Summary
Этот протокол описывает процесс оценки исцеления сухожилия в крыс, которые были введены с аллогенной тромбоцитов богатой плазмы (PRP) или физиологический раствор после удаления части ахиллова сухожилия. Ход лечения сухожилия оценивается в нескольких точках времени, с использованием различных видов анализа.
Abstract
Эта статья описывает экспериментальной процедуры, используемые для наблюдения, если PRP могут позитивно влиять на сухожилие исцеления. Есть 4 основные шаги, чтобы следовать: вызывают поражения в ахиллова сухожилия; подготовить PRP и вставляют его (или физиологический раствор); удалите сухожилия; и выполнять биомеханических, молекулярной и гистологической оценок. На каждом шаге все процедуры и методы описаны в деталях, так что они могут быть легко воспроизведены.
Ахиллова сухожилия были хирургически секционного (Удаление секции длиной 5 мм). Впоследствии ОТР или физиологический раствор был введен для изучения ли PRP имеет положительное влияние на исцеление сухожилия. Три группы 40 животных (в общей сложности 120 крыс были использованы в этом исследовании) были разделены на 2 подгруппы: PRP инъекции группы и солевые впрыск управления группы. Крысы были принесены в жертву на увеличение времени точек (Группа A: 5 дней; Группа B: 15 дней; Группа C: 30 дней) и сухожилий, были удалены. 90 сухожилий прошли биомеханические тестирования перед выполнением анализа транскриптомики и 30 оставшихся сухожилий были представлены гистологический анализ.
Introduction
Хорошо известно1коагуляции, воспалительные процессы и иммунитет модуляция функции тромбоцитов. Совсем недавно было продемонстрировано, что они также имеют реституционного свойства2,3. Действительно, различные факторы цитокинов и роста (VEGF, PDGF, TGF-Б, IGF-I и HGF) выпускаются тромбоцитов во время дегрануляции. Эти факторы роста содействовать ангиогенеза, тканей ремоделирования и раны исцеление (кости, кожу, мышцы, сухожилия)2. Центрифугирование аутологичной крови производит тромбоцитов богатой плазмы (PRP) который содержит тромбоцитов высокой концентрации в зависимости от метода изоляции (между 3 и 10 раз крови концентрации исходных условий). Действительно различные методы приготовления ОТР не может обеспечить идентичные конечного продукта. До сих пор был международного общего согласия по этому вопросу. В целом ОТР может быть привлекательным терапевтического лечения хронического опорно-двигательного аппарата, например плеча, подошвенный фасциит, артроз и исправления4. Он был использован в первый раз в оральной хирургии и имплантологии4 для улучшения и ускорения заживления после размещения стоматологических имплантатов кость. В этом исследовании мы описываем используется воспроизводимый метод, который позволяет приобретение PRP для экспериментов на животных4.
После поражения сухожилий часто наблюдаются в спортсменов и физических рабочих, повышение процесс заживления и таким образом сократить время восстановления являются большой интерес5. Новые методы лечения, которые разрабатывают часто связаны с использованием факторов роста, и администрация ОТР является простой и минимально инвазивной способ доставить смесь эндогенных факторов роста4.
Несколько в пробирке или животных исследования показали, что администрация плазмы, содержащие высокий уровень тромбоцитов, выпуская биологических посредников, могут стимулировать ремонт сухожилия и связки, выпустив биологических посредников6 ,,78,9. Кроме того другие исследования показали, что PRP могут стимулировать типа I и III синтез коллагена в сухожилие клетки9,10,11. Он также предложил, что PRP может уменьшить активации матрицы металлопротеиназ (MMPs) и таким образом уменьшить деградацию матрицы. Клетки, которые участвуют в процессе воспаления могут производить MMP-9, который играет роль в ткани реконструкции (физиологические и патологические) индуцированных воспаление12.
Основываясь на этой информации, мы предположили, что однократного введения ОТР в секционного ахиллова сухожилия крысы могут улучшить процесс восстановления и механическую прочность ткани, ремонт. Это проверяется путем измерения биомеханические свойства исцеления сухожилия во время процесса восстановления и гистологические и молекулярный анализ для оценки коллагена Ремоделирование в новообразованной ткани. Целью исследования было наблюдать, если одной инъекции аллогенной PRP могут повлиять на исцеление секционного ахиллова сухожилия.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Уход и обработки животных были проведены в соответствии с руководством для ухода за и использования лабораторных животных, подготовленный Национальной академии наук и публикации национальных институтов здравоохранения (США). Были тщательно следили за европейское и национальное законодательство.
1. животных подготовка
- Используйте 132 2 - месячного Sprague-Dawley самцах массой 320-450 г (120 крыс для экспериментов) и 12 крыс для забора крови, Рисунок 1. Основываясь на Dell13, 15 крыс для каждой группы был достаточно для питания 0,8 (80% шанс найти статистической значимости, если существует указанный эффект).
- Дом всех крыс в классической клеток в условиях изоляции в объекте обычных, с меняющейся станции. Спровоцировать разводить в стойке IVC (индивидуально вентилируемых Кейдж), с SPF (конкретного возбудителя бесплатно) крыс специально закупаемого.
- Используйте следующие жилищных условий: диапазон температур от 19-24 ° C; Относительная влажность: 40-60%; Вентиляция: частота обновления воздуха: 10-15 в час; свет/темно цикла: 12 h - 12 h.
- Простерилизуйте все арретирование оборудования и использовать облученного постельные принадлежности. Системно реализуйте Кейдж обогащения путем размещения стерильные картонные поддоны и полотенца внутри клетки.
- Разрешить доступ к зоне ограниченных условиях: новые лаборатории пальто, маски, перчатки, обувь и волосы капота на входе.
- Осуществлять наблюдение за работоспособностью колонии на контрольных животных, размещенный на грязной подстилке на ежегодной основе, в соответствии с рекомендациями14 Felasa для обычных объектов. Держать четыре или пять животных в клетке, с соответствующим облученных диеты и обеспечивают подкисленное воды ad libitum. Монитор ежедневно.
- Передача крыс, избранных для хирургического вмешательства в фильтрации верхней клетки в хирургической номера 2 ч до операции.
2. хирургическая процедура
- Подготовить хирургические инструменты: штраф ножницы, клещи, два кровоостанавливающие зажимы и иглодержателя. Во время всех процедур носите перчатки, маска, капот и халате.
- Случайным образом разделите крыс на две группы (PRP и физиологический раствор).
- Возьмите крысы из своей клетки и взвесить его. Используйте нумерованные ушные бирки для идентификации крыс. Чтобы избежать высыхания глаз, место капли воды на роговице.
- Анестезировать крыса внутрибрюшинно с Ксилазина (10 мг/кг массы тела) и кетамин (80 мг/кг веса тела). Чтобы подтвердить анестезии, место животных под кардио-респираторных функций мониторинга и проверки для любой глаз рефлексов.
- Придать 50 мкл бупренорфина подкожно (0,01-0,05 мг/кг каждые 8-12 ч) в области шеи, как болеутоляющее средство.
- Бритья левой задние конечности с электробритва, вылечить его с 3, чередуя скрабы iso-betadine/алкоголя (разбавленных 1:10) решения и крысы на площадку теплой (20 ° C) под микроскопом рассечения. Место крысы на боковых пролежни с ноги, чтобы быть оперированы в главенствующее положение. Держите Лапы с Щипцы хирургические.
- С помощью ножниц, сделать небольшой боковой разрез (20-25 мм) в кожу вокруг левого ахиллова сухожилия и вскрыть фасции, с помощью тонкой ножниц выставить ахиллово сухожилие комплекс (Рисунок 2a).
- Удаление plantaris сухожилия с ножницами (рис. 2b).
- Отрубом ахиллово сухожилие 5 мм проксимальнее пяточная вставки и удалить часть длиной 5 мм с помощью ножниц. Не шов сухожилия (рис. 2 c, 2d).
- Шовные фасции и затем кожу с рассасывающимся пряжи, делают overjet швом (непрерывный шов). Леска швов может использоваться также для предотвращения влагу от кожи в хирургический разрез.
- Поместите крысу под лампой Отопление пока спит и затем поместите крыса обратно в клетке (58 x 38 см) (Nota bene: накладывается не иммобилизация).
3. PRP подготовку15
- Внутрибрюшинной инъекцией анестезировать доноров крыс с Ксилазина (10 мг/кг массы тела) и кетамин (80 мг/кг веса тела). PRP впрыска осуществляется 2 ч после операции без каких-либо ре цистит.
- Вводить подкожно 50 мкл бупренорфина как болеутоляющее средство.
- Сбор цельной крови (20 мл на крысу, окончательный кровотечение), сердечной прокол в стерильные пробирки содержащие 3.2% буферизуются цитрат натрия (0.109 М, антикоагулянт). Затем усыпить крыса внутрисердечной инъекции.
- Чтобы получить ОТР, центрифуга крови в течение 10 минут при 150 x g и комнатной температуре. Этот первоначальный низкая скорость центрифугирования шаг дает два различных этапа: Нижняя фаза, состоящая из красных кровяных телец (эритроцитов), которые приходится около 80-90% от общего объема и Верхний этап, состоящий из тромбоцитов богатые плазмы (PRP) (обычно 10-20% крови образец).
- Аккуратно собирают PRP (Верхний этап) в средних пластиковую трубку с помощью пипетки пластиковые передачи. Как интерфейс между НРП и красные кровяные клетки очень свободно, не Пипетка слишком близко к интерфейсу. При правильном, загрязняя эритроцитов в ОТР должен быть ниже 0,05 x 103 клеток / мкл. отменить оставшиеся нижней фазе и основной пробирки.
- Определить объем собранных PRP и измерить количество тромбоцитов на гематологический анализатор. Эти значения необходимы для расчетов для регулировки концентрации тромбоцитов на следующем шаге. Кровяных телец также является полезным для оценки потенциального загрязнения с эритроцитов и лейкоцитов. тромбоцитов концентрация в ОТР на этой стадии обычно 1-1,5 x106µл.
- Выполните второй центрифугирования PRP для 10 мин на 1000 x g и комнатной температуре. Этот шаг высокоскоростной центрифуги дает свободно тромбоцитов лепешки и супернатанта, состоящий из аутологичной тромбоцитов плохой плазмы (ППС). С помощью значений, определенных на шаге 3.6, рассчитать объем супернатант удаляется сконцентрировать PRP и добраться до конечной концентрации 2,5 x106µл.
- Аккуратно собирают супернатант (ППС) вторичные пластиковую трубку с помощью пипетки пластиковые передачи, оставив примерно две трети из заключительного тома, рассчитанные на шаге 3.7. Как гранулы рыхлая, значительное количество тромбоцитов теряется, когда PPP отбрасывается, следовательно потенциально уменьшая окончательный желаемой концентрации.
- Тщательно Ресуспензируйте гранулы тромбоцитов с оставшихся супернатанта, нежный неоднократные закупорить. Измерьте количество тромбоцитов на этот концентрированный ОТР. Если требуется, добавьте соответствующие тома аутологичной PPP для достижения окончательной цели концентрации.
Примечание: Используйте ОТР в течение 3 часов подготовки. - Добавьте 50 мкл CaCl2 (11 mEq 10 мл) мл PRP для активации тромбоцитов.
- Inject 50 мкл свежие ОТР или физиологический раствор с иглой 21G непосредственно в место зашивается операции около 1 ч после подготовки. В это время Держите PRP при комнатной температуре.
- Внимательно следить за функциональное восстановление крыс в течение дней после операции и до удаления ахиллово сухожилие.
4. Удаление ахиллова сухожилия и биомеханические тестирования16
- 5, 15 или 30 дней позднее5, весят крыса. Затем анестезировать Ксилазина (10 мг/кг массы тела) и кетамин (80 мг/кг массы тела) внутрибрюшинной инъекцией.
- Вводить подкожно 50 мкл бупренорфина как болеутоляющее средство. Удалите сухожилия до принесения в жертву животное, чтобы сохранить физиологические условия для как можно дольше.
- Брить левой задних конечностей и место крысу под микроскопом рассечения. Место крысы на боковых пролежни с ноги, чтобы быть оперированы в главенствующее положение. Держите Лапы с пальцами.
- Сделать небольшой надрез (10 мм) в предыдущую операцию и продлить до suralis трицепс подвергается.
- Чтобы удалить исцеления ахиллова сухожилия, вырежьте пяточная кость поперек 5-10 мм дистальной своей привязанности ахиллова сухожилия. Затем вскрыть частью трицепс suralis, который прилагается к ахиллова сухожилия (рис. 3b). Мышечную часть должна быть достаточно большой, чтобы уместиться в крио челюсть (рис. 3 c-d). Поместить образец сразу в крио челюсти с помощью щипцов (Рисунок 3e).
- После удаления комплекс мышц сухожилие кость, усыпить крыса внутрисердечной инъекции с нембуталовым (200 мг/кг). Подтвердите смерть путем оценки отсутствие ритма сердца и дыхания за 15 мин.
- Поместите блок мышц в верхней челюсти (Рисунок 3e), закройте его и поместите его вертикально в Универсальная испытательная машина (106,2 кН, рис. 3a). Затем зафиксируйте кости между нижней зажимами машины (Рисунок 3f).
- Добавьте жидкого азота в обоих бассейнах верхней челюсти заморозить мышцы, так что это на порядок жестче, чем сухожилия и не деформируется во время испытания на растяжение.
- При замораживании зоны достигает границы металлический зажим, начните испытания на растяжение, поэтому сухожилие сохранит свою структуру. Установите скорость перемещения машины с постоянной скоростью 1 мм/с до разрыва. Запись конечной прочности (UTS) дано в Ньютонах (Н) на компьютере.
- Чтобы вычислить площадь поперечного сечения, место две камеры перпендикулярно друг к другу, образуя эллиптической формы и принимать фотографии.
- Для учета разницы в сечение исцеления сухожилий, нормализовать ОТС на единицу площади (N на квадратный миллиметр), которое представляет с механическим стрессом ткани.
5. гистологический анализ
Примечание: 15 сухожилий каждой группы прошли гистологический анализ.
- После его удаления, опускайте ахиллово сухожилие сразу в параформальдегида 4% для сохранения его структуры (1 мм ткани фиксируется в час, поэтому время фиксации варьируется в зависимости от размера сухожилие).
- Заменить параформальдегида на 70% этиловом спирте и оставить образец для по крайней мере одну ночь в этом решении.
- Место сухожилие маленький пластиковый контейнер с отверстиями и место этого контейнера в свежий раствор этанол 70% за 1 час.
- Место контейнера в 95% этаноле за 1 ч. повторить.
- Место в контейнер в 100% этанола за 1 ч. повторить.
- Место в контейнер в ксилоле 100% за 1 ч. повторить.
- Теперь поместите пластиковый контейнер, который содержит сухожилия, жидкий парафин (56 ° C) и оставить его на ночь.
- С помощью внедрения станции (оборудован расплавленный воск, плита и холодной пластины), выбрать металлический плесень, который лучше всего соответствует образца ткани и заполнить его с немного жидкий парафин, так что база покрыта.
Примечание: Ориентироваться образца для получения вертикальных разрезов на микротома. - Когда образец правильно, заполнить форму с жидкий парафин и поместить его на холодильной машины. Пусть ему остыть по крайней мере 15 минут.
- Удалите из блока парафина и поместите его на льду, по крайней мере 30 минут.
- Подготовить несколько слайдов чистого стекла и положить несколько капель деионизованной воды на них.
- В микротом вырезать блоков в разделах 5 мкм (только использовать разделы из средней части сухожилие) и раздел на слайде.
- Место слайды в Отопление печи при 65 ° C на несколько минут, так что парафин только начинает таять для склеивания тканей к стеклу.
- Место слайды, содержащие парафиновых срезах в держатель фрагмента.
- Теперь deparaffinize и увлажняет ткань, поместив его в следующих последовательных бани:
8 мин в ксилоле (ванна 1)
4 мин в ксилоле (баня 2)
2 мин в 100% этанола
2 мин в 95% спирте
2 мин в 70% этанол
2 мин в деионизированной воде - Для окрашивания гематоксилином-эозином место ткани в следующих решений.
- Погружайте ткани на 8 минут в растворе гематоксилином (1 g гематоксилином моногидрата, 0,2 г Кио3, 50 г AIK (4т)2.12H2O; 200 мл глицерина; приспособиться к 1 Л дистиллированной водой).
- Погружайте ткани на 8 мин под струей водопроводной воды.
- Погружать ткани на 30 s в раствор эозина (0,25% эозина в 100 мл дистиллированной воды, содержащей 200 мкл неразбавленном уксусной кислоты).
- Погружайте ткани на 2 мин под струей водопроводной воды.
- Для Trichrome окрашивание Masson выполните следующие действия.
- После регидратации поместить эти разделы в контейнере с железа квасцов (0,5 г (NH4) Fe (4т)2.12H2O 10 мл H2O) и закройте контейнер. Прогреться 3 мин в 280 W в микроволновую печь.
- Пусть ему остыть на минуту и затем ополосните деионизированной водой.
- Место разделы в закрытом контейнере раствором Regaud в гематоксилином (0,5 г гематоксилином растворяют в 50 мл H2O при 50 ° C, затем добавить этанола 95% 5 мл и 5 мл глицерина), прогреться 90 s на 280 W.
- Ополосните деионизированной водой.
- Место разделы в раствора пикриновой кислоты (при насыщении в метаноле) для 3 мин, ополосните в течение 5 мин под проточной водой и затем поместите его в деионизированной воде в течение нескольких секунд.
- Теперь место разделы в кислоты фуксин (0,5 g в 50 мл H2O, содержащий 0,25 мл неразбавленного уксусной кислоты) для 5 s и промыть под проточной водой до тех пор, пока краска исчезает.
- Инкубировать в подразделах phosphomolybdic кислоты раствор (0,5 g в 50 мл H2O) за 5 мин, поместить его на несколько секунд в деионизированной воде.
- Поместить эти разделы в светло-зеленый (0,5 g в 50 мл H2O, содержащий 0,25 мл неразбавленного уксусной кислоты) решение для еще 5 мин и поместите его под проточной водой до тех пор, пока краска исчезает.
- Теперь снова обезвоживает ткани.
- Погрузитесь в разделе 1 мин в 70% этиловом спирте.
- Погрузитесь в разделе 1 мин в 95% этаноле.
- Погрузитесь в разделе 1 мин в 100% этанола.
- Погрузитесь в разделе 1 мин в ксилоле (ванна 1).
- Погрузитесь в разделе 1 мин в ксилоле (баня 2).
- Удалите разделы без удаления слишком много ксилол и капнуть каплю монтажа средних на образце.
- Сверху положить coverslip (без провоцирования любые пузыри) и пусть он затвердеть в течение не менее 2 ч.
- Гидролизуют 5 Гистологические срезы (каждый из разных сухожилия) каждой группы в 6 N HCl 3 часа и определить концентрацию коллагена, измеряя гидроксипролина как индекс в 5 мкм незапятнанное секций.
- Нормализовать результаты по области раздела с помощью производителя программного обеспечения.
- Выведение некоторых секций с свет зеленый краситель для визуализации и количественно фибриллярного коллагена компьютерного анализа.
- Сканировать разделы и конвертировать изображения в оттенках серого, с использованием программного обеспечения IrfanView. Использование программного обеспечения для полу количественной оценке (например, количество один).
6. молекулярные оценки
- После разрыва сухожилия, которая происходит во время механические испытания, брать пробы, оснастки заморозить их в жидком азоте и хранить их в-80 ° C (PRP и физиологический раствор)17.
- Используйте коммерческий набор всего РНК для изоляции всего РНК17.
- Оценить экспрессию коллагена (Col I и Col III), матрицы металлопротеиназ (ММП-2, ММП-3 и ММП-9) и tenomodulin (TNMD), ПЦР-17,18.
- Нормализовать выражение уровня мРНК до уровня 28S19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Результаты выражаются как среднее ± стандартное отклонение от среднего значения и были по сравнению с дисперсионный анализ (ANOVA). Двусторонний ANOVA и пост Специального теста де Scheffé, который является параметрические испытания, были использованы.
Предел прочности на растяжение (UTS) требуется вызвать разрыв-ранения ахиллова сухожилия крыс было 42,0 ± 5.7 N (n = 10). Прочность на растяжение значительно увеличилось (p < 0,0001) в обеих группах после дня 5. Сравнивая обеих групп, ОТС был выше в группе ОТР в любое время измеряется, особенно в день 15 и 30. Путем измерять площадь поперечного сечения сухожилий, которые были удалены перед прохождением биомеханических оценки (11,4 ± 5,5 мм2 для не ранены сухожилия), было установлено, в день 5, что он больше в группе солевой обработки. Но в день 15 и 30, площадь поперечного сечения был больше в группе ОТР, хотя это количество было более разнообразны по сравнению с физиологическим обрабатываемой группы (рис. 4 и 5).
Гистологическая Оценка сухожилий, используя гематоксилином эозином окрашивание, показала высокий клеточности в день 5, который снизился после (никакого существенного различия было отмечено между группой PRP и физиологический раствор). Массон Trichrome окрашивание показали выше, присутствие фибриллярного коллагена в группе ОТР в день 5 и 15. Однако интенсивность окрашивания был похож на обоих групп через 30 дней после инъекции (рис. 6). Полуфинал количественной оценки, полученные путем окрашивания образцов с светло зеленый показали, что в день 5 и 15, интенсивность был выше в группе ОТР (не является статистически значимым), но в день 30, нет никакой разницы между двумя группами.
Данные нормализуется путем измерения количества аминокислоты, гидроксипролина, который специфичен для коллагена, подтверждения гистологическим полу количественной (день 5: большее значение в группе ОТР). Коллаген концентрация не был стабильным в группе ОТР, но стабилизировалась в день 30 в двух группах. Объем каллуса была измерена и оказалась значительно больше в ОТР лечить животных на первых этапах процесса заживления. Взятые вместе, эти результаты предполагают, что PRP инъекции на ранены сухожилия вызывает важные количество фибриллярного коллагена на хранение.
Измерение уровня экспрессии нескольких молекул, показали, что в не ранены сухожилия, Col III и TNMD были присутствует в меньшей суммы (2,5 - 3,0 раза) чем в исцеление сухожилий на 15 день, однако не было разницы в Col я выражение между группами. Равенству присутствовали на 12-fold высокой концентрации в исцеление сухожилий. Кроме того в день 30, там было значительное увеличение COL1A1 в группе ОТР, и положительная корреляция между COL1A1 выражения и ОТС был найден. В обеих группах было установлено, что Col III была выражена в высоких количествах от 1 дня до дня 14, прежде чем она снизилась (одинаковым для обеих групп). MMP-9 концентрации в обеих группах не изменился, но ММП-2 и MMP-3 присутствовали при более высоких концентрациях в течение периода заживления. На 5 день, TNDM была выражена в более высокую сумму в PRP (p < 0.03), но потом снизилась между 15 и 30 дней.
Рисунок 1: экспериментальный дизайн исследования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Хирургическая процедура.
() жилой комплекс после удаления окружающие фасции.
(b) удаление сухожилие plantaris.
(c) удаление раздела ахиллово сухожилие.
(d) 2 сухожилий, которые были удалены. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Биомеханические тестирования
(a) Универсальная испытательная машина (106,2 кН).
(b) мышц сухожилие кость комплекс, который будет устанавливаться в крио челюсть.
(c) верхняя и нижняя челюсти cryo
(d) верхняя и Нижняя крио челюсти
(e) комплекс введен в крио челюсти
(f) закрытой крио челюсть содержащий комплекс мышц сухожилие кость, фиксированной в машину. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: Биомеханические результаты тестирования
Прочность на растяжение, выраженная в Ньютонах (Н) в управления и группы ОТР в разное время точках после операции. Там было увеличение UTS в обеих группах со временем, с группой ОТР, показывая значительно более высокие значения в 15 и 30 дней после операции.
Погрешностей определяет стандартное отклонение (SD). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: Результаты биомеханические тестирования
Поперечная площадь сухожилия, выраженное в квадратных миллиметров (мм2). Площадь поперечного сечения был значительно выше в группе ОТР до 15 день. После этого Секция был похож в обеих группах.
Погрешностей определяет стандартное отклонение (SD). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6: Гистологические результаты
Представитель продольному сечениям ахиллова сухожилия от контроля и группы ОТР, витражи с Массон в Trichrome. Шкалы бар = 100 мкм. Есть сильнее зеленый окрашивания в сухожилие группы политики репликации Паролей на 5 день. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Тромбоциты имеют важное значение для раннего воспалительной фазы сухожилия, процесс заживления. Когда эти тромбоцитов подвергаются обязательной ткани или факторы, которые вызывают коагуляции, они будут выпускать факторы роста, которые хранятся в α гранул. Вследствие этого взаимодействия внеклеточная матрица макромолекул, синтезированный и Мезенхимальные клетки размножаются. Тромбоциты также имеют эозинофилов действие на клетки-предшественники в циркуляции крови, повышение ангиогенеза и стимулирования клеточной дифференциации6,20.
Биомеханические тестирования было сделано с помощью зажимного устройства, специально сделанные для ex vivo испытания на растяжение ахиллова сухожилия в крыс15. Крио челюсти позволяет замораживание мышцы, добавив жидкого азота, и пяточная кость, которая находится в нижней части образца, напрямую фиксируется в машину. Это очень важно начать испытания на растяжение, когда мышцы полностью жесткой, но до сих пор гибкие сухожилия. Этот метод позволяет избежать повреждения тканей и сохраняет механическую целостность. Также этот метод простой, безопасный, не компрессионный и явно воспроизводимость, как несколько исследований использовали этот метод4,15.
Для поддержки механических результаты, некоторые сухожилия претерпел гистологические оценки. Гематоксилином-эозином показывает большой обзор зарубцевавшиеся ткани и дает общую информацию о количестве клеток и коллаген настоящего. Кроме того измерение hydroxyprolin является полезным, поскольку это аминокислота, можно найти только в коллагена и позволяет обоснование гистологических данных. Однако это нужно делать Masson Trichrome окрашивание, как он показывает гораздо более подробную информацию о осаждения и концентрации коллагеновые волокна4.
Хотя уровень коллагена III мРНК в PRP лечение сухожилия не было изменено, в день 30 мРНК Col, я присутствовал в более высокой концентрации в пострадавшим сухожилий, относились с ОТР. Ранее было показано, что PRP мешает с распространением макрофагов и производства IL-121, который таким образом может избежать чрезмерного воспалительной реакции на ранних этапах процесса заживления11. Вполне возможно, что PRP стимулирует распространение, активации метаболических и превращение мезенхимальных клеток в tenocytes, которые являются активными.
Высокая концентрация TNDM в сухожилиях ОТР группа указывают, что вводили молекул может привлечь клетки, циркулирующие в крови поток и побудить дифференциация к tenocyte фенотип11. Взятые вместе, эти результаты показывают, что только одной инъекции ОТР в разрыв ахиллова сухожилия имеет положительное влияние на ранней стадии заживления и приводит к высокой механической прочностью.
Несколько доклинические исследования уже показали, что PRP улучшает процесс заживления ран, и что различные факторы роста имеют конкретные действия во время этого процесса22. Mazzocca и его команда продемонстрировала, что PRP стимулирует пролиферацию клеток мышц, костей и сухожилий. Из различных препаратов сильно концентрированный PRP без каких-либо белые кровяные клетки оказалось наиболее эффективным лечение23. McCarrell и др. сделал аналогичный эксперимент, тестирование нескольких препаратов ОТР, содержащие различные концентрации на лошади сухожилий PRP и белых кровяных клеток. Препараты, содержащие промежуточных концентрации тромбоцитов и высокая концентрация белых кровяных клеток привело к выбросу выше провоспалительных цитокинов, таких как Ил 1ß и TNFa и Нижняя синтез коллагена. Смеси с высокой концентрацией тромбоцитов и лейкоцитов крови также привело к увеличению воспалительных цитокинов, но синтез коллагена тормозится. В заключение, это означает, что если тромбоцитов концентрация слишком высока, синтез и клеток метаболизма коллагена замедляется24. Босуэлл и др. подтвердили эти выводы25. Наиболее эффективной подготовки PRP таким образом будет содержать тромбоцитов концентрации ниже, чем 106 тромбоцитов/мкл и без белых кровяных клеток.
Основным преимуществом использования ОТР является autogenity. Хотя в нашем исследовании, мы использовали аллогенной ОТР, жертвуя доноров крыс иметь достаточное количество крови. Кроме того принимая кровь из оперированных крыс ослабит их слишком много. Еще одно ограничение этого исследования является то, что все разрывы острых и выступал на здоровых сухожилий, который не всегда является в случае людей, как сухожилия часто разрыва из-за предварительного дегенерации. Эта модель основывается на острые сухожилия травм, не окончательные выводы можно извлечь для дегенеративного Тендинопатии.
С помощью этого метода, есть некоторые важнейшие шаги, чтобы помнить, первый из которых подготовка ОТР, который должен быть как воспроизводимость как можно. Другим важным шагом является хирургическая процедура: удаление сухожилий и мышц сухожилие комплекс должно быть сделано в воспроизводимый способ избежать каких-либо предубеждений. И наконец, подготовка к биомеханические тестирования: жидкого азота добавляется заморозить мышц, и это очень важно, что сухожилия не является замороженным в этом процессе потому, что это может привести к предвзятым результаты, как сухожилия жесткость будет изменена. Это также ограничение исследования, поскольку есть не стандартный протокол для обеспечения, что эластичность сухожилия не изменяется.
Наш метод основе метод, разработанный Вирченко и др. 26, но адаптировать его с помощью крио челюсти, которая защищает сухожилия против внешней агрессии, вызванных зажимы. Основным преимуществом данного метода является, что это воспроизводимый, даже если он еще не стандартизированы. Это дает представление о как сухожилия травм может рассматриваться в организме человека, хотя экспериментов с крысами не всегда перевод также в лечении человека травм. Вполне вероятно, что адаптированный вариант этого метода может быть полезным в лечении этих травм в будущем, подтверждается тем фактом, что он прост в использовании, имеет относительно низкую стоимость и менее инвазивна, чем другие методы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Отсутствие конфликта интересов объявил.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано стандартных де Льеж и Лежён - Lechien предоставляет Леон Frédéricq средств.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xylazine (Xyl-M) | VMD | none | anesthetic |
| Ketamin (Jétamine 1000 CEVA) | CEVA Santé Animale | none | anesthetic |
| Buprenorphin (Vetergésic Multidosis) | ALSTOE | none | Painkiller |
| iso-Betadine | MEDA-Pharma | none | Desinfectant |
| resorbable yarn Vicryl 6/0 | Johnson & Johnson | ||
| Nembutal | CEVA Santé Animale | none | Anesthetic |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Preserves structure of the tissue |
| Isopropanol 100% | VWR | 20,922,364 | |
| Ethanol 95% | VWR | 20,823,362 | |
| Xylene | VWR | 28973.363 | |
| Paraffin | VWR | LEIC3950.1006 | |
| Hematoxylin | Millipore | 1.15938.0025 | Colorant |
| Eosin | Millipore | 1.15935.0100 | Colorant |
| Eukitt | Sigma-Aldrich | 3989 | Mounting Medium |
| CaCl2 |
References
- Kaux, J., Degrave, N., Crielaard, J. Platelet rich plasma traitement des tendinopathies chroniques? Revue de la littérature. Platelet rich plasma treatment of chronic tendinopathies? Review of literature. J. Traumatol. du Sport. 24, 99-102 (2007).
- Anitua, E., et al. Autologous preparations rich in growth factors promote proliferation and induce VEGF and HGF production by human tendon cells in culture. J. Orthop. Res. 23, 281-286 (2005).
- Bosch, G., et al. Effects of platelet-rich plasma on the quality of repair of mechanically induced core lesions in equine superficial digital flexor tendons: A placebo-controlled experimental study. J. Orthop. Res. 28, 211-217 (2010).
- Kaux, J. F., Drion, P., Croisier, J. L., Crielaard, J. M. Tendinopathies and platelet-rich plasma (PRP): From pre-clinical experiments to therapeutic use. J. Stem Cells Regen. Med. 11, P7-P17 (2015).
- Maffulli, N., Wong, J., Almekinders, L. C.
- Molloy, T., Wang, Y., Murrell, G. The roles of growth factors in tendon and ligament healing. Sports Med. 33, 381-394 (2003).
- Lyras, D. N., et al. The effect of platelet-rich plasma gel in the early phase of patellar tendon healing. Arch. Orthop. Trauma Surg. 129, 1577-1582 (2009).
- Aspenberg, P., Virchenko, O. Platelet concentrate injection improves Achilles tendon repair in rats. Acta Orthop. Scand. 75, 93-99 (2004).
- Visser, L. C., et al. Growth Factor-Rich Plasma Increases Tendon Cell Proliferation and Matrix Synthesis on a Synthetic Scaffold: An In Vitro Study. Tissue Eng. Part A. 16, 1021-1029 (2010).
- Zhang, J., Wang, J. H. -C. Platelet-Rich Plasma Releasate Promotes Differentiation of Tendon Stem Cells Into Active Tenocytes. Am. J. Sports Med. 38, 2477-2486 (2010).
- Kajikawa, Y., et al. Platelet-rich plasma enhances the initial mobilization of circulation-derived cells for tendon healing. J. Cell. Physiol. 215, 837-845 (2008).
- Pasternak, B., Aspenberg, P. Metalloproteinases and their inhibitors-diagnostic and therapeutic opportunities in orthopedics. Acta Orthop. 80, 693-703 (2009).
- Dell, R. B., Holleran, S., Ramakrishnan, R.
- Mähler Convenor, M., et al. FELASA recommendations for the health monitoring of mouse, rat, hamster, guinea pig and rabbit colonies in breeding and experimental units. Lab. Anim. 48, 178-192 (2014).
- Kaux, J. -F., et al. Étude comparative de cinq techniques de préparation plaquettaire (platelet-rich plasma). Pathol. Biol. 59, 157-160 (2011).
- Wieloch, P., Buchmann, G., Roth, W., Rickert, M. A cryo-jaw designed for in vitro tensile testing of the healing Achilles tendons in rats. J. Biomech. 37, 1719-1722 (2004).
- Kaux, J. -F., et al. Vascular Endothelial Growth Factor-111 (VEGF-111) and tendon healing: preliminary results in a rat model of tendon injury. Muscles. Ligaments Tendons J. 4, 24-28 (2014).
- Docheva, D., Hunziker, E. B., Fässler, R., Brandau, O. Tenomodulin is necessary for tenocyte proliferation and tendon maturation. Mol. Cell. Biol. 25, 699-705 (2005).
- Lambert, C. A., Colige, A. C., Munaut, C., Lapière, C. M., Nusgens, B. V. Distinct pathways in the over-expression of matrix metalloproteinases in human fibroblasts by relaxation of mechanical tension. Matrix Biol. 20, 397-408 (2001).
- Nurden, A. T., Nurden, P., Sanchez, M., Andia, I., Anitua, E.
- Woodall, J., Tucci, M., Mishra, A., Benghuzzi, H. Cellular effects of platelet rich plasma: a study on HL-60 macrophage-like cells. Biomed. Sci. Instrum. 43, 266-271 (2007).
- Taylor, D. W., Petrera, M., Hendry, M., Theodoropoulos, J. S. A systematic review of the use of platelet-rich plasma in sports medicine as a new treatment for tendon and ligament injuries. Clin. J. Sport Med. 21, 344-352 (2011).
- Mazzocca, A. D., et al. The positive effects of different platelet-rich plasma methods on human muscle, bone, and tendon cells. Am. J. Sports Med. 40, 1742-1749 (2012).
- McCarrel, T. M., Minas, T., Fortier, L. A. Optimization of leukocyte concentration in platelet-rich plasma for the treatment of tendinopathy. J. Bone Joint Surg. Am. 94 (1-8), e143 (2012).
- Boswell, S. G., et al. Increasing platelet concentrations in leukocyte-reduced platelet-rich plasma decrease collagen gene synthesis in tendons. Am. J. Sports Med. 42, 42-49 (2014).
- Virchenko, O., Aspenberg, P. How can one platelet injection after tendon injury lead to a stronger tendon after 4 weeks?: Interplay between early regeneration and mechanical stimulation. Acta Orthop. 77, 806-812 (2006).
