Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Middelgrote voorbereiding van Published: May 30, 2017 doi: 10.3791/55804
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1Biology Department, University of Massachusetts Boston, 2Department of Bioengineering, University of California, San Diego

Summary

Het doel van dit protocol is om een ​​eenvoudige en goedkope aanpak te geven voor het verzamelen van Drosophila embryo's op middelgrote schaal (0,5-1 g) en het bereiden van eiwit extracten die kunnen worden toegepast in stroomafwaartse proteomische toepassingen, zoals affiniteitszuivering-massaspectrometrie (AP-MS ).

Abstract

Analyse van eiwit-eiwit interacties (PPI's) is een onontbeerlijke aanpak geworden voor het bestuderen van biologische processen en mechanismen, zoals celsignaalvorming, ontwikkeling van organismen en ziekte. Het is vaak gewenst om PPI-informatie te verkrijgen door gebruik te maken van in vivo materiaal, om de meest natuurlijke en onpartijdige weergave van de interactie netwerken te verkrijgen. De vruchtvlieg Drosophila melanogaster is een uitstekend platform om PPI's in vivo te bestuderen en leent zich op eenvoudige aanpakken voor isolatiemateriaal voor biochemische experimenten. In het bijzonder vormen vruchtvliegenembryo's een geschikt type weefsel om PPI's te bestuderen door het gemakkelijk verzamelen van dieren in dit ontwikkelingsfase en het feit dat de meeste eiwitten uitgedrukt worden in embryogenese, waardoor een relevante omgeving wordt verschaft om de meeste PPI's te onthullen. Hier presenteren we een protocol voor het verzamelen van Drosophila embryo's op middelgrote schaal (0,5-1 g), wat een ideale hoeveelheid is voor een breed scala aanProteomische toepassingen, inclusief analyse van PPI's door affiniteitszuivering-massaspectrometrie (AP-MS). We beschrijven onze ontwerpen voor 1 liter en 5 liter kooien voor embryo collecties die gemakkelijk en goedkoop in elk laboratorium kunnen worden opgezet. Wij bieden ook een algemeen protocol voor embryo-collectie en eiwit extractie om lysaten te genereren die direct kunnen worden gebruikt in downstream toepassingen zoals AP-MS. Ons doel is om alle onderzoekers een toegankelijke manier te bieden om de analyses van PPI's in vivo uit te voeren .

Introduction

Genetische schermen en recentere genomische benaderingen hebben de studie van biologische functies ge revolutioneerd. Echter, belangrijke cellulaire informatie is gecodeerd in eiwitten en hun ensemble van interactieve partners. Terwijl traditionele genetische modificatieschermen de snelheidsbeperkende componenten kunnen identificeren en indirecte interacties herstellen, ligt de sterkte van de proteomische benaderingen in hun vermogen om directe interactie-netwerken van eiwitten van belang te identificeren. Proteomics is dus een waardevolle orthogonale methode om biologische systemen te bestuderen, en complementeert genomics, transcriptomics en traditionele genetische schermen. Affiniteit zuiverings-massaspectrometrie (AP-MS) is bewezen een krachtige aanpak om eiwit-eiwitinteracties (PPI's) in hun natuurlijke omgeving in cellen en weefsels 1 , 2 te bestuderen. Deze methode maakt het mogelijk om directe of indirecte interacties bij specifieke ontwikkeling te identificerenAl fases of weefselcontexten, en is succesvol gebruikt om meerdere nieuwe PPI's te identificeren in een verscheidenheid aan ontwikkelingswegen (onderzocht in referentie 1 ). Ondanks het onbetwiste succes van PPI-studies, zijn de meeste van hen uitgevoerd in gekweekte cellen, waarin de 'aas' eiwitten van belang zijn overexpresseerd. Er zijn twee problemen bij het bestuderen van PPI's in celcultuur: eerst kan een specifieke cellijn geen volledige complement van interacties verschaffen als gevolg van het gebrek aan expressie van bepaalde eiwitten. Ten tweede kan hoge overexpressie die gewoonlijk bij dergelijke analyses wordt gebruikt, leiden tot artefacten zoals eiwit misfolding of identificatie van valse positieve interacties.

Beide deze beperkingen kunnen worden overwonnen door PPI's in vivo te analyseren. Een beperkende stap bij dergelijke experimenten is de beschikbaarheid van het uitgangsmateriaal voor het zuiveren van eiwitcomplexen. Drosophila melanogaster is al lang gebruikt als model voor functionele analyseSis, en recentelijk is ook aangetoond dat het een uitstekend systeem is voor het bestuderen van PPI's in vivo . Drosophila embryogenese vertegenwoordigt een bijzonder aantrekkelijk weefsel type om PPI's te bestuderen, omdat embryo's gemakkelijk in grote hoeveelheden kunnen worden verzameld, en ook omdat de meeste genen (> 88%) uitgedrukt worden in de loop van de embryogenese, waardoor een rijk in vivo omgeving verschaft wordt voor het opsporen van relevante PPI's 3 .

Traditioneel gebruikten biochemische studies in vliegen zeer grote embryo-collecties (100-150 g), zoals die welke nodig zijn voor het zuiveren van functionele transcriptieve lysaten 4 , 5 . Vorige AP-MS studies in Drosophila hadden ook grote hoeveelheden embryo's nodig (5-10 g), omdat ze vertrouwden op een tweestapszuiveringsbenadering zoals tandemaffiniteitszuivering (TAP), met het bijbehorende verlies van materiaal bij elke stap 6 . Grote amounTs van het uitgangsmateriaal moest het opzetten van embryo-collecties in grote populatiekooien, die zowel duur als commercieel gekocht kunnen worden en tijdrovend zijn om 7 , 8 , 9 te onderhouden en te reinigen.

Recente vooruitgang in de ontwikkeling van een-stap-affiniteitszuiveringsbenaderingen, evenals de toenemende gevoeligheid van massaspectrometers, hebben de benodigde hoeveelheid uitgangsmateriaal verminderd met een orde van grootte. Met behulp van labels zoals het streptavidine bindende peptide (SBP) of groen fluorescerend eiwit (GFP) en vanaf minder dan 1 g embryo's, is het mogelijk om de hoeveelheden aas eiwit en interactie componenten te isoleren die voldoende zouden zijn om te identificeren door Massaspectrometrie 10 , 11 .

Het doel van het protocol dat hier wordt gepresenteerd, is om de onderzoekers overco te helpenMij ​​een waargenomen belemmering voor biochemische analyse van PPI's in vivo . Daartoe bieden wij een eenvoudige en goedkope procedure voor het verzamelen van Drosophila embryo's op middelgrote schaal (0,5-1 g), gevolgd door een stap bereiding van eiwitten van hele cellen die geschikt zijn voor latere analyse door AP-MS of andere benaderingen . Onze methode is gebaseerd op het gebruik van op maat gemaakte 1-L of 5-L populatiekooien die gemakkelijk door elk laboratorium kunnen worden geproduceerd. Bovendien zijn de hier getoonde extractie condities in verschillende studies gevalideerd, zowel in gekweekte cellen als in vivo 10 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Voorbereiding van 5 L Vliegkooien (om 15 cm Platen aan te passen)

  1. Verkrijg de benodigde materialen: 5-kwart (4,7-L) houder met deksel (afbeelding 1A ), nylon gaas en een scheermesje.
  2. Merk een cirkel met een diameter van 12 cm en snijd een gat in de bodem van de container met behulp van het scheermesje ( figuur 1B ). Knip een gat van 15 cm in het deksel ( figuur 1C ).
  3. Snijd nylon mesh in 25 x 25 cm vierkantjes.
  4. Plaats het gaas over de bovenrand van de houder en druk met de deksel af ( Figuur 1C ). Zorg ervoor dat het gaas dicht is en dat de deksel niet gekanteld is. De kooi is klaar om met vliegen te worden gevuld (zie stap 5.3).

2. Voorbereiding van 1 L Vliegkooien (om 10 cm Platen aan te passen)

  1. Verkrijg de benodigde materialen: een elektrische boor, een 3 inch (76 mm) snijgereedschap ( Figuur 1E en FIgure 1F), een rechtzijdige 1 liter plastic pot met deksel, nylon gaas, een scheermesje, schuurpapier, bril en werkhandschoenen.
  2. Knip 3 inch (76 mm) gaten in de bodem en deksel van de plastic pot ( Figuur 1G ), met de deksel stevig vastgeklemd op de houder tijdens het boren. Plaats het snijgereedschap in het midden van de cirkel wanneer u een gat gaat maken.
    Let op: Draag oogbescherming en werkhandschoenen tijdens deze stap.
  3. Maak de randen van de gaten glad met een scheermesje en schuurpapier.
  4. Snijd nylon mesh in 18 x 18 cm vierkantjes.
  5. Plaats het gaas over de bovenste rand van de pot en draai het vast door het deksel aan te draaien ( Figuur 1G ). Zorg ervoor dat het gaas dicht is en dat de deksel niet gekanteld is. De kooi is klaar om met vliegen te worden gevuld (zie stap 5.3).

3. Bereiding van Appelsap (AJ) Platen

  1. Voeg 19 g agar en 1 L van 18,2 MΩ · cm water toe in een 2 L-fles.Voeg een roerbalk toe en meng kort.
  2. Autoclaaf gedurende 30 minuten. Ondertussen ontdooit 100% appelsapconcentraat uit bevroren voorraad en berei 10 ml 10% (gewicht / volume) methyl 4-hydroxybenzoaatoplossing in ethanol op.
  3. Begin na het autoclaven de agar op een roerplaat te mengen en voeg 80 ml 100% appelsapconcentraat en 10 ml 10% (gewicht / volume) methyl 4-hydroxybenzoaatoplossing toe aan de fles. Laat afkoelen bij kamertemperatuur met constant mengen.
  4. Giet 15 cm Petrischalen (voor 5 liter kooien) of 10 cm Petrischalen (voor 1 liter kooien), zodat het agariveau in elke schotel ongeveer 5 mm dik is. Laat het bij kamertemperatuur stollen en wikkel in plastic zakken. AJ-platen kunnen gedurende twee weken bij 4 ° C worden opgeslagen.
    Opmerking: Petrischotels kunnen worden gewassen en hergebruikt.
  5. Bereid de natte gistpasta op: doe wat actieve droge gist in een 100 ml container met een deksel die gemakkelijke mengen mogelijk maakt en water in kleine hoeveelheden bij roeren toevoegen om een ​​dikke maar grondig gemengdeplakken. Bewaar bij 4 ° C gedurende maximaal 2 weken.

4. Bereiding van Lysis Reagentia

  1. Bereid 5x lysisbuffer op: 250 mM Tris pH 7,5, 25% glycerol, 1% octylfenoxypoly (ethyleenoxy) ethanol (IGEPAL CA-630), 7,5 mM MgCl2, 625 mM NaCl, 125 mM NaF, 5 mM Na3VO4.
    1. Om 200 ml te maken: los 1 g NaF poeder en 184 mg Na 3 VO 4 poeder in 71 ml water los met constant roeren. Voeg 50 ml 1 M Tris pH 7,5, 2 ml 100% IGEPAL, 1,5 ml 1 M MgCl2 en 25 ml 5 M NaCl toe. Voeg vervolgens 50 ml glycerol toe (voeg het laatste toe) en blijf 1 uur roeren.
    2. Filtersteriliseren met behulp van 250 ml filtereenheden. Deze stap kan traag zijn, maar het oplossen van filters is belangrijk om onoplosbare deeltjes te verwijderen. Aliquot met 10 ml in 50 ml buizen en opslaan bij -80 ° C.
  2. Bereid 1 M dithiothreitol (DTT) oplossing in water. Bewaar bij -20 ° C in 1 ml porties.
  3. Verkrijg proteAse-inhibitor cocktail tabletten, met ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA). Bewaren bij 4 ° C.
  4. Verkrijg 10 ml spuiten en spuitfilters: 26 mm diameter, surfactantvrij celluloseacetaat (SFCA) membraan, 0,45 μm poriegrootte.

5. Verzameling van vliegenembrooien

  1. Versterk de transgene vlieglijnen die het getekende eiwit van belang in flessen (ongeveer 100 vliegen per fles) vervoeren en de flessen elke 2 dagen overbrengen tot 25-30 flessen worden verzameld voor elke vlieglijn. Versterk de besturingsvoorraad ( bijv. De yw lijn) op een vergelijkbare manier.
  2. Warme AJ borden tot kamertemperatuur (ongeveer 1-2 uur, kan overnacht gedaan worden). Gebruik een handschoenvinger, verspreid wat nat gistpasta in het midden van AJ-borden om een ​​ca. 6 cm cirkel voor een 15 cm plaat en een 4 cm cirkel voor een 10 cm plaat.
  3. Verdoof de vliegen met een stroom van kooldioxide met behulp van een standaard Drosophila stage setup, en overdracht naarDe kooien (ca. 15 goed gevulde flesjes per 5 liter kooi, 5 flessen per 1 liter kooi).
    1. Bedek de kooibodem met voorbereide AJ-platen uit stap 5.2 en plak de AJ-plaat aan de kooi met behulp van twee strookjes tape ( figuren 1D en 1H ). Het is handig om de tips van de tape die over de plaat lopen te vouwen om gemakkelijk te peelen bij het vervangen van borden.
    2. Nadat de vliegen zich herstellen van de verdoving, houd de kooien met de platen onderaan en gaas bovenop.
      Opmerking: het is belangrijk om te wachten tot de vliegen volledig herstellen, aangezien ze anders vasthouden aan de AJ-plaat en de gistpasta.
    3. Aan het eind van het experiment, om de kooi voor te bereiden voor het schoonmaken, plaats de kooi in de vriezer gedurende enkele uren. Een paar uur lang in het water in water weken, maakt het schoonmaken makkelijker.
  4. Incubeer de kooien met vliegen bij kamertemperatuur gedurende 2-3 dagen en verander AJ-platen tweemaal per dag. Om de platen te veranderen, draai de kooi ondersteboven,Trek de tape van de plaat af, doe de plaat op de kooi, tik de hele kooi zachtjes op de bank en ruil de oude plaat snel om een ​​nieuwe, probeer de vliegen niet te ontsnappen.
    Opmerking: Vliegen moeten zich aanpassen aan de kooi en zullen het best op dag 3 beginnen. Zij blijven ongeveer 4-5 dagen op piekniveau. Twee 5 liter kooien op de bovenste legcapaciteit kunnen tot 1 g embryo's produceren in een overnight collectie. Gebruik 1 liter kooien voor kleinere experimenten.
  5. Laat vliegen toe om embryo's op verse AJ-borden overnacht (ongeveer 16 uur) of voor elke andere gewenste tijdsperiode te leggen.
  6. De volgende ochtend, merk en weeg gaascontainers voor embryo-inzameling, één per elke gebruikte vliegregel.
  7. Bereid 1x lysisbuffer op met behulp van reagentia uit sectie 4 (Opmerking: 1x lysis-buffer moet direct voor extractie worden bereid): voeg 40 ml water toe aan 10 ml 5x geconcentreerde lysisbuffer (opgeslagen bij -80 ° C) In een 50 ml buis.
    1. Voeg 50 μL van 1 MD toeTT tot een uiteindelijke concentratie van 1 mM, mengen goed en scheiden in twee 50 ml buizen, 25 ml in elk. Aan een van de buizen, voeg een proteaseremmerschakelaar toe en draai gedurende 30 minuten bij 4 ° C. Terwijl de tablet oplost, verzamelen en dechorioneren embryo's (stappen 5.8 tot 6.6). Controleer of de tablet volledig is opgelost, en houd de buffer op ijs.
      Opmerking: De tweede buis van 1x buffer met DTT kan opgeslagen worden bij -80 ° C en vereist alleen de toevoeging van de tablet voor het volgende experiment. 25 ml lysisbuffer is voldoende voor maximaal 2 monsters, waarbij rekening wordt gehouden met latere wassingen tijdens eiwitzuiveringsstappen.
  8. Markeer de AJ-platen op de kooien met de genotypes van de gebruikte vlieglijnen en wissel de borden voor frisse.
    Opmerking: Bij deze stap kan de overtollige gistpasta van de plaat worden geschraapt. Embryo's kunnen op de platen worden gelegd bij 25 ° C of kamertemperatuur om het gewenste venster van de ontwikkelingstijd te verkrijgen.
  9. Voeg genoeg water t toeO dek elke AJ-plaat. Verwijder de embryo's voorzichtig uit de bord met een zachte verfborstel (vlakke kop ongeveer 10 mm breed werkt goed voor grote platen). Giet de embryo's in de eerder gewogen en gemarkeerde maasbak, en laat het overtollige water af.
    1. Indien nodig, voer een tweede spoeling en poetsen van de plaat uit om alle embryo's te verwijderen. Combineer de embryo's van extra plaat (en) voor dezelfde vlieglijn in dezelfde maashouder.
  10. Maak het gaas kort op de handdoeken om het overtollige water te verwijderen.

6. Embryo Dechorionatie

  1. Halfvul een 6 cm Petri-schotel met 50% bleekmiddel (vol / vol oplossing in water).
    Opmerking: Zie belangrijke reacties over bleekmerk in de tabel van materialen en reagentia.
    Let op: Draag handschoenen en voorkom dat u bleekmiddel op kleding krijgt.
  2. Bereid 2 grotere petrischalen met water op.
  3. Dompel de meshcontainer met embryo's in 50% bleekmiddel gedurende 90 s. Tik de maas voorzichtig tijdens de incuBation een paar keer om de embryo's in de bleekoplossing op te schorten.
  4. Aan het eind van de 90 s incubatie was de maasbak in elk van de 2 afwas met water gedurende ongeveer 10 s.
  5. Spoel de maatschouder grondig af met 18,2 MΩ · cm water met behulp van de spuitfles. Was ook de zijkanten en de buitenkant van de gaashouder.
    Opmerking: Na een grondige wassing moet er geen bleekgeur worden gedetecteerd.
  6. Doe de maasbak op papierhanddoeken. Weeg de meshcontainer met de embryo's en trek het gewicht van de lege container in stap 5.6 af. Noteer het resulterende gewicht van de embryo's. Een goede hoeveelheid embryo's om na te streven is 0,5 - 1 g.

7. Bereiding van embryo-extract

  1. Voeg 1 ml lysisbuffer met protease-remmers (van stap 5.7) toe aan een dounceglas homogenisator en houd het op ijs. Breng de embryo's uit de maashouder in de homogenisator.
    Opmerking: Embryo's kunnen worden opgehaald met een vlakke einde oFa metalen spatel of een borstel en direct overgebracht in de buffer. Voer alle stappen uit in dit gedeelte op ijs.
  2. Was de resterende embryo's op het maas af met een extra 1 ml lysisbuffer en voeg het in het homogenisator toe aan het materiaal. Laat de embryo's zich neerzetten op de bodem van de homogenisator, en zorg voor de supernatant zorgvuldig.
  3. Voeg lysisbuffer toe met proteaseremmers (van stap 5.7) naar de homogenisator, met als doel 5-6 ml lysisbuffer per gram embryo's.
  4. Homogeniseer de embryo's met 4-6 strepen met een losse pestle.
    Opmerking: tijdens de eerste slag zal er meer weerstand zijn. Probeer de stamper voortdurend te bewegen om de oplossing te voorkomen.
  5. Homogeniseer de embryo's met 8-10 strepen met een strakke passende stamper.
  6. Incubeer het homogenaat gedurende 20 minuten op ijs.
  7. Breng het homogenaat over in microcentrifugebuizen en centrifuge gedurende 15 minuten bij 4 ° C bij hoge snelheid (ca. 13.000 xg).
  8. AvoidiNa de pellets en de allerlaatste lipidelaag, overstappen de supernatanten in verse microcentrifugebuizen en centrifugeer bij 15 ° C bij 15 ° C bij maximale snelheid (ca. 13.000 xg).
  9. Zuig de supernatanten met 1 ml druppel voorzichtig af en laad deze in gekoelde 10 ml spuiten met 0,45 μm filters vast (voeg de monsters van hetzelfde monster in één injectiespuit toe). Druk alle oplossing in een gelabelde 15 ml buis op ijs. Het extract kan onmiddellijk worden gebruikt voor latere eiwitzuiveringsexperimenten of gesneden in vloeibare stikstof en wordt bij -80 ° C voor toekomstig gebruik gehouden.
    Opmerking: het is beter om de extracten te bevriezen in plaats van de embryo's, omdat tijdens het ontdooien van embryo's proteasen kunnen worden geactiveerd en leiden tot eiwitafbraak.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Om het gebruik van dit protocol in een proteïnecomplex zuiveringsexperiment te illustreren, genereren we een homozygote levensvatbare vlieglijn, arm-EGFP-ERK , die EGFP- gemarkeerde Drosophila extracellulaire signaal-gereguleerde kinase (ERK, gecodeerd door het gerold gen) onder de controle uitdrukken Van een alomtegenwoordig uitgesproken armadillo ( arm ) promotor 18 , 19 . De armpromotor is actief gedurende de meeste stadia van Drosophila embryogenese 19 . Lysaten werden bereid onder toepassing van het beschreven protocol en de expressie van eiwit uit het arm-EGFP-ERK transgeen werd bevestigd door western blotting voor totaal ERK eiwit om gelijktijdig de niveaus van endogene en transgene EGFP-ERK te detecteren, migreren bij 42 kDa en 69 kDa , Respectievelijk ( figuur 2A ). Een enkele band die overeenkomt met niet-aangenomen endogene ER K (42 kDa) werd gedetecteerd in de yw regelleiding . Dit resultaat bevestigt een succesvolle winning van ERK en EGFP-ERK uit embryo's.

Om te testen of ons extractieprotocol geschikt is voor de daaropvolgende zuivering van een gelabeld eiwit, werden extracten van de yw- en arm-EGFP-ERK- vliegen onderworpen aan affiniteitszuivering onder toepassing van GFP-agarose kralen volgens de gevestigde protocollen 10 , 11 . Zilverkleuren van monsters die op een gradiënt SDS-PAGE lopen, lieten een succesvolle zuivering van het aasproteïne, EGFP-ERK ( Figuur 2B ) zien. Naast EGFP-ERK zelf bevatte de experimentele baan extra banden die niet in het controle yw monster werden waargenomen, wat suggereerde dat de zuiveringsprocedure potentiële ERK-interactieve eiwitten herstelde.

"Src =" / files / ftp_upload / 55804 / 55804fig1.jpg "/>
Figuur 1 : Bereiding van populatiekooien. ( A - D ) Een 5-L kooi gemaakt van een plastic container. ( A ) Een startcontainer. ( B ) Onderaanzicht van de 5 liter kooi. ( C ) Bovenaanzicht van 5 liter kooi met mesh bevestigd. ( D ) Gecombineerde 5 liter kooi met een 15 cm appelsapplaat, onderaanzicht. ( E en F) Een 3-inch (76 mm) boorstuk die wordt gebruikt voor het boren van gaten in de 1 liter container. ( G , H ) Een 1 liter kooi. ( G ) Bovenaanzicht van een 1 liter kooi met mesh bevestigd. ( H ) Gecombineerde 1 liter kooi met een 10 cm appelsapplaat bevestigd, onderaanzicht. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2 : Extractie en zuivering van EGFP-ERK uit embryo's. ( A ) Western blot die expressie toont van EGFP-ERK en endogene ERK in een extract bereid uit de transplantaat van de arm-EGFP-ERK . De yw lijn werd gebruikt als een controle. Groen, totaal ERK antilichaam; Rode, molecuulgewichtsmarkering. ( B ) Zilvergekleurde gel die gezuiverd EGFP-ERK en geassocieerde eiwitten toont. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het hier gepresenteerde protocol is een eenvoudige en algemene procedure voor het opbouwen van Drosophila populatiekooien op middelgrote schaal en het maken van eiwitten van hele cellen uit embryo's. De resulterende extracten kunnen worden gebruikt in een verscheidenheid van stroomafwaartse toepassingen, zoals zuivering van eiwitcomplexen op affiniteitsharsen. Het is van cruciaal belang om de extractiestadies op ijs uit te voeren en sterke protease remming te gebruiken, om eiwitafbraak te minimaliseren. Zoals beschreven is het protocol geschikt voor isolatie van de meeste cytoplasmatische en sommige membraan en oplosbare nucleaire eiwitten 6 , 10 , 12 , 15 . Het kan gemakkelijk worden aangepast voor een meer gerichte zuivering van eiwitten uit andere compartimenten, zoals isolatie van minder oplosbare nucleaire eiwitten met behulp van hoge zoutextractie 5 . Zoals vermeld in stap 5.8 kunnen verzameltijden en embryo-verouderingsperioden zijnOpgericht met precieze intervallen om verschillende ontwikkelingsfasen te verkrijgen.

Het is vaak gewenst om vast te stellen dat het gelabelde eiwit van belang wordt uitgedrukt in niveaus die nauw aansluiten op de endogene expressieniveaus, zoals we hebben aangetoond met het gebruik van anti-totaal ERK antilichaam ( figuur 2A ). Als het antilichaam tegen endogeen eiwit niet beschikbaar is, kan de functionaliteit van de constructen worden gecontroleerd door andere analyses, bijv. In een genetisch reddingsexperiment. In de meeste gevallen dient echter een milde overexpressie van het gelabelde eiwit nog steeds in isolatie te zijn van betekenisvolle eiwitcomplexen en kan de extractie en zuivering van "moeilijke" eiwitten in feite gemakkelijker worden.

Het belangrijkste voordeel van dit protocol is de eenvoud en de mogelijkheid om de gehele procedure tegen gematigde kosten op te zetten. Een bijkomend voordeel van het gebruik van kleinere kooien is dat meerdere transgene lijnen kunnen worden opgezet en geanalyseerd in paralleL, die mogelijk niet haalbaar is bij het gebruik van grotere kooien. De vliegkooien die we hier beschrijven kunnen gemakkelijk worden gereinigd en hergebruiken voor jaren. In plaats van 1-L-kooien uit Nalgene-potten te maken zoals beschreven, is het mogelijk om andere beschikbare containers te gebruiken, zoals een kleinere versie van de 5-L-container.

We hebben dit protocol succesvol gebruikt (of zijn variaties met kleine wijzigingen) voor het zuiveren van complexen die verschillende signaleringsproteïnen en bijbehorende componenten bevatten, gevolgd door analyse door massaspectrometrie 6 , 10 , 15 . Deze benaderingen hebben geleid tot de identificatie van nieuwe PPI's die verder werden gevalideerd in functionele studies 10 , 15 . Variaties van het hier gepresenteerde protocol zijn eerder gebruikt om de fosfoproteoom in Drosophila embryogenese 20 te analyseren en het landschap te bestuderenVan ubiquitinatie bij neurale ontwikkeling 21 , 22 . Deze procedure vertegenwoordigt daarom een ​​handige gateway voor het analyseren van PPI's in vivo , en is bruikbaar voor andere proteomische toepassingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

De auteurs bedanken leden van het laboratorium Veraksa voor nuttige opmerkingen over het manuscript en suggesties voor protokolverbeteringen. AV werd ondersteund door de NIH-subsidies GM105813 en NS096402. LY werd ondersteund door de universiteit van Massachusetts Sanofi Genzyme Doctoral Fellowship.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Leaktite 5-Qt. Natural Multi Mix Container (Pack of 3) Home Depot 209330 For making 5-L cages.
Leaktite 5-Qt. Natural Multi Mix Lid (Pack of 3) Home Depot 209320 Diameter 8.37 in. Lids for 5-L cages.
Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 100 x 15 mm Fisher Scientific FB0875712 Material: Polystyrene. To be used with 1-L cages.
Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 150 x 15 mm Fisher Scientific FB0875714 Material: Polystyrene. To be used with 5-L cages.
Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 60 x 15 mm Fisher Scientific FB0875713A Material: Polystyrene. Used during embryo dechorionation.
Sefar NITEX nylon mesh Sefar 03-180/44 180 micron, 44% open area, used for fly cages.
Milwaukee 3 in. Hole Dozer Hole Saw with Arbor Home Depot 49-56-9670 3 inch cutting tool for making 1-L cages.
Nalgene Wide-Mouth Straight-Sided PMP Jars with White Polypropylene Screw Closure Fisher Scientific 11-823-33 For making 1-L cages. Thermo Scientific cat # 21171000. Alternative 1-L containers can be used.
Red Star Active Dry Yeast, 2 pound pouch Red Star  can be purchased from Amazon.com or other suppliers.
Frozen 100% Apple Juice Concentrate  can be purchased from a grocery store. Has to say "100% apple juice" on the can.
Methyl 4-hydroxybenzoate Acros Organics AC126965000 also known as methylparaben or Tegosept. Used as a preservative in AJ plates.
IGEPAL CA-630 for molecular biology, 100 ml Sigma I8896 used for preparing lysis buffer.
Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with CN Membrane  Fisher Scientific 09-740-2A 0.2 μm pore size. Used for filtering 5x lysis buffer. Thermo Scientific cat # 1260020.
CO-RO ROCHE cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Sigma 11697498001 Vial of 20 tablets. Used for protease inhibition in lysis buffer.
Corning SFCA syringe filters  Fisher Scientific 09-754-21 SFCA membrane, diameter 26 mm, pore size 0.45 μm. Used for filtering final extract samples.
BD Luer-Lok Disposable Syringes without Needles Fisher Scientific 14-823-2A for filtering final extract samples. BD cat # 309604.
Bleach Clorox used for embryo dechorionation at 50% (vol/vol) in water, can be purchased at any supermarket. It is important to use the Clorox brand, as other brands may result in incomplete dechorionation or may be toxic for embryos.
Corning Costar Netwell Plates Fisher Scientific 07-200-213 mesh containers for embryo collections. 74 μm mesh size, 6-well.
Wheaton Dounce Tissue Grinders, capacity 15 ml Fisher Scientific 06-435B homogenizer for embryos, with loose and tight pestles. Wheaton cat # 357544.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Veraksa, A. Regulation of developmental processes: insights from mass spectrometry-based proteomics. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 723-734 (2013).
  2. Gavin, A. C., Maeda, K., Kuhner, S. Recent advances in charting protein-protein interaction: mass spectrometry-based approaches. Curr Opin Biotechnol. 22 (1), 42-49 (2011).
  3. Arbeitman, M. N., et al. Gene expression during the life cycle of Drosophila melanogaster. Science. 297 (5590), 2270-2275 (2002).
  4. Soeller, W. C., Poole, S. J., Kornberg, T. In vitro transcription of the Drosophila engrailed gene. Genes Dev. 2 (1), 68-81 (1988).
  5. Kamakaka, R. T., Kadonaga, J. T. The soluble nuclear fraction, a highly efficient transcription extract from Drosophila embryos. Methods Cell Biol. 44, 225-235 (1994).
  6. Kyriakakis, P., Tipping, M., Abed, L., Veraksa, A. Tandem affinity purification in Drosophila: The advantages of the GS-TAP system. Fly (Austin). 2 (4), 229-235 (2008).
  7. Shaffer, C. D., Wuller, J. M., Elgin, S. C. Raising large quantities of Drosophila for biochemical experiments. Methods Cell Biol. 44, 99-108 (1994).
  8. Sisson, J. C. Culturing large populations of Drosophila for protein biochemistry. CSH Protoc. 2007, (2007).
  9. Caravaca, J. M., Lei, E. P. Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage. J Vis Exp. (109), (2016).
  10. Yang, L., et al. Minibrain and Wings apart control organ growth and tissue patterning through down-regulation of Capicua. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (38), 10583-10588 (2016).
  11. Neumuller, R. A., et al. Stringent analysis of gene function and protein-protein interactions using fluorescently tagged genes. Genetics. 190 (3), 931-940 (2012).
  12. Veraksa, A., Bauer, A., Artavanis-Tsakonas, S. Analyzing protein complexes in Drosophila with tandem affinity purification-mass spectrometry. Dev Dyn. 232 (3), 827-834 (2005).
  13. Mukherjee, A., et al. Regulation of Notch signalling by non-visual beta-arrestin. Nat Cell Biol. 7 (12), 1191-1201 (2005).
  14. Gilbert, M. M., Tipping, M., Veraksa, A., Moberg, K. H. A Screen for Conditional Growth Suppressor Genes Identifies the Drosophila Homolog of HD-PTP as a Regulator of the Oncoprotein Yorkie. Dev Cell. 20 (5), 700-712 (2011).
  15. Anjum, S. G., et al. Regulation of Toll Signaling and Inflammation by beta-Arrestin and the SUMO Protease Ulp1. Genetics. 195 (4), 1307-1317 (2013).
  16. Degoutin, J. L., et al. Riquiqui and minibrain are regulators of the hippo pathway downstream of Dachsous. Nat Cell Biol. 15 (10), 1176-1185 (2013).
  17. Zhang, C., et al. The ecdysone receptor coactivator Taiman links Yorkie to transcriptional control of germline stem cell factors in somatic tissue. Dev Cell. 34 (2), 168-180 (2015).
  18. Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
  19. Vincent, J. P., Girdham, C. H., O'Farrell, P. H. A cell-autonomous, ubiquitous marker for the analysis of Drosophila genetic mosaics. Dev Biol. 164 (1), 328-331 (1994).
  20. Zhai, B., Villen, J., Beausoleil, S. A., Mintseris, J., Gygi, S. P. Phosphoproteome analysis of Drosophila melanogaster embryos. J Proteome Res. 7 (4), 1675-1682 (2008).
  21. Franco, M., Seyfried, N. T., Brand, A. H., Peng, J., Mayor, U. A novel strategy to isolate ubiquitin conjugates reveals wide role for ubiquitination during neural development. Mol Cell Proteomics. 10 (5), (2011).
  22. Ramirez, J., et al. Proteomic Analysis of the Ubiquitin Landscape in the Drosophila Embryonic Nervous System and the Adult Photoreceptor Cells. PLoS One. 10 (10), 0139083 (2015).

Tags

Ontwikkelingsbiologie Uitgave 123 extract lysaat eiwit, Fruitvlieg embryo proteomics middelgrote schaal zuivering kooi
Middelgrote voorbereiding van<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryo Extracten voor Proteomische Experimenten
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yang, L., Paul, S., DuBois-Coyne,… More

Yang, L., Paul, S., DuBois-Coyne, S., Kyriakakis, P., Veraksa, A. Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments. J. Vis. Exp. (123), e55804, doi:10.3791/55804 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter