Gener som är nödvändig för överlevnad utgöra tekniska hinder för att skapa mutant linjer. Bli ledande kringgår dödlighet genom att kombinera genomet redigering med primordiala könsceller transplantation till skapa vildtyp djur som bär könsceller mutationer. Bli ledande tillåter också effektiv generering av homozygot null mutanter i F1 generationen. Här demonstreras steget transplantation.
Skapandet av muterade linjer genom gen editering accelererar genetisk analys i många organismer. CRISPR/Cas9 metoder har anpassats för användning i afrikanska kloförsedda grodan, Xenopus, långvariga modellorganism för biomedicinsk forskning. Traditionell avel system för att skapa homozygot muterad linjer med CRISPR/Cas9-riktad mutagenes har flera tidsödande och mödosamma steg. För att underlätta skapandet av muterade embryon, särskilt för att övervinna de hinder som är associerad med knackar ut gener som är viktiga för embryogenes, utvecklades en ny metod som kallas bli ledande. Denna teknik utnyttjar robustheten i Xenopus embryon att ”klippa och klistra” embryologiska metoder. Bli ledande använder tredjeparts överföring av primordiala könsceller (PGCs) från effektivt-mutagenized givare embryon till PGC-uppföljningsstudien vildtyp syskon. Denna metod möjliggör effektiv mutationen av viktiga gener genom att skapa chimära djur med vildtyp somatiska celler som bär en mutant könsceller. När två F0 djur som bär ”leapfrog transplantationer” (dvs, mutant könsceller) är intercrossed, de producerar homozygot eller sammansatt heterozygot, null F1 embryon, vilket sparar en hel tid att skaffa fenotypiska data. Bli ledande ger också en ny metod för att analysera maternell effekt gener, som är refraktära mot F0 fenotypiska analys efter CRISPR/Cas9 mutagenes. Detta manuskript Detaljer metoden för bli ledande, med särskild tonvikt på hur man lyckas utföra PGC transplantation.
Hur genotyp kodar fenotyp har varit en stor fråga i biologi eftersom återupptäckten av Mendels lagar. En förståelse för gener, deras reglering och växelverkan inom genen nätverk roller och funktioner kodade produkter löften att ge verktyg för avtäckning nya biologi och ameliorating sjukdomstillstånd. För mer än hälften en talet1, har afrikanska kloförsedda grodan, Xenopus, varit en ledande modell för studier på en mängd olika ämnen i grundläggande biologi och biomedicin, inklusive genetisk kontroll av utveckling. Historiskt har de flesta forskning om Xenopus har använt allotetraploid grodan, X. laevis, men mer nyligen, på grund av dess diploidy, X. tropicalis har utvecklats som en amfibie genetisk modell. Hela genomet sekvenser har samlats från både Xenopus arter2,3. Gemenskapens ”groda” är nu vid en vändpunkt där grundläggande genomet ändring teknik tillåter studier av geners funktion, praktiskt taget på kommer. Programmerbara CRISPR/Cas9 endonucleases har gjort mutagenicitet gener högeffektiva, med biallelic mutation möjligt i de flesta celler av djur4,5,6,7, 8,9,10,11. Dessa studier, ministerkvartetten Bhattacharya et al. 12 och Shigeta o.a. 13, har visat att många geners funktion kan studeras av mutagenicitet i F0 mosaik djur. Detta tillvägagångssätt har många fördelar; Cas9-sgRNA-microinjected embryon visas dock ofta variabla fenotyper på grund av ofullständig förlust av funktion (LOF). Mer påtagligt, generering av muterade linjerna är mycket fördelaktigt för vissa program – i synnerhet när man studerar gener som har ett moderns mRNA-bidrag. Maternell mRNA och proteiner och deras påverkan på epigenetik, kvarstår under en längre period i embryogenes14,15,16, rendering tidigt utvecklings bidrag från många gener eldfasta F0 analyser. Därför krävs andra LOF tillvägagångssätt.
När man vill skapa mutant linjer, har sökvägen till att erhålla homozygot LOF embryon flera hinder. Första, effektiv mutagenes att producera biallelic mutationer kan vara ofördelaktigt eftersom förlust av viktiga genen funktioner resulterar i fel att överleva till könsmognad, störa produktionen av en livskraftig linje. En gemensam lösning är försiktig titrering av mängden Cas9-sgRNA levereras. Här är målet att uppnå en balans mellan att minska dödlighet samtidigt också maximera könsceller mutagenes effektivitet. Ett andra problem uppstår från systemet med standard avel, där fenotypiska analyser är uppskjuten tills den F2 generationen. Med standardmetoden, könsmogna F0 djur som överför mutant alleler genom könsceller är outcrossed för att producera F1 heterozygot ”bärare”, som odlas sedan till könsmognad. Två F1 heterozygoter är sedan intercrossed för att producera F2 mutant embryon i förväntade Mendelian frekvens på 25%. Två generationer av avel är således nödvändiga för analys av muterade fenotyper. Muterade djur kan vara antingen homozygoter eller sammansatta heterozygoter (dvs avkomma som innehåller två olika muterade alleler, vilket beror på genotyperna av de föräldra djur som används i den F1 intercross).
Dessa hinder kan övervinnas genom att begränsa programmerbara nuclease-medierad mutagenes att könsceller, som ligger bakom en ny metod som kallas utvecklingssprång17. Bli ledande har två huvudsakliga komponenter: (1) Mikroskop Cas mRNA tillsammans med sgRNA eller nuclease-sgRNA komplex (eller, i princip, TALENs eller zink finger nukleotider) på encelliga scenen för att effektivt mutagenize embryonala genomen, följt av (2) transplantation av PGCs till vildtyp syskon embryon, där de endogena PGCs togs bort. När båda stegen är effektiv, komplett könsceller ersättning med muterade könsceller kan erhållas. Blackler visade i början av 1960 att Xenopus PGCs kunde transplanteras mellan embryon på den sena neurula och tidig tailbud arrangerar18,19. För att bli ledande, ändrades Blacklers strategi genom att utföra transplantationerna på blastula etapp17, när PGCs är lokaliserade i vegetal stången av embryo20,21. Transplantation före gastrulation har två huvudsakliga fördelar. Först, engraftment transplantationer och efterföljande normala utveckling befanns vara effektivare när transplantation görs i ett skede blastula (opublicerade observationer). Andra, genom att utföra blastula-scenen transplantationer strax efter zygotic transkription har börjat, kan man undvika den dödlighet som följd utvecklingsmässiga genen mutationer som stör gastrulation eller som annars leder till missbildade sena neurulae. PGC transplantation räntebärande (”leapfrogged”) embryon odlas till könsmognad och intercrosses mellan dessa F0 djur har visat att, i många fall 100% av F1 avkomman visar LOF fenotypen (de flesta som är sammansatta heterozygoter), som anger komplett könsceller ersättning med de rikta mutationerna.
Det förväntas att bli ledande kommer att påskynda genetiska metoder i Xenopus. Bli ledande föreskrivs också ett alternativ till ”host överföring” metod22 LOF analysen av mödra-effekt gener (opublicerade observationer). I den aktuella publikationen presenteras en detaljerad beskrivning av metoden, med särskilt fokus på PGC transplantation, i X. tropicalis (med smärre ändringar för X. laevis). Transplantation av PGCs demonstreras här för att underlätta en snabbare överföring av denna teknik till andra laboratorier som arbetar med Xenopus. Principerna för denna metod bör vara framgångsrika i andra groddjur (t.ex. urodeles), och organism-specifika ändringar i metodik bör möjliggöra för att många andra djur som effektiv mutagenes kan åstadkommas och PGCs är lätt transplanterbara.
Denna rapport ger ett detaljerat protokoll för transplantation av vegetal vävnad innehållande PGCs. Transplantation av PGCs används i samband med editering teknik (t.ex. CRISPR/Cas9) för att ändra könsceller av djur medan att behålla nästan alla dess somatiska vävnader som genetiskt vildtyp. För att bli ledande för att lyckas, finns det ett antal kritiska faktorer att överväga innan du utför utför transplantationer.
För att säkerställa fullständig ersättning av k?…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete utfördes med stöd av anslaget, 5R21HD080684-02, från National Institute of Child Health och mänsklig utveckling. Författaren vill tacka Ken Cho för hans fortsatta entusiasm och stöd. Författaren vill också erkänna Bruce Blumberg för användning av sin kamera, Rebecka Charney, för den kritiska behandlingen av manuskript, och Sean McNamara och Marcin Wlizla på den nationella Xenopus resursen (RRID:SCR_013731), för värdefullt samtal om X. tropicalis utfodring och djurvård regimer.
Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 or 11252-30 | |
Eyebrow hair knife | Homemade | ||
Hair loop | Homemade | ||
Pasteur pipettes, borosilicate glass | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
Krazy Glue (Cyanoacrylate-based) | Elmer's Products, Inc. | KG581 | To affix eyebrow hair and hair loops into Pasteur pipettes, other similar glues can be used. |
Oligodeoxynucleotides, custom ordered | Integrated DNA Technologies | Custom ordered | Template oligos for sgRNA synthesis, see Nakayama et al., 2014 for design details. |
Megascript T7 kit | Ambion/ThermoFisher | AM1334 | Or use Megashortscript T7 (AM1354) kit |
Phenol, Tris buffered | High quality distilled phenol from any commercial supplier | ||
Chloroform | High quality chloroform from any commercial supplier | ||
Ethanol | High quality ethanol from any commercial supplier | ||
Diethylpyrocarbonate (DEPC) | Sigma Chemical Co. | D5758-50ML | |
Cas9 protein, with nuclear localization signal | PNA Bio, Inc. | CP01 | Reconstituted using DEPC-treated water according to manufacturer's recommendations |
10X Marc's Modified Ringers solution | Homemade. Recipe (ref 26) for 1X MMR (lacking EDTA) is 100mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES. Solution is pH adjusted to 7.4. | ||
Agarose | Any Molecular Biology grade agarose is sufficient | ||
60 X15 mm Petri plates | Falcon | 351007 | |
24-well plates | Falcon | 3047 | |
L-Cysteine | Sigma Chemical Co. | C7352-100G | Free base, not HCl salt |
Proteinase K | Roche | 03 115 828 001 | Typically ~20mg/ml from Roche |
sera Micron | sera | Tadpole food. Resuspend in growth medium. Can be purchased from a variety of online retailers |