Summary
生存に不可欠な遺伝子突然変異系統を作成するための技術的なハードルをもたらします。リープフロッギング ゲノムの生殖細胞系突然変異を運ぶ野生型動物を作成する始原生殖細胞移植と編集を組み合わせることにより致死性を回避できます。リープフロッギング F1世代でホモの null 変異体の効率的な生成ができます。ここでは、移植の手順が示されています。
Abstract
ゲノム編集による突然変異系統の作成は多くの有機体の遺伝解析を加速しています。CRISPR/Cas9 方法は、アフリカツメガエル、アフリカツメガエル、生物医学研究のための長年のモデル有機体の使用のために適応されています。CRISPR/Cas9 標的突然変異のホモ接合体の突然変異系統を作成するための伝統的な育種方式があるいくつかの時間がかかり、骨の折れる手順。特に、胚形成に不可欠な遺伝子をノックアウトに関連付けられている障害を克服するために突然変異体の胚の作成を容易にするには、リープフロッギングと呼ばれる新しい方法を開発しました。この手法は「カットアンド ペースト「アフリカツメガエル胚の堅牢性を活用して胎生学的方法。リープフロッギング PGC アブレーション野生型兄弟に効率的に突然変異誘発ドナー胚から始原生殖細胞 (PGCs) の伝達を利用します。このメソッドは、必須遺伝子の効率的な変異の変異の生殖細胞を運ぶ野生型細胞とキメラ動物を作成することによってできます。ときを運ぶ 2 つの F0動物」を抜いて移植」(すなわち、突然変異体生殖細胞) を intercrossed、彼ら胚を作り出すホモ、または複合ヘテロ接合体、null F1 、そのため表現型データを取得する完全な生成時間節約します。F0表現型解析 CRISPR/Cas9 変異を次に不応性である母性効果遺伝子を解析するための新しいアプローチを示しますもリープフロッギングします。この原稿は、リープフロッギング、PGC 移植を正常に実行する方法に特別な重点を置いての方法を詳しく説明します。
Introduction
遺伝子型が表現型にエンコードし、メンデルの法則の再発見から生物学の主要な質問がされています。発掘の新しい生物学および従って, これらの疾患状態のツールを提供するためにエンコードされた製品約束の機能と遺伝子、その調節と遺伝子ネットワークの相互作用の役割の理解。半分以上世紀1アフリカツメガエル、アフリカツメガエルは、基礎生物学、生物医学、開発の遺伝制御を含むさまざまなトピックに関する研究の主要なモデルをされています。歴史的に、アフリカツメガエルのほとんどの研究は、allotetraploid カエル、 X. laevisを使用しているが、最近では、その二倍体遺伝のために、 X. tropicalisを両生類遺伝モデルとして開発されています。全ゲノム配列は、両方アフリカツメガエル種2,3から組み立てされています。「カエルのコミュニティ」は基礎ゲノム改質技術が許可されている遺伝子機能の研究事実上はターニング ポイントで今です。プログラマブル CRISPR/Cas9 酵素からの遺伝子の突然変異を誘発した非常に効率的に、シュミレーション可能な大部分の細胞の変異動物4,5,6,7、 8,9,10,11。バッタチャリヤらによって強調したこれらの研究12重田ら13F0モザイク動物の突然変異誘発による多くの遺伝子の機能を学ぶことができることが示されています。このアプローチは多くの利点;ただし、Cas9 sgRNA microinjected 胚はしばしば関数 (LOF) の不完全な損失のため変数表現型を表示します。大きくなり、突然変異系統の生成は、いくつかのアプリケーションのため、非常に有利、特に母性 mRNA 貢献をしている遺伝子の研究の際に。母性 Mrna とタンパク質とエピジェネティクス、胚発生14,15,16、多くの遺伝子の早期発達貢献をレンダリング長時間にわたって永続化します。F0解析する耐火物。したがって、他の LOF のアプローチが必要です。
突然変異系統を作成しようとすると、ホモの LOF の胚を取得するパスはいくつかの障害には。必須な遺伝子機能の損失結果として生き残るために性的に成熟、現実的なラインの生産と干渉する障害シュミレーションの突然変異を生成する最初、効率的な変異が不利なるです。一般的なソリューションは、Cas9 sgRNA の配信量の慎重な滴定です。ここでは、目的はまた生殖細胞系突然変異誘発効率を最大化しながら致死率を減らすことの間のバランスを達成するためにです。2 番目の問題は、表現型解析が F2世代まで遅延される標準的な育種方式から発生します。標準的なアプローチを使用すると、性的成熟する F0動物生殖細胞を通じて対立遺伝子が F1ヘテロ「キャリア」が、性的な成熟に成長して生成する outcrossed 変異体を送信します。2 F1ヘテロ接合体は、25% の期待されるメンデル頻度で F2変異胚を作り出すため、intercrossed します。したがって、繁殖の二世代が突然変異体の表現型解析のため必要です。変異動物は、急性または複合ヘテロ接合体 (すなわち、子孫含む 2 つの異なる変異対立遺伝子、F1エムアンドエー インター クロスにおける親動物の遺伝子型に依存する) 可能性があります。
これらの障害は、プログラマブル ヌクレアーゼを介した突然変異誘発による生殖細胞、馬跳び17と呼ばれる新しいメソッドの基礎となる拘束で克服できます。2 つの主要コンポーネントがありますリープフロッギング: (1) 一緒に sgRNA、またはヌクレアーゼ sgRNA 錯体 (または原則、TALENs または亜鉛指核酸) Cas mRNA マイクロインジェクション (2) 続いて胚性ゲノムを効率的に mutagenize に単一細胞の段階でPGCs の内因性の PGCs が削除された、野生型の兄弟の胚への移植。両方の手順が突然変異体の生殖細胞を効率的で、完全な生殖系列の置換を取得できます。Blackler は、後半 neurula で胚と早く尾段階18,19アフリカツメガエル始原生殖を移植できれば、1960 年代初頭に示した。リープフロッギングの Blackler のアプローチは、胞胚のステージ17で移植胚20,21の植物極の PGCs がローカライズされる場合を実行することによって変更されました。原腸陥入前に移植には 2 つの主な利点。まず、移植とそれに続く正常な発達の生着は (未発表観察) 胞胚の段階で移植するときより効率的なことが判明しました。第二に、ココヤシの転写の開始後まもなく、胞胚期移植を実行する、不正な後半 neurulae に導いてくれる原腸陥入を混乱させる変異進化の遺伝子から生じる致死避けることが 1 つ。PGC 移植軸受 (「アベンテイル」) 胚が性的に成熟、成長、これら F0動物間の intercrosses は、F1子孫の 100% は多くのケースで、LOF 表現型 (ほとんどされている化合物も表示を示しています。ヘテロ接合体)、対象となる遺伝子変異を有する完全な生殖系列の置換を示します。
リープフロッギングアフリカツメガエルの遺伝的アプローチを加速する予定です。22 「ホスト転送」メソッドに代わるは母性効果遺伝子 (未発表観測) の LOF の分析も、飛び越えて.現在の文書では、PGC 移植中心メソッドの詳細な説明はX. tropicalisで (、 X. laevisに変更を加える) されます。PGCs の移植は、アフリカツメガエルの使用他の所により迅速な技術移転を容易にする紹介です。この方法の原理は他の両生類 (例えば有尾) に成功したする必要があり、効率的な変異を実現する他の多くの動物への応用方法論で生物固有の変更を許可し、PGCs が容易に移植できます。
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Protocol
ここで説明するすべての方法は、制度的動物のケアとカリフォルニア大学アーバイン校の利用委員会によって承認されています。
1. PGC 移植の準備
- 前述23として解剖ツールを事前に準備します。
注: 眉髪のナイフは、切開手術を実行しているとき、胎児を安定させるために毛のループの支援に使用されます。眉毛と髪のループを炎で描かれた最初パスツール ピペット ホウケイ酸ガラスに接着し、薄くなった部分に壊れた (図 1 aを参照してください矢印) 手先の器用さより短くより狭いヒント (図 1 b) を作成するには手術の際に。 - 手順説明した24を使用して sgRNAs を生成します。
注: 簡潔に、短い DNA テンプレート sgRNAs のためのコーディングが作成されます、エラー無料、耐熱性 DNA ポリメラーゼを焼鈍が 5' バクテリオファージ T7 プロモーターと「入力」を含む重複する deoxyoligonucleotides を使用しています。SgRNA 合成反応の in vitro (キット使用) によって一夜にして数時間孵化します。反応は、DNAse 処理テンプレートを削除します。SgRNAs は24キットの製造元の指示に従ってフェノール/クロロホルム抽出とアンモニウム酢酸/イソプロパノール沈殿の標準的な方法で精製しました。 - 直前に薬剤を実行すると、最初の変化 〜 250 で Cas9 sgRNA 錯体を準備 RNAse フリー (ジエチルピロカーボネート処理) H2O 60 から 65 ° c 5 分の総量が 3 μ L sgRNA の ng は、5 分間氷の上迅速な冷却が続きます。数秒間、sgRNA を遠心 1 μ g/μ L Cas9 蛋白質の 1 μ L を追加して、複雑な形成を促進する 37 ° C で 10 分間インキュベートします。
注: このインキュベーション後チューブを維持する氷上一方マイクロインジェクションの胚を準備します。 - 前述の25として標準的な方法を使用して体外受精によってX. tropicalis胚を取得します。25,26を解除ゼリー 10 分後受精で胚。
注: 受精の時間時間後に卵に精子懸濁液を追加し、料理は 1/9thX が殺到である Marc の着信音の変更 (MMR)26。X. tropicalis25、 X. laevisとは異なり実行 1/9 で解除ゼリー x MMR システインの遊離の塩基の 3% (ない塩酸塩) を含む pH 7.8 8.0 に調整は 1/9 で複数の洗浄が続く x MMR。(1%)、アガロースに胚を転送-1/9 を含むコーティング皿室温で x MMR。 - すぐの 1 を含んでいる 1% アガロースゲル コーティング皿注入胚を転送パスツール ピペットを使用して x MMR。
-
1 細胞の段階で投入します。参照26,27 アフリカツメガエルマイクロインジェクション メソッドの詳細についてを参照してください。
- 4 動物極で 1 つのサイトでそれぞれの胚に注入 Cas9 sgRNA 複合体の nL (最終的な金額 = 1 Cas9 と sgRNA の ~ 250 pg の ng; 見なさい議論)24。インジェクション サイト癒しの 10-20 分後 1/9 を含む agarose コーティングの皿に胚を転送 x MMR 25 ° c. で孵化させなさいと胚移植の受信者として使用される uninjected の兄弟の皿を作成もできます。
-
〜 5 mm を含むペトリネット プレート (60 mm) を準備-0.3、1% の agarose の厚い層 x MMR、 X. tropicalis、または 1 の移植を行う場合X. laevisの x MMR。
- 3 ~ 4 のくぼみを作成 mm、3 を挿入することによって深い-4 ウェル金型 (96 ウェル PCR プレートを切断することによって作成された) x 溶融 agarose プレートを注ぐときに (図 1を参照してくださいとD)。Agarose が固まるまで、リング スタンドに接続されているクランプを使用してシャーレの底の上の数ミリの金型を保持します。
- さらに、1/9、1% の agarose の薄層で井戸をコーティングすることにより家個々 の胚に 24 ウェル プレートを作る x MMR。
注: これらの井戸に追加培養培地はゲンタマイシン硫酸塩/mL の 50 μ g を添加した MMR 1/9 x。
2. PGCs の移植
- とき胚だけ Nieuwkoop とフェーバー28胞胚の段階に達する 9 (図 2 a) ~4.5 h X. tropicalisのためのポスト受精 (hpf) 25 の ° C の定温器から削除し、さらに室温に釣り合うように0.5 h。
- 5 に移植を開始する hpf (図 2 b)、0.3 のくぼみ (1.7 のステップで作成した) を含む 60 mm agarose の皿に (Cas9 sgRNA と挿入された) 1 つの PGC ドナー胚を転送するパスツール ピペットを使用して、x MMR (または 1 x MMR X. laevisを使用している場合)。また、1 つ uninjected 兄弟の胚移植の受信者は、この皿に転送します。
注: これらの胚のそれぞれのアイデンティティが混同されていないことが重要です。 - 手動で鉗子を使用してそれぞれの胚から卵黄の封筒を削除し、植物極がビューで、手術のためアクセス両方の胎児を回転させます。
注: 胚のマニュアル ・ デ ・ vitellination の説明に記載されている26がきた。 - 髪、眉のナイフの鋭い先端を使用して、マーク、原口将来ボトル細胞が形成されますゾーン中、受信者の胚の植物極に正方形の形をした 4 つの浅い切開を作る。胚は、毛のループを持つ胚の安定が上向きの動きをスライスして、表面のすぐ下に眉髪のナイフの先端を挿入して切開を行います。
注:図 2 4.5 7.0 hpf セル サイズを表示してボトル細胞が (白の破線円) を形成を推定するためのガイドを提供するから half-hourly 間隔で胚の植物性のビューを示します。目的は、ように切開し、破線のブラック ボックスが示されているです。 - 正方形の 4 つの側面は、切開で区切られる、一度眉髪のナイフが類似の切断動作を使用して深さの約 1/3、1/2 胞胚腔の床までの距離に到達すると各切開を深めます。
- 無料の受信者の胚からの植物組織植 (図 3 a とB) (植物の表面に平行) 水平することによって深い植物地域で cut(s)。
注: PGC 含む植物性外植体のサイズは約 0.4-0.45 mm 面ごと mm で深さ 0.25 0.3。受信者の胚からこの植物の植が不要し、破棄される脇したがって設定する必要があります。 - すぐに働いて、この手順 (手順 2.4 2.6) PGC ドナー胚移植のための同様に大きさで分類された植物組織片を作成するを繰り返します。
注: その傷口を癒すために受信者の胚のための時間を最小限に抑えるため遅延の少ないこの第二の郭清を行うことが重要です。 - ドナー胚始原生殖を含む組織を削除すると、受信者の胚は、開口部の位置にこの植を移動するのに眉髪のナイフと髪のループを使用します。
注: ドナー移植片の内部の表面は受信者の胚の内部に直面する必要があります。受信者の胚で移植の背腹軸、左右の軸の向きを揃える必要はありません。 - 受信者の胚の植物の表面の開口部に移植をそっと押して、移植片の表面に平行に開催眉髪のナイフの軸の長いエッジを使用します。
- 一度移植を配置すると、ドナー胚の「死体」をアガロースうつ病優しく agarose 表面にスライドするのに、hairloop または、眉髪のナイフのシャフトを使用します。死体の傷口で大量の液体が直面していることを確認します。該当しない場合は、この方向性を達成するために胚を回転させる眉髪のナイフを使用します。
- 癒しの場所に隣接するうつ病に移植の受信者の胚をスライドし、同様に接木された植物極組織が大量の液体を直面していることを確認してください。
- ドナーと受信者の胚の別のペアを使用して移植/死体の別のペアを作成するこの手順 (手順 2.1 2.11) を繰り返します空のくぼみに、これらを転送します。
注: 死体と胚移植軸受のペアを追跡する表記をするとが重要です。ドナー死体移植軸受け動物性的成熟に達するまで簡単に測定できない移植の PGCs の Cas9 sgRNA 誘発突然変異の効率のプロキシとして使用されます (以下、3.3、手順を参照してください、ディスカッション). - 胚までは約 6.5 約初期原腸胚ステージ 10、移植を作り続けるX. tropicalisで hpf (図 2 eを参照してください)。
3. 胚世話治癒後
注: 移植を癒す ~ 30 分以内の場所に、通常セル換散 (図 3) 胚から染み出すからいくつかの卵黄の残骸を観察します。
-
癒される、アガロース コーティング 24 ウェルのプレートの個々 の井戸にくぼみから非常に優しく移植胚にパスツール ピペットを使用します。液になります流体転送中に混合によって (図 3 D) を削除します。
- 一括ソリューションを直面する植物性極配置されますので、胚を回転します。また、ドナーの死体を置き移植胚のペアを追跡するのに支援するために隣接する井戸の受信者この情報を記録します。
- 一晩文化の 25 ° C の定温器に胚を含む 24 ウェル プレートに転送します。
注: 次の日、胚が持っている尾の段階に達した。 - ゲンタマイシン硫酸塩/mL、ウェルあたり 1 胚での 50 μ g を添加した MMR 1/9 x を含む agarose コーティング 6 ウェル プレートをきれいにする移植の受信者を移動します。これらに一致するドナー死体の明確な記録の受信者を移植します。
- シーケンス PCR 産物5,17,24または PCR 産物 (ディスカッションを参照) に依存する他のメソッドを使用して突然変異誘発効率を評価するために個々 の死体を 0.2 mL PCR ストリップ管に移動します。媒体のほとんどを削除し、100 μ L 換散バッファー24プロテイナーゼ K (PK) によって繰り返し上下ピペッティング P200 ピペットを使用してを含む均質化します。
- 胚換散24 PK 消化を許可するように一晩に 6 h 56 ° C でを実行します。クイック 4 ° C に冷却後、10 分の 90-95 ° C に加熱することによって PK を不活性化します。直接サンガー DNA シーケンス24の短い産物を取得するのに PCR の反作用をシードするのにさらにクリーンアップ手順を実行することがなく溶解液を使用します。-20 ° C の溶解液を保存します。
注: いくつかの日以内オタマジャクシ栄養段階 (約ステージ 45 46) になるし、浮遊性粉末 (血清ミクロン) の懸濁液を供給することができます。 - 培地に清潔を維持し、微生物の増殖を最小限に抑えるための日変化との 〜 1 週間後点滴の流れと循環水生システムの小型タンクにオタマジャクシを移動します。シーケンス データを使用すると、突然変異誘発に低い効率とオタマジャクシから高効率人為 PGCs のオタマジャクシを分離します。変身が完了したら、一度、froglet をラボで大人の水生システムに移動します。
注: 国立アフリカツメガエルリソース (MA、ウッズホール海洋生物学研究所) が開発した療法は29と大人カエル メンテナンス30餌オタマジャクシのガイドを提供します。
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Representative Results
次の移植、CRISPR/Cas9 の突然変異の効果の定性定量は、成長し、性成熟に動物を維持し畜産の努力を費やす前に行わなければなりません。リープフロッグ移植を運ぶ動物アデノーマ野生型、生殖細胞は直接測定のアクセスも困難ですのでドナー胚の死体の保存が重要になります。死体から DNA 解析は、移植生殖17で発生する突然変異の程度のためのプロキシとして機能します。
突然変異の成功を評価する 1 つの方法は、対象となっているゲノムの領域にまたがる PCR 産物を直接シーケンスすることです。多くの動物から多数個別に複製する DNA のフラグメントのシーケンスに特にコストと非効率な 1 つの願いになります。モザイク胚遺伝子から派生するいるとターゲット ・ サイトで異種 amplicons のシーケンスを使用して各胚19の変異導入効率を評価する代わりに、クロマト グラムの可視化は、ターゲットのシーケンスとなるピーク「スクランブル」(すなわち、各塩基の位置で表示される複数拠点に対応するピークの共起) 野生型シーケンス (ピーク) 上流を示していますの下流Cas9 触媒を用いた二本鎖切断のサイト。このようなプロファイルの例としては、S1 のブリッツの図ら見つけることが。17. これらのスクランブルのピークで表される突然変異の範囲の正確な定量はシーケンス分解アルゴリズム、潮 (https://tide-calculator.nki.nl/)31を使用して得ることができます。自信、それぞれの胚は正しく注入し、突然変異誘発のために目標を与えるこの手法を用いた個々 の胚をスクリーニングします。蛍光タグ デキストランなどのトレーサーは成功した射出24の確認に使用することができ、オタマジャクシは、移植された組織 (未発表データ) を運ぶ確かに確立を支援することができますも。一緒に Cas9 sgRNA 蛍光デキストランの射出が Cas9 の変異導入効率を恐れ形式的な可能性が検討されていないことに注意してくださいすることが重要です。不十分なまたは unmutagenized ドナーから移植を含む任意の"leapfrogged"胚は破棄できます。
リープフロッギング F1胚における効率的な表現型解析を許可することによって標準的な育種のスキームで F2世代分析の必要性を回避できます。必須遺伝子を変異させる標準的なアプローチを使用して、Cas9 sgRNA 線量の慎重な滴定がで減らされた突然変異誘発効率創始者胚の生存性を確保するためです。F0を存続この標準の配色から動物はその後にキャリアを識別するために上映される、実行可能なの F1胚を取得する wildtypes と outcrossed します。最後に、これらの F1ヘテロ接合体は性的な成熟に成長され突然変異体の表現型を表示するホモの F2個人を取得する intercrossed。対照的に、突然変異体の対立遺伝子を持つ彼らの germlines の完全な交換を持って作り出す動物を飛び越えて、ためにはこれら F0動物を交配 F1世代の突然変異体の表現型を生成します。電撃ら17 F0動物がメラニン形成細胞と網膜の色素沈着に必要なチロシナーゼ(tyr) の軌跡をターゲットの大半が 100% 生殖 ( 、アウトブ リードによって測定を示したことを報告しました。tyr-/- アルビノ動物) のドナー由来変異ゲノム (図 4 a Bと表 1を参照)。したがって、リープフロッギングによって生成される 2 つの動物を交配ホモ接合体あるいは複合ヘテロ接合体変異 F1胚をもたらすでしょう。
同様の結果は、 goosecoid (gsc) 遺伝子 (DNA 結合ホメオ ドメイン エンコード) ホメオ ボックスの突然変異を運ぶ F0アベンテイル動物を交配により17を求めた (図 4 a, C Hを参照してください)。X. laevis [morpholino アンチセンス オリゴヌクレオチドを使用して Gsc 式のノックダウン示唆gsc遺伝子は32の前頭部の完全な開発に必要な Cas9 sgRNA 注入オタマジャクシもショー胚性致死表現型17。ただし、leapfrogged F0動物、野生型であるアデノーマは実行可能で、堅牢な、F1コンテンツクリエイター生産X. laevisノックダウン17の発行するものに同一の LOF の表現型の胚。Morpholino の表現型と同様、原則の証拠を飛び越えてのこれらのデータ提供遺伝の確証は、胚性致死の表現型を克服するために使用できます。
図 1: 移植に必要な材料。(A) ホウケイ酸ガラス パスツール ピペットを使用して眉髪のナイフと髪が初期胚のマイクロサージェリーのループします。ブンゼン バーナーを使用してガラスを図面は髪の挿入のための狭い端にことができます。赤の矢印は、ガラスを破ることでおおよその位置をマークします。(B) ピペットに速乾性の接着剤で固定眉髪のナイフ (上) と毛のループ (下) の例。96 ウェル PCR プレートの (C) の部分は金型の周りを固めるための 1% の agarose を許可することで、アガロース ・ プレートのくぼみを作成する使用されます (アガロースは 0.3 x または 1 で作られてX. tropicalis で、移植が行われているかどうかに応じて、x MMRまたはX. laevis、それぞれ)。Agarose の厚さは 3-4 mm ~ 5 mm-深井戸。(D) 移植、12 のアガロース ・ プレートの例のくぼみ、パネルCに示すように。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 中原腸胚初期と郭清の戦略に後期胞胚の植物極の形態。(A ~ F)アフリカツメガエルの性胚胞胚期 9 の初めからの half-hourly 間隔で植物性ビューに表示 (4.5 hpf) 初期原腸胚ステージ ~10.25 に (7 hpf)。5 の前に hpf、割球が大きくより簡単に破損します。白破線の円は、パネル (EおよびF) の背側 (上) の先頭を形成を見ることができる原腸陥入時にボトル細胞形成の正常な位置をマークします。リープフロッギングの 4 つが切開広場内、黒の破線で描かれた、最終的なカット (示されていない) 組織の表面に平行な作られた植物性の外植体を解放します。スケール バー = 400 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 移植します。(A) 植物性の PGC を含む組織の除去後 ~5.5 hpf 胚の例。黒い点線のボックスと白い破線の円は、図 2に示すように、同じ相対寸法です。パネル、ビューアーに直面して内面の胚から削除 (B)、植物性植側 mm あたり約 0.4-0.45 mm で深さ 0.25 0.3 です。(C) 移植された植物組織を持つ胚。画像は、移植後 〜 10 分を買収されました。(D)、植物性、移植後 30 分組織 (穏やかな旋回、眉髪のナイフで上記パネルCに見られる破片を一掃渦を作成する使用された胚) 場所に治癒が見られています。1/9 倍 MMR と 25 ° C で培養する転送後、ほとんど胚の原腸陥入通常完了します。スケール バー = 400 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: F0動物から生殖のリープフロッギング プロデュースします。(A) リープフロッギングの 2 つの遺伝子は、CRISPR/Cas9、チロシナーゼ(上)、 goosecoid (下) に狙われました。Tyr遺伝子は、N 末端のシグナルペプチド (SP、赤影) (青) のコーディングのシーケンス内でターゲットを絞った4、5 、 gsc遺伝子がコーディングでシーケンス内でターゲットを絞った17ホメオ ボックス (赤影) の初め、2 つのエクソン間で分割されています。5' と 3' exonic の非翻訳領域が影付きです。(B) からのすべての 160 F1オタマジャクシ (表 1を参照してください) leapfrogged F0男性 (LF1) とアルビノの繁殖 (tyr-/-)女性だったことを示すアルビノ leapfrogged 男性から全体の生殖であったtyr変異の生殖細胞に置き換えられます。はめ込みは、通常網膜とメラニン色素沈着と野生型の幼生を示しています。(C H)2 F0エムアンドエー インター クロスから派生した F1胚アベンテイルアフリカツメガエルホメオ ボックス遺伝子をターゲットとgsc。Gscの表現型変異胚の約 2/3rds、表現型とされる (E H) 頭の前部切り捨ての度合い。変異体の半分かサイクロ ピックやその他の半分が眼 (H) 密接に間隔の目 (F) を持っていた。ジェノタイピングは、これらについてまたは複合ヘテロ接合体を示した。野生型のホモまたはヘテロ接合体 (C, D) の野生型表現型を示す胚の 1/3rd .Otx2 (前脳、中脳、目のマーカー)、 egr2 (マーカー 3 と 5、および神経の頂上のストリームを菱脳 rhombomeres) およびhoxb9 (脊髄のマーカー) のin situハイブリダイゼーションは、の損失を示しています。gsc関数otx2ドメインの前方の部分のみに影響を与えます。電撃らからこれらのデータを再生しています。生物学者の会社から許可を得て17 。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| クロス | 男性 | 女性 | アルビノ | 野生型 | 合計 | % アルビノ |
| 1 | LF1 | tyr-/- | 160 | 0 | 160 | 100 |
| 2 | LF2 | tyr-/- | 148 | 0 | 148 | 100 |
| 3 | tyr-/- | LF3 | 409 | 0 | 409 | 100 |
| 4 | tyr-/- | LF4 | 0 | 519 | 519 | 0 |
| 5 | tyr-/- | LF5 | 223 | 0 | 223 | 100 |
| 6 | LF6 | tyr-/- | 493 | 703 | 1196 | 41.2 |
| 7 | tyr-/- | LF7 | 1 | 94 | 95 | 1.1 |
| 8 | tyr-/- | LF8 | 125 | 0 | 125 | 100 |
| 9 | tyr-/- | LF9 | 0 | 417 | 417 | 0 |
| 10 | tyr-/- | LF10 | 252 | 0 | 252 | 100 |
チロシナーゼの突然変異を運ぶリープフロッグ移植によって表 1: 効率的な生殖細胞系列交換。チロシナーゼをターゲットに、男女の移植軸受け動物が得られました。これらの動物は、ホモtyr-/-、突然変異体の対立遺伝子の生殖と幼生段階で検定した白子症を示した F1胚の % の効率をテストするためのアルビノと交差しました。「男性」と「女性」というラベルの付いた列内のエントリは、親がtyr-/- またはリープフロッギング (LF) から派生した実験動物のいずれかを示します。アルビノ表現型は「% アルビノ」の下で示されるクロス表示内で胚の割合リープフロッグ移植 10 動物の 6 が突然変異体の対立遺伝子と完全に (100%) 代替を示したことに注意してください。電撃らからこのテーブルを再現します。17権限を持つ。
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Discussion
このレポート提供中動物の生殖細胞を変更する PGCs。 移植の PGCs を含む植物性の組織移植のための詳しいプロトコルはゲノム編集技術 (例えばCRISPR/Cas9) と組み合わせて使用遺伝子野生型としてその体細胞組織のほぼすべてを維持します。成功するリープフロッギングの行う移植を実行する前に考慮すべき重要な要因の数があります。
生殖細胞の突然変異体の対立遺伝子との完全な代替品を確保するため、1 つは最初 sgRNAs の生体内で効率を決定することをお勧めします。経験では、ほとんど sgRNAs CRISPRDirect (https://crispr.dbcls.jp/) または CRISPRScan (http://www.crisprscan.org/) によって設計されている 250 pg/胚で使用すると効率的を示唆しています。ただし、場合によっては、高濃度 (例えば電撃ら17刊gsc sgRNA ~ 1 ng/胚を必須) を使用する必要がある場合があります。ターゲット ・ サイトの突然変異誘発性を評価することが不可欠であると潮の使用により、定量的評価31。強調したメソッドはここで直接サンガーを使用中 (F0胚の突然変異体の対立遺伝子の人口を表す)、PCR 産物の多数の他の方法使用されているゲノム編集文献でこの目的のため。一般的に使用される他の穏健派にローコスト テクニックがあります損失制限酵素33や測量、Cas9/TALEN 胸の谷間のサイト34T7 エンドヌクレアーゼ 135のいずれかを使用してフラグメント長多型解析36試金、37、ヘテロ二本鎖のモビリティ アッセイの高分解融解法38、フラグメント キャピラリー電気泳動39,40, と qPCR 法41,による分析42。
第 2 考察は、ターゲット サイトのターゲット遺伝子内の場所の選択です。F1世代の突然変異体の表現型の効率的回収を許可するには、完全な LOF の対立遺伝子のためのチャンスを最大化することが重要です。古典的なアプローチを使用して突然変異系統を作る蛋白質コード領域の先頭付近は時期尚早翻訳終結を引き出すために、地域のコーディングの 5' 端近く Cas9 胸の谷間を対象とする共通の戦略です。フレーム シフト突然変異で、F1のヘテロ接合体が識別され、これらの動物には劣性を運ぶことが期待されますので、以降の作業選択されているでしょう。馬跳びの戦略は、F0 intercrosses を使用しているのでターゲットにコード配列の 5' 端のアプローチは高効率になります。F0胚モザイク germlines、ほとんど F1突然変異体の人口の交配結果複合ヘテロ接合体17。この方法で生成されるほとんどの F1胚がフレーム内で少なくとも 1 つの対立遺伝子が大規模解析は、平均して、二重鎖切断による突然変異の予想 ~1/3rdはフレームで43を検証するため突然変異であり、野生型の活動を保持可能性があります。したがって、これらのフレームで変異遺伝子の null にする可能性がありますを確実にする別の戦略が必要です。通常のタンパク質の機能に不可欠なタンパク質フォールディングのドメイン内で二重鎖切断をターゲット完了 LOF (null 対立遺伝子)17,44のより高いチャンスが発生する予定です。タンパク質ドメインの原子レベルの構造を慎重に考慮、利用可能な場合、ドメイン構造 (を混乱させることは、単一のアミノ酸のフレームの削除を含む場合でもを予想する二次構造の領域を識別するに役立ちます例えば、 gsc電撃ら17刊の Δ3bp 突然変異)。これらの地域内 CRISPR/Cas9 ターゲット サイトを識別できる場合 null 対立遺伝子を正常に作成するより高いチャンスがあります。柔軟な地域変異がタンパク質まだありますので、蛋白質二次構造コンポーネント間の溶媒露出ループ内で小さな削除が少ないことが望ましい。
リープフロッギングの第 3 考察は受信者の胚から PGC 除去の効率です。この手順は、完全な生殖系列の置換を確保するために効率的になる必要があります。ここで説明したメソッドによって作成されたすべての移植受容胚が胞胚期の胚における PGC マーカーのローカリゼーションで交配を変動場のPGCs 全体マウントの完全な除去をあるかどうかは不明です。多くの場合、すべて、またはほぼすべての信号が見つかった付近の胚の植物性ほとんど終わりしたがって、ここで説明した手術によって除去が (そこに電撃ら17と引用)。しかし、いくつかの胚は、胞胚腔床に近いいくつかのセルで PGC マーカー式を示します。生殖質は、まず受精後植物極で連結し、胸の谷間の溝に沿って初期亀裂の中にスイープし。いくつかの生殖質植物性の半球の中央にあるセルの分散になることがあります、胞胚腔まで移植を使わず効果的に削除できません。しかし、それもマイクロ Rna が細胞45,46mRNAs を PGC をオフに知られているこれらの深い細胞の生殖細胞マーカーが含まれている可能性があります、生殖に寄与していないことに注意する重要です。これらの深い細胞 PGC マーカー陽性染色などのクリアランスを受ける体細胞があります。受信者の胚から完全に PGC 削除を確認する手法を開発中です。
最後に、それもリープフロッギングして生成するどのように多くの F0動物を考慮する重要です。可変個動物の性的な成熟に生き残るれませんと 20 以上の胚を移植を含むを作成することをお勧めします。それは、(1) 男女の十分な数を確保するため十分な生存動物のいただきますが必要とこれらが研究者によって計画された解析に合うように十分に高い頻度で変異遺伝子を送信 (2) になります。
ここでは、いくつかの練習で説明されたプロトコルを使用して両生類胚はいくつかの練習と PGC 移植テクニックをマスターすることができる必要があります。飛び越えては他の両生類も、容易に移植可能胚発生の初期の段階で個人間孵卵を含んでいる他の生物だけではなく、可能なはずです。
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Disclosures
著者は、何を開示します。
Acknowledgments
この作業は、助成金の支援を受けて行われた 5R21HD080684-02、国立小児保健と人間開発から。著者は彼の継続的な熱意と支援の県町をお礼申し上げます。著者とも認めるしたいブルース ・ ブランバーグ彼のカメラ、リベカ チャーニー、原稿とショーン · マクナマラ、Marcin Wlizla 国立アフリカツメガエルリソース (RRID:SCR_013731) での重要な読書のための使用のための貴重なX. tropicalisの餌と動物の治療法についての会話。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 or 11252-30 | |
| Eyebrow hair knife | Homemade | ||
| Hair loop | Homemade | ||
| Pasteur pipettes, borosilicate glass | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| Krazy Glue (Cyanoacrylate-based) | Elmer's Products, Inc. | KG581 | To affix eyebrow hair and hair loops into Pasteur pipettes, other similar glues can be used. |
| Oligodeoxynucleotides, custom ordered | Integrated DNA Technologies | Custom ordered | Template oligos for sgRNA synthesis, see Nakayama et al., 2014 for design details. |
| Megascript T7 kit | Ambion/ThermoFisher | AM1334 | Or use Megashortscript T7 (AM1354) kit |
| Phenol, Tris buffered | High quality distilled phenol from any commercial supplier | ||
| Chloroform | High quality chloroform from any commercial supplier | ||
| Ethanol | High quality ethanol from any commercial supplier | ||
| Diethylpyrocarbonate (DEPC) | Sigma Chemical Co. | D5758-50ML | |
| Cas9 protein, with nuclear localization signal | PNA Bio, Inc. | CP01 | Reconstituted using DEPC-treated water according to manufacturer's recommendations |
| 10X Marc's Modified Ringers solution | Homemade. Recipe (ref 26) for 1X MMR (lacking EDTA) is 100mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES. Solution is pH adjusted to 7.4. | ||
| Agarose | Any Molecular Biology grade agarose is sufficient | ||
| 60 X15 mm Petri plates | Falcon | 351007 | |
| 24-well plates | Falcon | 3047 | |
| L-Cysteine | Sigma Chemical Co. | C7352-100G | Free base, not HCl salt |
| Proteinase K | Roche | 03 115 828 001 | Typically ~20mg/ml from Roche |
| sera Micron | sera | Tadpole food. Resuspend in growth medium. Can be purchased from a variety of online retailers |
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