Summary
الجينات الأساسية للبقاء على قيد الحياة تشكل عقبات تقنية لإنشاء خطوط المسخ. قفزات واسعة تلتف الفتك بالجمع بين الجينوم التحرير مع زرع الخلايا البدائية خلق الحيوانات البرية من نوع تحمل طفرات الخط. قفزات واسعة ويسمح أيضا بكفاءة توليد طفرات فارغة متماثل في الجيل1 و. ويتجلى هنا، خطوة الزرع.
Abstract
هو التعجيل بإنشاء خطوط متحولة عن طريق تحرير الجينوم التحليل الجيني في العديد من الكائنات الحية. أساليب كريسبر/Cas9 وقد تم تكييف للاستخدام في الضفدع المخالب الأفريقية، النمو، كائن طراز القديم للبحوث الطبية الحيوية. وقد نظم التربية التقليدية لخلق خطوط متحولة متماثل مع الطفرات كريسبر/Cas9--استهدفت عدة خطوات شاقة وتستغرق وقتاً طويلاً. تيسيرا تخليق أجنة متحولة، لا سيما التغلب على العقبات المرتبطة بانقطاع الجينات التي لا غنى عنها ل embryogenesis، وضعت طريقة جديدة تسمى قفزات واسعة. هذا الأسلوب روافع متانة النمو الأجنة "قص ولصق" أساليب الجنينية. قفزات واسعة يستخدم نقل الخلايا الجرثومية الأساسية (بجكس) من الأجنة موتاجينيزيد كفاءة الجهات المانحة إلى الأخوة والأخوات أبلاتيد PGC wildtype. يسمح هذا الأسلوب للطفرة كفاءة الجينات الأساسية عن طريق إنشاء تشيميريك الحيوانات مع خلايا جسدية wildtype التي تحمل الفعل المسخ. عندما تقل اثنين من الحيوانات0 و "زرع قفز" هي إينتيركروسيد (أي، متحولة الخلايا الجرثومية)، وأنها تنتج متماثل، أو مجمع متخالف، فارغة و1 الأجنة، مما يوفر وقت جيل كامل للحصول على البيانات المظهرية. قفزات واسعة كما يوفر نهجاً جديداً لتحليل الجينات تأثير الأم، التي صهر لتحليل المظهرية0 و بعد الطفرات كريسبر/Cas9. هذه المخطوطة تفاصيل أسلوب القفزات، مع التركيز بوجه خاص على كيفية إجراء زرع PGC بنجاح.
Introduction
وقد كيف بالنمط الوراثي ترميز النمط الظاهري مسألة رئيسية في علم الأحياء منذ إعادة اكتشاف قوانين مندل. فهم أدوار الجينات وتنظيمها والتفاعلات داخل شبكات الجينات، ووظائف المنتجات المشفرة بالوعود تقديم أدوات للكشف عن الأحياء الجديدة وتحسين المرض الدول. لأكثر من نصف قرن1، كان الضفدع الأفريقية المخالب، النمو، نموذجا رائدا للدراسات بشأن طائفة واسعة من المواضيع في البيولوجيا الأساسية والطب الحيوي، بما في ذلك عنصر التحكم الوراثي للتنمية. تاريخيا، استخدمت معظم البحوث بشأن النمو الضفدع اللوتيترابلويد، X. laevis، ولكن في الآونة الأخيرة، وضعت بسبب ما ديبلويدي، X. tropicalis كنموذج وراثية البرمائية. وقد تم تجميع تسلسل الجينوم الكامل من كل الأنواع النمو 2،3. "المجتمع الضفدع" الآن في نقطة تحول حيث تسمح تقنية تعديل الجينوم الأساسي دراسة وظيفة الجينات، وتقريبا في الإرادة. برمجة كريسبر/Cas9 اندونوكليسيس جعلت الطفرات الجينات ذات كفاءة عالية، مع الطفرة بياليليك ممكن في معظم الخلايا الحيوانية4،5،،من67، 8،9،،من1011. هذه الدراسات، وأبرز بهاتاشاريا et al. 12 وشيجيتا et al. 13، قد أظهرت أن الدالة العديد من الجينات يمكن أن يدرسها الطفرات في و0 فسيفساء الحيوانات. وهذا النهج له العديد من المزايا؛ ومع ذلك، عرض الأجنة Cas9-سجرنا-ميكروينجيكتيد غالباً ما تعمل متغير بسبب فقدان وظيفة (LOF) غير مكتملة. الأهم من ذلك، توليد خطوط متحولة مفيد جداً لبعض التطبيقات – وبخاصة عند دراسة الجينات التي لها مساهمة مرناً النفاسية. مرناس الأمهات والبروتينات، وتأثيراتها على التخلق، تستمر لفترة طويلة في امبريوجينيسيس14،،من1516، تقديم المساهمات الإنمائية المبكرة العديد من الجينات صهر للتحليلات و0 . ولذلك، نهج LOF أخرى مطلوبة.
عندما تسعى إلى إنشاء خطوط متحولة، والمسار للحصول على الأجنة LOF متماثل قد عدة عقبات. يمكن أن تكون الطفرات أولاً، تتسم بالكفاءة لإنتاج طفرات بياليليك غير ملائم نظراً لفقدان وظائف الجينات الأساسية يؤدي إلى الفشل في البقاء على قيد الحياة إلى مرحلة النضج الجنسي، تتداخل مع إنتاج خط قابلة للحياة. حل مشترك هو المعايرة الدقيق مقدار Cas9-سجرنا تسليمها. هنا، أن الهدف تحقيق توازن بين خفض الفتك مع تعظيم كفاءة الطفرات germline أيضا. ظهرت مشكلة ثانية من نظام تربية قياسية، حيث يتم تأجيل تحليلات المظهرية إلى الجيل2 و. استخدام النهج الموحدة، ناضجة جنسياً و0 الحيوانات التي تنقل المسخ الآليلات من خلال الخط يتم أووتكروسيد لإنتاج و1 متخالف "ناقلات"، التي تزرع ثم إلى مرحلة النضج الجنسي. ثم يتم إينتيركروسيد اثنين heterozygotes1 و إنتاج و2 أجنة المسخ في تردد مندلية المتوقعة بنسبة 25%. وهكذا، جيلين تربية ضرورية لتحليل تعمل المسخ. يمكن أن تكون الحيوانات المسخ homozygotes أو heterozygotes المركب (أي ذرية تحتوي على اثنين من الآليلات المختلفة المسخ، الذي يعتمد على الأنماط الجينية للحيوانات الأبوية المستخدمة في إينتيركروس1 و).
ويمكن التغلب على هذه العقبات بقصره للبرمجة نوكلاس بوساطة الطفرات في الخلايا الجرثومية، الذي يكمن وراء طريقة جديدة تسمى الوثب17. قفزات واسعة بعنصرين رئيسيين هما: (1) microinjection مرناً Cas جنبا إلى جنب مع سجرنا، أو مجمعات سجرنا nuclease (أو في مبدأ أو تالينس أو الزنك nucleases الإصبع) مرحلة وحيدة الخلية كفاءة موتاجينيزي الجينوم الجنينية، تليها (2) زرع بجكس إلى أجنة الأخوة wildtype، حيث أزيلت بجكس الذاتية. يمكن الحصول على كل الخطوات عند استبدال الخط كاملة، وكفاءة مع الخلايا الجرثومية المسخ. أظهر بلاكلير في أوائل الستينات أن يمكن زرع بجكس النمو بين الأجنة في نارولا الراحل وأوائل تايلبود مراحل18،19. للقفزات، تعديل النهج الذي بلاكلير بالقيام عمليات الزرع في مرحلة البلاستولا17، عندما يتم ترجمة بجكس في القطب فيجيتال20،الجنين21. وقد زرع قبل gastrulation اثنين من المزايا الرئيسية. أولاً، تم العثور على انجرافتمينت لعمليات زرع الأعضاء والتطور الطبيعي اللاحقة لتكون أكثر فعالية عندما يتم زرع الأعضاء في مرحلة البلاستولا (الملاحظات غير منشورة). ثانيا، عن طريق إجراء عمليات الزرع في مرحلة البلاستولا بعد وقت قصير من النسخ زيجوتيك وقد بدأ، واحد تجنب الفتك الناشئة عن الجينات الإنمائية الطفرات التي تعطل gastrulation أو خلاف ذلك يؤدي إلى تالف نارولا أواخر. وتزرع PGC الحاملة لزرع الأجنة ("تخطي") إلى مرحلة النضج الجنسي، وإينتيركروسيس بين هذه الحيوانات0 و قد أثبتت أنه في كثير من الحالات، عرض 100 ٪ ذرية1 و النمط الظاهري LOF (معظم يجري مجمع heterozygotes)، التي تشير إلى استبدال الخط كاملة مع التحولات المستهدفة.
ومن المتوقع أن القفزات سوف تعجل بالنهج الوراثية في النمو. قفزات واسعة كما يوفر بديلاً ل أسلوب "مضيفة نقل"22 لتحليل LOF للأمهات تأثير الجينات (الملاحظات غير منشورة). في المنشور الحالي، يرد وصف مفصل للطريقة، وتركز بصفة خاصة على زرع PGC، في X. tropicalis (مع تعديلات طفيفة ل X. laevis). ويتجلى زرع بجكس هنا لتسهيل نقل هذه التكنولوجيا أكثر سرعة إلى مختبرات أخرى تعمل مع النمو. ينبغي أن تكون مبادئ هذا الأسلوب الناجح في البرمائيات الأخرى (مثلاً، أوروديليس)، والتعديلات الخاصة بالكائن الحي في المنهجية التي ينبغي أن تسمح بالتطبيق للعديد من الحيوانات الأخرى التي يمكن تحقيق كفاءة الطفرات و بجكس سهولة الأولى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
جميع الأساليب الموصوفة هنا أقرتها لجنة الاستخدام من جامعة كاليفورنيا في إيرفين ورعاية الحيوان المؤسسية.
1-الأعمال التحضيرية لزرع PGC
- إعداد أدوات تشريح مسبقاً، كما هو موضح سابقا23.
ملاحظة: يتم استخدام السكاكين شعر الحواجب جعل شقوق بالمساعدة من حلقة الشعر استقرار الجنين أثناء إجراء العمليات الجراحية. الشعر الحاجب والشعر الحلقات لصقها في زجاج البورسليكات باستور الممصات التي قد وضعت أولاً في لهب وكسر في الجزء ضعفت (انظر الشكل 1A، رأس السهم) لإنشاء تلميح أقصر وأضيق (الشكل 1B) لمهارة أكبر عند إجراء العمليات الجراحية. - إنشاء سجرناس باستخدام الإجراءات الموصوفة سابقا24 .
ملاحظة: بإيجاز، قصيرة الحمض النووي الترميز سجرناس يتم إنشاء قوالب باستخدام ديوكسيوليجونوكليوتيديس المتداخلة التي تحتوي على "ملء" و 5 ' عاثية T7 المروجين، التي هي تعتيق بوليميراز الدنا خالية من الأخطاء، والحرارة. في المختبر سجرنا التوليف التفاعلات هي المحتضنة لعدة ساعات بين عشية وضحاها (اعتماداً على عدة المستخدمة). ردود الفعل المعالجة الدناز لإزالة القالب. يتم تنقيته سجرناس بالأساليب القياسية للفينول/كلوروفورم الاستخراج والأمونيوم اسيتات/الايزوبروبانول هطول الأمطار، وفقا لإرشادات الشركة المصنعة مجموعة24. - قبل وقت قصير من أداء ميكروينجيكشنز، إعداد مجمعات سجرنا Cas9 بأول يشوه ~ 250 نانوغرام سجرنا في ميليلتر 3 إجمالي حجم رناسي خالية (المعالجة ديثيلبيروكاربوناتي) ح2س في 60-65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، تليها التبريد السريع على الجليد لمدة 5 دقائق. الطرد المركزي في سجرنا لبضع ثوان وإضافة 1 ميليلتر من 1 ميكروغرام/ميليلتر Cas9 البروتين واحتضان لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية لتعزيز تشكيل معقدة.
ملاحظة: بعد هذا الاحتضان، الأنبوب يمكن الاحتفاظ على الجليد بينما كان يستعد الأجنة ل microinjection. - الحصول على X. tropicalis الأجنة عن طريق الإخصاب في المختبر باستخدام الأساليب القياسية، كما هو موضح سابقا25. إزالة جيلي،من2526 الأجنة في إخصاب بعد 10 دقائق.
ملاحظة: يعتبر وقت الإخصاب الوقت بعد تعليق الحيوانات المنوية إضافة للبيض والطبق طوفان 1/9thX مارك قارعو الأجراس تعديل (MMR)26. لإجراء X. tropicalis25، خلافا X. laevis، في جيليينج دي في 1/9 x MMR التي تحتوي على 3% سيستين مجاناً قاعدة (لا الملح HCl)، الأس الهيدروجيني تعديلها إلى 7.8-8.0، تليها يغسل المتعددة في 1/9 x MMR. نقل الأجنة إلى [اغروس] (1%)-طبق المغلفة التي تحتوي على 1/9 x MMR في درجة حرارة الغرفة. - نقل الأجنة بالحقن لطبق [اغروس] المغلفة 1% الذي يحتوي على 1 على الفور x MMR باستخدام ماصة باستور.
-
حقن في المرحلة 1-الخلية. راجع مراجع26،27 أوصاف مفصلة لأساليب microinjection النمو .
- حقن كل الأجنة في موقع واحد في القطب الحيواني، مع 4 nL مجمع Cas9-سجرنا (المبلغ النهائي = 1 نانوغرام Cas9 وجزء من الغرام ~ 250 من سجرنا؛ انظر المناقشة)24. بعد 10-20 دقيقة لحقن الموقع الشفاء، نقل الأجنة طبق [اغروس] المغلفة التي تحتوي على 1/9 x MMR واحتضان عند 25 درجة مئوية. أيضا إنشاء طبق من الأخوة أونينجيكتيد الأجنة التي ستكون بمثابة متلقي الاختلاس.
-
إعداد لوحات بيتري (60 ملم) التي تحتوي على مم ~ 5-طبقة سميكة من 1% [اغروس] في 0.3 x MMR، إذا كان القيام بعمليات الزرع في X. tropicalis، أو 1 x MMR ل X. laevis.
- إنشاء المنخفضات ~ 3-4 مم العميقة بإدراج 3-x 4-البئر العفن (تم إنشاؤه عن طريق خفض صفيحة بكر 96-جيدا) في المنصهرة [اغروس] عند سكب اللوحات (انظر الشكل 1 و دال). عقد العفن عدة ملليمترات فوق الجزء السفلي من صحن بيتري استخدام المشبك تعلق على موقف خاتم حتى قد تصلب [اغروس].
- بالإضافة إلى ذلك، جعل لوحة 24-جيدا للأجنة الفردية بيت بطلاء الآبار مع طبقة رقيقة من 1% [اغروس] في 1/9 x MMR.
ملاحظة: هو المتوسط الثقافة إضافة إلى هذه الآبار x 1/9 MMR تستكمل مع 50 ميكروغرام مع الجنتامايسين كبريتات/مل.
2-زرع بجكس
- عند الأجنة فقط الوصول إلى نيووكوب وإبر28 البلاستولا المرحلة 9 (الشكل 2A)، ح ~4.5 بعد الإخصاب (hpf) ل X. tropicalis، إزالتها من حاضنة 25 درجة مئوية، والسماح لهم بحجته إلى درجة حرارة غرفة إضافية ح 0.5.
- للبدء زرع 5 هبف (الشكل 2)، استخدم ماصة باستور نقل أحد الأجنة المانحة PGC (حقن Cas9-سجرنا) للطبق [اغروس] 60 ملم تحتوي على منخفضات (تم إنشاؤه في الخطوة 1، 7) في 0.3 x MMR (أو 1 x MMR في حالة استخدام X. laevis). كما نقل أحد الأخوة أونينجيكتيد الجنين، المستلم الاختلاس، لهذا الطبق.
ملاحظة: من المهم أن لا يتم الخلط هويات كل من هذه الأجنة. - يدوياً إزالة المغلفات فيتيلين من كل الأجنة باستخدام الملقط وتدوير كل الأجنة حيث تكون أقطاب فيجيتال بهم في العرض ويمكن الوصول إليها لإجراء عملية جراحية.
ملاحظة: وصف فيتيلينيشن دي اليدوي من الأجنة قد سبق وصف26. - استخدام تلميح حادة سكين الشعر الحاجب، جعل أربعة شقوق ضحلة على شكل مربع في القطب فيجيتال الجنين المتلقية، داخل المنطقة حيث سوف تشكل الخلايا زجاجة مستقبلا بوضع علامة بلاستوبوري. جعل الشقوق بإدراج غيض السكين شعر الحاجب في الجنين، فقط تحت السطح، وجعل التصاعدي تقطيع الحركات حين استقرار الجنين مع حلقة الشعر.
ملاحظة: يبين الشكل 2 آراء نباتية للجنين على فترات التابع من 4.5 7.0 هبف لإظهار حجم الخلية وتوفير دليل لتقدير حيث ستشكل الخلايا الزجاجات (دائرة بيضاء متقطع). والهدف جعل شقوق حيث تتم الإشارة إلى مربع أسود متقطع. - حالما يتم تحدد الجوانب الأربعة للمربع شقوق، تعميق كل شق بالسكين شعر الحاجب استخدام الاقتراحات قطع مماثلة للوصول إلى عمق من حوالي 1/3 إلى 1/2 المسافة إلى الكلمة blastocoel.
- مجاناً explant الأنسجة النباتية من الجنين المتلقية (الشكل 3 ألف و ب) بجعل أفقي (الموازية للسطح النباتي) cut(s) في منطقة نباتية عميقة.
ملاحظة: هو حجم explant النباتية المحتوية على PGC حوالي 0.4-0.45 ملم من كل جانب و 0.25-0.3 ملم في العمق. لم يعد هناك حاجة هذا explant نباتية من الجنين المتلقي وينبغي لذلك جانبا لإهمالها. - العمل بسرعة، كرر هذا الإجراء (خطوات 2.4-2.6) على الجنين PGC المانحين إنشاء جزء حجم وبالمثل أنسجة نباتية لزرع الأعضاء.
ملاحظة: من المهم الاضطلاع بهذا التشريح الثاني مع القليل من التأخير لتقليل الوقت للجنين المتلقية للشفاء جرح مفتوح. - حالما تتم إزالة الأنسجة التي تحتوي على بجكس من الأجنة المانحة، استخدام حلقة السكين وحلاقة الشعر الحاجب لنقل هذا اكسبلانت إلى الموقف في افتتاح إنشاؤها في الجنين المتلقية.
ملاحظة: يجب أن تواجه السطح الداخلية للاختلاس المانحة الداخلية للجنين المتلقية. فإنه ليس من الضروري لمطابقة لتوجهات المحاور الظهرية البطني واليسار واليمين للاختلاس مع الجنين المتلقية. - استخدام الحافة الطويلة رمح السكين شعر الحاجب، الذي عقد موازيا لسطح الابتزاز، لاضغط برفق الاختلاس في الافتتاح في السطح النباتي الجنين المتلقية.
- مرة واحدة وضعت الاختلاس، استخدام هايرلوب أو مدخل المنجم سكين شعر الحواجب للشريحة بلطف "الذبيحة" الجنين المانحة عبر السطح [اغروس] وإلى اكتئاب [اغروس]. تأكد من أن تواجه جرح مفتوح من الذبيحة السائل الأكبر. إذا لم يكن الأمر كذلك، استخدم السكين شعر الحواجب لتدوير الجنين إلى تحقيق هذا التوجه.
- الشريحة الجنين المتلقية، مع الاختلاس الشفاء في المكان، إلى اكتئاب المتاخمة وكذلك التأكد من أن تواجه الأنسجة المطعمة فيجيتال القطب السائل الأكبر.
- كرر هذا الإجراء (خطوات 2.1-2.11) باستخدام زوج آخر من البلدان المانحة والمتلقية من الأجنة لإنشاء زوج زرع/الذبيحة آخر؛ نقل هذه المنخفضات فارغة.
ملاحظة: من الأهمية بمكان واحد يجعل تدوينات لتعقب أزواج متماثلة من الذبائح والحاملة لزرع الأجنة. جيف المانحين ستستخدم كوكيل للكفاءة للطفرات التي يسببها سجرنا Cas9 في بجكس المزروعة، التي لا يمكن أن تكون بسهولة جزيئي حتى الحيوانات الحاملة لزرع تصل إلى مرحلة النضج الجنسي (راجع الخطوة 3-3، أدناه، و مناقشة ). - مواصلة إجراء عمليات زرع الأعضاء حتى تصل الأجنة إلى مرحلة gastrula مبكرة حوالي 10، وهو ما يقرب من 6.5 هبف في X. tropicalis (انظر الشكل 2E).
3-بعد شفاء رعاية الأجنة
ملاحظة: شفاء الطعوم في مكانها داخل ~ 30 دقيقة، ومن الطبيعي أن نلاحظ بعض الحطام yolky من تحلل الخلية تنزح من الجنين (الشكل 3).
-
عندما تلتئم، استخدام ماصة باستور إلى بلطف جداً نقل الأجنة من المنخفضات إلى الآبار الفردية من صفيحة 24-جيدا [اغروس] المغلفة. سوف تكون الإفرازات إزالتها (الشكل ثلاثي الأبعاد) بخلط أثناء النقل السوائل.
- قم بتدوير الأجنة حيث أن وضعها نباتية القطب حتى تواجه الحل الأكبر. مرة أخرى، ضع جيف المانحين و graft المستلمين في الآبار المجاورة للمساعدة في اقتفاء أثر أزواج الجنين؛ تسجيل هذه المعلومات.
- نقل لوحة 24-كذلك تحتوي على الأجنة لحاضنة 25 درجة مئوية للثقافة بين عشية وضحاها.
ملاحظة: في اليوم التالي، الأجنة سوف وصلت إلى مراحل تايلبود. - نقل المستلمين الابتزاز لتنظيف لوحات 6-جيدا [اغروس] المغلفة التي تحتوي على 1/9 x MMR تستكمل مع 50 ميكروغرام مع الجنتامايسين كبريتات/مل، مع الجنين 1 كل بئر. الاحتفاظ بسجل واضح لجثث الجهات المانحة التي تطابق هذه graft المستلمين.
- لتقييم كفاءة الطفرات بتسلسل بكر أمبليكونس5،،من1724 أو باستخدام الأساليب الأخرى التي تعتمد على أمبليكونس بكر (انظر المناقشة)، نقل جثث الفردية إلى 0.2 مل PCR قطاع أنابيب. إزالة أكثر من المتوسط وتجانسه في تحلل 100 ميليلتر المخزن المؤقت24 تتضمن بروتيناز ك (PK) بتكرار بيبيتينج صعودا ونزولاً باستخدام ماصة P200.
- إجراء تحلل الجنين24 في 56 درجة مئوية ل 6 (ح) بين عشية وضحاها إلى تصريح الهضم PK. إلغاء تنشيط PK بتدفئة 90-95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، متبوعاً بالتبريد السريع إلى 4 درجات مئوية. استخدام ليساتيس دون مزيد من خطوات تنظيف للبذور PCR ردود الفعل للحصول على أمبليكونس قصيرة ل تسلسل "الحمض النووي سانجر" مباشرة24. تخزين ليساتيس في-20 درجة مئوية.
ملاحظة: في غضون عدة أيام، سوف تصل إلى مراحل التغذية (المرحلة حوالي 45-46) الضفادع الصغيرة ويمكن تغذية تعليق مسحوق العوالق (الأمصال ميكرون). - بعد أسبوع ~ 1، مع التغيرات اليومية للثقافة المتوسطة الحفاظ على نظافة والتقليل من فرط الميكروبية، نقل الضفادع الصغيرة إلى خزانات صغيرة في تعميم نظام المائية مع تدفق بالتنقيط. استخدام البيانات التسلسل لفصل الضفادع الصغيرة مع بجكس موتاجينيزيد عالية الكفاءة من الضفادع الصغيرة مع انخفاض كفاءة الطفرات. بمجرد اكتمال المسخ، نقل الضفيدعات نظام المائية الكبار في المختبر.
ملاحظة: أنظمة وضعتها المورد النمو الوطني (مختبر البيولوجيا البحرية، وودز هول، ماجستير) تقديم دليل شرغوف التغذية29 والضفدع الكبار صيانة30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
عقب الزرع، ينبغي أن يجري تحديد النوعية لكفاءة الطفرات كريسبر/Cas9 قبل أنفاق الجهد في تربية الحيوانات على النمو والحفاظ على الحيوانات لمرحلة النضج الجنسي. لأن الحيوانات تحمل زرع قفز سوماتيكالي wildtype والفعل يصعب الوصول إليها للقياسات المباشرة، يصبح من المهم إنقاذ جثث الأجنة المانحة. تحليل الحمض النووي من جيف يعمل كوكيل لمدى الطفرات التي تحدث في زرع germline17.
يتمثل أحد النهج لتقييم نجاح الطفرات مباشرة تسلسل بكر أمبليكونس التي تغطي منطقة الجينوم استهدافهم. ويصبح هذا رغبات خاصة مكلفة وغير فعالة في حالة واحدة تسلسل أجزاء الحمض النووي المستنسخة على حدة العديد من العديد من الحيوانات. بدلاً من ذلك، يستخدم التسلسل أمبليكونس غير متجانسة في الموقع المستهدف، كما أنها مشتقة من أجنة فسيفساء وراثيا، لتقييم كفاءة الطفرات في كل جنين19. التصور تشروماتوجرامس يبين تسلسل نوع البرية (قمم) المنبع الهدف تسلسل وقمم تصبح "المجمعة" (أي حدوث المشارك من قمم المقابلة لقواعد متعددة الظهور في كل موضع النوكليوتيدات) المتلقين للمعلومات من موقع فاصل مزدوج-حبلا حفزت Cas9. يمكن الاطلاع على أمثلة لمثل هذه التشكيلات في S1 الغارة الشكل وآخرون. 17-كوانتيتيشن دقيقة لمدى الطفرات التي تمثلها هذه القمم المجمعة يمكن الحصول على استخدام خوارزمية تحلل التسلسل، والمد والجزر (https://tide-calculator.nki.nl/)31. فحص الأجنة الفردية باستخدام هذه التقنية يعطي الثقة أن كل الأجنة بشكل صحيح حقن والمستهدفة للطفرات. يمكن استخدامها للتأكد من نجاح حقن24 الراسم، مثل ديكستران فلوريسسينتلي المعلمة، ويمكن أن تساعد أيضا في أن شرغوف هي في الواقع تقوم بزرع الأنسجة (بيانات غير منشورة). من المهم ملاحظة أن لم تستكشف إمكانية الرسمي أن كوينجيكشن من ديكستران نيون جنبا إلى جنب مع Cas9-سجرنا قد يغير كفاءة الطفرات Cas9. يمكن أن يتم تجاهل أي الأجنة "تخطي" التي تحتوي على عمليات زرع الأعضاء من المانحين سيئة أو أونموتاجينيزيد.
قفزات واسعة تلتف الحاجة إلى تحليل الجيل2 و في المخططات القياسية الإكثار الوراثي، بالسماح بكفاءة تحليلات المظهرية في الأجنة و1 . عند استخدام نهج موحد التحور الجينات الأساسية، معايرة دقيقة لجرعة Cas9-سجرنا مطلوب لضمان بقاء الأجنة مؤسس، نتج عنه كفاءة الطفرات مخفضة. الباقين على قيد الحياة و0 أووتكروسيد الحيوانات من هذا المخطط القياسي ثم مع ويلدتيبيس للحصول على الأجنة1 و قابلة للحياة، التي يتم فحصهم لتحديد شركات النقل. وأخيراً، هذه heterozygotes1 و نمت إلى النضج الجنسي وإينتيركروسيد للحصول على متماثل و2 الأفراد عرض تعمل المسخ. وفي المقابل، نظراً للقفزات تنتج الحيوانات التي لديها الاستبدال الكامل لما جيرملينيس مع الآليلات متحولة، إينتيركروسينج هذه الحيوانات0 و تنتج تعمل المسخ في الجيل1 و. الغارة et al. 17 وذكرت أن أغلبية الحيوانات0 و تستهدف محور التيروزينات (صور)، ومطلوب لتصبغ الخلايا الصباغية والشبكية، وأظهرت انتقال germline 100 في المائة (مقيسا بالتهجين مع صور-/-ألبينو الحيوانات) الجينومات متحولة المستمدة من الجهات المانحة (انظر الجدول 1و الشكل 4A-ب ). وهكذا، إينتيركروسينج اثنين من الحيوانات التي تنتجها الوثابة سيحقق متماثل أو مجمع متخالف المسخ و1 الأجنة.
تم الحصول على نتائج مماثلة17 من إينتيركروسينج و0 تفوقوا الحيوانات تحمل طفرات في هوميوبوكس (ترميز هوميودومين الحمض النووي ملزم) من الجينات جوسيكويد (gsc) (انظر الشكل 4 أ، ج-ح). كنوكدوونس غسك التعبير استخدام العقاقير النوكليوتيد morpholino في X. laevis اقترح أن الجين غسك ضروري لتطوير كامل ل الرأس الأمامي32، و Cas9-سجرنا حقن الضفادع الصغيرة أيضا إظهار تعمل قاتلة الجنينية17. ومع ذلك، تخطي و0 الحيوانات، ويجري سوماتيكالي من النوع المتوحش، قابلة للحياة وقوية، وإينتيركروس1 و إنتاج أجنة مع تعمل LOF مماثلة لتلك التي نشرت في X. laevis كنوكدوونس17. يمكن استخدام مؤيد الوراثية هذه البيانات المقدمة من النمط الظاهري morpholino، فضلا عن دليل على مبدأ أن القفزات للتغلب على تعمل قاتلة الجنينية.
رقم 1: المواد اللازمة للزرع. (أ) البورسليكات الزجاج الماصات باستور تستخدم لجعل السكاكين شعر الحواجب والشعر الحلقات للجراحة الدقيقة في الأجنة في وقت مبكر. الرسم على الزجاج باستخدام موقد بنسن يسمح لحد أضيق لإدراج الشعر. رأس السهم الأحمر يمثل موقف التقريبي الذي كسر الزجاج. (ب) مثال سكين شعر الحواجب (أعلى) وحلقة الشعر (أسفل)، ثابتة في الماصات مع الغراء سريعة الجفاف. (ج) جزء من صفيحة بكر 96-بئر يستخدم لإنشاء المنخفضات في صفيحة [اغروس] بالسماح 1% [اغروس] ترسيخ حول القالب ([اغروس] هو المحرز في 0.3 x أو 1 x MMR، اعتماداً على ما إذا كانت تنفذ الزرع في X. tropicalis أو X. laevis، على التوالي). سمك [اغروس] ~ 5 ملم، مع 3-4 ملم-الآبار العميقة. (د) مثال على صفيحة [اغروس] لزرع الأعضاء، مع 12 المنخفضات، كما هو مبين في لوحة ج. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: مورفولوجيا القطب فيجيتال خلال البلاستولا الراحل للمراحل الأولى جاسترولا واستراتيجية للتشريح- (واو) تظهر الأجنة تروبيكاليس النمو في عرض نباتية في فترات زمنية التابع، ابتداء من مرحلة البلاستولا 9 (4.5 هبف) إلى جاسترولا بداية مرحلة ~10.25 (7 هبف). قبل 5 هبف، بلاستوميريس الكبيرة والتالفة بسهولة أكبر. الأبيض، دائرة متقطعة علامات الموضع المتوقع لتشكيل خلية زجاجة خلال جاستروليشن، التي يمكن أن ينظر إليها تشكل بداية في الجهة الظهرية (أعلى) في الألواح (هاء و واو). للقفزات، تصنع أربعة شقوق داخل مربع، ويصور بخطوط متقطعة السوداء، مع نهائي قطع تقدم مواز لسطح النسيج (لا يتضح) لتحرير explant نباتية. شريط المقياس = 400 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: زرع الأعضاء- (أ) مثال على جنين هبف ~5.5 بعد إزالة الأنسجة النباتية المحتوية على PGC. مربع منقط أسود وأبيض الدائرة المتقطعة هي نفس الأبعاد النسبية كتلك المبينة في الشكل 2. (ب) النباتية explant إزالتها من الجنين في الفريق، السطح الداخلي التي تواجه المشاهد، هو حوالي 0.4-0.45 ملم من كل جانب و 0.25-0.3 ملم في العمق. (ج) جنين بزرع الأنسجة النباتية. تم اقتناء الصورة ~ 10 دقيقة بعد زرع الأعضاء. ويعتبر النسيج (د) 30 دقيقة بعد زرع الأعضاء، نباتية قد تلتئم في مكانة (يحوم لطيف أعلاه سكين شعر الحواجب التي الجنين تم استخدامه لإنشاء دوامة جرفت الحطام ينظر في لوحة ج). بعد التحويل إلى 1/9 × الحصبة والنكاف والحميراء والحضانة عند 25 درجة مئوية، إكمال معظم الأجنة gastrulation عادة. شريط المقياس = 400 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: انتقال الفعل من الحيوانات0 و تنتجها الوثابة. (أ) للقفزات، استهدفت اثنين من الجينات كريسبر/Cas9، التيروزينات (أعلى) و جوسيكويد (أسفل). الجين طير كان المستهدف4،5 ضمن تسلسل الترميز (تظليل أزرق) للطرفي ن إشارة ببتيد (SP، الأحمر التظليل)، في حين كان الجين غسك المستهدفة17 داخل الترميز تسلسل في بداية هوميوبوكس (تظليل أحمر)، الذي هو انقسام بين اثنين exons. غير مترجمة 5 '3' اكسونيك في منطقتي أونشاديد. (ب) "جميع 160 و"1 الضفادع الصغيرة من (انظر أيضا الجدول 1) التزاوج من الذكور و0 تخطي (LF1) والبينو (صور--/--) الإناث كانت ألبينو، مما يدل على أن الخط كامل من الذكور تخطي كان استبدال صور المسخ الخلايا الجرثومية. يظهر اقحم شرغوف البرية من نوع مع عادي تصبغ الشبكية والخلايا الصباغية. (ج-ح) الأجنة1 و المستمدة من إينتيركروس بين اثنين و0 تفوقوا النمو استهداف المورثات هوميوبوكس gsc. حوالي 2/3rds من الأجنة phenotypically متحولة المؤسسة العلمية العالمية، يجري مع النمط الظاهري درجات متفاوتة من اقتطاع الأمامي من الرأس (ح ه). نصف طفرات كانت أما سيكلوبيك أو كان عيون متباعدة عن كثب (F)، بينما كان النصف الآخر إيليس (ح). وأظهرت هذه homozygotes أو heterozygotes مجمع التنميط. 1/3rd الأجنة تظهر البرية من نوع النمط الظاهري (ج، د) هي نوع البرية متماثل أو heterozygotes. التهجين في الموقع otx2 (علامة forebrain و midbrain والعيون) و egr2 (علامة على رهومبوميريس هيندبرين 3 و 5، وتيار من قمة العصبية) hoxb9 (علامة الحبل الشوكي) يبين أن الخسارة في gsc يؤثر على وظيفة فقط الجزء الأمامي من المجال otx2 . وترد هذه البيانات من الغارة et al. 17 مع الحصول على إذن من "الشركة لعلماء الأحياء". الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| الصليب | أنثى | أنثى | ألبينو | نوع البرية | المجموع | ألبينو % |
| 1 | LF1 | صور--/- | 160 | 0 | 160 | 100 |
| 2 | LF2 | صور--/- | 148 | 0 | 148 | 100 |
| 3 | صور--/- | LF3 | 409 | 0 | 409 | 100 |
| 4 | صور--/- | LF4 | 0 | 519 | 519 | 0 |
| 5 | صور--/- | LF5 | 223 | 0 | 223 | 100 |
| 6 | LF6 | صور--/- | 493 | 703 | 1196 | 41.2 |
| 7 | صور--/- | LF7 | 1 | 94 | 95 | 1.1 |
| 8 | صور--/- | LF8 | 125 | 0 | 125 | 100 |
| 9 | صور--/- | LF9 | 0 | 417 | 417 | 0 |
| 10 | صور--/- | LF10 | 252 | 0 | 252 | 100 |
الجدول 1: استبدال germline كفاءة بزرع قفز تحمل طفرات في التيروزينات. استهداف التيروزينات، تم الحصول على الحيوانات الحاملة لزرع الأعضاء من كلا الجنسين. وقد عبرت هذه الحيوانات مع المصابين بالمهق، التي هي متماثل صور-/-، لاختبار كفاءة انتقال germline الآليلات متحولة، والنسبة المئوية للأجنة1 و التي أظهرت كان جزيئي المهق في مرحلة شرغوف. الإدخالات في الأعمدة المسماة "ذكر" و "أنثى" تشير إلى الأصل الذي هو صور-/-أو الحيوان التجارب المستمدة من الوثب (LF). المئة من الأجنة داخل عرض عبر النمط الظاهري ألبينو يرد تحت "% ألبينو." علما بأن 6 من 10 الحيوانات مع زرع قفز أظهرت الاستبدال الكامل (100%) مع الآليلات المسخ. ويرد هذا الجدول من الغارة et al. 17، مع الإذن.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويقدم هذا التقرير يستخدم بروتوكول مفصل لزرع الأنسجة النباتية التي تحتوي على بجكس-"زرع الأعضاء من بجكس" بالتزامن مع تحرير الجينوم التكنولوجيات (مثل، كريسبر/Cas9) لتعديل الفعل حيوان بينما الحفاظ على ما يقرب من جميع الأنسجة الجسدية، كنوع البرية وراثيا. لتجاوز المراحل لتكون ناجحة، هناك عدد من العوامل الحاسمة في الاعتبار قبل تنفيذ عمليات الزرع المنفذ.
لضمان الاستبدال الكامل للفعل مع الآليلات متحولة، من المستحسن واحدة أولاً يحدد الكفاءة في فيفو سجرناس. التجربة تشير إلى أن معظم سجرناس كريسبرديريكت (https://crispr.dbcls.jp/) أو كريسبرسكان (http://www.crisprscan.org/) الذي صممه فعالة عند استخدامها في 250 بيكوغرام/الجنين. ومع ذلك، في بعض الحالات، قد يكون من الضروري استخدام تركيزات أعلى (مثلاً، سجرنا غسك نشرتها17من الغارة وآخرون، مطلوب ~ 1 نانوغرام/الجنين). تقييم كفاءة الطفرات موقع الهدف الضروري واستخدام المد يسمح تقييم كمي31. بينما يستخدم الأسلوب أكد هنا سانجر مباشرة تسلسل أمبليكونس بكر (يمثل سكان الآليلات المسخ في الأجنة و0 ) والعديد من الأساليب الأخرى قد استخدمت في الأدب تحرير الجينوم لهذا الغرض. تشمل التقنيات ذات تكلفة منخفضة إلى متوسطة الأخرى المستخدمة بشكل شائع طول جزء تعدد التحليل باستخدام أما فقدان الإنزيمات تقييد33 أو Cas9/TALEN الانقسام ومواقع34و T7 endonuclease 135 مساح 36 فحوصات، الإنزيم هيتيرودوبليكس تنقل37، مقايسة ذوبان عالية الاستبانة38، تجزئة التحليل بالتفريد الشعرية39،40و41الأساليب المستندة إلى قبكر، 42.
اعتبار ثاني هو اختيار موقع موقع الهدف داخل الجين المستهدف. للسماح باسترداد كفاءة تعمل المسخ في الجيل1 و، من المهم إلى أقصى حد الفرصة لإكمال LOF الآليلات. عند جعل خطوط متحولة باستخدام النهج الكلاسيكي وضع استراتيجية مشتركة لاستهداف الانقسام Cas9 قرب النهاية 5 ' لترميز المناطق، للحصول على إنهاء الترجمة سابقة لأوانها بالقرب من البداية من البروتين ترميز المنطقة. ستحدد heterozygotes1 و مع الطفرات فراميشيفت، ويتم اختيار هذه الحيوانات بمزيد من العمل لأنه من المتوقع أن تحمل الآليلات فارغة. لأنه يستخدم استراتيجية الوثب و0 إينتيركروسيس، سيكون نهج استهداف 5 ' نهاية تسلسل الترميز غير فعالة. و0 الأجنة جيرملينيس الفسيفساء، والنتائج إينتيركروسينج في سكان طفرات1 و التي في الغالب مجمع heterozygotes17. حيث يتحقق التحليل على نطاق واسع، في المتوسط، ~1/3 المتوقعةrd من الطفرات التي تنتجها فواصل حبلا مزدوجة هي في إطار43، معظم الأجنة1 و المنتجة بهذه الطريقة سيكون اليل واحد على الأقل في إطار الطفرة التي قد تحتفظ البرية نوع النشاط. ولذلك، يلزم وجود استراتيجية مختلفة لضمان أن حتى هذه الآليلات المسخ في الإطار من المحتمل أن تكون القيم الخالية. تستهدف مضاعفة حبلا فواصل داخل مجالات قابلة للطي البروتين التي لا غنى عنها لوظيفة البروتين العادي من المتوقع أن يؤدي إلى فرصة أكبر لإكمال LOF (null الآليلات)17،44. النظر بعناية إلى structure(s) الذري مستوى نطاقات البروتين، عندما تكون متاحة، يمكن أن تساعد في تحديد مناطق هيكل الثانوية، حتى عندما تحتوي على حذف في إطار واحد من الأحماض الأمينية، قد يتوقع أن تعطيل (بنية المجال مثلاً، الطفرة Δ3bp في غسك نشرت قبل الغارة وآخرون17). إذا كان يمكن تحديد المواقع المستهدفة كريسبر/Cas9 داخل هذه المناطق، واحد لديه فرصة أكبر للنجاح في خلق الآليلات فارغة. الحذف الصغيرة داخل الحلقات المعرضة المذيب بين مكونات البروتين الهيكلي الثانوية أقل من المرغوب فيه لأن الطفرات في مناطق أكثر مرونة قد لا يزال ينتج البروتينات الوظيفية.
اعتبار ثالث لتجاوز المراحل هو كفاءة إزالة PGC من الجنين المتلقية. هذه الخطوة تحتاج إلى أن تكون فعالة من أجل ضمان استبدال الخط كاملة. ليس واضحا حاليا ما إذا كان يتمتع جميع أجنة المتلقية الاختلاس المنتجة بواسطة الأسلوب الموصوفة هنا إزالة كاملة من بجكس الجامعة-جبل في الموقع هيبريديزيشنز إظهار تغيراتها في ترجمة علامات PGC في مرحلة البلاستولا الأجنة. في كثير من الحالات، كل أو تقريبا كل ما يتم العثور على الإشارة بالقرب من نهاية نباتية أكثر للجنين وذلك سيتم رفعه بالجراحة المذكورة هنا (مداهمات et al.17 والاستشهادات فيه). ولكن تظهر بعض الأجنة PGC علامة التعبير في الخلايا قليلة أقرب إلى الكلمة blastocoel. أولاً يتحول في القطب فيجيتال بعد الإخصاب الجبلة الجرثومية وثم اجتاحت على طول الشقوق الانقسام أثناء الانقسامات المبكرة. قد تصبح موزعة في الخلايا في منتصف نصف الكرة الأرضية النباتية بعض الجبلة الجرثومية ولا يمكن إزالتها دون استخدام عمليات زرع الأعضاء التي تمتد إلى بلاستوكول فعالية. ومع ذلك، من المهم أيضا أن نلاحظ أن هذه الخلايا العميقة التي تحتوي على علامات الخلية الجرثومية قد لا تسهم الفعل، كما هي معروفة ميكرورناس لمسح مرناس PGC من خلايا جسدية45،46. قد تكون هذه الخلايا العميقة تلطيخ إيجابية بالنسبة لعلامات PGC خلايا جسدية تمر بإزالة هذه الألغام. يجري حاليا وضع أساليب لضمان إتمام عملية الإزالة PGC من الأجنة المتلقية.
وأخيراً، من المهم أيضا النظر في كيفية العديد من الحيوانات0 و لتوليد بقفزات واسعة. كما لن تنجو من عدد متغير من الحيوانات لمرحلة النضج الجنسي، من المستحسن أن يتم إنشاء أكثر من 20 من الأجنة التي تحتوي على عمليات زرع الأعضاء. سيكون من الضروري الحيوانات على قيد الحياة ما يكفي لضمان (1) أن أعدادا كافية من كلا الجنسين وسيتم الحصول على و (2) أن يحيل هذه الآليلات المسخ في وتيرة عالية بما فيه الكفاية تكون مناسبة للتحليلات التي خططت لها الباحث.
استخدام بروتوكول الموصوفة هنا، مع بعض الممارسة، ينبغي أن يكون قادراً على إتقان تقنية زرع PGC مع بعض الممارسة امبريولوجيستس البرمائية. ينبغي أن تكون القفزات ممكنة، ليس فقط في البرمائيات الأخرى، ولكن أيضا غيرها من الكائنات التي تحتوي على بجكس التي سهولة الأولى بين الأفراد في المراحل الأولى من امبريوجينيسيس.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس له علاقة بالكشف عن صاحب البلاغ.
Acknowledgments
أنجز هذا العمل بالدعم من منحة، 5R21HD080684-02، من المعهد الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية. المؤلف يود أن يشكر شو كين للحماس المتواصل ودعمه. صاحب البلاغ أيضا تود أن تقر بلومبرغ بروس لاستخدام آلة التصوير، "ربيكا شارني"، لقراءة نقدية للمخطوطات، وشون مكنمارا ومارسين وليزلا في المورد النمو الوطني (RRID:SCR_013731)، لقيمة المحادثات المتعلقة بتغذية X. tropicalis ونظم الرعاية الحيوانية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 or 11252-30 | |
| Eyebrow hair knife | Homemade | ||
| Hair loop | Homemade | ||
| Pasteur pipettes, borosilicate glass | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| Krazy Glue (Cyanoacrylate-based) | Elmer's Products, Inc. | KG581 | To affix eyebrow hair and hair loops into Pasteur pipettes, other similar glues can be used. |
| Oligodeoxynucleotides, custom ordered | Integrated DNA Technologies | Custom ordered | Template oligos for sgRNA synthesis, see Nakayama et al., 2014 for design details. |
| Megascript T7 kit | Ambion/ThermoFisher | AM1334 | Or use Megashortscript T7 (AM1354) kit |
| Phenol, Tris buffered | High quality distilled phenol from any commercial supplier | ||
| Chloroform | High quality chloroform from any commercial supplier | ||
| Ethanol | High quality ethanol from any commercial supplier | ||
| Diethylpyrocarbonate (DEPC) | Sigma Chemical Co. | D5758-50ML | |
| Cas9 protein, with nuclear localization signal | PNA Bio, Inc. | CP01 | Reconstituted using DEPC-treated water according to manufacturer's recommendations |
| 10X Marc's Modified Ringers solution | Homemade. Recipe (ref 26) for 1X MMR (lacking EDTA) is 100mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES. Solution is pH adjusted to 7.4. | ||
| Agarose | Any Molecular Biology grade agarose is sufficient | ||
| 60 X15 mm Petri plates | Falcon | 351007 | |
| 24-well plates | Falcon | 3047 | |
| L-Cysteine | Sigma Chemical Co. | C7352-100G | Free base, not HCl salt |
| Proteinase K | Roche | 03 115 828 001 | Typically ~20mg/ml from Roche |
| sera Micron | sera | Tadpole food. Resuspend in growth medium. Can be purchased from a variety of online retailers |
References
- Gurdon, J. B., Hopwood, N. The introduction of Xenopus laevis into developmental biology: of empire, pregnancy testing and ribosomal genes. Int J Dev Biol. 44 (1), 43-50 (2000).
- Hellsten, U., et al. The genome of the Western clawed frog Xenopus tropicalis. Science. 328 (5978), 633-636 (2010).
- Session, A. M., et al. Genome evolution in the allotetraploid frog Xenopus laevis. Nature. 538 (7625), 336-343 (2016).
- Blitz, I. L., Biesinger, J., Xie, X., Cho, K. W. Biallelic genome modification in F(0) Xenopus tropicalis embryos using the CRISPR/Cas system. Genesis. 51 (12), 827-834 (2013).
- Nakayama, T., Fish, M. B., Fisher, M., Oomen-Hajagos, J., Thomsen, G. H., Grainger, R. M. Simple and efficient CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Xenopus tropicalis. Genesis. 51 (12), 835-843 (2013).
- Guo, X., et al. Efficient RNA/Cas9-mediated genome editing in Xenopus tropicalis. Development. 141 (3), 707-714 (2014).
- Wang, F., Shi, Z., Cui, Y., Guo, X., Shi, Y. B., Chen, Y. Targeted gene disruption in Xenopus laevis using CRISPR/Cas9. Cell Biosci. 5, 15 (2015).
- Jaffe, K. M., et al. c21orf59/kurly Controls Both Cilia Motility and Polarization. Cell Rep. 14 (8), 1841-1849 (2016).
- Liu, Z., et al. Efficient genome editing of genes involved in neural crest development using the CRISPR/Cas9 system in Xenopus embryos. Cell Biosci. 6, 22 (2016).
- Naert, T., et al. CRISPR/Cas9 mediated knockout of rb1 and rbl1 leads to rapid and penetrant retinoblastoma development in Xenopus tropicalis. Sci Rep. 6 (35264), (2016).
- Ratzan, W., Falco, R., Salanga, C., Salanga, M., Horb, M. E. Generation of a Xenopus laevis F1 albino J strain by genome editing and oocyte host-transfer. Dev Biol. 426 (2), (2016).
- Bhattacharya, D., Marfo, C. A., Li, D., Lane, M., Khokha, M. K. CRISPR/Cas9: An inexpensive, efficient loss of function tool to screen human disease genes in Xenopus. Dev Biol. 408 (2), 196-204 (2015).
- Shigeta, M., et al. Rapid and efficient analysis of gene function using CRISPR-Cas9 in Xenopus tropicalis founders. Genes Cells. 21 (7), 755-771 (2016).
- Hontelez, S., et al. Embryonic transcription is controlled by maternally defined chromatin state. Nat Commun. 6, 10148 (2015).
- Peshkin, L., et al. On the Relationship of Protein and mRNA Dynamics in Vertebrate Embryonic Development. Dev Cell. 35 (3), 383-394 (2015).
- Owens, N. D., et al. Measuring Absolute RNA Copy Numbers at High Temporal Resolution Reveals Transcriptome Kinetics in Development. Cell Rep. 14 (3), 632-647 (2016).
- Blitz, I. L., Fish, M. B., Cho, K. W. Leapfrogging: primordial germ cell transplantation permits recovery of CRISPR/Cas9-induced mutations in essential genes. Development. 143 (15), 2868-2875 (2016).
- Blackler, A. W. Transfer of germ-cells in Xenopus laevis. Nature. 185, 859-860 (1960).
- Blackler, A. W., Fischberg, M. Transfer of primordial germ-cells in Xenopus laevis. J Embryol. Exp Morph. 9, 634-641 (1961).
- Bounoure, L. L'origine des cellules reproductrices et le problem de la lignee germinale. , Gauthier-Villars. Paris. (1939).
- Nieuwkoop, P. D., Sutasurya, L. A. Primordial Germ Cells in the Chordates: Embryogenesis and phylogenesis. , Cambridge University Press. Cambridge. (1979).
- Heasman, J., Holwill, S., Wylie, C. C. Fertilization of cultured Xenopus oocytes and use in studies of maternally inherited molecules. Methods Cell Biol. 36, 213-230 (1991).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Embryo dissection and micromanipulation tools. CSH Protoc. , (2007).
- Nakayama, T., et al. Cas9-based genome editing in Xenopus tropicalis. Methods Enzymol. 546, 355-375 (2014).
- Ogino, H., McConnell, W. B., Grainger, R. M. High-throughput transgenesis in Xenopus using I-SceI meganuclease. Nat Protoc. 1 (4), 1703-1710 (2006).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early development of Xenopus laevis.: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2000).
- Kay, B. K. Injection of oocytes and embryos. Xenopus laevis: Practical Uses in Cell and Molecular Biology (Methods in Cell Biology Vol. 36). Kay, B. K., Peng, H. B. , Academic Press. San Diego. (1991).
- Normal Table of Xenopus laevis. (Daudin): A Systematical and Chronological Survey of the Development from the Fertilized Egg till the End of Metomorphosis. Nieuwkoop, P., Faber, J. , Garland Publishing Inc. New York. (1994).
- Xenopus Tadpole Feeding. , Available from: http://www.mbl.edu/xenopus/files/2016/06/Xenopus-Tadpole.pdf (2017).
- Xenopus tropicalis Animal Care. , Available from: http://www.mbl.edu/xenopus/files/2016/06/Xenopus-Tropicalis.pdf (2017).
- Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Res. 42 (22), e168- (2014).
- Sander, V., Reversade, B., De Robertis, E. M. The opposing homeobox genes Goosecoid and Vent1/2 self-regulate Xenopus patterning. EMBO J. 26 (12), 2955-2965 (2007).
- Bedell, V. M., et al. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).
- Kim, J. M., Kim, D., Kim, S., Kim, J. S. Genotyping with CRISPR-Cas-derived RNA-guided endonucleases. Nat Commun. 5, 3157 (2014).
- Kim, H. J., Lee, H. J., Kim, H., Cho, S. W., Kim, J. S. Targeted genome editing in human cells with zinc finger nucleases constructed via modular assembly. Genome Res. 19 (7), 1279-1288 (2009).
- Qiu, P., Shandilya, H., D'Alessio, J. M., O'Connor, K., Durocher, J., Gerard, G. F. Mutation detection using Surveyor nuclease. Biotechniques. 36 (4), 702-707 (2004).
- Ota, S., et al. Efficient identification of TALEN-mediated genome modifications using heteroduplex mobility assays. Genes Cells. 18 (6), 450-458 (2013).
- Dahlem, T. J., et al. Simple Methods for Generating and Detecting Locus- Specific Mutations Induced with TALENs in the Zebrafish Genome. PLoS Genet. 8 (8), e1002861 (2012).
- Ramlee, M. K., Yan, T., Cheung, A. M., Chuah, C. T., Li, S. High-throughput genotyping of CRISPR/Cas9-mediated mutants using fluorescent PCR-capillary gel electrophoresis. Sci Rep. 5, 15587 (2015).
- Bhattacharya, D., Marfo, C. A., Li, D., Lane, M., Khokha, M. K. CRISPR/Cas9: An inexpensive, efficient loss of function tool to screen human disease genes in Xenopus. Dev Biol. 408 (2), 196-204 (2015).
- Yu, C., Zhang, Y., Yao, S., Wei, Y. A PCR Based Protocol for Detecting Indel Mutations Induced by TALENs and CRISPR/Cas9 in Zebrafish. PLoS ONE. 9 (6), e98282 (2014).
- Mock, U., Hauber, I., Fehse, B. Digital PCR to assess gene-editing frequencies (GEF-dPCR) mediated by designer nucleases. Nat Protoc. 11 (3), 598-615 (2016).
- Varshney, G. K., et al. High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9. Genome Res. 25 (7), 1030-1042 (2015).
- Shi, J., Wang, E., Milazzo, J. P., Wang, Z., Kinney, J. B., Vakoc, C. R. Discovery of cancer drug targets by CRISPR-Cas9 screening of protein domains. Nat Biotechnol. 33 (6), 661-667 (2015).
- Koebernick, K., Loeber, J., Arthur, P. K., Tarbashevich, K., Pieler, T. Elr-type proteins protect Xenopus Dead end mRNA from miR-18-mediated clearance in the soma. Proc Natl Acad Sci USA. 107, 16148-16153 (2010).
- Yang, J., Aguero, T., King, M. L. The Xenopus maternal-to-zygotic transition from the perspective of the germline. Curr Top Dev Biol. 113, 271-303 (2015).
