Summary
Det här protokollet beskriver utvärderingen av healing senor på råttor som har injicerats med allogen trombocytantal rika plasma (PRP) eller saltlösning efter att ta bort en del av hälsenan. Utvecklingen av senan healing utvärderas vid flera tidpunkter med hjälp av olika typer av analyser.
Abstract
Denna artikel beskriver de experimentella rutiner används för att observera om PRP positivt kan påverka senan healing. Det finns 4 huvudsakliga steg att följa: framkalla en lesion i hälsenan; förbereda PRP och injicera det (eller saltlösning); ta bort senan; och utföra biomekaniska, molekylär och histologiska utvärderingar. Vid varje steg beskrivs alla förfaranden och metoder i detalj, så de kan reproduceras enkelt.
Akilles senor har varit kirurgiskt sektionerad (avlägsnande av ett 5-mm långa avsnitt). Efteråt, PRP eller saltlösning injicerades för att studera huruvida PRP har en positiv effekt på läkning av senan. Tre grupper med 40 djur (totalt 120 råttor användes i denna studie) var indelad i 2 undergrupper: PRP injektion grupp och en saltlösning injektion kontroll grupp. Råttor offrades öka tidpunkter (grupp A: 5 dagar; Grupp B: 15 dagar. Grupp C: 30 dagar) och senor togs bort. 90 senor genomgick biomekaniska tester innan du utför transcriptomic analys och de 30 återstående senorna överlämnades till histologisk analys.
Introduction
Koagulation, inflammatoriska processer och rollerna immunitet modulering av blodplättar är välkänd1. Mer nyligen har visats det att de också har vårdande egenskaper2,3. Faktiskt olika cytokiner och tillväxt faktorer (VEGF, PDGF, TGF-B, IGF-I, och HGF) släpptes av trombocyter under degranulering. Dessa tillväxtfaktorer främja angiogenes, vävnad remodeling och sår läkning (ben, hud, muskler, senor)2. Centrifugering autologt blod producerar trombocyter rika plasma (PRP) som innehåller hög trombocyter koncentrationer beroende på vilken isolering metod (mellan 3 och 10 gånger blod baslinjen koncentrationer). Olika tekniker för beredning av PRP tillhandahålla inte faktiskt en identisk slutprodukt. Hittills har man inga internationella allmänna överenskommelse om denna fråga. Sammantaget kunde PRP vara ett attraktivt behandlingsalternativ för behandling av kroniska muskuloskeletala tillstånd, såsom tendinopathy, plantar fasciit, artros och avsaknad av hopläkning4. Det användes för första gången i oral kirurgi och implantologi4 att förbättra och påskynda ben läkning efter att placera ett tandimplantat. I denna studie beskriver vi en reproducerbar metod som möjliggör förvärv av PRP för djurförsök4.
Eftersom skador i senor kan ofta observeras i idrottsmän och fysiska arbetstagare, främja läkningsprocessen och därmed minska tiden för återhämtning är av stort intresse5. Nya behandlingsmetoder som utvecklar ofta innebär användning av tillväxtfaktorer och administrationen av PRP är ett enkelt och minimalinvasiv sätt att leverera en blandning av endogena tillväxtfaktorer4.
Flera in vitro- eller djur studier har visat att administrering av plasma som innehåller en hög nivå av blodplättar, genom att släppa biologiska medlare, kan stimulera senor och ligament reparation genom att släppa biologiska medlare6 ,7,8,9. Andra studier har dessutom visat att PRP kan stimulera typ I och III kollagensyntes i senan celler9,10,11. Det har också föreslagits att PRP kan minska aktivering av matrix metalloproteinaser (MMP) och därför minskar nedbrytningen av matrisen. Celler som medverkar i inflammationsprocessen kan producera MMP-9, som spelar en roll i vävnad ombyggnad (fysiologisk och patologisk) induceras av inflammation12.
Baserat på denna information, hypotesen vi att en PRP engångsinjektion i sektionerad Achilles senor av råttor skulle kunna förbättra återvinnande förlopp och den mekaniska hållfastheten hos repareras vävnaden. Detta testas genom att mäta helande senor biomekaniska egenskaper under återhämtningsprocessen och genom histologiska och molekylära analyser för att utvärdera kollagen remodeling i den nybildade vävnaden. Syftet med studien var att observera om en enda injektion av allogena PRP kunde påverka läkningen av sektionerad Akilles senor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Skötsel och hantering av djuren utfördes enligt guiden för vård och användning av laboratoriedjur utarbetats av National Academy of Sciences och publiceras av nationella institut för hälsa (USA). Europeiska och nationella lagstiftningen följs noggrant.
1. animaliskt förberedelse
- Använd 132 2 - månader gammal hane Sprague-Dawley-råttor väger 320-450 g (120 råttor för experiment) och 12 råttor för blodprovstagning, figur 1. Baserat på Dell13, 15 råttor för varje grupp var nog för en kraft av 0,8 (80% chans att hitta statistisk signifikans, om den angivna effekten finns).
- Hus alla råttor i klassiskt burar under isolerade förhållanden i en konventionell anläggning utrustad med en föränderlig station. Anstiftar avel i en IVC (individuellt ventilerade cage) rack, med SPF (specifik patogen fri) råttor som specifikt köps.
- Använd följande inhysa villkorar: temperaturområde från 19-24 ° C; relativ luftfuktighet: 40-60%. ventilation: frekvensen av förnyelse av luften: 10-15 per h; ljus/mörk cykel: 12 h - 12 h.
- Sterilisera all caging utrustning och använder bestrålat sängar. Systemiskt implementera bur berikning genom att placera sterila kartong tråg och handdukar i burarna.
- Tillåta åtkomst till zonen begränsade villkor: nya lab-coat, mask, handskar, skor och hår motorhuven vid ingången.
- Genomföra kolonin hälsoövervakning på sentinel djur inrymt på smutsiga sängkläder på årlig basis, enligt Felasa14 rekommendationer för konventionella anläggningar. Behåll fyra till fem djur per bur, med en lämplig bestrålade kost och ge försurade vatten ad libitum. Övervaka dagligen.
- Överföra råttor väljs för kirurgiska ingrepp i filtreringen översta burar till de kirurgiska rum 2 h före operation.
2. kirurgiska ingrepp
- Förbereda de kirurgiska instrument: fina sax, en klämma, två hemostatiska klämmor och en nålförare. Under alla förfaranden, bära handskar, en mask, en huva och en labbrock.
- Slumpmässigt dela råttorna i två grupper (PRP och koksaltlösning).
- Ta råtta ur sin bur och tynga. Använda numrerade öronmärken för att identifiera råttorna. För att undvika uttorkning av ögonen, placera vattendroppar på hornhinnan.
- Söva råtta intraperitonealt med xylazin (10 mg/kg kroppsvikt) och ketamin (80 mg/kg kroppsvikt). För att bekräfta anesthetization, placera djuren under cardio-respiratory övervakning och kontrollera om något öga reflexer.
- Injicera 50 µL av buprenorfin subkutant (0,01-0,05 mg/kg varje 8-12 h) i nacken som ett smärtstillande medel.
- Rakning på vänster bakben med en rakapparat, desinficera det med 3 omväxlande scrubs av iso-betadine/alkohol (utspädd 1:10) lösning och placera råtta på en varm pad (20 ° C) under en dissekera Mikroskop. Placera råtta på laterala decubitus med benet ska opereras i en överlägsen position. Håll tass med kirurgisk pincett.
- Med sax, göra ett litet laterala snitt (20-25 mm) i huden runt vänster hälsenan och dissekera den fascia med fina sax för att exponera hälsenan komplexa (figur 2a).
- Ta bort plantaris senan med en sax (figur 2b).
- Skär hälsenan tvären 5 mm proximalt dess calcaneal insättning och ta bort en 5-mm lång del med sax. Inte sutur senan (figur 2 c, 2d).
- Sutur fascian och sedan huden med resorberbara garn gör en overjet suturen (kontinuerlig sutur). Monofilament suturer kan användas samt att förhindra fukttransport från huden in kirurgiska snittet.
- Placera råtta under en värme lampa tills vaken och sedan placera råtta tillbaka i en bur (58 x 38 cm) (Nota bene: ingen immobilisering tas ut).
3. PRP förberedelse15
- Söva givare råttorna med xylazin (10 mg/kg kroppsvikt) och ketamin (80 mg/kg kroppsvikt) av intraperitoneal injektion. PRP injektionen utförs 2 h postoperativt utan någon re-bedövningsmedel.
- Injicera subkutant 50 µL av buprenorfin som ett smärtstillande medel.
- Samla in helblod (20 mL per råtta, slutliga blödning) av hjärt punktering i sterilt rör som innehåller 3,2% buffrad natriumcitrat (0.109 M, antikoagulans). Sedan avliva råtta som intrakardiellt injektion.
- För att erhålla PRP, Centrifugera blodet för 10 min på 150 x g och rumstemperatur. Här låg utgångshastighet centrifugeringssteget ger två skilda faser: en lägre bestående av röda blodkroppar (RBC) som står för ca 80-90% av den totala volymen, och en övre fas bestående av trombocyt-rich plasma (PRP) (vanligtvis 10-20% av blodet prov).
- Samla försiktigt in principen för Lösenordsreplikering (övre fasen) i en sekundär plaströr med plast överföring pipett. Gränssnittet mellan PRP och röda blodkroppar är mycket lös, Pipettera inte alltför nära till gränssnittet. När hanteras korrekt, kontaminerande röda blodkroppar i PRP bör understiga 0,05 x 103 celler / µL. Kassera återstående lägre fasen och de primära bloduppsamlingsrör.
- Bestäm volymen av insamlade PRP och mäta antalet trombocyter på en hematologi analyzer. Dessa värden krävs för beräkningar för att justera trombocytantal koncentration i nästa steg. Ett antal blodkroppar är också användbart att utvärdera potentiella kontaminering med röda blodkroppar och WBCs. trombocyter koncentration i PRP i detta skede är oftast 1-1,5 x106/µl.
- Utföra en andra centrifugering av Lösenordsreplikeringsprincipen för 10 min vid 1000 x g och rumstemperatur. Detta höghastighetståg centrifugeringssteget ger en lös trombocytantal pellet och en supernatant bestående av autologa trombocyt-fattiga plasma (PPP). Med hjälp av de värden som bestäms i steg 3.6, beräkna volymen av supernatant som skall kasseras för att koncentrera PRP och nå en slutlig koncentration på 2,5 x106/µl.
- Samla försiktigt in supernatanten (PPP) i en sekundär plaströr med plast överföring pipett, lämnar ungefär två tredjedelar av den slutliga volymen som beräknades i steg 3,7. Pelleten är lös, förloras en betydande mängd trombocyter när PPP är kasseras, därmed potentiellt minska slutliga önskad koncentration.
- Noggrant återsuspendera pelleten blodplättar med återstående supernatanten genom skonsam upprepad pipettering. Mäta antalet trombocyter på denna koncentrerade PRP. Om det behövs, lägga till lämplig volym av autologa PPP till slutmålet koncentration.
Obs: Använd principen för Lösenordsreplikering inom 3 timmar efter beredning. - Tillsätt 50 µL av CaCl2 (11 mEq 10 mL) per mL PRP att aktivera trombocyter.
- Injicera 50 µL färska PRP eller saltlösning med en 21G nål direkt in i sys drift tomt ca 1 h efter beredning. Under denna tid hålla PRP vid rumstemperatur.
- Funktionell återhämtning av råttorna noga övervaka de dagarna efter operationen och före avlägsnande av hälsenan.
4. avlägsnande av hälsenan och biomekanisk testning16
- 5, 15 eller 30 dagar senare5, väga råtta. Sedan, söva med xylazin (10 mg/kg kroppsvikt) och ketamin (80 mg/kg kroppsvikt) av intraperitoneal injektion.
- Injicera subkutant 50 µL av buprenorfin som ett smärtstillande medel. Ta bort senan innan att offra djur för att hålla de fysiologiska förhållandena för så länge som möjligt.
- Raka i vänster bakben och placera råtta i dissekera Mikroskop. Placera råtta på laterala decubitus med benet ska opereras i en överlägsen position. Håll tassen med fingrar.
- Gör ett litet snitt (10 mm) i den föregående operation platsen och förlänga tills den triceps suralis är utsatt.
- Ta bort helande hälsenan, skär calcaneal ben tvären 5-10 mm distalt till dess hälsenan fastsättning. Sedan dissekera en del av den triceps suralis, som är knuten till hälsenan (figur 3b). Den muskel delen måste vara tillräckligt stor för att passa i cryo-käken (figur 3 c-d). Placera provet omedelbart i cryo-käken med hjälp av tången (figur 3e).
- Efter bort komplexet muskel-senan-ben, eutanasi råtta som intrakardiellt injektion med Nembutal (200 mg/kg). Bekräfta död genom att bedöma avsaknad av hjärtrytm och andning i 15 min.
- Placera enheten muskel i överkäken (figur 3e), stänga den och placera den vertikalt till en universell testa maskin (106,2 kN, figur 3a). Sedan fixa benet mellan lägre klämmorna av maskinen (figur 3f).
- Tillsätt flytande kväve i både de övre käken bassänger att frysa muskeln, så att det är en storleksordning som är styvare än senan och inte deformeras under dragprovet.
- När zonen frysning når gränsen metall klämman, starta dragprovet, så att senan kommer att bevara dess struktur. Ange förskjutning av maskinen vid en konstant hastighet av 1 mm/s tills bristning. Registrera den ultimata tänjbara styrkan (UTS) anges i Newton (N) på en dator.
- Att beräkna tvärsnittsarean, placera två kameror vinkelräta mot varandra, bildar en elliptisk form och ta bilder.
- För att kompensera för skillnaden i tvärsnittsytan av helande senor, normalisera UTS till en ytenhet (N per kvadrera millimetern), som representerar den mekanisk stress som upplevs av vävnaden.
5. histologisk analys
Obs: 15 senor i varje grupp genomgick histologisk analys.
- Efter dess avlägsnande, dränka hälsenan omedelbart i 4% PARAFORMALDEHYD att bevara dess struktur (1 mm av vävnad är fast per timme, så tiden för fixering varierar beroende på storleken av senan).
- Ersätta PARAFORMALDEHYD med 70% etanol, och lämna provet för minst en natt i denna lösning.
- Placera senan i en liten plastbehållare med hål och placera behållaren i en färsk 70% etanol lösning för 1 h.
- Plats behållaren i 95% etanol för 1 h. Upprepa.
- Plats behållaren i 100% etanol för 1 h. Upprepa.
- Plats behållaren i 100% xylen för 1 h. Upprepa.
- Nu placera plast behållaren, som innehåller senan, i flytande paraffin (56 ° C) och lämnar det över natten.
- Använder en inbäddning station (utrustade med smält vax, en värmeplatta och en kall tallrik), välja en metallisk form som bäst passar vävnadsprov, och fyll den med lite flytande paraffin så att botten täcks.
Obs: Orientera provet för att få vertikala sektioner på mikrotomen. - När provet är rätt placerad, fyll upp formen med flytande paraffin och placera den på maskinens kylrum. Låt den svalna i minst 15 min.
- Ta bort från blocket paraffin och placera den på is i minst 30 min.
- Förbereda flera rena glasskivor och sätta några droppar av avjoniserat vatten på dem.
- På mikrotomen, skära blocken i avsnitt 5 µm (endast använda avsnitt från den mellersta delen av senan) och placera avsnittet på en bild.
- Placera glasen i en uppvärmning ugnen vid 65 ° C under flera minuter, så att paraffinet bara börjar smälta för att bond vävnaden till glas.
- Placera glasen som innehåller paraffin avsnitt i en slice hållare.
- Nu deparaffinize och rehydrera vävnaden genom att placera den i följande på varandra följande bad:
8 min i xylen (bad 1)
4 min i xylen (bad 2)
2 min i 100% etanol
2 min i 95% etanol
2 min i 70% etanol
2 min i avjoniserat vatten - För Hematoxylin-Eosin färgning, placera vävnaden i följande lösningar.
- Fördjupa vävnaden i 8 min i hematoxylin lösning (1 g hematoxylin monohydrat, 0,2 g KIO3, 50 g AIK (SO4)2.12H2O; 200 mL glycerin; justera till 1 L med destillerat vatten).
- Fördjupa vävnaden i 8 min under rinnande vatten.
- Fördjupa vävnaden för 30 s i eosin lösning (0,25% eosin i 100 mL destillerat vatten innehållande 200 µL outspädd ättiksyra).
- Fördjupa vävnaden i 2 min under rinnande vatten.
- För Masson trikrom färgning, Följ dessa steg.
- Efter rehydrering, placera avsnitten i en behållare med järn alun (0,5 g (NH4) Fe (SO4)2.12H2O i 10 mL H2O) och Stäng behållaren. Värm upp för 3 min vid 280 W i en mikrovågsugn.
- Låt det svalna en stund och sedan skölja med avjoniserat vatten.
- Placera avsnitten i en sluten behållare med Regaud's hematoxylin lösning (0,5 g hematoxylin löses i 50 mL H2O vid 50 ° C, tillsätt 5 mL 95% etanol och 5 mL glycerin), Värm upp för 90 s vid 280 W.
- Skölj med avjoniserat vatten.
- Placera avsnitten i en pikrinsyra lösning (på mättnad i metanol) för 3 min, skölj under 5 minuter under rinnande vatten och sedan placera den i avjoniserat vatten i några sekunder.
- Nu placera avsnitten i syra fuchsin (0,5 g 50 mL H2O som innehåller 0,25 mL outspädd ättiksyra) för 5 s och skölj under rinnande vatten tills färgen försvinner.
- Inkubera i avsnitt i phosphomolybdic sur lösning (0,5 g 50 mL H2O) för 5 min, placera den i några sekunder i avjoniserat vatten.
- Placera avsnitten i ljusgrön (0,5 g 50 mL H2O som innehåller 0,25 mL outspädd ättiksyra) lösning för en annan 5 min och placera den under rinnande vatten tills färgen försvinner.
- Nu torka vävnaden igen.
- Sänk ned avsnittet för 1 min i 70% etanol.
- Sänk ned avsnittet för 1 min i 95% etanol.
- Sänk ned avsnittet för 1 min i 100% etanol.
- Sänk ned avsnittet för 1 min i xylen (bad 1).
- Sänk ned avsnittet för 1 min i xylen (bad 2).
- Ta bort avsnitten utan att ta bort för mycket xylen och sätta en droppe monteringsmedium på provet.
- Sätta ett täckglas på toppen (utan provocera eventuella bubblor) och låt det härda i minst 2 h.
- Hydrolyserar 5 histologiska sektioner (varje en annan sena) av varje grupp i 6 N HCl för 3 h och bestämma koncentrationen av kollagen genom att mäta hydroxiprolin som ett index i 5 µm ofärgade sektioner.
- Normalisera resultaten av området avsnitt med tillverkarens programvara.
- Fläcken några av avsnitten med ljus gröna fläcken att visualisera och kvantifiera fibrillar kollagen av datorstödd analys.
- Skanna avsnitten och konvertera bilder i nyanser av grått med programmet IrfanView. Använda programvaran för semi kvantifiering (t.ex., en kvantitet).
6. molekylär utvärdering
- Efter senruptur, som uppstår under mekanisk provning, ta proverna, snap frysa dem i flytande kväve, och lagra dem vid-80 ° C (PRP och saltlösning)17.
- Använda en kommersiell Total-RNA-kit för att isolera totalt RNA17.
- Mäta uttrycket av kollagen (Col I och Col III), Matrix metalloproteinaser (MMP-2, MMP-3 och MMP-9) och tenomodulin (TNMD) av RT-PCR-17,18.
- Normalisera nivåer för uttryck av mRNA att nivåerna av 28S19.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Resultaten uttrycks som medelvärde ± standardavvikelsen för medelvärdet och jämfördes med variansanalys (ANOVA). En tvåvägs ANOVA och post hoc test de Scheffé, som är en parametrisk test, användes.
Den ultimata tänjbara styrkan (UTS) krävs att provocera en bristning i de icke-skadade Akilles senorna av råttor var 42,0 ± 5,7 N (n = 10). Den tänjbara styrkan ökade signifikant (p < 0,0001) i båda grupperna efter dag 5. Jämföra båda grupperna, UTS var högre i gruppen PRP helst mätas, särskilt på dag 15 och 30. Genom att mäta tvärsnittsarean på senor som togs bort innan de genomgick biomekanisk utvärdering (11,4 ± 5,5 mm2 för icke-skadade senor), konstaterades det att dag 5, det var större i saltlösning behandlade gruppen. Men på dag 15 och 30, tvärsnittsarea var större i gruppen PRP, även om denna kvantitet var mer variabel jämfört med saltlösning behandlade gruppen (figur 4 och figur 5).
Histologisk utvärdering av senor, med hematoxylin-eosin färgning, visade en hög cellularitet vid dag 5, vilket minskade efteråt (ingen signifikant skillnad observerades mellan saltlösning och PRP-gruppen). De Masson Trichrome färgning visade en högre närvaro av fibrillar kollagen i gruppen PRP vid dag 5 och 15. Men intensiteten i färgningen var likartad i båda grupper 30 dagar efter injektion (figur 6). Semi kvantifiering erhålls genom färgning av prov med ljusgrön visade att vid dag 5 och 15, intensiteten var högre i gruppen PRP (ej statistiskt signifikant) men vid dag 30, det fanns ingen skillnad mellan de två grupperna.
Data var normaliserade genom att mäta mängden en aminosyra, hydroxiprolin, som är specifika för kollagen, bekräftar den histologiska semi kvantifieringen (dag 5: större värde i PRP-gruppen). Kollagen koncentrationen var inte stabil i gruppen PRP men var stabiliseras vid dag 30 i de två grupperna. Volymen av förhårdnader mättes och befanns vara betydligt större hos PRP-behandlade djur under de första stadierna av läkningsprocessen. Sammantaget antyder dessa resultat att den PRP injektionen i den skada senan orsakar ett betydande belopp av fibrillar kollagen att deponera.
Mäta flera molekyler visade att i icke-skadade senor, Col III och TNMD uttryck var närvarande i ett mindre belopp (2,5 - 3,0 gånger) än i healing senor på dag 15, men det fanns ingen skillnad i Col jag uttryck mellan grupperna. MMP var närvarande vid en 12-fold högre koncentration i helande senor. Dessutom vid dag 30, det fanns en betydande ökning av COL1A1 i gruppen PRP, och en positiv korrelation mellan COL1A1 uttryck och UTS hittades. I båda grupperna konstaterades det att Col III uttrycktes i en hög kvantitet från dag 1 till dag 14, innan det minskade (samma för båda grupperna). MMP-9-koncentration ändrade inte i båda grupperna men MMP-2 och MMP-3 var närvarande vid högre koncentrationer under läkningsperioden. Dag 5, TNDM uttrycktes i ett högre belopp i principen för Lösenordsreplikering (p < 0,03) men sedan minskade mellan dag 15 och 30.
Figur 1: experimentell design av studien. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Kirurgiskt ingrepp.
(a) senan komplexa efter avlägsnande av den omgivande fascian.
(b) avlägsnande av plantaris senan.
(c) borttagande av ett avsnitt av hälsenan.
(d) The 2 senor som har tagits bort. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Biomekanisk testning
(a) Universal maskin för provning (106,2 kN).
(b) muskel-senan-ben anläggningen som kommer att fastställas i cryo-käken.
(c) övre och lägre cryo käken
(d) övre och lägre cryo-käken
(e) komplexet sätta i cryo käken
(f) stängda cryo-käken som innehåller komplexet muskel-senan-ben fast i maskinen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Biomekaniska testresultat
Draghållfasthet uttryckt i Newton (N) i kontroll och PRP grupper vid olika tidpunkter efter operation. Det var en ökning med UTS i båda grupperna över tid, med PRP gruppen visar betydligt högre värden på 15 och 30 dagar efter operation.
Felstapel definierar standardavvikelsen (SD). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Biomekaniska testresultat
Tvärgående område av senan uttryckt i kvadratmillimeter (mm2). Tvärsnittsarean var signifikant större i gruppen PRP tills dag 15. Efteråt, avsnittet var likartad i båda grupperna.
Felstapel definierar standardavvikelsen (SD). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Histologiska resultat
Representativa längdsnitt av hälsenan från kontroll och PRP grupper, fläckade Masson's Trichrome. Skalstapeln = 100 µm. Det finns en starkare grön färgning i senan i gruppen PRP dag 5. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Trombocyter är väsentliga för den tidiga inflammatoriska fasen av senan läkningsprocessen. När dessa blodplättar utsätts för bindande vävnad eller faktorer som inducerar koagulering, kommer de att släppa tillväxtfaktorer som lagerförs i α granulat. På grund av denna interaktion, extracellulär matrix makromolekyler är synthetized och mesenkymala celler föröka. Trombocyter har även en kemotaktisk verksamhet på stamceller i blodcirkulationen, förbättrar angiogenes och stimulerande celldifferentiering6,20.
Biomekaniska tester gjordes med hjälp av en fastspänningsanordning speciellt framtagen för ex vivo tensile tester av hälsenan i råttor15. Cryo-käken tillåter frysning av muskeln genom att lägga till flytande kväve och calcaneal ben, som är den nedre delen av preparatet, fixas direkt i maskinen. Det är mycket viktigt att starta dragprovet när muskeln är helt stela, men senan är fortfarande flexibelt. Denna teknik undviker vävnadsskada och bevarar den mekaniska integriteten. Också är denna teknik enkel, säker, icke-tryckhållfasthet och bevisligen reproducerbara, som flera studier har använt denna metod4,15.
För att stödja mekaniska resultaten, genomgick några senor Histologisk undersökning. Hematoxylin-eosin färgningen visar en bra översikt av läkt vävnad och ger allmän information om mängden celler och kollagen närvarande. Även mätning av hydroxyprolin är användbar eftersom det är en aminosyra som bara finns i kollagen och tillåter objectivation histologiska data. Det är dock nödvändigt att göra en Masson trikrom färgning, eftersom den visar mycket mer detaljerad information om nedfall och koncentrationen av kollagen fibrer4.
Även om nivån av kollagen III mRNA i principen för Lösenordsreplikering behandlas senor förändrades inte, på dag 30 mRNA av Col jag var närvarande i en högre koncentration i skadade senor behandlas med PRP. Det hade tidigare visat att PRP stör spridningen av makrofager och produktionen av IL-121, som därmed kunde undvika en överdriven inflammatorisk reaktion under de tidiga stadierna av helande process11. Det är möjligt att PRP stimulerar spridning, aktivering av metaboliska vägar och omvandlingen av mesenkymala celler i tenocytes som är aktiva.
Höga koncentrationer av TNDM i senorna i gruppen PRP indikerar att de injicerade molekylerna kunde locka celler som cirkulerar i blodet och framkalla en differentiering mot tenocyte fenotyp11. Sammantaget visar dessa resultat att bara en injektion av PRP i en brusten hälsena har en positiv effekt på tidiga läkningsfasen och leder till en högre mekanisk hållfasthet.
Flera kliniska studier har redan visat att PRP förbättrar läkningsprocessen och att de olika tillväxtfaktorerna har särskilda åtgärder under denna process22. Mazzocca och hans team visat att PRP stimulerar cellproliferation i muskler, ben och senor. Av olika preparat, starkt koncentrerad PRP utan några vita blodkroppar visat sig vara den mest effektiva behandling23. McCarrell et al. gjorde ett liknande experiment, testar flera beredningar av PRP som innehåller olika koncentrationer av PRP och vita blodkroppar på häst senor. Preparat som innehåller en mellanliggande koncentration av trombocyter och en hög koncentration av vita blodkroppar ledde till en högre utgåva av pro-inflammatoriska cytokiner, IL-1ß och TNFa samt lägre kollagensyntes. Blandningar med en hög koncentration av blodplättar och vita blodkroppar också lett till en ökning av inflammatoriska cytokiner men hämmad kollagensyntes. Sammanfattningsvis innebär detta att om trombocytantalet koncentrationen är för hög, kollagen syntes och cell metabolism är långsammare24. Boswell et al. bekräftade dessa fynd25. Mest effektiva PRP preparatet skulle därmed innehålla ett trombocytantal koncentration lägre än 106 trombocyter/µL och inga vita blodkroppar.
En stor fördel med att använda PRP är autogenity. Men i vår studie, brukade vi allogen PRP genom att offra givare råttor har en tillräcklig mängd blod. Dessutom skulle tar blod från opererade råttorna försvaga dem för mycket. En annan begränsning av denna studie är att alla brister är akut och utförs på friska senor, som inte är alltid fallet i människor, som senor ofta brista på grund av tidigare degeneration. Denna modell bygger på skarpa sena skador, kan inga definitiva slutsatser dras för degenerativa tendinopathies.
Med den här metoden finns det vissa kritiska moment att komma ihåg, den första en som utarbetandet av PRP, som bör vara lika reproducerbara som möjligt. Ett annat viktigt steg är det kirurgiska ingreppet: avlägsnande av senan och muskel-senan komplex bör göras på ett reproducerbart sätt att undvika någon bias. Slutligen, förberedelserna för biomekaniska tester: flytande kväve läggs till frysa muskeln, och det är ganska viktigt att senan inte är fryst i denna process eftersom det kan leda till partisk resultat, som senan styvheten skulle ändras. Detta är också en begränsning av studien, eftersom det inte finns något standardiserat protokoll att se till att Senans elasticitet inte ändras.
Vi bygger vår metod på den metod som utvecklats av Virchenko et al. 26, anpassat men det använda cryo-käken som skyddar senan mot yttre aggressioner inducerad av klämmor. Den stora fördelen med denna metod är att det är reproducerbara även om det inte är ännu standardiserad. Det ger en idé om hur sena skador kunde behandlas hos människa, även om experiment med råttor inte alltid översätta väl att behandla mänskliga skador. Det är troligt att en anpassad version av den här metoden kan vara användbart vid behandling av dessa skador i framtiden, stöds av det faktum att det är lätt att använda, har en relativt låg kostnad, och är mindre invasiv än andra metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter förklarade.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av Standard de Liège och Lejeune - Lechien bidrag av Leon Frédéricq medel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xylazine (Xyl-M) | VMD | none | anesthetic |
| Ketamin (Jétamine 1000 CEVA) | CEVA Santé Animale | none | anesthetic |
| Buprenorphin (Vetergésic Multidosis) | ALSTOE | none | Painkiller |
| iso-Betadine | MEDA-Pharma | none | Desinfectant |
| resorbable yarn Vicryl 6/0 | Johnson & Johnson | ||
| Nembutal | CEVA Santé Animale | none | Anesthetic |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Preserves structure of the tissue |
| Isopropanol 100% | VWR | 20,922,364 | |
| Ethanol 95% | VWR | 20,823,362 | |
| Xylene | VWR | 28973.363 | |
| Paraffin | VWR | LEIC3950.1006 | |
| Hematoxylin | Millipore | 1.15938.0025 | Colorant |
| Eosin | Millipore | 1.15935.0100 | Colorant |
| Eukitt | Sigma-Aldrich | 3989 | Mounting Medium |
| CaCl2 |
References
- Kaux, J., Degrave, N., Crielaard, J. Platelet rich plasma traitement des tendinopathies chroniques? Revue de la littérature. Platelet rich plasma treatment of chronic tendinopathies? Review of literature. J. Traumatol. du Sport. 24, 99-102 (2007).
- Anitua, E., et al. Autologous preparations rich in growth factors promote proliferation and induce VEGF and HGF production by human tendon cells in culture. J. Orthop. Res. 23, 281-286 (2005).
- Bosch, G., et al. Effects of platelet-rich plasma on the quality of repair of mechanically induced core lesions in equine superficial digital flexor tendons: A placebo-controlled experimental study. J. Orthop. Res. 28, 211-217 (2010).
- Kaux, J. F., Drion, P., Croisier, J. L., Crielaard, J. M. Tendinopathies and platelet-rich plasma (PRP): From pre-clinical experiments to therapeutic use. J. Stem Cells Regen. Med. 11, P7-P17 (2015).
- Maffulli, N., Wong, J., Almekinders, L. C.
- Molloy, T., Wang, Y., Murrell, G. The roles of growth factors in tendon and ligament healing. Sports Med. 33, 381-394 (2003).
- Lyras, D. N., et al. The effect of platelet-rich plasma gel in the early phase of patellar tendon healing. Arch. Orthop. Trauma Surg. 129, 1577-1582 (2009).
- Aspenberg, P., Virchenko, O. Platelet concentrate injection improves Achilles tendon repair in rats. Acta Orthop. Scand. 75, 93-99 (2004).
- Visser, L. C., et al. Growth Factor-Rich Plasma Increases Tendon Cell Proliferation and Matrix Synthesis on a Synthetic Scaffold: An In Vitro Study. Tissue Eng. Part A. 16, 1021-1029 (2010).
- Zhang, J., Wang, J. H. -C. Platelet-Rich Plasma Releasate Promotes Differentiation of Tendon Stem Cells Into Active Tenocytes. Am. J. Sports Med. 38, 2477-2486 (2010).
- Kajikawa, Y., et al. Platelet-rich plasma enhances the initial mobilization of circulation-derived cells for tendon healing. J. Cell. Physiol. 215, 837-845 (2008).
- Pasternak, B., Aspenberg, P. Metalloproteinases and their inhibitors-diagnostic and therapeutic opportunities in orthopedics. Acta Orthop. 80, 693-703 (2009).
- Dell, R. B., Holleran, S., Ramakrishnan, R.
- Mähler Convenor, M., et al. FELASA recommendations for the health monitoring of mouse, rat, hamster, guinea pig and rabbit colonies in breeding and experimental units. Lab. Anim. 48, 178-192 (2014).
- Kaux, J. -F., et al. Étude comparative de cinq techniques de préparation plaquettaire (platelet-rich plasma). Pathol. Biol. 59, 157-160 (2011).
- Wieloch, P., Buchmann, G., Roth, W., Rickert, M. A cryo-jaw designed for in vitro tensile testing of the healing Achilles tendons in rats. J. Biomech. 37, 1719-1722 (2004).
- Kaux, J. -F., et al. Vascular Endothelial Growth Factor-111 (VEGF-111) and tendon healing: preliminary results in a rat model of tendon injury. Muscles. Ligaments Tendons J. 4, 24-28 (2014).
- Docheva, D., Hunziker, E. B., Fässler, R., Brandau, O. Tenomodulin is necessary for tenocyte proliferation and tendon maturation. Mol. Cell. Biol. 25, 699-705 (2005).
- Lambert, C. A., Colige, A. C., Munaut, C., Lapière, C. M., Nusgens, B. V. Distinct pathways in the over-expression of matrix metalloproteinases in human fibroblasts by relaxation of mechanical tension. Matrix Biol. 20, 397-408 (2001).
- Nurden, A. T., Nurden, P., Sanchez, M., Andia, I., Anitua, E.
- Woodall, J., Tucci, M., Mishra, A., Benghuzzi, H. Cellular effects of platelet rich plasma: a study on HL-60 macrophage-like cells. Biomed. Sci. Instrum. 43, 266-271 (2007).
- Taylor, D. W., Petrera, M., Hendry, M., Theodoropoulos, J. S. A systematic review of the use of platelet-rich plasma in sports medicine as a new treatment for tendon and ligament injuries. Clin. J. Sport Med. 21, 344-352 (2011).
- Mazzocca, A. D., et al. The positive effects of different platelet-rich plasma methods on human muscle, bone, and tendon cells. Am. J. Sports Med. 40, 1742-1749 (2012).
- McCarrel, T. M., Minas, T., Fortier, L. A. Optimization of leukocyte concentration in platelet-rich plasma for the treatment of tendinopathy. J. Bone Joint Surg. Am. 94 (1-8), e143 (2012).
- Boswell, S. G., et al. Increasing platelet concentrations in leukocyte-reduced platelet-rich plasma decrease collagen gene synthesis in tendons. Am. J. Sports Med. 42, 42-49 (2014).
- Virchenko, O., Aspenberg, P. How can one platelet injection after tendon injury lead to a stronger tendon after 4 weeks?: Interplay between early regeneration and mechanical stimulation. Acta Orthop. 77, 806-812 (2006).
