Summary
Ce protocole décrit le processus d’évaluation de la guérison des tendons chez les rats qui ont reçu une injection de plasma riche en plaquettes allogéniques (PRP) ou une solution saline après avoir enlevé la partie du tendon d’Achille. L’état d’avancement de la guérison du tendon est évalué à plusieurs points dans le temps à l’aide de différents types d’analyses.
Abstract
Cet article décrit les procédures expérimentales utilisées pour observer si PRP peut influencer positivement la guérison du tendon. Il y a 4 grandes étapes à suivre : induire une lésion dans le tendon d’Achille ; préparer des PRP et injecter (ou la solution saline) ; supprimer le tendon ; et effectuer des évaluations biomécaniques, moléculaires et histologiques. A chaque étape, toutes les procédures et les méthodes sont décrites en détail, donc ils peuvent être facilement reproduits.
Tendons d’Achille ont été sectionnée chirurgicalement (suppression d’un tronçon de 5 mm de long). Par la suite, PRP ou une solution saline a été injectée pour étudier si le PRP a un effet positif sur la guérison du tendon. Trois groupes de 40 animaux (un total de 120 rats ont été utilisés dans cette étude) ont été divisés en 2 sous-groupes : groupe d’injection de PRP et une injection saline groupe témoin. Des rats ont été sacrifiés à accroître les points dans le temps (groupe A: 5 jours ; Groupe B: 15 jours ; Groupe C: 30 jours) et les tendons ont été supprimés. 90 tendons ont subi des tests biomécaniques avant d’effectuer l’analyse transcriptomique et les 30 tendons restants ont été soumis à une analyse histologique.
Introduction
Coagulation, processus inflammatoires et les rôles de modulation de l’immunité des plaquettes sont bien connu1. Plus récemment, il a été démontré qu’ils ont aussi des propriétés réparatrice2,3. En effet, divers facteurs de croissance et cytokines (VEGF, PDGF, TGF-B, IGF-I et HGF) sont libérés par les plaquettes au cours de la dégranulation. Ces facteurs de croissance favorisent l’angiogenèse, remodelage tissulaire et plaie de guérison (OS, peau, muscle, tendon)2. Centrifugation de sang autologue produit plasma riche en plaquettes (PRP) qui contient des concentrations de plaquettes élevé selon la méthode d’isolement (entre 3 et 10 fois les concentrations initiales de sang). En effet, les différentes techniques de préparation de PRP ne peut pas fournir un produit final identique. Jusqu'à présent, il n’y a eu aucun accord international général sur cette question. Dans l’ensemble, le PRP pourrait être une option thérapeutique intéressante pour le traitement des troubles musculo-squelettiques chroniques, comme la tendinopathie, fasciite plantaire, l’arthrose et non syndiqué4. Il a été utilisé pour la première fois en chirurgie buccale et implantologie4 pour améliorer et accélérer les os guérison après avoir placé un implant dentaire. Dans cette étude, nous décrivons une méthode reproductible qui permet l’acquisition de la PRP pour l’expérimentation animale4.
Étant donné que les lésions des tendons sont fréquemment observées dans les sportifs et les travailleurs physiques, amélioration du processus de guérison et réduisant ainsi le temps de récupération sont de grand intérêt5. Nouvelles méthodes de traitement qui sont développent souvent impliquent l’utilisation de facteurs de croissance, et l’administration de la PRP est un moyen simple et peu invasif à offrir un mélange de facteurs de croissance endogène4.
Plusieurs études in vitro ou animal ont démontré que l’administration de plasma contenant un niveau élevé de plaquettes, en libérant des médiateurs biologiques, peut stimuler la réparation de tendon et ligament en libérant des médiateurs biologiques6 ,7,8,9. En outre, les autres études ont montré que le PRP peut stimuler type I et la synthèse du collagène III dans tendon cellules9,10,11. Il a également été suggéré que le PRP peut diminuer l’activation des métalloprotéinases matricielles (MMP) et par conséquent réduire la dégradation de la matrice. Les cellules qui sont impliqués dans le processus d’inflammation peuvent produire de MMP-9, qui joue un rôle dans le tissu remodelage (physiologiques et pathologiques) induite par l’inflammation12.
Basé sur cette information, nous avons supposé qu’une seule injection de PRP dans les tendons d’Achille sectionnés des rats pourrait améliorer le processus de récupération et de la résistance mécanique des tissus réparés. Ceci a été testé en mesurant les propriétés biomécaniques des tendons guérison pendant le processus de récupération et en faisant des analyses histologiques et moléculaires pour évaluer le collagène transformant dans le tissu nouvellement formé. L’objectif de cette étude était d’observer si une seule injection de PRP allogénique pourrait influer sur la cicatrisation des tendons d’Achille sectionnés.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Soin et la manipulation des animaux ont été effectuées conformément au Guide pour les soins et Use of Laboratory Animals établi par la National Academy of Sciences et publiées par les instituts nationaux de santé (USA). Législation européenne et nationale ont été suivis attentivement.
1. la préparation animaux
- Utilisez 132 2 - mois vieux mâles Sprague-Dawley rats pesant 320-450 g (120 rats d’expérimentation) et de 12 rats pour les prélèvements sanguins, Figure 1. Dell,13, 15 rats pour chaque groupe était suffisant pour une puissance de 0,8 (80 % de chance de trouver une signification statistique, si l’effet spécifié existe).
- Maison de tous les rats dans les cages classiques dans des conditions d’isolement dans une installation classique équipé d’une station de mutation. Fomentent qui se reproduisent dans un rack IVC (cage ventilée individuellement), sur des rats de SPF (agent pathogène spécifique gratuit) spécifiquement achetés.
- Utiliser les conditions de logement suivantes : température comprise entre 19 et 24 ° C ; hygrométrie : 40 à 60 % ; ventilation : fréquence de renouvellement d’air : 10-15 par h ; cycle lumière/obscurité : 12 h - 12 h.
- Stériliser tous les équipements de mise en cage et utilisez la litière irradié. Appliquer systématiquement enrichissement cage en plaçant des barquettes en carton stériles et serviettes à l’intérieur des cages.
- Autoriser l’accès à la zone dans des conditions restreintes : nouveau capot manteau, masque, gants, chaussures et cheveux lab à l’entrée.
- Procéder à la colonie surveillance sanitaire sur les animaux sentinelles logé sur une literie sale sur une base annuelle, selon les Felasa14 recommandations pour les installations conventionnelles. Gardez quatre ou cinq animaux par cage, avec le cas échéant irradiés diète et fournit acidifié l’eau ad libitum. Contrôler au quotidien.
- Transfert des rats élus pour une intervention chirurgicale dans le filtrage de haut cages aux chambres 2 h avant l’intervention chirurgicales.
2. opération chirurgicale
- Préparer les instruments chirurgicaux : fine, ciseaux, une pince, deux pinces hémostatiques et un porte-aiguille. Au cours de toutes les procédures, porter des gants, un masque, une hotte et une blouse de laboratoire.
- Au hasard de diviser les rats en deux groupes (PRP et du sérum physiologique).
- Prenez le rat hors de sa cage et pesez-le. Marques auriculaires numérotée permet d’identifier les rats. Pour éviter la dessiccation des yeux, placer les gouttes d’eau sur la cornée.
- Anesthésier le rat par voie intrapéritonéale avec xylazine (10 mg/kg de poids corporel) et la kétamine (80 mg/kg de poids corporel). Pour confirmer anesthetization, placez les animaux sous surveillance cardio-respiratoire et de vérifier des réflexes oculaires.
- Injecter par voie sous-cutanée de 50 µL de buprénorphine (0,01 à 0,05 mg/kg toutes les 8-12 h) dans la région du cou comme un analgésique.
- Le membre postérieur gauche vous raser avec un rasoir électrique, désinfecter avec 3 alternant scrubs de solution d’iso-betadine/alcool (dilué 01:10), placez le rat sur un coussin chaud (20 ° C) sous un microscope à dissection. Placez le rat sur décubitus latéral avec la jambe d’être opéré dans une position supérieure. Tenez la patte avec une pince chirurgicale.
- À l’aide des ciseaux, faire une petite incision latérale (20-25 mm) dans la peau qui entoure le tendon d’Achille gauche et disséquer le carénage à l’aide des ciseaux pour exposer le tendon d’Achille complex (Figure 2 a).
- Retirez le tendon du plantaire grêle avec une paire de ciseaux (Figure 2 b).
- Couper le tendon d’Achille transversalement 5 mm proximaux à son insertion calcanéenne et enlever une portion longue de 5 mm à l’aide de ciseaux. Pas suturer le tendon (Figure 2c, 2d).
- Suture de l’aponévrose et ensuite la peau avec du fil résorbable faisant une suture overjet (suture en continu). Les sutures monofilament peuvent être utilisés aussi bien pour empêcher l’infiltration de la peau dans l’incision chirurgicale.
- Placez le rat sous une lampe chauffante jusqu'à éveillé et puis replacez le rat dans une cage (58 x 38 cm) (Nota bene: aucune immobilisation n’est imposée).
3. PRP préparation15
- Anesthésier les rats de donneur avec xylazine (10 mg/kg de poids corporel) et la kétamine (80 mg/kg de poids corporel) par injection intrapéritonéale. L’injection de PRP est effectuée 2 h après l’opération sans aucune re-anesthésique.
- Injecter par voie sous-cutanée 50 µL de buprénorphine comme un analgésique.
- Collecte de sang total (20 mL par rat, saignement final) par ponction cardiaque dans des tubes stériles contenant 3,2 % tampon citrate de sodium (0.109 M, anticoagulant). Ensuite euthanasier le rat par injection intracardiaque.
- Pour obtenir des PRP, centrifuger le sang pendant 10 min à 150 x g et à température ambiante. Cette étape de centrifugation initial faible vitesse donne deux phases distinctes : une phase inférieure constituée de globules rouges (hématies) qui prend en compte environ 80 à 90 % du volume total et une phase supérieure composée de plasma riche en plaquettes (PRP) (généralement 10 à 20 % du sang échantillon).
- Doucement, recueillir le PRP (phase supérieure) dans un tube en plastique secondaire à l’aide d’une pipette en plastique. Comme l’interface entre les globules rouges et de PRP est très lâche, ne pas pipeter de trop près à l’interface. Quand a manié correctement, contaminant les globules rouges en PRP doit être inférieure à 0,05 x 103 cellules / µL. jetez la phase inférieure restante et le tube de prélèvement sanguin primaire.
- Déterminer le volume de la PRP collectée et mesurer le taux de plaquettes sur un analyseur d’hématologie. Ces valeurs sont requises pour les calculs d’ajuster la concentration plaquettaire à l’étape suivante. Une numération des globules est également utile pour évaluer la contamination potentielle par les globules rouges et la concentration de globules blancs. plaquettes en PRP à ce stade est généralement de 1 à 1,5 x106/µL.
- Effectuer une seconde centrifugation de la PRP pendant 10 min à 1 000 x g et à température ambiante. Cette étape de centrifugation à grande vitesse donne une boulette de plaquettes lâche et un surnageant consistant autologue plasma pauvre en plaquettes (PPP). En utilisant les valeurs déterminées à l’étape 3.6, calculer le volume du liquide surnageant est supprimée pour concentrer le PRP pour atteindre une concentration finale de 2,5 x106/µL.
- Recueillir délicatement le surnageant (PPP) dans un tube en plastique secondaire à l’aide d’une pipette en plastique, en laissant environ les deux tiers du volume final calculé à l’étape de 3,7. Comme le culot est lâche, une quantité importante de plaquettes est perdue quand PPP est défaussée, réduisant potentiellement la concentration finale souhaitée.
- Soigneusement Resuspendre le culot de plaquettes avec le surnageant restant de pipetage répétées douces. Mesurer le taux de plaquettes sur ce concentré PRP. Si nécessaire, ajouter le volume approprié de PPP autologue pour atteindre la concentration cible finale.
Remarque : Utilisez le PRP dans les 3 h de préparation. - Ajouter 50 µL de CaCl2 (mEq 11 10 mL) par mL de PRP pour activer les plaquettes.
- Injecter 50 µL de PRP fraîche ou une solution saline avec une aiguille de 21G directement dans le site opération suturées environ 1 h après la préparation. Pendant ce temps, garder le PRP à la température ambiante.
- Surveiller étroitement la récupération fonctionnelle des rats au cours des jours après la chirurgie et avant l’enlèvement du tendon d’Achille.
4. retrait du tendon d’Achille et tests biomécaniques16
- 5, 15 ou 30 jours plus tard5, peser le rat. Puis, anesthésier avec xylazine (10 mg/kg de poids corporel) et la kétamine (80 mg/kg de poids corporel) par injection intrapéritonéale.
- Injecter par voie sous-cutanée 50 µL de buprénorphine comme un analgésique. Retirez le tendon avant de sacrifier l’animal pour garder les conditions physiologiques pour aussi longtemps que possible.
- Raser le membre postérieur gauche et placez le rat sous un microscope à dissection. Placez le rat sur décubitus latéral avec la jambe d’être opéré dans une position supérieure. Tenez la patte avec les doigts.
- Faites une petite incision (10 mm) à l’ancien site de l’opération et s’étendent jusqu'à ce que le suralis triceps est exposée.
- Pour supprimer la guérison tendon d’Achille, couper l’OS calcanéen transversalement de 5-10 mm distal à sa fixation sur le tendon d’Achille. Ensuite disséquer une partie de la suralis de triceps, apposée sur le tendon d’Achille (Figure 3 b). La partie musculaire doit être assez grand pour tenir dans la cryo-mâchoire (Figure 3 c-d). Mettre l’échantillon immédiatement sur la cryo-mâchoire à l’aide de pinces (Figure 3e).
- Après avoir enlevé l’ensemble muscle-tendon-OS, euthanasier le rat par injection intracardiaque avec Nembutal (200 mg/kg). Confirmer la mort en évaluant l’absence du rythme cardiaque et la respiration pendant 15 min.
- Placez l’appareil musculaire dans la mâchoire supérieure (Figure 3e), fermez-le et placez-le verticalement dans la machine d’essai universelle (106,2 kN, Figure 3 a). Fixer ensuite l’os entre les mâchoires inférieures de la machine (Figure 3f).
- Ajouter l’azote liquide dans les deux les bassins de la mâchoire supérieure de geler le muscle, alors que c’est un ordre de grandeur plus rigide que le tendon et ne se déforme pas lors de l’essai de traction.
- Lorsque la zone de congélation atteint la frontière de collier métallique et a commencé l’essai de traction, alors le tendon conservera sa structure. Définir le taux de déplacement de la machine à une vitesse constante de 1 mm/s jusqu'à la rupture. Enregistrer la résistance à la traction (UTS) donnée en Newtons (N) sur un ordinateur.
- Pour calculer la section transversale, placer deux caméras perpendiculaires entre eux, formant une forme elliptique et prendre des photos.
- Pour tenir compte de la différence de la section transversale des tendons guérison, normaliser l’UTS à une unité de surface (N par millimètre carré), qui représente les contraintes mécaniques subies par le tissu.
5. histologique analyse
NOTE : 15 tendons de chaque groupe a subi une analyse histologique.
- Après son retrait, submerger le tendon d’Achille immédiatement à 4 % de paraformaldéhyde à préserver sa structure (1 mm de tissu est fixe à l’heure, le temps de fixation varie selon la taille du tendon).
- Remplacer le paraformaldéhyde par l’éthanol à 70 % et laisser l’échantillon pendant au moins une nuit dans cette solution.
- Placer le tendon dans un petit récipient en plastique avec trous et placer ce récipient dans une solution d’éthanol 70 % frais pendant 1 h.
- Placer le récipient dans l’éthanol à 95 % pendant 1 h. répéter.
- Placer le récipient dans l’éthanol à 100 % pendant 1 h. répéter.
- Placer le récipient dans le xylène 100 % pendant 1 h. répéter.
- Maintenant, placez le récipient en plastique, qui contient le tendon, en paraffine liquide (56 ° C) et laisser la nuit.
- À l’aide d’une station d’enrobage (équipée de cire fondue, une plaque chauffante et une plaque froide), choisir un moule métallique qui correspond le mieux à l’échantillon de tissu et le remplir avec de la paraffine liquide un peu afin que la base est couverte.
NOTE : Orientez l’échantillon afin d’obtenir des coupes verticales au microtome. - Lorsque l’échantillon est correctement positionné, remplir le moule avec de la paraffine liquide et placez-la sur la machine frigorifique. Laissez-le refroidir pendant au moins 15 minutes.
- Retirer le bloc de paraffine et placez-le sur la glace pendant au moins 30 min.
- Préparer plusieurs lames de verre propre et mettre quelques gouttes d’eau déionisée sur eux.
- En le microtome, couper les blocs en sections de 5 µm (seules les sections utilisation de la partie moyenne du tendon) et placez la section sur une lame.
- Déposer les lames dans un four à chauffage à 65 ° C pendant plusieurs minutes, afin que la paraffine commence à fondre pour coller le tissu sur le verre.
- Placez les diapositives contenant des sections de la paraffine dans un support de tranche.
- Maintenant Déparaffiner et réhydrater le tissu en le plaçant dans les bains successifs suivants :
8 min dans le xylène (1 bain)
4 min dans le xylène (bain 2)
2 min dans l’éthanol à 100 %
2 min dans l’éthanol à 95 %
2 min dans l’éthanol à 70 %
2 min dans l’eau désionisée - Pour une coloration hématoxyline-éosine, placez le tissu dans les solutions suivantes.
- Plongez le tissu pendant 8 min dans une solution de l’hématoxyline (monohydrate de l’hématoxyline 1 g, 0,2 g KIO3, 50 g AIK (SO4)2.12h2O ; glycérine 200 mL ; ajuster à 1 L avec de l’eau distillée).
- Plongez le tissu pendant 8 min sous l’eau courante.
- Plongez le tissu pendant 30 s dans une solution d’éosine (0,25 % éosine dans 100 mL d’eau distillée contenant 200 µL de l’acide acétique dilué).
- Plongez le tissu pendant 2 min sous l’eau courante.
- Pour la coloration Trichrome de Masson, procédez comme suit.
- Après réhydratation, déposer les éléments dans un conteneur à l’alun de fer (0,5 g (NH4) Fe (SO4)2.12h2O 10 mL H2O) et fermer le récipient. Chauffer pendant 3 min à 280 W au micro-ondes.
- Laissez-le refroidir pendant une minute et ensuite rincer à l’eau désionisée.
- Placez les sections dans un récipient fermé avec une solution de Regaud hématoxyline (hématoxyline 0,5 g dissous dans 50 mL H2O à 50 ° C, puis ajouter 5 mL d’éthanol à 95 % et de la glycérine de 5 mL), chauffez-le pendant 90 s à 280 w.
- Rincer à l’eau désionisée.
- Déposer les éléments dans une solution d’acide picrique (à saturation dans le méthanol) pendant 3 min, rincer pendant 5 min sous l’eau courante et puis placez-la dans l’eau désionisée pendant quelques secondes.
- Maintenant, placez les sections dans la fuchsine acide (0,5 g dans 50 mL H2O contenant 0,25 mL de l’acide acétique dilué) pendant 5 s et rincer sous l’eau courante jusqu'à ce que disparaisse la teinture.
- Incuber les sections dans la solution d’acide phosphomolybdique (0,5 g dans 50 mL H2O) pendant 5 min, placer pendant quelques secondes dans l’eau désionisée.
- Déposer les éléments en solution de vert clair (0,5 g dans 50 mL H2O contenant 0,25 mL de l’acide acétique dilué) pendant 5 min et placez-le sous l’eau courante jusqu'à ce que disparaisse la teinture.
- Maintenant de déshydrater le tissu à nouveau.
- Immerger la section pendant 1 min dans l’éthanol à 70 %.
- Immerger la section pendant 1 min dans l’éthanol à 95 %.
- Immerger la section pendant 1 min dans l’éthanol à 100 %.
- Immerger la section pendant 1 min dans le xylène (1 bain).
- Immerger la section pendant 1 min dans le xylène (bain 2).
- Supprimer les sections sans enlever trop xylène et mettre une goutte de milieu de montage sur l’échantillon.
- Mettre une lamelle sur le dessus (sans provoquer les bulles) et laissez durcir pendant au moins 2 h.
- Hydrolysent 5 coupes histologiques (chacun d’un tendon différent) de chaque groupe dans 6 N HCl pendant 3 h et déterminer la concentration de collagène en mesurant l’hydroxyproline sous forme d’index en 5 sections µm non souillées enregistré.
- Normaliser les résultats de la zone de section à l’aide du logiciel du fabricant.
- Certaines des sections tacher avec lumière verte tacher de visualiser et de quantifier de collagène fibrillaire par analyse assistée par ordinateur.
- Parcourir les sections et de convertir les images en nuances de gris en utilisant le logiciel IrfanView. Utiliser le logiciel pour semi-quantification (par exemple, une quantité).
6. moléculaire évaluation
- Après la rupture de tendon, qui survient au cours d’essais mécaniques, effectue les prélèvements, clin d’oeil leur congélation dans l’azote liquide et les stocker à-80 ° C (solution saline et PRP)17.
- Utilisez un kit commercial d’ARN Total pour isoler total RNA17.
- Mesurer l’expression du collagène (Col I et III du Col), métalloprotéinases matricielles (MMP-2, MMP-3 et MMP-9) et tenomodulin (TNMD) par RT-PCR17,18.
- Normaliser les niveaux d’expression de l’ARNm au niveau de 28 s19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Les résultats sont exprimés sous la moyenne ± écart-type de la moyenne et ont été comparés à l’analyse de variance (ANOVA). Une analyse de la variance bidirectionnelle et post hoc test de Scheffé, qui est un test paramétrique, ont été utilisés.
La résistance à la traction (UTS) nécessaire pour provoquer une rupture des tendons d’Achille non lésés de rats a été 42,0 ± 5,7 N (n = 10). La résistance à la traction a augmenté significativement (p < 0,0001) dans les deux groupes après le jour 5. En comparant les deux groupes, l’UTS était plus élevée dans le groupe PRP à tout moment mesurée, surtout au jour 15 et 30. En mesurant la section transversale des tendons qui ont été retirés avant de subir l’évaluation biomécanique (11,4 ± 5,5 mm2 pour les tendons non lésé), il a été constaté qu’au jour 5, il était plus importante dans le groupe traité salin. Mais au jour 15 et 30, la section transversale était plus importante dans le groupe PRP, bien que cette quantité était plus variable par rapport au groupe traité salin (Figure 4 et Figure 5).
L’évaluation histologique des tendons, à l’aide de l’hématoxyline-éosine, coloration, a montré une cellularité élevée au jour 5, qui a diminué par la suite (aucune différence significative n’a été observée entre le groupe de PRP et de solution saline). Trichrome de Masson coloration ont montré une présence supérieure de collagène fibrillaire dans le groupe PRP au jour 5 et 15. Cependant l’intensité de la coloration a été similaire dans les deux groupes de 30 jours après l’injection (Figure 6). La quantification semi obtenue par coloration des échantillons avec lumière verte a montré qu’au jour 5 et 15, l’intensité est plus élevée dans le groupe PRP (non statistiquement significatif), mais à 30 jours, il n’y avait aucune différence observée entre les deux groupes.
Les données a été normalisées en mesurant la quantité d’un acide aminé, hydroxyproline, qui est spécifique au collagène, confirmant la quantification semi histologique (jour 5 : valeur supérieure dans le groupe PRP). La concentration de collagène n’est pas stable dans le groupe PRP, mais s’est stabilisée à 30 jours dans les deux groupes. Le volume du CAL a été mesuré et s’est avéré significativement plus grandes chez les animaux traités PRP pendant les premiers stades du processus de guérison. Pris ensemble, ces résultats laissent entendre que l’injection de PRP dans le tendon lésé provoque une quantité importante de collagène fibrillaire de déposer.
Mesurer le niveau d’expression de plusieurs molécules ont montré que dans les tendons non lésés, Col III et TNMD étaient présents dans une moindre mesure s’élèvent (2,5 - 3,0 fois) que dans guérison tendons au jour 15, cependant il n’y avait aucune différence dans le Col j’ai expression entre les groupes. MMP était présents à une concentration plus élevée 12-fold dans les tendons de guérison. En outre, à 30 jours, il y avait une augmentation significative de COL1A1 dans le groupe PRP, et a trouvé une corrélation positive entre l’expression COL1A1 et l’UTS. Dans les deux groupes, il a été constaté que le Col III est exprimée en quantité élevée du jour 1 au jour 14, avant il a diminué (même pour les deux groupes). Concentrations de MMP-9 n’a pas changé dans les deux groupes mais la MMP-2 et MMP-3 étaient présents à des concentrations plus élevées pendant la période de cicatrisation. Au jour 5, DNT s’exprimait dans une plus grande quantité dans le PRP (p < 0,03) puis a diminué entre 15 et 30 jours.
Figure 1 : dispositif expérimental de l’étude. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Intervention chirurgicale.
(a) le tendon complex après le retrait du fascia environnant.
(b) retrait du tendon plantaris.
(c) la suppression d’une section du tendon d’Achille.
(d) les 2 tendons qui ont été supprimées. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Tests biomécaniques
(a) machine d’essai universelle (106,2 kN).
(b) le complexe de muscle-tendon-OS qui sera fixé dans la mâchoire de cryo.
(c) haut et cryo mâchoire inférieure
(d) supérieur et cryo-mâchoire inférieure
(e) le complexe dans la mâchoire de cryo
(f) la fermé cryo-mâchoire contenant le complexe de muscle-tendon-OS fixé dans la machine. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Résultats des tests biomécaniques
Résistance à la traction exprimée en Newtons (N) en contrôle et groupes PRP aux points différents temps après la chirurgie. Il y avait une augmentation de UTS dans les deux groupes au fil du temps, avec le groupe PRP montrant des valeurs nettement supérieures à 15 et 30 jours après la chirurgie.
Barre d’erreur définit l’écart-type (SD). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Résultats des tests biomécaniques
Domaine transversal du tendon exprimé en millimètres carrés (mm2). La section transversale était significativement plus élevée dans le groupe PRP jusqu'à 15 jours. Par la suite, la section a été similaire chez les deux groupes.
Barre d’erreur définit l’écart-type (SD). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Résultats histologiques
Des sections longitudinales représentatives du tendon d’Achille du contrôle et des groupes PRP, colorées au Trichrome de Masson. Echelle = 100 µm. Il y a une plus forte coloration verte dans le tendon du groupe PRP au jour 5. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Les plaquettes sont essentiels à la phase précoce et inflammatoire du tendon processus de guérison. Lorsque ces plaquettes sont exposés à liant les tissus ou les facteurs qui induisent la coagulation, ils vont sortir des facteurs de croissance qui sont stockées dans les granules α. En raison de cette interaction, macromolécules de la matrice extracellulaire sont synthétisée et prolifèrent des cellules mésenchymateuses. Les plaquettes ont aussi une activité chimiotactique sur cellules progénitrices dans la circulation sanguine, améliorant l’angiogenèse et en stimulant la différenciation cellulaire6,20.
Des tests biomécaniques ont été effectués à l’aide d’un dispositif de serrage spécialement conçu pour les ex vivo essai de traction du tendon d’Achille en rat15. La cryo-mâchoire permet le gel du muscle en ajoutant l’azote liquide, et l’OS calcanéen, qui est la partie inférieure de l’échantillon, est fixé directement dans la machine. Il est très important de commencer l’essai de traction lorsque le muscle est complètement rigide, mais le tendon est toujours flexible. Cette technique permet d’éviter des lésions tissulaires et préserve l’intégrité mécanique. Aussi, cette technique est simple, sûr, non-compression et manifestement reproductibles, car plusieurs études ont utilisé cette méthode4,15.
Pour soutenir les résultats mécaniques, certains tendons ont subi une évaluation histologique. La coloration à l’hématoxyline-éosine présente un bon aperçu des tissus cicatrisés et donne des informations générales sur la quantité de cellules et le collagène présent. En outre, la mesure de hydroxyprolin est utile car c’est un acide aminé présent seulement en collagène et permet à l’objectivation des données histologiques. Toutefois, il est nécessaire de faire une coloration Trichrome de Masson, un, car il montre des informations beaucoup plus détaillées sur le dépôt et la concentration des fibres de collagène4.
Bien que le niveau de collagène III ARNm dans le PRP traités tendons n’est pas modifiée, à 30 jours ARNm du Col, j’étais présent à une concentration plus élevée dans les tendons blessés traités avec PRP. Auparavant, il avait été démontré que le PRP interfère avec la prolifération des macrophages et la production de IL-121, qui pourrait éviter ainsi une réaction inflammatoire excessive durant les premiers stades de la guérison de processus11. Il est possible que le PRP stimule la prolifération, l’activation des voies métaboliques et la transformation de cellules mésenchymateuses en tenocytes qui sont actives.
Des concentrations élevées de DNT dans les tendons du groupe PRP indiquent que les molécules injectées pourraient attirer des cellules circulant dans le sang et induit une différenciation vers le phénotype de tenocyte11. Globalement, ces résultats démontrent que qu’une seule injection de PRP dans un tendon d’Achille rompu a un effet positif sur la phase de guérison précoce et conduit à une plus grande résistance mécanique.
Plusieurs études précliniques ont déjà montré que le PRP améliore le processus de guérison, et que les facteurs de croissance différents ont des actions spécifiques au cours de ce processus22. Miriam et son équipe ont démontré que le PRP stimule la prolifération cellulaire dans les muscles, les os et les tendons. Hors de différentes préparations, fortement concentré PRP sans les globules blancs s’est avérée la plus efficace de traitement23. McCarrell et al. avez-vous une expérience similaire, essais de plusieurs préparations de la PRP contenant différentes concentrations de PRP et globules blancs sur les tendons du cheval. Les préparations contenant une concentration intermédiaire des plaquettes et une concentration élevée de globules blancs a conduit à une version plus élevée de cytokines pro-inflammatoires, telles que IL-1ß TNFa et la synthèse du collagène inférieure. Mélanges avec une forte concentration de plaquettes et de globules blancs a également conduit à une augmentation des cytokines inflammatoires, mais la synthèse du collagène inhibé. En conclusion, cela signifie que si la concentration de plaquettes est trop élevée, métabolisme cellulaire et de synthèse de collagène sont ralentis de24. Boswell et al. a confirmé ces conclusions25. La préparation plus efficace de la PRP contiendrait donc une concentration de plaquettes inférieure à 106 plaquettes/µL et aucune cellule de sang blanche.
Un avantage majeur de l’utilisation de PRP est autogenity. Bien que dans notre étude, nous avons utilisé des PRP allogénique en sacrifiant des rats de donateurs d’avoir une quantité suffisante de sang. En outre, prise de sang de rats exploités affaiblirait leur trop. Une autre limite de cette étude est que toutes les ruptures sont aiguës et effectuées sur des tendons sains, qui n’est pas toujours le cas chez les humains, comme les tendons rompent souvent à cause de la dégénérescence préalable. Ce modèle étant basé sur des blessures vives tendon, aucune conclusion définitive ne peut être tirée pour les tendinopathies dégénératives.
En utilisant cette méthode, il y a certaines étapes critiques à retenir, l’une étant la préparation de la PRP, qui devrait être plus reproductible que possible. Une autre étape critique est l’intervention chirurgicale : la suppression du tendon et muscle-tendon complexe devrait être fait de façon reproductible pour éviter toute distorsion. Enfin, la préparation pour le test biomécanique : azote liquide est ajouté à geler le muscle, et il est très important que le tendon n’est pas figé dans ce processus car elle pourrait conduire à des résultats biaisés, comme la rigidité du tendon serait modifiée. C’est également une limitation de l’étude, puisqu’il n’y a aucun protocole normalisé pour s’assurer qu’élasticité du tendon n’est pas modifiée.
Nous avons basé notre méthode sur la méthode développée par Virchenko et al. 26, mais adapté à l’aide de la cryo-mâchoire qui protège le tendon contre les agressions extérieures, induite par des colliers. Le principal avantage de cette méthode est qu’il est reproductible, même si elle n’est pas encore standardisé. Il donne une idée de comment les tendon lésions pourraient être traitées chez l’homme, bien que les expériences sur des rats ne se traduisent pas toujours bien au traitement des blessures humaines. Il est probable qu’une version adaptée de cette méthode peut être utile dans le traitement de ces lésions à l’avenir, étayée par le fait qu’elle est facile à utiliser, a un coût relativement faible et est moins invasive que les autres méthodes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Aucun conflit d’intérêts ne déclarés.
Acknowledgments
Cette étude a été financée par le Standard de Liège et Lejeune - Lechien accorde des Fonds Léon Frédéricq.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xylazine (Xyl-M) | VMD | none | anesthetic |
| Ketamin (Jétamine 1000 CEVA) | CEVA Santé Animale | none | anesthetic |
| Buprenorphin (Vetergésic Multidosis) | ALSTOE | none | Painkiller |
| iso-Betadine | MEDA-Pharma | none | Desinfectant |
| resorbable yarn Vicryl 6/0 | Johnson & Johnson | ||
| Nembutal | CEVA Santé Animale | none | Anesthetic |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Preserves structure of the tissue |
| Isopropanol 100% | VWR | 20,922,364 | |
| Ethanol 95% | VWR | 20,823,362 | |
| Xylene | VWR | 28973.363 | |
| Paraffin | VWR | LEIC3950.1006 | |
| Hematoxylin | Millipore | 1.15938.0025 | Colorant |
| Eosin | Millipore | 1.15935.0100 | Colorant |
| Eukitt | Sigma-Aldrich | 3989 | Mounting Medium |
| CaCl2 |
References
- Kaux, J., Degrave, N., Crielaard, J. Platelet rich plasma traitement des tendinopathies chroniques? Revue de la littérature. Platelet rich plasma treatment of chronic tendinopathies? Review of literature. J. Traumatol. du Sport. 24, 99-102 (2007).
- Anitua, E., et al. Autologous preparations rich in growth factors promote proliferation and induce VEGF and HGF production by human tendon cells in culture. J. Orthop. Res. 23, 281-286 (2005).
- Bosch, G., et al. Effects of platelet-rich plasma on the quality of repair of mechanically induced core lesions in equine superficial digital flexor tendons: A placebo-controlled experimental study. J. Orthop. Res. 28, 211-217 (2010).
- Kaux, J. F., Drion, P., Croisier, J. L., Crielaard, J. M. Tendinopathies and platelet-rich plasma (PRP): From pre-clinical experiments to therapeutic use. J. Stem Cells Regen. Med. 11, P7-P17 (2015).
- Maffulli, N., Wong, J., Almekinders, L. C.
- Molloy, T., Wang, Y., Murrell, G. The roles of growth factors in tendon and ligament healing. Sports Med. 33, 381-394 (2003).
- Lyras, D. N., et al. The effect of platelet-rich plasma gel in the early phase of patellar tendon healing. Arch. Orthop. Trauma Surg. 129, 1577-1582 (2009).
- Aspenberg, P., Virchenko, O. Platelet concentrate injection improves Achilles tendon repair in rats. Acta Orthop. Scand. 75, 93-99 (2004).
- Visser, L. C., et al. Growth Factor-Rich Plasma Increases Tendon Cell Proliferation and Matrix Synthesis on a Synthetic Scaffold: An In Vitro Study. Tissue Eng. Part A. 16, 1021-1029 (2010).
- Zhang, J., Wang, J. H. -C. Platelet-Rich Plasma Releasate Promotes Differentiation of Tendon Stem Cells Into Active Tenocytes. Am. J. Sports Med. 38, 2477-2486 (2010).
- Kajikawa, Y., et al. Platelet-rich plasma enhances the initial mobilization of circulation-derived cells for tendon healing. J. Cell. Physiol. 215, 837-845 (2008).
- Pasternak, B., Aspenberg, P. Metalloproteinases and their inhibitors-diagnostic and therapeutic opportunities in orthopedics. Acta Orthop. 80, 693-703 (2009).
- Dell, R. B., Holleran, S., Ramakrishnan, R.
- Mähler Convenor, M., et al. FELASA recommendations for the health monitoring of mouse, rat, hamster, guinea pig and rabbit colonies in breeding and experimental units. Lab. Anim. 48, 178-192 (2014).
- Kaux, J. -F., et al. Étude comparative de cinq techniques de préparation plaquettaire (platelet-rich plasma). Pathol. Biol. 59, 157-160 (2011).
- Wieloch, P., Buchmann, G., Roth, W., Rickert, M. A cryo-jaw designed for in vitro tensile testing of the healing Achilles tendons in rats. J. Biomech. 37, 1719-1722 (2004).
- Kaux, J. -F., et al. Vascular Endothelial Growth Factor-111 (VEGF-111) and tendon healing: preliminary results in a rat model of tendon injury. Muscles. Ligaments Tendons J. 4, 24-28 (2014).
- Docheva, D., Hunziker, E. B., Fässler, R., Brandau, O. Tenomodulin is necessary for tenocyte proliferation and tendon maturation. Mol. Cell. Biol. 25, 699-705 (2005).
- Lambert, C. A., Colige, A. C., Munaut, C., Lapière, C. M., Nusgens, B. V. Distinct pathways in the over-expression of matrix metalloproteinases in human fibroblasts by relaxation of mechanical tension. Matrix Biol. 20, 397-408 (2001).
- Nurden, A. T., Nurden, P., Sanchez, M., Andia, I., Anitua, E.
- Woodall, J., Tucci, M., Mishra, A., Benghuzzi, H. Cellular effects of platelet rich plasma: a study on HL-60 macrophage-like cells. Biomed. Sci. Instrum. 43, 266-271 (2007).
- Taylor, D. W., Petrera, M., Hendry, M., Theodoropoulos, J. S. A systematic review of the use of platelet-rich plasma in sports medicine as a new treatment for tendon and ligament injuries. Clin. J. Sport Med. 21, 344-352 (2011).
- Mazzocca, A. D., et al. The positive effects of different platelet-rich plasma methods on human muscle, bone, and tendon cells. Am. J. Sports Med. 40, 1742-1749 (2012).
- McCarrel, T. M., Minas, T., Fortier, L. A. Optimization of leukocyte concentration in platelet-rich plasma for the treatment of tendinopathy. J. Bone Joint Surg. Am. 94 (1-8), e143 (2012).
- Boswell, S. G., et al. Increasing platelet concentrations in leukocyte-reduced platelet-rich plasma decrease collagen gene synthesis in tendons. Am. J. Sports Med. 42, 42-49 (2014).
- Virchenko, O., Aspenberg, P. How can one platelet injection after tendon injury lead to a stronger tendon after 4 weeks?: Interplay between early regeneration and mechanical stimulation. Acta Orthop. 77, 806-812 (2006).
