Summary
Dit protocol beschrijft het evaluatieproces van genezing van pezen bij ratten die zijn ingespoten met allogene platelet rich plasma (PRP) of zoutoplossing na het verwijderen van deel van de achillespees. De voortgang van de genezing van de pees wordt geëvalueerd op verschillende tijdstippen met behulp van verschillende types van analyses.
Abstract
Dit artikel beschrijft de experimentele procedures gebruikt om te observeren als PRP positief pees genezing beïnvloeden kunt. Er zijn 4 belangrijke stappen te volgen: induceren van een laesie in de achillespees; PRP bereiden en Injecteer het (of de zoutoplossing); Verwijder de pees; en biomechanische, moleculaire en histologische evaluaties uit te voeren. Bij elke stap, zijn alle procedures en methoden in detail beschreven, zodat deze gemakkelijk kan worden gereproduceerd.
Achilles pezen geweest operatief verdeelde (verwijdering van een lang stuk van 5 mm). Daarna werd PRP of zoutoplossing geïnjecteerd om te bestuderen of PRP een positief effect heeft op de genezing van de pees. Drie groepen van 40 dieren (totaal 120 ratten werden gebruikt in deze studie) werden onderverdeeld in 2 deelgroepen: PRP injectie groep en een zoutoplossing injectie controle groep. Ratten werden opgeofferd in toenemende tijd punten (groep A: 5 dagen; Groep B: 15 dagen; Groep C: 30 dagen) en pezen werden verwijderd. 90 pezen onderging biomechanische testen vóór het uitvoeren van analyses van de transcriptomic en de 30 resterende pezen aan histologische analyse werden voorgelegd.
Introduction
Stolling, inflammatoire processen en de immuniteit modulatie rollen van bloedplaatjes zijn bekende1. Meer recentelijk is gebleken dat ze ook herstellende eigenschappen2,3 hebben. Inderdaad, verschillende cytokines en groei factoren (VEGF, PDGF, TGF-B, IGF-I, en HGF) worden uitgebracht door trombocyten tijdens degranulatie. Deze factoren die de groei bevorderen angiogenese, weefsel remodeling en wond genezing (bot, huid, spier, pees)2. Centrifugeren autoloog bloed produceert bloedplaatjes rijk plasma (PRP), waarin hoge bloedplaatjes concentraties afhankelijk van de isolatie-methode (tussen 3 en 10 keer bloed concentraties van de basislijn). Inderdaad, geen verschillende PRP voorbereiding technieken een identieke eindproduct. Tot nu toe is er geen internationale algemene overeenstemming over deze kwestie bereikt. PRP zou over het algemeen een aantrekkelijke therapeutische optie voor de behandeling van chronische musculoskeletale aandoeningen, zoals tendinopathie, plantaire fasciitis, artrose en nonunion4. Het werd voor het eerst gebruikt in mondelinge chirurgie en implantologie4 te verbeteren en versnellen van de genezing na plaatsing van een tandheelkundig implantaat bot. In deze studie beschrijven we een reproduceerbare methode waarmee de verwerving van PRP voor dierproeven4.
Aangezien letsels van de pezen worden vaak waargenomen bij sporters en fysieke werknemers, verbetering van het genezingsproces en dus minder tijd voor herstel zijn van groot belang5. Nieuwe behandelmethoden die vaak ontwikkelen wordt gekenmerkt door het gebruik van groeifactoren, en het beheer van PRP is een eenvoudig en minimaal invasieve manier om het leveren van een mix van endogene groei factoren4.
Verscheidene in vitro of dierlijke studies hebben aangetoond dat de administratie van plasma met een hoog niveau van Trombocyten, door het vrijgeven van biologische bemiddelaars, pees en een ligament reparatie stimuleren kan door het vrijgeven van biologische bemiddelaars6 ,7,8,9. Bovendien, andere studies hebben aangetoond dat PRP kan het stimuleren van type I en III collageen synthese in pees cellen9,10,11. Er is ook gesuggereerd dat PRP kan de activering van matrix metalloproteinasen (MMP) verlagen en daardoor de afbraak van de matrix verminderen. Cellen die bij het proces van de ontsteking betrokken zijn kunnen produceren MMP-9, dat een rol speelt bij weefsel remodeling (fysiologische en pathologische) geïnduceerd door ontsteking12.
Op basis van deze informatie, veronderstelde wij dat een enkele PRP injectie in de verdeelde Achilles pezen van ratten het herstelproces en de mechanische sterkte van het gerepareerde weefsel verbeteren kan. Dit is getest door het meten van de biomechanische eigenschappen van de helende pezen tijdens het herstelproces en door het uitvoeren van de histologische en moleculaire analyses om te evalueren van collageen in het nieuw gevormde weefsel remodeling. Het doel van de studie was om te observeren als een enkele injectie van allogene PRP invloed kan zijn op de genezing van verdeelde Achilles pezen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Zorg en behandeling van de dieren werden uitgevoerd volgens de richtsnoeren voor de verzorging en het gebruik van proefdieren opgesteld door de National Academy of Sciences en gepubliceerd door de nationale instituten van gezondheid (USA). Europese en nationale wetgevingen werden zorgvuldig gevolgd.
1. dierlijke voorbereiding
- Gebruik 132 2 - maanden oude mannelijke Sprague-Dawley ratten met een gewicht van 320-450 g (120 ratten voor experimenten) en 12 ratten voor bloedmonsters, Figuur 1. Op basis van Dell13, 15 ratten voor elke groep was genoeg voor een kracht van 0.8 (80% kans op het vinden van statistische significantie, als het opgegeven effect bestaat).
- Het huis van alle ratten in klassieke kooien in een conventionele faciliteit uitgerust met een station van de veranderende omstandigheden isolatie. Kweken in een rack van IVC (individueel geventileerde kooi), gang met SPF (specifieke pathogene vrije) ratten wordt specifiek gekocht.
- Gebruik de volgende huisvestingsomstandigheden: temperatuurbereik van 19-24 ° C; relatieve vochtigheid: 40-60%; ventilatie: frequentie van lucht vernieuwing: 10-15 per uur kan bereiken; licht/donker cyclus: 12 h - 12 h.
- Steriliseren van alle caging apparatuur en gebruik van bestraalde beddengoed. Systemisch implementeren kooi verrijking door het plaatsen van steriele kartonnen trays en handdoeken binnen de kooien.
- Toegang tot de zone onder beperkte voorwaarden: nieuwe lab jas, masker, handschoenen, schoeisel en haar motorkap bij de ingang.
- Verrichten kolonie gezondheidsmonitoring op sentinel dieren gehuisvest op vuile beddengoed op jaarbasis, volgens de Felasa14 aanbevelingen voor conventionele faciliteiten. Houd vier à vijf dieren per kooi, met de juiste bestraald dieet en bieden aangezuurde water ad libitum. Dagelijks volgen.
- Overdracht van ratten gekozen voor chirurgische interventie in het filteren van top kooien naar de chirurgische kamers 2 uur voor de ingreep.
2. de chirurgische Procedure
- Voorbereiden van de chirurgische instrumenten: fijne schaar, een klem, twee hemostatische klemmen en de houder van een naald. Tijdens alle procedures, Draag handschoenen, een masker, een kap en een laboratoriumjas.
- Willekeurig verdelen de ratten in twee groepen (PRP en zoutoplossing).
- Neem de rat uit haar kooi en wegen. Gebruik genummerde oormerken te identificeren van de ratten. Voorkom uitdroging van de ogen, waterdruppels op het hoornvlies te plaatsen.
- Anesthetize de rat intraperitoneally met xylazine (10 mg/kg lichaamsgewicht) en ketamine (80 mg/kg lichaamsgewicht). Om te bevestigen afstomping, plaatst u de dieren onder cardio-respiratoire monitoring en controle voor elk oog reflexen.
- Subcutaan injecteren van 50 µL van buprenorfine (0.01-0,05 mg/kg elke 8-12 h) in de nek gebied als een pijnstiller.
- De linker hind-limb scheren met een scheerapparaat, gedesinfecteerd met 3 afwisselend scrubs van iso-betadine/alcohol (verdunde 1:10) oplossing en plaats de rat op een warme pad (20 ° C) onder een Microscoop ontleden. Plaats de rat op laterale decubitus met het been op in een superieure positie worden geëxploiteerd. Houd de poot met chirurgische pincet.
- Met de schaar, maak een kleine incisie van laterale (20-25 mm) in de huid rondom de linker achillespees en ontleden de fascia mooie schaar met bloot van de achillespees complexe (Figuur 2a).
- Verwijder de pees van de plantaris met een schaar (Figuur 2b).
- Snijd de achillespees textielgedeelte 5 mm proximale te zijn teneinde inbrengen en verwijderen van een 5-mm lange deel met behulp van schaar. Suture niet de pees (Figuur 2 c, 2d).
- Suture de fascia en de huid met resorbeerbare garen doen een overjet hechtdraad (continu hechtdraad). Monofilamenten hechtingen kunnen ook worden gebruikt om te voorkomen dat wicking uit de huid in de chirurgische incisie.
- Plaats de rat onder een lamp van verwarming tot wakker en plaatst u vervolgens de rat terug in een kooi (58 x 38 cm) (Nota bene: geen immobilisatie wordt opgelegd).
3. PRP voorbereiding15
- Anesthetize de donor ratten met xylazine (10 mg/kg lichaamsgewicht) en ketamine (80 mg/kg lichaamsgewicht) door intraperitoneale injectie. De PRP-injectie wordt 2 h postoperatief zonder ieder re-verdoving uitgevoerd.
- Injecteren subcutaan 50 µL van buprenorfine als een pijnstiller.
- Verzamelen van volbloed (20 mL per rat, definitieve bloeden) door cardiale punctie in steriele buizen bevattende 3,2% gebufferd Natriumcitraat (0.109 M, antistollingsmiddel). Dan euthanaseren de rat door intracardiac injectie.
- Centrifugeer het bloed voor 10 min op 150 x g en kamertemperatuur PRP om, te verkrijgen. Deze lage beginsnelheid centrifugeren stap levert twee fasen: een lagere fase bestaande uit rode bloedcellen (RBC) die goed is voor ongeveer 80-90% van het totale volume en een hogere fase bestaande uit platelet-rich plasma (PRP) (gewoonlijk 10-20% van het bloed monster).
- Zachtjes verzamelen de PRP (bovenste fase) in een secundaire plastic buis met behulp van een precisiepipet kunststof overdracht. Als de interface tussen PRP en rode bloedcellen zeer los is, niet te dicht aan de interface Pipetteer. Wanneer behoorlijk behandeld, verontreiniging van RBC in PRP moeten beneden 0,05 x 103 cellen / µL. Gooi de overgebleven lagere fase en de primaire bloed collectie buis.
- Bepalen van de omvang van de verzamelde PRP en meten van de bloedplaatjes op een hematologie analyzer. Deze waarden zijn vereist voor de berekeningen aan te passen van bloedplaatjes concentratie in de volgende stap. Een bloedcel telling is ook handig om te evalueren van mogelijke besmetting met RBC en WBCs. bloedplaatjes concentratie in PRP in dit stadium is meestal 1 – 1,5 x106/µL.
- Een tweede centrifugeren van het Wachtwoordreplicatiebeleid voor 10 min op 1000 x g en kamertemperatuur uitvoeren. Deze snelle centrifugeren stap levert een losse bloedplaatjes pellet en een bovendrijvende substantie bestaande uit autologe bloedplaatjes-armen plasma (PPP). Met behulp van de waarden bepaald in stap 3.6, het berekenen van het volume van het supernatans moeten worden afgevoerd om te concentreren het Wachtwoordreplicatiebeleid en bereiken een eindconcentratie van 2.5 x106/µL.
- Zachtjes het supernatant (PPP) te verzamelen in een secundaire plastic buis met behulp van een precisiepipet kunststof overdracht, verlaten ongeveer tweederde van het uiteindelijke volume berekend in stap 3.7. Zoals de pellet los is, gaat een aanzienlijke hoeveelheid bloedplaatjes verloren wanneer PPP wordt weggegooid, vandaar mogelijk de vermindering van de gewenste eindconcentratie.
- Zorgvuldig resuspendeer de pellet bloedplaatjes met het resterende supernatant door zachte herhaalde pipetteren. Het meten van de bloedplaatjes op deze geconcentreerde PRP. Indien nodig, voeg het juiste volume voor autologe PPP te bereiken van het concentratie einddoel.
Opmerking: Gebruik het Wachtwoordreplicatiebeleid binnen 3 uur van bereiding. - Voeg 50 µL van CaCl2 (11 milli 10 mL) per mL PRP te activeren van de bloedplaatjes.
- Injecteren 50 µL van verse PRP of zoutoplossing met een naald 21G rechtstreeks in de site ingehecht operatie ongeveer 1 h na bereiding. Houd gedurende deze tijd, PRP bij kamertemperatuur.
- Het functionele herstel van de ratten nauwlettend volgen tijdens de dagen na de operatie en voor de verwijdering van de achillespees.
4. verwijdering van achillespees en biomechanische testen16
- 5, 15 of 30 dagen later5, wegen de rat. Vervolgens, anesthetize met xylazine (10 mg/kg lichaamsgewicht) en ketamine (80 mg/kg lichaamsgewicht) door intraperitoneale injectie.
- Injecteren subcutaan 50 µL van buprenorfine als een pijnstiller. Verwijder de pees voordat het opofferen van het dier om te houden van de fysiologische omstandigheden voor zo lang mogelijk.
- Scheren van de linker hind-limb en plaats de rat onder een Microscoop ontleden. Plaats de rat op laterale decubitus met het been op in een superieure positie worden geëxploiteerd. Houd de poot met vingers.
- Maken een kleine snede (10 mm) in de vorige operatie site en uit te breiden tot de suralis van de triceps is blootgesteld.
- Als u wilt verwijderen de helende achillespees, knippen en het teneinde bot textielgedeelte 5-10 mm distale naar zijn achillespees gehechtheid. Vervolgens het ontleden van een deel van de suralis van de triceps, die is aan de achillespees (Figuur 3b gehecht). Het deel van de spier is groot genoeg om te passen in de cryo-kaak (Figuur 3 c-d). Leg het monster met onmiddellijk in de cryo-kaak met pincet (de 3e figuur).
- Na het verwijderen van de spier-pees-bot complex, euthanaseren de rat door intracardiac injectie met Nembutal (200 mg/kg). Bevestig dood door gebrek aan hartritme en ademhaling voor 15 min te beoordelen.
- Plaats van de eenheid van de spier in de bovenkaak (figuur 3e), sluit u het en plaats deze verticaal in een universele machine testen (106.2 kN, Figuur 3a). Dan fix het bot tussen de lagere klauwen van de machine (figuur 3f).
- Vloeibare stikstof in zowel van de bekkens van de bovenkaak te bevriezen van de spier, zodat het is een orde van grootte stijver dan de pees en niet tijdens de treksterkte test vervormen toevoegen.
- Wanneer de bevriezing zone de grens van de metalen klem bereikt, start de treksterkte test, zodat de pees zal het behoud van de structuur. Stelt het tarief van de verplaatsing van de machine met een constante snelheid van 1 mm/s tot breuk. Het opnemen van de ultieme treksterkte (UTS) gegeven in Newton (N) op een computer.
- Berekenen van de oppervlakte van de dwarsdoorsnede, plaats twee camera's loodrecht op elkaar, vorming van een elliptische vorm, en foto's nemen.
- Om het verschil in de oppervlakte van de dwarsdoorsnede van de helende pezen te verklaren, de UTS naar een oppervlakte-eenheid (N per vierkante millimeter), die de mechanische stress ervaren door het weefsel vertegenwoordigt te normaliseren.
5. histologische analyse
Opmerking: 15 pezen van elke groep onderging histologische analyse.
- Na de verwijdering, het onderdompelen van de achillespees onmiddellijk in 4% paraformaldehyde voor het behoud van de structuur (1 mm van weefsel wordt vastgesteld per uur, zodat de tijd van fixatie afhankelijk van de grootte van de pees varieert).
- Vervang de paraformaldehyde door 70% ethanol en laat het monster gedurende ten minste één nacht in deze oplossing.
- Plaats van de pees in een kleine plastic container met gaten en plaats die container in een verse 70% ethanol oplossing voor 1 h.
- Plaats de container in 95% ethanol voor 1 h. herhalen.
- Plaats de container in 100% ethanol voor 1 h. herhalen.
- Plaats de container in 100% xyleen voor 1 h. herhalen.
- Nu de plastic container, waarin de pees, in vloeibare paraffine (56 ° C) plaatsen en laten overnachten.
- Met behulp van een insluiten station (uitgerust met gesmolten wax, een kookplaat en een koude plaat), kies een metalen schimmel die het beste past bij het monster weefsel, en vul het met een beetje vloeibare paraffine zodat de base wordt gedekt.
Opmerking: Oriënteren het monster te verkrijgen van verticale secties op de microtoom. - Wanneer het monster juist gepositioneerd is, vullen opwaarts naar de mal met vloeibare paraffine en plaats deze op de refrigerating machine. Laat het afkoelen gedurende ten minste 15 minuten.
- Verwijderen uit het blok paraffine en plaats deze in de ijskast voor minstens 30 min.
- Voorbereiding van de verschillende schone glazen dia's en enkele druppels met gedeïoniseerd water op hen.
- Op de microtoom, snijd de blokken in de secties 5 µm (alleen gebruik secties uit het middelste deel van de pees) en de sectie op een dia plaatsen.
- Plaats de dia's in een oven verwarming bij 65 ° C gedurende enkele minuten, zodat de paraffine net begint te smelten om de binding van het weefsel aan het glas.
- Plaats de dia's met paraffine secties in de houder van een segment.
- Nu deparaffinize en hydrateren het weefsel door deze te plaatsen in de volgende opeenvolgende Baden:
8 min in xyleen (bad 1)
4 min in xyleen (Bad 2)
2 min in 100% ethanol
2 min in 95% ethanol
2 min in 70% ethanol
2 min in gedeïoniseerd water - Plaats het weefsel in de volgende oplossingen voor Haematoxyline-eosine-kleuring.
- Dompel het weefsel voor 8 min in Haematoxyline oplossing (1 g Haematoxyline monohydraat, 0.2 g KIO3, 50 g AIK (SO4)2.12H2O; 200 mL glycerine; aanpassen aan 1 L met gedistilleerd water).
- Dompel het weefsel gedurende 8 minuten onder stromend kraantjeswater.
- Dompel het weefsel voor 30 s in oplossing van eosine (eosine 0,25% in 100 mL gedestilleerd water met 200 µL onverdund azijnzuur).
- Dompel het weefsel gedurende 2 minuten onder stromend kraantjeswater.
- Ga als volgt te werk voor de de Masson Trichrome kleuring.
- Na rehydratie, plaats van de secties in een container met ijzeren aluin (0,5 g (NH4) Fe (SO4)2.12H2O in 10 mL H2O) en sluit de container. Verwarm het voor 3 min op 280 W in een magnetron.
- Laat het afkoelen voor een minuut en spoel het na met gedeïoniseerd water.
- Plaats van de secties in een ongeopende verpakking met Regaud de Haematoxyline oplossing (0,5 g Haematoxyline opgelost in 50 mL H2O bij 50 ° C, dan Voeg toe 5 mL 95% ethanol en 5 mL glycerine), verwarm het omhoog voor 90 s bij 280 W.
- Spoel het met gedeïoniseerd water.
- Plaats van de secties in een oplossing van de pikrinezuur (bij verzadiging in methanol) voor 3 min, spoel gedurende 5 minuten onder stromend leidingwater en plaats het dan in gedeïoniseerd water voor een paar seconden.
- Plaats nu de secties in zure Fuchsine (0,5 g in 50 mL H2O met 0,25 mL onverdund azijnzuur) voor 5 s en spoel onder stromend leidingwater totdat de kleurstof verdwijnt.
- Incubeer de secties in phosphomolybdic zure oplossing (0,5 g in 50 mL H2O) voor 5 min, plaatst u het voor een paar seconden in gedeïoniseerd water.
- Plaats van de secties in lichtgroen (0,5 g in 50 mL H2O met 0,25 mL onverdund azijnzuur) oplossing voor een ander 5 min en plaats het onder stromend leidingwater totdat de kleurstof verdwijnt.
- Nu het uitdrogen van het weefsel opnieuw.
- Dompel de sectie voor 1 min in 70% ethanol.
- Dompel de sectie voor 1 min in 95% ethanol.
- Dompel de sectie voor 1 min in 100% ethanol.
- Dompel de sectie voor 1 min in xyleen (bad 1).
- Dompel de sectie voor 1 min in xyleen (Bad 2).
- De secties verwijderen zonder het verwijderen van teveel xyleen en een daling van montage medium zetten het monster.
- Leg een dekglaasje aan op de top (zonder provoceren bubbels) en laat het harden voor ten minste 2 uur.
- Hydrolyseren 5 histologische delen (elk van een verschillende pees) van elke groep in 6 N HCl voor 3 h en bepaal de concentratie van collageen door het meten van hydroxyproline als een index in 5 µm onbevlekt secties.
- Normaliseren van de resultaten op het gebied van de sectie met behulp van software van de fabrikant.
- Vlek enkele van de secties met licht groene vlek te visualiseren en te kwantificeren fibrillar collageen door computer geassisteerd analyse.
- De secties scannen en converteren van afbeeldingen in de nuances van grijs met behulp van de software IrfanView. Gebruik de software voor semi-kwantificering (bijvoorbeeldeen hoeveelheid).
6. moleculaire evaluatie
- Na de breuk van de pees, die tijdens het mechanische testen optreedt, de monsters te nemen, module bevriezen ze in vloeibare stikstof, en bewaar ze op-80 ° C (PRP en zoutoplossing),17.
- Gebruik een commerciële totaal RNA-kit te isoleren totaal RNA17.
- Meten van de expressie van collageen (Col I en III van de Col), Matrix metalloproteinasen (MMP-2, MMP-3 en MMP-9) en tenomodulin (TNMD) door RT-PCR17,18.
- Normaliseren van de niveaus van de uitdrukking van mRNA naar de niveaus van 2819.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De resultaten worden uitgedrukt als de gemiddelde ± standaardafwijking van het gemiddelde en werden vergeleken met variantieanalyse (ANOVA). Een two-way ANOVA en post hoc test de Scheffé, die is een parametrische test, werden gebruikt.
De ultieme treksterkte (UTS) moet leiden tot een breuk van de niet-verwonde Achilles pezen van ratten was 42.0 ± 5.7 N (n = 10). De treksterkte aanzienlijk gestegen (p < 0.0001) in beide groepen na dag 5. Het vergelijken van beide groepen, de UTS was hoger in de groep PRP op elk gewenst moment gemeten, met name op dag 15 en 30. Door het meten van de oppervlakte van de dwarsdoorsnede van de pezen die werden verwijderd voordat het ondergaan van de biomechanische evaluatie (11.4 ± 5,5 mm2 voor niet-verwonde pezen), bleek dat er op dag 5, groter in de zoute testgroep. Maar op dag 15 en 30, de oppervlakte van de dwarsdoorsnede groter in de groep PRP was, hoewel dit aantal was meer variabele in vergelijking met de zoute testgroep (Figuur 4 en Figuur 5).
De histologische evaluatie van de pezen, met behulp van de Haematoxyline-eosine-kleuring, toonde een hoge buiten op dag 5, die daarna daalde (geen significant verschil werd waargenomen tussen de zoutoplossing en PRP group). Van de Masson Trichrome kleuring toonde een hogere aanwezigheid van fibrillar collageen in de PRP-groep op dag 5 en 15. Maar de intensiteit van de kleuring was vergelijkbaar zijn in beide groepen 30 dagen na injectie (Figuur 6). De semi-kwantificering verkregen door kleuring van de monsters met licht groen is gebleken dat op dag 5 en 15, de intensiteit was hoger in de PRP-groep (niet statistisch significant) maar ten dage 30, was er geen verschil waargenomen tussen de twee groepen.
De gegevens was genormaliseerd door het meten van de hoeveelheid een aminozuur, hydroxyproline, die specifiek is voor collageen, bevestiging van de histologische halve kwantificering (dag 5: grotere waarde in PRP groep). De collageen-concentratie was niet stabiel in de PRP-groep maar was gestabiliseerd op dag 30 in de twee groepen. Het volume van de eelt werd gemeten en bleek te zijn aanzienlijk groter in PRP-behandelde dieren gedurende de eerste fasen van het genezingsproces. Samen genomen, impliceren deze resultaten dat de PRP injectie in de geblesseerde pees een belangrijke hoeveelheid fibrillar collageen veroorzaakt te deponeren.
Meten van het niveau van de expressie van verschillende moleculen is gebleken dat in niet-verwonde pezen, Col III en TNMD waren aanwezig in mindere bedragen (2.5 - 3.0 keer) dan in pezen Helen op dag 15, maar er was geen verschil in Col ik expressie tussen de fracties. MMP waren aanwezig op een 12-fold hogere concentratie in de helende pezen. Bovendien, ten dage 30, was er een aanzienlijke stijging van de COL1A1 in de PRP-groep, en een positieve correlatie tussen COL1A1 expressie en de UTS werd gevonden. In beide groepen bleek dat de Col III werd uitgedrukt in een hoge hoeveelheid vanaf dag 1 tot dag 14, voordat het daalde (zelfde voor beide groepen). MMP-9 concentratie veranderde niet in beide groepen maar MMP-2 en MMP-3 waren aanwezig bij hogere concentraties in de helende periode. Op dag 5, TNDM kwam tot uitdrukking in een hoger bedrag in de PRP (p < 0.03) maar daarna daalde tussen dag 15 en 30.
Figuur 1: experimenteel design van de studie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Chirurgische ingreep.
(a) de pees die complexe na verwijdering van de omliggende fascia.
(b) verwijdering van de pees van de plantaris.
(c) verwijdering van een deel van de achillespees.
(d) de 2 pezen die zijn verwijderd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Biomechanische testen
(a) universele testen machine (106.2 kN).
(b) het complex voor spier-pees-bot die zal worden vastgesteld in de cryo-kaak.
(c) Upper en lower cryo kaak
(d) Upper en lower cryo-jaw
(e) het complex de cryo kaak gestoken
(f) de gesloten cryo-kaak met het complex van de spier-pees-bot vast in de machine. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: Biomechanische testende resultaten
Treksterkte uitgedrukt in Newton (N) in controle en PRP groepen op de verschillende tijdstippen na de operatie. Er was een toename van UTS in beide groepen na verloop van tijd, met de groep van de PRP aanzienlijk hogere waarden tonen op 15 en 30 dagen na de operatie.
Foutbalk definieert de standaarddeviatie (SD). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: Biomechanische testende resultaten
Transversale gedeelte van de pees uitgedrukt in vierkante millimeters (mm2). De oppervlakte van de dwarsdoorsnede was significant groter in de PRP-groep tot dag 15. Daarna werd de sectie vergelijkbaar zijn in beide groepen.
Foutbalk definieert de standaarddeviatie (SD). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6: Histologische resultaten
Representatieve longitudinale secties van de achillespees van controle en PRP-fracties, gekleurd met Masson van Trichrome. Schaal bar = 100 µm. Er is een sterkere groene vlekken in de pees van de PRP-groep op dag 5. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bloedplaatjes zijn essentieel voor de vroege inflammatoire fase van de pees genezingsproces. Wanneer deze bloedplaatjes worden blootgesteld aan bindende weefsel of factoren die coagulatie veroorzaken, zal zij vrijgeven groeifactoren die zijn voorradig in α korrels. Als gevolg van deze interactie, extracellulaire matrix macromoleculen zijn synthetized en mesenchymale cellen vermenigvuldigen. Trombocyten hebben ook een Chemotactische activiteit op voorlopercellen in de bloedcirculatie, verbeteren van de angiogenese en het stimuleren van celdifferentiatie6,20.
Biomechanische testen werd gedaan met behulp van een klemmen hulpmiddel dat speciaal is vervaardigd voor ex vivo treksterkte testen van de achillespees in ratten15. De cryo-kaak kunt de bevriezing van de spier door toevoeging van vloeibare stikstof, en de teneinde bot, dat het onderste deel van het model is, direct in de machine is bevestigd. Het is zeer belangrijk de treksterkte test wordt gestart wanneer de spier volledig stijf is, maar de pees nog steeds flexibel is. Deze techniek vermijdt weefselschade en behoudt de mechanische integriteit. Ook is deze techniek eenvoudig, veilig, niet-druksterkte en aantoonbaar reproduceerbaar is, zoals verscheidene studies hebben gebruikt deze methode4,15.
Ter ondersteuning van de mechanische resultaten, onderging enkele pezen histologische evaluatie. De Haematoxyline-eosine-kleuring geeft een goed overzicht van het genezen weefsel en geeft algemene informatie over de hoeveelheid cellen en collageen aanwezig. Ook de meting van hydroxyprolin is handig, want het is een aminozuur die alleen gevonden in collageen en laat de objectivation van de histologische gegevens. Het is echter noodzakelijk om te doen van een Masson Trichrome kleuring, zoals het bevat veel meer gedetailleerde informatie over de afzetting en de concentratie van collageen vezels4.
Hoewel het niveau van collageen III mRNA in het Wachtwoordreplicatiebeleid behandeld pezen niet is gewijzigd, ten dage 30 mRNA van Col ik aanwezig in een hogere concentratie in de benadeelde pezen PRP behandeld was. Het had eerder aangetoond dat PRP interfereert met de proliferatie van de macrofagen en de productie van IL-121, die aldus een overdreven ontstekingsreactie tijdens de vroege stadia van het helende proces11kon vermijden. Het is mogelijk dat PRP stimuleert de proliferatie, de activering van de metabolische banen en de omvorming van mesenchymale cellen tot tenocytes die actief zijn.
Hoge concentraties van TNDM in de pezen van de PRP-groep blijkt dat de ingespoten moleculen kunnen trekken in de bloedstroom circulerende cellen en een differentiatie naar de tenocyte fenotype11 veroorzaken. Samen genomen, deze resultaten tonen aan dat slechts één injectie van PRP in een gescheurde achillespees een positief effect op de vroege helende fase heeft en tot een hogere mechanische sterkte leidt.
Verschillende Preklinische studies hebben reeds aangetoond dat PRP verbetert het genezingsproces, en dat de verschillende factoren die de groei hebben specifieke acties tijdens dit proces22. Mazzocca en zijn team aangetoond dat PRP celproliferatie in spieren, botten en pezen stimuleert. Uit verschillende preparaten, sterk geconcentreerde PRP zonder enige witte bloedcellen bleek te zijn de meest effectieve behandeling23. McCarrell et al. deed een soortgelijk experiment, testen van verschillende bereidingen van PRP met verschillende concentraties van PRP en witte bloedcellen op paard pezen. Preparaten die een tussenliggende concentratie van de bloedplaatjes en een hoge concentratie aan witte bloedcellen leidde tot een hogere versie van pro-ontsteking cytokinen, zoals IL-1ß TNFa en lagere collageen synthese. Mengsels met een hoge concentratie van de bloedplaatjes en witte bloedcellen ook geleid tot een toename van inflammatoire cytokines maar geremde collageen synthese. Kortom, dit betekent dat als de concentratie van de bloedplaatjes is te hoog, collageen synthese en cel stofwisseling worden vertraagd24. Boswell et al. Deze bevindingen25bevestigd. De meest efficiënte PRP voorbereiding zou dus een bloedplaatjes concentratie lager dan 106 bloedplaatjes/µL en geen witte bloedcellen bevatten.
Een groot voordeel van het gebruik van PRP is autogenity. Hoewel in onze studie, we allogene PRP gebruikten door donor ratten opofferen om een voldoende hoeveelheid bloed te hebben. Bovendien zou nemen bloed van de bediende rats verzwakken ze teveel. Een andere beperking van deze studie is dat alle de breuken zijn acute en uitgevoerd op gezonde pezen, die is niet altijd het geval bij de mens, zoals de pezen vaak wegens voorafgaande degeneratie scheuren. Dit model wordt gebaseerd op scherpe pees verwondingen, kunnen geen definitieve conclusies worden getrokken voor degeneratieve Tendinopathieën.
Met behulp van deze methode, zijn er enkele kritische stappen om te onthouden, de eerste die de voorbereiding van PRP, die zo reproduceerbare moet mogelijk wordt. Een andere belangrijke stap is de chirurgische procedure: het verwijderen van de pees en de spier-pees complex moet gebeuren in een reproduceerbare manier om te voorkomen dat vooringenomenheid. Tot slot, de voorbereiding voor het testen van de biomechanische: vloeibare stikstof is toegevoegd aan het bevriezen van de spier, en is het heel belangrijk dat de pees niet in dit proces bevroren is omdat het tot vooringenomen resultaten leiden kan, zoals de pees stijfheid zou worden gewijzigd. Dit is ook een beperking van de studie, aangezien er geen gestandaardiseerde protocol om ervoor te zorgen dat de elasticiteit van de pees wordt niet gewijzigd.
We hebben onze methode gebaseerd op de methode ontwikkeld door Virchenko et al. 26, maar aangepast met behulp van de cryo-kaak die de pees tegen exterieur agressie geïnduceerd door klemmen beschermt. Het grote voordeel van deze methode is dat het reproduceerbaar is, zelfs als het is nog niet gestandaardiseerd. Het geeft een idee over hoe de pees verwondingen kunnen worden behandeld bij de mens, hoewel experimenten met ratten niet altijd te vertalen goed naar menselijke verwondingen te behandelen. Het is waarschijnlijk dat een aangepaste versie van deze methode nuttig zijn kan bij de behandeling van deze letsels in de toekomst ondersteund door het feit dat het is makkelijk te gebruiken, een relatief lage kostprijs heeft, en minder invasief dan andere methoden is.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door Standard de Liège en Lejeune - Lechien verleent van de Leon Frédéricq fondsen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xylazine (Xyl-M) | VMD | none | anesthetic |
| Ketamin (Jétamine 1000 CEVA) | CEVA Santé Animale | none | anesthetic |
| Buprenorphin (Vetergésic Multidosis) | ALSTOE | none | Painkiller |
| iso-Betadine | MEDA-Pharma | none | Desinfectant |
| resorbable yarn Vicryl 6/0 | Johnson & Johnson | ||
| Nembutal | CEVA Santé Animale | none | Anesthetic |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Preserves structure of the tissue |
| Isopropanol 100% | VWR | 20,922,364 | |
| Ethanol 95% | VWR | 20,823,362 | |
| Xylene | VWR | 28973.363 | |
| Paraffin | VWR | LEIC3950.1006 | |
| Hematoxylin | Millipore | 1.15938.0025 | Colorant |
| Eosin | Millipore | 1.15935.0100 | Colorant |
| Eukitt | Sigma-Aldrich | 3989 | Mounting Medium |
| CaCl2 |
References
- Kaux, J., Degrave, N., Crielaard, J. Platelet rich plasma traitement des tendinopathies chroniques? Revue de la littérature. Platelet rich plasma treatment of chronic tendinopathies? Review of literature. J. Traumatol. du Sport. 24, 99-102 (2007).
- Anitua, E., et al. Autologous preparations rich in growth factors promote proliferation and induce VEGF and HGF production by human tendon cells in culture. J. Orthop. Res. 23, 281-286 (2005).
- Bosch, G., et al. Effects of platelet-rich plasma on the quality of repair of mechanically induced core lesions in equine superficial digital flexor tendons: A placebo-controlled experimental study. J. Orthop. Res. 28, 211-217 (2010).
- Kaux, J. F., Drion, P., Croisier, J. L., Crielaard, J. M. Tendinopathies and platelet-rich plasma (PRP): From pre-clinical experiments to therapeutic use. J. Stem Cells Regen. Med. 11, P7-P17 (2015).
- Maffulli, N., Wong, J., Almekinders, L. C.
- Molloy, T., Wang, Y., Murrell, G. The roles of growth factors in tendon and ligament healing. Sports Med. 33, 381-394 (2003).
- Lyras, D. N., et al. The effect of platelet-rich plasma gel in the early phase of patellar tendon healing. Arch. Orthop. Trauma Surg. 129, 1577-1582 (2009).
- Aspenberg, P., Virchenko, O. Platelet concentrate injection improves Achilles tendon repair in rats. Acta Orthop. Scand. 75, 93-99 (2004).
- Visser, L. C., et al. Growth Factor-Rich Plasma Increases Tendon Cell Proliferation and Matrix Synthesis on a Synthetic Scaffold: An In Vitro Study. Tissue Eng. Part A. 16, 1021-1029 (2010).
- Zhang, J., Wang, J. H. -C. Platelet-Rich Plasma Releasate Promotes Differentiation of Tendon Stem Cells Into Active Tenocytes. Am. J. Sports Med. 38, 2477-2486 (2010).
- Kajikawa, Y., et al. Platelet-rich plasma enhances the initial mobilization of circulation-derived cells for tendon healing. J. Cell. Physiol. 215, 837-845 (2008).
- Pasternak, B., Aspenberg, P. Metalloproteinases and their inhibitors-diagnostic and therapeutic opportunities in orthopedics. Acta Orthop. 80, 693-703 (2009).
- Dell, R. B., Holleran, S., Ramakrishnan, R.
- Mähler Convenor, M., et al. FELASA recommendations for the health monitoring of mouse, rat, hamster, guinea pig and rabbit colonies in breeding and experimental units. Lab. Anim. 48, 178-192 (2014).
- Kaux, J. -F., et al. Étude comparative de cinq techniques de préparation plaquettaire (platelet-rich plasma). Pathol. Biol. 59, 157-160 (2011).
- Wieloch, P., Buchmann, G., Roth, W., Rickert, M. A cryo-jaw designed for in vitro tensile testing of the healing Achilles tendons in rats. J. Biomech. 37, 1719-1722 (2004).
- Kaux, J. -F., et al. Vascular Endothelial Growth Factor-111 (VEGF-111) and tendon healing: preliminary results in a rat model of tendon injury. Muscles. Ligaments Tendons J. 4, 24-28 (2014).
- Docheva, D., Hunziker, E. B., Fässler, R., Brandau, O. Tenomodulin is necessary for tenocyte proliferation and tendon maturation. Mol. Cell. Biol. 25, 699-705 (2005).
- Lambert, C. A., Colige, A. C., Munaut, C., Lapière, C. M., Nusgens, B. V. Distinct pathways in the over-expression of matrix metalloproteinases in human fibroblasts by relaxation of mechanical tension. Matrix Biol. 20, 397-408 (2001).
- Nurden, A. T., Nurden, P., Sanchez, M., Andia, I., Anitua, E.
- Woodall, J., Tucci, M., Mishra, A., Benghuzzi, H. Cellular effects of platelet rich plasma: a study on HL-60 macrophage-like cells. Biomed. Sci. Instrum. 43, 266-271 (2007).
- Taylor, D. W., Petrera, M., Hendry, M., Theodoropoulos, J. S. A systematic review of the use of platelet-rich plasma in sports medicine as a new treatment for tendon and ligament injuries. Clin. J. Sport Med. 21, 344-352 (2011).
- Mazzocca, A. D., et al. The positive effects of different platelet-rich plasma methods on human muscle, bone, and tendon cells. Am. J. Sports Med. 40, 1742-1749 (2012).
- McCarrel, T. M., Minas, T., Fortier, L. A. Optimization of leukocyte concentration in platelet-rich plasma for the treatment of tendinopathy. J. Bone Joint Surg. Am. 94 (1-8), e143 (2012).
- Boswell, S. G., et al. Increasing platelet concentrations in leukocyte-reduced platelet-rich plasma decrease collagen gene synthesis in tendons. Am. J. Sports Med. 42, 42-49 (2014).
- Virchenko, O., Aspenberg, P. How can one platelet injection after tendon injury lead to a stronger tendon after 4 weeks?: Interplay between early regeneration and mechanical stimulation. Acta Orthop. 77, 806-812 (2006).
