגודל של הגיד).
- להחליף את paraformaldehyde על ידי 70% אתנול, ולהשאיר את הדגימה ללילה אחד לפחות בפתרון זה.
- מקום הגיד במיכל פלסטיק קטנה עם חורים ולמקם את המיכל פתרון טריים של אתנול 70% עבור 1 h.
- חזור על המקום הגורם המכיל אתנול 95% עבור ה 1.
- חזור על המקום הגורם המכיל 100% אתנול עבור ה 1.
- חזור על המקום המיכל בתוך 100% קסילן עבור ה 1.
- כעת הכנס את מיכל פלסטיק, אשר מכיל את הגיד, שמן פראפין (56 ° C), להשאיר את זה בן לילה.
- באמצעות תחנה ההטבעה (מצויד עם שעווה מותכת, צלחת חמה צלחת קר), בחר תבנית מתכתי המתאימה ביותר דגימת הרקמות, ולמלא אותה עם קצת שמן פראפין כך הבסיס מכוסה.
הערה: להתמצא הדגימה כדי להשיג מקטעים אנכיים-האזמל הקטן. - כאשר המדגם ימוקם בצורה נכונה, ממלאים את התבנית עם שמן פראפין ומניחים אותו על גבי המכונה קירור. . תן לזה להתקרר למשך 15 דקות לפחות.
- הסר הבלוק פרפין ומניחים אותו על קרח במשך לפחות 30 דקות.
- להכין כמה שקופיות זכוכית נקי, לשים כמה טיפות של מים יונים עליהם.
- -האזמל הקטן, חותכים את בסעיפים 5 מיקרומטר (רק סעיפים שימוש מהחלק האמצעי של הגיד) ומניחים את המקטע בשקופית.
- המקום השקופיות בתנור חימום-65 מעלות צלזיוס למשך מספר דקות, כך הפרפין רק מתחילה להימס להתחבר הרקמה אל הזכוכית.
- מקם את השקופיות המכיל מקטעים פרפין בעל פרוסה.
- עכשיו deparaffinize, נתרענן הרקמה על-ידי הצבתו של המרחצאות רצופים הבאים:
8 דקות של קסילן (אמבט 1)
4 דקות ב קסילן (אמבט 2)
2 דקות ב- 100% אתנול
2 דקות ב- 95% אתנול
2 דקות ב-70% אתנול
2 דקות במים יונים - עבור Hematoxylin-אאוזין מכתים, מקם את רקמת הפתרונות הבאים.
- לטבול את הרקמה במשך 8 דקות ב hematoxylin פתרון (1 g hematoxylin מונוהידראט, 0.2 g קיו3, 50 גרם AIK (אז4)2.12H2O; 200 מ"ל גליצרין; התאם ל 1 ליטר מים מזוקקים).
- לטבול את הרקמה במשך 8 דקות תחת ברז מים זורמים.
- לטבול את הרקמה ב-30 s באאוזין פתרון (0.25% אאוזין ב- 100 מ של מים מזוקקים המכילים µL 200 של חומצת חומץ מדולל).
- לטבול את הרקמה למשך 2 דקות תחת ברז מים זורמים.
- צביעת Trichrome של מאסון, בצע את הפעולות הבאות.
- לאחר התייבשות, במקום הסעיפים במיכל עם ברזל אלום (0.5 ג'י (NH4) Fe (אז4)2.12H2O 10 מ ל H2O), לסגור את המיכל. חום זה במשך 3 דקות ב 280 W במיקרוגל.
- . תן לזה להתקרר למשך דקה, ואז לשטוף אותו במים יונים.
- במקום הסעיפים במיכל סגור עם פתרון hematoxylin של Regaud (0.5 ג'י hematoxylin מומס 50 מ ל H2O ב 50 מעלות צלזיוס, ואז הוסף 5 מ ל 95% אתנול וביו -5 מ"ל גליצרין), אחמם את זה עד 90 s ב 280 W.
- יש לשטוף אותה במים יונים.
- למקם את הסעיפים פתרון חומצה picric (על הרוויה ב מתנול) למשך 3 דקות, לשטוף למשך 5 דקות תחת ברז מים זורמים ולאחר מכן מקם אותו במים יונים לכמה שניות.
- עכשיו מקום הסעיפים חומצה fuchsin (0.5 גרם 50 מ ל H2O המכיל 0.25 mL של חומצת חומץ מדולל) עבור 5 s ולאחר מכן לשטוף תחת ברז מים זורמים עד לצבוע נעלם.
- דגירה בסעיפים phosphomolybdic תמיסה חומצית (0.5 גרם 50 מ ל H2O) במשך 5 דקות, מקום זה במשך כמה שניות במים יונים.
- למקם את הסעיפים פתרון ירוק בהיר (0.5 גרם 50 מ ל H2O המכיל 0.25 mL של חומצת חומץ מדולל) עוד 5 דקות ומניחים אותו תחת ברז מים זורמים עד לצבוע נעלם.
- עכשיו מייבשים את הרקמה שוב.
- לטבול בסעיף 1 דקות ב- 70% אתנול.
- לטבול בסעיף 1 דקות ב- 95% אתנול.
- לטבול בסעיף 1 דקות ב- 100% אתנול.
- לטבול בסעיף 1 דקות בקסילן (אמבט 1).
- לטבול בסעיף 1 דקות בקסילן (אמבט 2).
- להסיר את הסעיפים מבלי להסיר קסילן מדי ולשים טיפה של הרכבה בינונית על הדגימה.
- לשים את coverslip על גבי (ללא מעוררות בועות) ולתת לו להקשיח כבר לפחות שעתיים.
- Hydrolyze 5 היסטולוגית מקטעים (כל אחד גיד שונים) של כל קבוצה ב- HCl N 6 עבור 3 h ולקבוע את הריכוז של קולגן על ידי מדידת hydroxyproline כמו אינדקס בסעיפים 5 מיקרומטר מוכתם.
- לנרמל את התוצאות על-ידי האזור מקטע באמצעות התוכנה של היצרן.
- כתם של הסעיפים עם אור ירוק כתם כדי להמחיש ולכמת קולגן fibrillar על ידי ניתוח בסיוע מחשב.
- לסרוק את המקטעים ולהמיר את התמונות בניואנסים של גריי באמצעות תוכנת IrfanView. להשתמש בתוכנה על כימות למחצה (למשל, כמות אחת).
6. מולקולרית הערכה
- לאחר קרע בגיד, אשר מתרחש במהלך בדיקות מכניות, לקחת את הדוגמאות, הצמד להקפיא אותם בחנקן נוזלי, ואחסן אותם ב- 80 ° C (PRP ותמיסת)17.
- השתמש ערכת RNA הכולל מסחרית כדי לבודד RNA סה כ17.
- למדוד את הביטוי של קולגן (Col I ו- Col III), Metalloproteinases מטריצה (MMP-2, MMP-3 ו- MMP-9), tenomodulin (TNMD) מאת RT-PCR17,18.
- לנרמל את רמות הביטוי של mRNA את רמות 28S19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
התוצאות מבוטא הממוצע ± סטיית התקן של הממוצע, הושוו עם השונות (ANOVA). דו כיוונית ANOVA, פוסט הוק מבחן דה Scheffé, אשר הוא מבחן פרמטרית, שימשו.
כוח מתיחה האולטימטיבי (UTS) הנדרש כדי לעורר קרע של הגידים אכילס שאינם הפצועה של חולדות היה ± 42.0 5.7 N (n = 10). חוזק מתיחה גדל באופן משמעותי (p < 0.0001) בשתי הקבוצות לאחר יום 5. השוואה בין שתי הקבוצות, UTS היה גבוה בקבוצה PRP בכל עת נמדד, במיוחד ביום 15 עד 30. על ידי מדידת האזור חתך הרוחב של הגידים הוסרו לפני שעברו הערכה ביו-מכני (11.4 ± בעובי 5.5 מ מ2 עבור שאינו נפגע גידים), נמצא ביום 5, שהיה גדול יותר בקבוצה שטופלו מלוחים. אבל ביום 15 עד 30, אזור חתך הרוחב היה גדול יותר בקבוצה PRP, למרות כמות זו היה משתנה יותר בהשוואה לקבוצת שטופלו מלוחים (איור 4 , איור 5).
הערכה היסטולוגית של הגידים, באמצעות hematoxylin-אאוזין מכתים, הראה cellularity גבוהה ביום 5, להפחתה לאחר מכן (הבדל משמעותי נצפתה בין תמיסת PRP קבוצה). Trichrome של מאסון מכתים הראה נוכחות גבוהה יותר של קולגן fibrillar בקבוצה PRP ביום 5 ו-15. עם זאת עוצמת ההכתמה היה דומה בשתי קבוצות 30 ימים לאחר ההזרקה (איור 6). כימות למחצה מתקבל על ידי מכתימה את הדגימות עם אור ירוק הראו כי ביום 5 ו- 15, עוצמת היה גבוה יותר בקבוצה PRP (לא משמעותי סטטיסטית) אבל ביום 30, לא היה הבדל הבחינו בין שתי הקבוצות.
הנתונים היה מנורמל על ידי מדידת כמות חומצת אמינו, hydroxyproline, שהוא ספציפי ל קולגן, המאשר כימות למחצה היסטולוגית (יום 5: ערך הגדול בקבוצה PRP). ריכוז קולגן לא היה יציב בקבוצה PRP אך התייצבה ביום 30 בין שתי הקבוצות. הנפח של קסם נמדדה, נמצאה להיות משמעותי יותר בבעלי חיים שטופלו PRP בשלבים הראשונים של תהליך הריפוי. תוצאות אלה יחדיו, לרמוז כי הזריקה PRP לתוך הגיד הפגוע גורם חשוב כמות הקולגן fibrillar להפקיד.
מדידת רמת ביטוי של מספר מולקולות הראו כי הגידים שאינו נפגע, Col השלישי, TNMD היו נוכחות כזו כמות (2.5 - 3.0 פעמים) מאשר ריפוי הגידים ביום 15, אולם לא היה הבדל ב- Col אני הביטוי בין הקבוצות. MMPs נכחו במסיבה ריכוז גבוה יותר 12-fold של הגידים הריפוי. בנוסף, ביום 30, הייתה עלייה משמעותית של COL1A1 בקבוצה PRP, נמצא מתאם חיובי בין ביטוי COL1A1 ולא UTS. בשתי הקבוצות, התברר כי Col השלישי בא לידי ביטוי בכמות גבוהה מיום א' עד יום 14, לפני זה ירד (גם עבור שתי הקבוצות). ריכוז MMP-9 לא השתנה בשתי הקבוצות אך MMP-2 ו- MMP-3 היו נוכח בריכוזים גבוהים במהלך תקופת ההחלמה. יום 5, TNDM בא לידי סכום גבוה יותר ב- PRP (p < 0.03) אבל אז ירד בין יום 15 -30.
איור 1: תכנון ניסויים של המחקר- אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: הליך כירורגי.
(א) הגיד מורכבים לאחר הסרת fascia שמסביב.
(b) להסרת של הגיד plantaris.
(ג) הסרה של מקטע של גיד אכילס.
הגידים 2 (ד) אשר הוסרו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: בדיקות ביו-מכני
(א) מכונת בדיקות אוניברסלי (106.2 kN).
(b) שריר-גיד-עצם המתחם שתתוקן לתוך הלסת-הקפאה.
(ג) העליונה הקפאה הלסת התחתונה
(ד) העליונה ולהוריד את הלסת-הקפאה
(ה) המתחם להכניס את הלסת הקפאה
(נ) סגור הקפאה-הלסת המכיל המתחם גיד-שריר-עצם קבוע לתוך המכונה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: תוצאות בדיקות ביו-מכני
חוזק ביטוי ניוטונים (N) PRP ובקרה קבוצות בנקודות זמן שונות לאחר הניתוח. היה גידול של UTS בשתי הקבוצות לאורך זמן, עם הקבוצה PRP מציג ערכים גבוהים יותר באופן משמעותי ב 15 ו-30 ימים לאחר הניתוח.
קו שגיאה מגדיר את סטיית התקן (SD). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: תוצאות בדיקות ביו-מכני
שטח רוחבי של הגיד לידי ביטוי מילימטרים מרובעים (2מ מ). האזור חתך הרוחב היה גדול יותר באופן משמעותי בקבוצה PRP עד יום 15. לאחר מכן, הסעיף היה דומה בשתי הקבוצות.
קו שגיאה מגדיר את סטיית התקן (SD). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6: תוצאות היסטולוגית
נציג סעיפים האורך של גיד אכילס של שליטה וקבוצות PRP, מוכתם Trichrome של מאסון. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. הנה חזק ירוק מכתים ב הגיד של קבוצת PRP-יום 5 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
טסיות דם חיוניים דלקתית בשלב מוקדם הגיד תהליך הריפוי. כאשר אלה טסיות נחשפים מחייב רקמות או גורמים זירוז קרישת הדם, הם ישחררו את גורמי גדילה שמוחזקים במלאי בα גרגירים. עקב אינטראקציה זו, מטריצה חוץ-תאית מקרומולקולות synthetized, להתרבות תאים mesenchymal. טסיות הדם יש גם פעילות chemotactic ובתאים בזרם הדם, שיפור אנגיוגנזה ועירור התמיינות6,20.
בדיקה biomechanical נעשתה באמצעות התקן clamping שהוכנו במיוחד עבור ex-vivo בדיקות של גיד אכילס חולדות15. הקפאה-הלסת מאפשר ההקפאה של השריר על-ידי הוספת חנקן נוזלי, העצם calcaneal, המהווה החלק התחתון של הדגימה, תתוקן ישירות לתוך המכונה. חשוב מאוד להתחיל את המבחן מתיחה כאשר השריר נוקשה לגמרי, אך הגיד הוא עדיין גמיש. טכניקה זו מונע נזק לרקמות ושומר על שלמות מכני. גם טכניקה זו היא פשוטה, מאובטח, שאינו compressive ו כאפשרית לשחזור, כמו מספר מחקרים השתמשו בשיטה זו,4,15.
כדי לתמוך את התוצאות מכני, כמה גידים עברו הערכה היסטולוגית. ההכתמה hematoxylin-אאוזין מציג סקירה גדולה של רקמה בריאה ונותנת מידע כללי אודות כמות התאים ואת קולגן הנוכחי. בנוסף, המדידה של hydroxyprolin הוא שימושי כמו זה חומצת אמינו נמצאו רק קולגן ומאפשר את objectivation של הנתונים היסטולוגית. עם זאת, יש צורך לעשות של מאסון צביעת Trichrome, זה מראה מידע מפורט יותר על התצהיר ריכוז של סיבי קולגן4.
למרות הרמה של קולגן III mRNA ב PRP מטופלים הגידים לא שונה, ביום 30 mRNA של Col. הייתי נוכח ריכוז גבוה יותר של הגידים פצועים מטופלים עם PRP. בעבר היה הוכח כי PRP מפריע ההתפשטות של מקרופאגים ואת הייצור של IL-121, אשר ובכך יכול להימנע לתגובה דלקתית מוגזמת כבר בשלבים המוקדמים של תהליך הריפוי11. זה אפשרי כי PRP מעוררת את ההתפשטות את ההפעלה של מסלולים מטבוליים, הטרנספורמציה של תאים mesenchymal לתוך tenocytes הפעילים.
ריכוזים גבוהים של TNDM ב הגידים של קבוצת PRP מצביעים על כך מולקולות מוזרק יכול למשוך תאים ונע בזרם הדם זירוז הבחנה לעבר פנוטיפ tenocyte11. תוצאות אלה יחדיו, מדגימים כי הזרקה אחת בלבד של PRP לתוך גיד אכילס קרע יש השפעה חיובית על תחילת שלב הריפוי, מוביל חוזק מכני גבוה יותר.
מספר מחקרים קליניים הראו כבר PRP משפר את תהליך הריפוי, גורמי גדילה שונים שיש פעולות מסוימות במהלך תהליך זה22. Mazzocca והצוות שלו הפגינו PRP מעוררת את התפשטות תאים השרירים, העצמות, הגידים. . הכנות שונות, PRP בחום מרוכז ללא כל תאי הדם הלבנים הוכיח הטיפול היעיל ביותר23. McCarrell et al. עשה ניסוי דומה, בדיקת מספר הכנות של PRP המכילים ריכוזים שונים של PRP ותאי דם לבנים על הסוס הגידים. ההכנות של ריכוז ביניים של טסיות דם המכיל ריכוז גבוה של תאי דם לבנים הובילה לשחרור גבוה יותר של ציטוקינים פרו-דלקתיים, כגון IL-1ß ו- TNFa, סינתזה של קולגן נמוכה יותר. תערובות עם ריכוז גבוה של טסיות דם ותאי דם לבנים גם הוביל לעלייה של ציטוקינים דלקתיים אך סינתזה קולגן עכבות. לסיכום זה אומר כי אם ריכוז טסיות גבוהה מדי, קולגן סינתזה ותא חילוף החומרים הם האט24. בוזוול ואח. אישר את הממצאים האלה25. הכנת PRP היעילה ביותר ובכך יכיל ריכוז טסיות נמוכה יותר מאשר טסיות6 10/µL ואין תאי דם לבנים.
היתרון העיקרי של שימוש PRP הוא autogenity. למרות במחקר שלנו, השתמשנו allogeneic PRP ע י הקרבת התורם חולדות יש כמות מספקת של דם. יתר על כן, לקיחת דם העכברים המופעלים יחליש אותם יותר מדי. הגבלה נוספת של מחקר זה היא כי כל יתבקע חריפה והושמעה על הגידים בריא, מה שלא תמיד במקרה של בני אדם, כפי הגידים לעיתים קרובות להיקרע בשל ניוון מוקדמת. מודל זה המבוסס על פציעות גיד חדה, אין סופית מסקנות ניתן להסיק על tendinopathies ניוונית.
באמצעות שיטה זו, ישנם כמה צעדים קריטיים לזכור, הראשון להיות הכנת PRP, אשר צריכה להיות כמו לשחזור ככל האפשר. עוד צעד קריטי הוא הליך כירורגי: הסרת של הגיד, גיד השריר מורכב צריך להיעשות על דרך לשחזור כדי למנוע הטיה כלשהי. לבסוף, ההכנה לבדיקות ביו-מכני: חנקן נוזלי נוסף להקפיא את השריר, וזה די חשוב כי הגיד לא קפוא בתהליך זה כי זה יכול להוביל לתוצאות משוחד, כפי הקשיחות הגיד להשתנות. זוהי גם מגבלה של המחקר, שכן אין שום פרוטוקול מתוקננים כדי להבטיח כי האלסטיות של הגיד אינו משתנה.
אנחנו מבוססת השיטה שלנו על השיטה שפותחה על ידי Virchenko et al. 26, אבל להתאים אותו באמצעות הקפאה-הלסת אשר מגן על הגיד כנגד התוקפנות החיצוני הנגרם על ידי מהדק. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא כי זה לשחזור גם אם זה לא נערך עדיין. זה נותן מושג על איך ניתן להתייחס פציעות גיד בבני אדם, למרות ניסויים עם חולדות לא תמיד לתרגם טוב לטיפול אנושי פציעות. סביר כי גירסה מותאמת של שיטה זו יכולה להיות שימושית בטיפול אותן פציעות בעתיד, נתמך על ידי העובדה שהוא קל לשימוש, כולל של עלות נמוכה יחסית, והוא פחות פולשני מאשר שיטות אחרות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
שאין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך על ידי תקן דה Liège ומענקים לז'ן - Lechien את הכספים Frédéricq ליאון.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xylazine (Xyl-M) | VMD | none | anesthetic |
| Ketamin (Jétamine 1000 CEVA) | CEVA Santé Animale | none | anesthetic |
| Buprenorphin (Vetergésic Multidosis) | ALSTOE | none | Painkiller |
| iso-Betadine | MEDA-Pharma | none | Desinfectant |
| resorbable yarn Vicryl 6/0 | Johnson & Johnson | ||
| Nembutal | CEVA Santé Animale | none | Anesthetic |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Preserves structure of the tissue |
| Isopropanol 100% | VWR | 20,922,364 | |
| Ethanol 95% | VWR | 20,823,362 | |
| Xylene | VWR | 28973.363 | |
| Paraffin | VWR | LEIC3950.1006 | |
| Hematoxylin | Millipore | 1.15938.0025 | Colorant |
| Eosin | Millipore | 1.15935.0100 | Colorant |
| Eukitt | Sigma-Aldrich | 3989 | Mounting Medium |
| CaCl2 |
References
- Kaux, J., Degrave, N., Crielaard, J. Platelet rich plasma traitement des tendinopathies chroniques? Revue de la littérature. Platelet rich plasma treatment of chronic tendinopathies? Review of literature. J. Traumatol. du Sport. 24, 99-102 (2007).
- Anitua, E., et al. Autologous preparations rich in growth factors promote proliferation and induce VEGF and HGF production by human tendon cells in culture. J. Orthop. Res. 23, 281-286 (2005).
- Bosch, G., et al. Effects of platelet-rich plasma on the quality of repair of mechanically induced core lesions in equine superficial digital flexor tendons: A placebo-controlled experimental study. J. Orthop. Res. 28, 211-217 (2010).
- Kaux, J. F., Drion, P., Croisier, J. L., Crielaard, J. M. Tendinopathies and platelet-rich plasma (PRP): From pre-clinical experiments to therapeutic use. J. Stem Cells Regen. Med. 11, P7-P17 (2015).
- Maffulli, N., Wong, J., Almekinders, L. C.
- Molloy, T., Wang, Y., Murrell, G. The roles of growth factors in tendon and ligament healing. Sports Med. 33, 381-394 (2003).
- Lyras, D. N., et al. The effect of platelet-rich plasma gel in the early phase of patellar tendon healing. Arch. Orthop. Trauma Surg. 129, 1577-1582 (2009).
- Aspenberg, P., Virchenko, O. Platelet concentrate injection improves Achilles tendon repair in rats. Acta Orthop. Scand. 75, 93-99 (2004).
- Visser, L. C., et al. Growth Factor-Rich Plasma Increases Tendon Cell Proliferation and Matrix Synthesis on a Synthetic Scaffold: An In Vitro Study. Tissue Eng. Part A. 16, 1021-1029 (2010).
- Zhang, J., Wang, J. H. -C. Platelet-Rich Plasma Releasate Promotes Differentiation of Tendon Stem Cells Into Active Tenocytes. Am. J. Sports Med. 38, 2477-2486 (2010).
- Kajikawa, Y., et al. Platelet-rich plasma enhances the initial mobilization of circulation-derived cells for tendon healing. J. Cell. Physiol. 215, 837-845 (2008).
- Pasternak, B., Aspenberg, P. Metalloproteinases and their inhibitors-diagnostic and therapeutic opportunities in orthopedics. Acta Orthop. 80, 693-703 (2009).
- Dell, R. B., Holleran, S., Ramakrishnan, R.
- Mähler Convenor, M., et al. FELASA recommendations for the health monitoring of mouse, rat, hamster, guinea pig and rabbit colonies in breeding and experimental units. Lab. Anim. 48, 178-192 (2014).
- Kaux, J. -F., et al. Étude comparative de cinq techniques de préparation plaquettaire (platelet-rich plasma). Pathol. Biol. 59, 157-160 (2011).
- Wieloch, P., Buchmann, G., Roth, W., Rickert, M. A cryo-jaw designed for in vitro tensile testing of the healing Achilles tendons in rats. J. Biomech. 37, 1719-1722 (2004).
- Kaux, J. -F., et al. Vascular Endothelial Growth Factor-111 (VEGF-111) and tendon healing: preliminary results in a rat model of tendon injury. Muscles. Ligaments Tendons J. 4, 24-28 (2014).
- Docheva, D., Hunziker, E. B., Fässler, R., Brandau, O. Tenomodulin is necessary for tenocyte proliferation and tendon maturation. Mol. Cell. Biol. 25, 699-705 (2005).
- Lambert, C. A., Colige, A. C., Munaut, C., Lapière, C. M., Nusgens, B. V. Distinct pathways in the over-expression of matrix metalloproteinases in human fibroblasts by relaxation of mechanical tension. Matrix Biol. 20, 397-408 (2001).
- Nurden, A. T., Nurden, P., Sanchez, M., Andia, I., Anitua, E.
- Woodall, J., Tucci, M., Mishra, A., Benghuzzi, H. Cellular effects of platelet rich plasma: a study on HL-60 macrophage-like cells. Biomed. Sci. Instrum. 43, 266-271 (2007).
- Taylor, D. W., Petrera, M., Hendry, M., Theodoropoulos, J. S. A systematic review of the use of platelet-rich plasma in sports medicine as a new treatment for tendon and ligament injuries. Clin. J. Sport Med. 21, 344-352 (2011).
- Mazzocca, A. D., et al. The positive effects of different platelet-rich plasma methods on human muscle, bone, and tendon cells. Am. J. Sports Med. 40, 1742-1749 (2012).
- McCarrel, T. M., Minas, T., Fortier, L. A. Optimization of leukocyte concentration in platelet-rich plasma for the treatment of tendinopathy. J. Bone Joint Surg. Am. 94 (1-8), e143 (2012).
- Boswell, S. G., et al. Increasing platelet concentrations in leukocyte-reduced platelet-rich plasma decrease collagen gene synthesis in tendons. Am. J. Sports Med. 42, 42-49 (2014).
- Virchenko, O., Aspenberg, P. How can one platelet injection after tendon injury lead to a stronger tendon after 4 weeks?: Interplay between early regeneration and mechanical stimulation. Acta Orthop. 77, 806-812 (2006).
