Summary
Genen essentieel voor overleving vormen technische hindernissen voor het maken van mutant lijnen. Sprongen omzeilt letaliteit door het combineren van genoom bewerken met primordiale geslachtscellen transplantatie wild-type dieren uitvoering germline mutaties maken. Sprongen maakt ook de efficiënte generatie homozygoot null mutanten in de F1 generatie. Hier, wordt de transplantatie stap aangetoond.
Abstract
De oprichting van mutant lijnen door het bewerken van het genoom versnelt genetische analyse in vele organismen. CRISPR/Cas9 methoden zijn aangepast voor gebruik in de Afrikaanse klauwkikker kikker, Xenopus, een langdurige modelorganisme voor biomedisch onderzoek. Traditionele fokken regelingen voor het maken van homozygoot mutant lijnen met CRISPR/Cas9-gerichte mutagenese hebben verschillende tijdrovend en moeizaam stappen. Ter vergemakkelijking van de oprichting van mutant embryo's, met name voor het overwinnen van de obstakels die is gekoppeld aan het uitsparen van genen die essentieel voor embryogenese zijn, ontstond een nieuwe methode genaamd sprongen. Deze techniek maakt gebruik van de robuustheid van Xenopus embryo's "knippen en plakken" embryologische methoden. Sprongen maakt gebruik van de overdracht van primordiaal kiemcellen (PGCs) van efficiënt mutagenized donor embryo's in wildtype PGC-ablated worden broers en zussen. Deze methode zorgt voor de efficiënte mutatie van essentiële genen door het creëren van chimeer dieren met wildtype somatische cellen die een mutant germline dragen. Wanneer twee F0 dieren uitvoering "haasje transplantaties" (dat wil zeggen, mutant geslachtscellen) zijn intercrossed, ze produceren homozygoot of samengestelde heterozygote, null F1 embryo's, waardoor het opslaan van een volledige generatietijd om fenotypische gegevens te verkrijgen. Sprongen biedt ook een nieuwe aanpak voor het analyseren van maternale effect genen, die vuurvaste F0 fenotypische analyse na CRISPR/Cas9 mutagenese. Dit manuscript detailleert de methode van de sprongen, met speciale nadruk op het succesvol uitvoeren van PGC transplantatie.
Introduction
Hoe genotype codeert fenotype is een grote vraag in de biologie sinds de herontdekking van wetten van Mendel. Inzicht in de rollen van genen, hun regelgeving en interacties binnen gene netwerken, en de functies van gecodeerde producten belooft te bieden hulpprogramma's voor het blootleggen nieuwe biologie en verbetering van ziekte staten. Voor meer dan de helft een eeuw1is de Afrikaanse klauwkikker kikker, Xenopus, een toonaangevende model voor studies over een breed scala aan onderwerpen in de fundamentele biologie en de biogeneeskunde, met inbegrip van de genetische controle van ontwikkeling. Historisch, meeste onderzoek op Xenopus hanteert de allotetraploid kikker, X. laevis, maar meer recentelijk als gevolg van de diploidy, X. tropicalis is ontwikkeld als een amfibie genetische model. Compleet genoom sequenties zijn samengesteld uit beide Xenopus soorten2,3. De "kikker Gemeenschap" is nu op een keerpunt waar fundamentele genoom modificatietechnologie toelaat de studie van de genfunctie, vrijwel op wil. Programmeerbare CRISPR/Cas9 enzym hebben de mutagenese van genen zeer efficiënt, met biallelic mutatie mogelijk in de meeste cellen van de dierlijke4,5,6,7, 8,9,10,11. Deze studies, onderstreept door Bhattacharya et al. 12 en Shigeta et al. 13, hebben aangetoond dat de functie van veel genen door mutagenese in F0 mozaïek dieren kan worden bestudeerd. Deze aanpak heeft vele voordelen; embryo's Cas9-sgRNA-microinjected wordt echter vaak een variabele fenotypen als gevolg van onvolledige verlies van functie (LOF) weergegeven. En wat nog belangrijker is, de generatie van mutant lijnen is zeer voordelig voor sommige toepassingen — in het bijzonder bij de studie van genen die een maternale mRNA-bijdrage hebben. Maternale mRNAs en proteïnen, en hun invloeden op de epigenetica, aanhouden gedurende een langere periode in embryogenese14,15,16, waardoor de vroege ontwikkeling bijdragen van vele genen vuurvaste tot F0 analyses. Andere benaderingen LOF zijn dus vereist.
Bij het zoeken naar mutant lijnen te maken, heeft het pad naar het verkrijgen van de embryo's homozygoot LOF verschillende obstakels. Eerste, efficiënte mutagenese voor de productie van biallelic mutaties kunnen nadelig zijn, omdat het verlies van essentiële gene functies resulteert in falen om te overleven naar seksuele volwassenheid, mengend in de productie van een levensvatbare lijn. Een gemeenschappelijke oplossing is de zorgvuldige titratie van het bedrag van Cas9-sgRNA geleverd. Hier, is het doel om een evenwicht tussen de vermindering van de letaliteit terwijl ook maximaliseren van de efficiëntie van germline mutagenese. Een tweede probleem vloeit voort uit de standaard fokken regeling, waar fenotypische analyses zijn uitgesteld tot de F2 generatie. Met behulp van de standaardbenadering, seksueel volwassen F0 dieren die mutant allelen via de germline zijn outcrossed zenden voor de productie van F1 heterozygoot "vervoerders", die zijn vervolgens uitgegroeid tot seksuele volwassenheid. Twee F1 heterozygoten zijn dan intercrossed om te produceren van F2 mutant embryo's bij een verwachte Mendelian frequentie van 25%. Twee generaties van de fok zijn dus nodig voor de analyse van de mutant fenotypen. Mutant dieren kunnen zijn homozygotes of samengestelde heterozygoten (dat wil zeggen, nakomelingen met twee verschillende allelen voor mutant, die afhangt van de genotypen van de ouderlijke proefdieren in de F-1 -intercross).
Deze obstakels kunnen worden weggenomen door het beperken van programmeerbare nuclease-gemedieerde mutagenese naar germinale cellen, die de basis vormt van een nieuwe methode genaamd sprongsgewijze17. Sprongen bestaat uit twee hoofdonderdelen: (1) de microinjection van de Cas mRNA samen met sgRNA, of nuclease-sgRNA complexen (of, in beginsel, TALENs of zink vinger nucleasen) stadium de eencellige efficiënt mutagenize embryonaal genoom, gevolgd door (2) de transplantatie van PGCs in wildtype broer/zus embryo's, waar de endogene PGCs werden verwijderd. Wanneer beide stappen zijn efficiënte, volledige germline vervanging en de mutant geslachtscellen kunnen worden verkregen. Blackler aangetoond in de vroege jaren 1960 dat Xenopus PGCs kon worden getransplanteerd tussen embryo's op de late neurula en vroege tailbud fasen18,19. Voor sprongen, werd Blackler de aanpak gewijzigd door het uitvoeren van de transplantatiecentra op de blastocyste stadium17, wanneer PGCs zijn gelokaliseerd in de vegetal pool van het embryo20,21. Transplantatie voordat gastrulatie twee belangrijke voordelen heeft. Ten eerste is de engraftment van transplantaties en de verdere ontwikkeling van de normale bleek te zijn efficiënter wanneer de transplantatie wordt uitgevoerd in het stadium van de blastocyste (niet-gepubliceerde opmerkingen). Ten tweede, door blastocyste-fase transplantaties te voeren kort nadat zygotic transcriptie is begonnen, kan men de letaliteit als gevolg van ontwikkelingsstoornissen gen mutaties die gastrulatie of die verstoren anderszins tot misvormde laat neurulae leiden vermijden. PGC transplantatie-bevattende ("overgeslagen") embryo's worden geteeld naar seksuele volwassenheid, en intercrosses tussen deze F0 dieren hebben aangetoond dat, in veel gevallen, 100% van het nageslacht van F1 het fenotype van de LOF (meeste zijnde samengestelde weergeven heterozygoten), met vermelding van de volledige germline vervanging door de gerichte mutaties.
De verwachting is dat de sprongen genetische benaderingen in Xenopuszal versnellen. Sprongen biedt ook een alternatief voor de "overdracht van de ontvangst" methode22 voor de analyse van de LOF van moeders-effect genen (niet-gepubliceerde opmerkingen). In de huidige publicatie, wordt een gedetailleerde beschrijving van de methode, vooral gericht op PGC transplantatie, voorgesteld in X. tropicalis (met kleine wijzigingen voor X. laevis). De transplantatie van PGCs is hier gedemonstreerd om een snellere overdracht van deze technologie aan andere laboratoria die werken met Xenopus. De beginselen van deze methode moeten lukken in andere amfibieën (bijvoorbeeld urodeles) en organisme-specifieke wijzigingen in de methodologie ruimte laten voor toepassing op vele andere dieren waarin efficiënte mutagenese kan worden bereikt en PGCs zijn gemakkelijk transplanteerbaar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik van het Comité van de Universiteit van Californië, Irvine.
1. voorbereiding voor PGC transplantatie
- Bereiden dissectie hulpmiddelen, als eerder beschreven23.
Opmerking: Wenkbrauw haren messen worden gebruikt voor het maken van insnijdingen met de hulp van een haar lus te stabiliseren van het embryo tijdens het uitvoeren van de operaties. Wenkbrauw haren en haren loops zijn gelijmd in borosilicaat glas Pasteur pipettes die eerst zijn getekend in een vlam en gebroken op het verdunde gedeelte (Zie figuur 1A, pijlpunt) maken een kortere, smaller tip (figuur 1B) voor grotere beweeglijkheid bij het uitvoeren van chirurgische ingrepen. - Genereren sgRNAs met behulp van de eerder beschreven procedures24 .
Opmerking: Kort, korte DNA sjablonen codering voor sgRNAs worden gemaakt met behulp van overlappende deoxyoligonucleotides met 5' bacteriofaag T7 initiatiefnemers, die worden gegloeid en "ingevuld" door een foutloze, thermostable polymerase van DNA. In vitro sgRNA synthese reacties worden geïncubeerd urenlang naar girale (afhankelijk van de kit gebruikt). Reacties zijn DNAse-getrakteerd op de sjabloon verwijderen. De sgRNAs worden gezuiverd door standaardmethoden van fenol/chloroform extractie en ammonium acetaat/isopropanol en neerslag, volgens van de instructies van de fabrikant van de kit24. - Kort voor het uitvoeren van microinjections, Cas9-sgRNA complexen bereiden door eerste denatureren ~ 250 ng van sgRNA in een totaal volume van 3 µL van RNAse-vrij (diethylpyrocarbonate-behandeld) H2O bij 60-65 ° C gedurende 5 minuten, gevolgd door snelle afkoeling op ijs gedurende 5 minuten. Centrifugeer het sgRNA gedurende een paar seconden, voeg 1 µL van 1 µg/µL Cas9 eiwit en incubeer gedurende 10 minuten bij 37 ° C te bevorderen complexvorming.
Opmerking: Na deze incubatie, de buis kan worden gehouden op het ijs terwijl de voorbereiding van de embryo's van microinjection. - X. tropicalis embryo's verkrijgen door in vitro bevruchting met standaardmethoden, als eerder beschreven25. De gelei25,,26 de embryo's op 10 min na bevruchting.
Opmerking: Bevruchting tijd wordt beschouwd als de tijd na de schorsing van het sperma wordt toegevoegd aan de eieren en de schotel overspoeld met 1/9thX wordt van Marc's bewerkt Ringers (BMR)26. Voor X. tropicalis25, in tegenstelling tot X. laevis, voeren de-jellying in 1/9 x MMR met 3% cysteïne vrije base (niet het HCl-zout), pH aangepast naar 7,8-8.0, gevolgd door meerdere wasbeurten in 1/9 x MMR. Transfer van de embryo's naar een agarose (1%)-gecoate schotel met daarin 1/9 x MMR bij kamertemperatuur. - Onmiddellijk overdracht de embryo's te worden geïnjecteerd met een 1% agarose beklede schotel met 1 x MMR met behulp van een precisiepipet Pasteur.
-
Injecteren op de fase 1-cel. Zie referenties26,27 voor gedetailleerde beschrijvingen van Xenopus microinjection methoden.
- Injecteren van elk embryo op één site in de pool van het dier, met 4 nL van Cas9-sgRNA-complex (eindbedrag = 1 ng van Cas9 en ~ 250 pg van sgRNA; Zie de discussie)24. Na 10-20 min van injectie site genezing, overbrengen in de embryo's een agarose beklede schotel met daarin 1/9 x MMR en Incubeer bij 25 ° C. Ook maken een schotel van uninjected broer/zus embryo's die als graft ontvangers dienen zal.
-
Bereiden van Petri-platen (60 mm) die een ~ 5 mm bevatten-dikke laag van 1% agarose gemaakt in 0.3 x MMR, als het doen van transplantaties in X. tropicalis, of 1 x MMR voor X. laevis.
- Maken van depressies ~ 3-4 mm diep door invoeging van een 3-x 4-well schimmel (gemaakt door het snijden van een 96-Wells PCR plaat) in de gesmolten agarose bij het gieten van de platen (Zie Figuur 1 c en D). Houd de mal enkele millimeters boven de onderkant van de petrischaal met behulp van een klem die is gekoppeld aan een ring staan totdat de agarose is gehard.
- Bovendien maken een 24-well-plate huis individuele embryo's door de coating van de putjes met een dun laagje van 1% agarose gemaakt in 1/9 x MMR.
Opmerking: Het kweekmedium toegevoegd aan deze putten is 1/9 x die MMR aangevuld met 50 µg voor gentamycine sulfaat/mL.
2. transplantatie van PGCs
- Wanneer de embryo's slechts bereiken Nieuwkoop en Faber28 blastocyste fase 9 (figuur 2A), ~4.5 h na bevruchting (hpf) voor X. tropicalis, uit de 25 ° C incubator verwijderen en laten equilibreer tot kamertemperatuur voor een extra 0.5 h.
- Om te beginnen de transplantatie op 5 hpf (figuur 2B), een pipet van Pasteur gebruiken voor het overdragen van één PGC donor embryo (ingespoten met Cas9-sgRNA) op de 60 mm agarose dish met depressies (gemaakt in stap 1.7) in 0.3 x MMR (of 1 x MMR als X. laevisgebruikt). Ook het overzetten van één embryo uninjected broer/zus, de ontvanger van de graft, aan dit gerecht.
Opmerking: Het is essentieel dat de identiteit van elk van deze embryo's niet worden verward. - Handmatig verwijderen van de vitelline enveloppen van elk embryo met pincet en draai beide embryo's zo dat hun vegetal Polen in de weergave en toegankelijk voor chirurgie zijn.
Opmerking: Een beschrijving van handmatig de-vitellination van embryo's is eerder beschreven26. - Met behulp van de scherpe punt van een mes wenkbrauw haren, maak vier ondiepe insnijdingen in de vorm van een vierkant op de vegetal paal van het ontvangende embryo, binnen de zone waar toekomstige fles cellen dat merk de blastopore zal vormen. Maak de insnijdingen door het invoegen van het topje van de wenkbrauw haren mes in het embryo, net onder het oppervlak, en snijden opwaartse bewegingen tijdens het stabiliseren van het embryo met de haar lus maken.
Opmerking: Figuur 2 geeft plantaardige weergaven van een embryo elk half uur intervallen van 4.5-7.0 hpf te tonen van de grootte van de cel en bedoeld als richtsnoer voor het schatten van waar de flessen cellen (onderbroken witte cirkel) zal vormen. Het doel is om insnijdingen waar de onderbroken zwarte doos wordt aangegeven. - Zodra de vier zijden van het vierkant zijn afgebakend door insnijdingen, verdiepen elke snede met de wenkbrauw haren mes met behulp van soortgelijke snijden bewegingen te bereiken een diepte van ongeveer 1/3 tot 1/2 van de afstand tot de blastocoel vloer.
- Gratis de explant plantaardig weefsel uit de ontvangende embryo (figuur 3A en B) door een horizontale (parallel aan de plantaardige oppervlak) cut(s) diep plantaardige regio.
Opmerking: De grootte van de PGC-bevattende plantaardige explant is ongeveer 0.4-0,45 mm per kant en 0,25-0.3 mm in diepte. Deze plantaardige explant uit de ontvangende embryo is niet langer nodig en moet daarom worden gereserveerd moeten worden afgevoerd. - Snel werkend, herhaal deze procedure (stappen 2.4-2.6) voor het embryo van de donor PGC maken een fragment van vergelijkbaar formaat plantaardige weefsels voor transplantatie.
Opmerking: Het is belangrijk voor het uitvoeren van deze tweede dissectie met weinig vertraging om de tijd van het ontvangende embryo te genezen van haar open wond te minimaliseren. - Zodra de weefsel bevattende PGCs is verwijderd van het embryo van de donor, gebruiken de wenkbrauw haren mes en haar lus positie in de opening gemaakt in de ontvangende embryo zetten deze explant.
Opmerking: De binnenkant van de donor prothese moet worden geconfronteerd met het interieur van de ontvanger embryo. Het is niet noodzakelijk overeenkomen met de oriëntaties van de assen van het dorsale-ventrale en links-rechts van de prothese met het ontvangende embryo. - Gebruik de lange zijde van de as van de wenkbrauw haren mes, die evenwijdig aan het oppervlak van de prothese, gehouden om het zachtjes druk op de prothese in de opening in de plantaardige oppervlak van het ontvangende embryo.
- Als de prothese is geplaatst, gebruik een hairloop of de schacht van een wenkbrauw haren mes voorzichtig het "karkas" van het embryo van de donor glijden over het oppervlak van het agarose en in een depressie agarose. Ervoor te zorgen dat de open wond van het karkas wordt geconfronteerd met de bulk-vloeistof. Als dat niet het geval is, gebruik maken van de wenkbrauw haren mes om te draaien het embryo om te bereiken deze oriëntatie.
- Schuif het ontvangende embryo, met de prothese genezing in plaats, in een aangrenzende depressie en ook ervoor te zorgen dat het geënte vegetal pole weefsel wordt geconfronteerd met de bulk-vloeistof.
- Herhaal deze procedure (stap 2.1-2.11) gebruik van een ander paar van donor en ontvanger embryo's voor het maken van een ander paar van de transplantatie/karkas; Breng deze aan lege depressies.
Opmerking: Het is essentieel dat men maakt notaties om paren van karkassen en transplantatie-bevattende embryo's bij te houden. De karkassen van de donor zal worden gebruikt als een proxy voor de efficiëntie van Cas9-sgRNA-geïnduceerde mutagenese in de getransplanteerde PGCs, die gemakkelijk kan niet worden bepaald tot de transplantatie-dragende dieren geslachtsrijp (zie stap 3.3, hieronder, en de discussie ). - Doorgaan met het maken van transplantaties, de embryo's tot ongeveer begin gastrulastadium 10, die ongeveer 6.5 hpf in X. tropicalis (Zie figuur 2E).
3. genezing na verzorging van embryo 's
Opmerking: Transplantaten genezen op zijn plaats binnen ~ 30 min, en het is normaal om te observeren wat yolky puin van lysis van de cel van het embryo (Figuur 3 c) uitstraalt.
-
Eenmaal genezen, kunt een pipet van Pasteur heel zachtjes overdracht embryo's van de depressies aan individuele putjes van een 24-well agarose beklede plaat. De afgescheiden zal worden verwijderd (figuur 3D) door een vloeistof mengen tijdens de overdracht.
- Draai de embryo's zo dat zij plantaardige-polig omhoog, geconfronteerd met de bulk-oplossing worden gebracht. Nogmaals, plaats de karkassen van de donor en enten van geadresseerden in aangrenzende putten om te helpen bij het bijhouden van embryo paren; het opnemen van deze informatie.
- Overdracht van de 24-well plaat met embryo's een 25 ° C incubator voor overnachting cultuur.
Opmerking: De volgende dag, de embryo's zullen hebben bereikt tailbud fasen. - De ontvangers van de prothese schoon agarose beklede 6-Wells-platen met 1/9 x die MMR aangevuld met 50 µg voor gentamycine sulfaat/mL, met 1 embryo per putje te verplaatsen. Donor karkassen die overeenkomen met deze duidelijke bijhouden graft ontvangers.
- Om te beoordelen mutagenese efficiëntie door sequentiebepaling PCR waarbij5,17,24 of het gebruik van andere methoden die afhankelijk zijn van PCR waarbij (Zie de bespreking), individuele karkassen naar 0,2 mL PCR strip buizen te verplaatsen. Meeste van het medium verwijderd en meng in 100 µL lysis buffer24 met proteïnase K (PK) door herhaald en neergaande pipetteren met behulp van een precisiepipet P200.
- Voeren embryo lysis24 bij 56 ° C gedurende 6 uur naar girale zodat PK spijsvertering. Inactivering van PK door verhitting het tot 90-95 ° C gedurende 10 min, gevolgd door snelle afkoeling tot 4 ° C. Gebruik lysates zonder verdere cleanup stappen om het zaad van de PCR reacties om te verkrijgen van korte waarbij voor directe Sanger DNA sequencing24. Winkel de lysates bij-20 ° C.
Opmerking: Binnen enkele dagen, de kikkervisjes haalt voeding fasen (fase ongeveer 45-46) en kunnen worden gevoed een opschorting van de planktonische poeder (sera Micron). - Na ~ 1 week, met dagelijkse wijzigingen van gestolde voedingsbodem te handhaven van de netheid en microbiële begroeiing, te minimaliseren door kikkervisjes naar kleine tanks in een circulerende aquatisch systeem met infuus stroom te verplaatsen. Gebruik de gegevens rangschikken om te scheiden van kikkervisjes met zeer efficiënt mutagenized PGCs van kikkervisjes met lagere mutagenese efficiëntie. Zodra metamorfose voltooid is, verplaats de froglets naar de volwassen aquatisch systeem in het lab.
Opmerking: Regimes ontwikkeld door de nationale Xenopus Resource (Marine Biology Laboratory, Woods Hole, MA) bieden een gids voor tadpole voederen29 en volwassen kikker onderhoud30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Na transplantatie, de kwalitatieve bepaling van de efficiëntie van CRISPR/Cas9 mutagenese moet worden uitgevoerd voordat de inspanning in de veehouderij te groeien en te handhaven van de dieren naar seksuele volwassenheid gebruikten. Omdat dieren uitvoering leapfrog transplantaties somatically wildtype zijn en de germline is moeilijk toegankelijk voor directe metingen, wordt opslaan van de karkassen van donor embryo's belangrijker. DNA-analyse van de kadavers dient als een maatstaf voor de omvang van de mutagenese dat zich in de getransplanteerde germline17 voordoet.
Een benadering voor de beoordeling van het succes van de mutagenese is om direct opeenvolging PCR waarbij verspreid over de genomic regio gericht. Dit wordt vooral dure en inefficiënte als men wil sequentie van talrijke individueel gekloonde DNA-fragmenten van vele dieren. In plaats daarvan, waarbij heterogene op de doelsite, sequencing zoals ze zijn afgeleid van genetisch mozaïek embryo's wordt gebruikt ter beoordeling van de mutagenese efficiëntie in elk embryo19. Visualisatie van chromatogrammen toont de wild type reeks (pieken) stroomopwaarts van het streefcijfer volgorde en pieken geworden "vervormd" (dat wil zeggen, het mede ontstaan van pieken overeenkomt met meerdere bases verschijnen op de positie van elk nucleotide) stroomafwaarts van de site van de Cas9-gekatalyseerde dubbel-strand break. Voorbeelden van dergelijke profielen kunnen worden gevonden in figuur S1 van Blitz et al. 17. nauwkeurige kwantificatie van de omvang van de mutagenese vertegenwoordigd door deze gecodeerde pieken kan worden verkregen met behulp van een reeks ontleding algoritme, TIDE (https://tide-calculator.nki.nl/)31. Screening van individuele embryo's met behulp van deze techniek geeft vertrouwen dat elk embryo goed was geïnjecteerd en voor mutagenese gerichte. Een tracer, zoals een fluorescently tagged dextran, kan worden gebruikt ter bevestiging van de succesvolle injectie24 en kan ook helpen bij de vaststelling van dat een tadpole is inderdaad het dragen van het getransplanteerde weefsel (niet-gepubliceerde gegevens). Het is belangrijk op te merken dat de formele mogelijkheid dat Cas9 mutagenese efficiëntie kan worden gewijzigd door de coinjection van een fluorescerende dextran samen met Cas9-sgRNA is niet onderzocht. Elke "leapfrogged" embryo's met transplantaties van slecht of unmutagenized donors kunnen worden weggegooid.
Sprongen omzeilt de noodzaak in de standaard genetische fokken regelingen, p.a. F2 generatie door efficiënte fenotypische analyses toe te staan in de F1 embryo's. Bij gebruik van de standaardbenadering voor essentiële genen muteren, is zorgvuldige titratie van Cas9-sgRNA dosis nodig om te zorgen voor de levensvatbaarheid van oprichter embryo's, wat resulteert in een verminderde mutagenese efficiëntie. F0 overlevende zijn dieren uit deze standaardkleurenschema vervolgens outcrossed met wildtypes te verkrijgen van levensvatbare F1 embryo's, die worden gescreend om te identificeren van vervoerders. Tot slot zijn deze F1 heterozygoten uitgegroeid tot seksuele volwassenheid en intercrossed om te verkrijgen homozygoot F2 personen mutant fenotypen weergeven. In tegenstelling, omdat sprongen produceert dieren moeten de volledige vervanging van hun germlines met mutant allelen, produceert intercrossing deze F0 dieren mutant fenotypen in de F1 generatie. Blitz et al. 17 gemeld dat een meerderheid van F0 dieren gericht op de locus tyrosinase (tyr), die vereist voor pigmentatie van melanocyten en netvlies is, bleek 100% germline transmissie (gemeten door kruising met Tyr- / - albino dieren) van donor-afgeleide mutant genomen (Zie Figuur 4A-B en tabel 1). Dus, twee dieren geproduceerd door sprongen intercrossing zou opleveren homozygoot of samengestelde heterozygote mutant F1 embryo's.
Vergelijkbare resultaten werden verkregen17 door intercrossing F0 leapfrogged dieren mutaties in het homeobox (de homeodomain van DNA-bindende codering) van het gen goosecoid (SGR) vervoeren (Zie figuur 4A, C-H). Knockdowns van SGR expressie morfolino antisense oligonucleotides met X. laevis gesuggereerd dat het SGR -gen nodig voor de volledige ontwikkeling van de voorste hoofd32 is, en Cas9-sgRNA geïnjecteerd kikkervisjes ook Toon embryonale dodelijke fenotypen17. Echter de leapfrogged F0 dieren, wordt somatically wild type, zijn levensvatbaar en robuust, en de F-1 intercross geproduceerde embryo's met identieke LOF fenotypen aan die zijn gepubliceerd in X. laevis knockdowns17. Deze genetische datanauwkeurigheid van de verstrekte gegevens van het fenotype van de morfolino, evenals een bewijs van beginsel dat sprongen kan worden gebruikt om te overwinnen van embryonale dodelijke fenotypen.
Figuur 1: materialen die nodig zijn voor transplantatie. (A) borosilicaatglas Pasteur pipetten worden gebruikt om wenkbrauw haren messen en haar lussen voor microchirurgie op vroege embryo's. Tekening uit het glas met behulp van een bunsenbrander zorgt voor een smallere einde voor het inbrengen van het haar. De rode pijlpunt geeft de benaderende positie waartegen te breken van het glas. (B) een voorbeeld van een wenkbrauw haren mes (boven) en haar lus (onder), vaste in pipetten met sneldrogende lijm. (C) A gedeelte van een 96-wells-plaat PCR gebruikt voor het maken van depressies in een agarose plaat doordat de 1% agarose te stollen rond de schimmel (agarose bestaat in 0.3 x of 1 x MMR, afhankelijk van of de transplantatiecentra in X. tropicalis worden uitgevoerd of X. laevis, respectievelijk). De dikte van het agarose is ~ 5 mm, met 3-4 mm-diepe putten. (D) een voorbeeld van een agarose plaat voor transplantatie, met 12 depressies, zoals wordt weergegeven in het deelvenster C. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: morfologie van de vegetal paal tijdens de late blastocyste vroege stadia van de gastrula en de strategie voor dissectie. (A-F) Xenopus tropicalis embryo's worden weergegeven in plantaardige weergave op elk half uur tijdsintervallen, vanaf het begin van blastocyste etappe 9 (4.5 hpf) te vroeg gastrula stadium ~10.25 (7 hpf). Vóór 5 hpf, blastomeren zijn groot en gemakkelijker beschadigd. De witte, onderbroken cirkel markeert de verwachte positie van fles celvorming tijdens de gastrulatie, die kan worden gezien vormen begin aan de dorsale zijde (boven) in panelen (E en F). Voor sprongen, vier incisies worden gemaakt binnen een vierkant, afgebeeld door zwarte onderbroken lijnen, met een finale gesneden gemaakte parallel aan het oppervlak van het weefsel (niet geïllustreerd) te bevrijden van de plantaardige explant. Schaal bar = 400 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: transplantatie. (A) een voorbeeld van een ~5.5 hpf embryo na de verwijdering van het plantaardige PGC-bevattende weefsel. De zwarte onderbroken doos en witte gestippelde cirkel zijn dezelfde relatieve afmetingen als aangegeven in Figuur 2. (B) de plantaardige explant verwijderd uit het embryo in deelvenster A, binnenzijde geconfronteerd met de viewer, is ongeveer 0.4-0,45 mm per kant en 0,25-0.3 mm in diepte. (C) een embryo met het getransplanteerde plantaardig weefsel. Het beeld werd verworven ~ 10 min na de transplantatie. (D) 30 min na de transplantatie, het plantaardig weefsel wordt gezien te hebben genezen vastklikt (zachte wervelende met een wenkbrauw haren mes hierboven die het embryo werd gebruikt voor het maken van een vortex die weggevaagd van het puin gezien in deelvenster C). Na overdracht aan 1/9 x BMR en incubatie bij 25 ° C voltooid de meeste embryo's gastrulatie gewoon. Schaal bar = 400 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: Germline transmissie van F0 dieren geproduceerd door sprongen. (A) voor de sprongen, twee genen werden gericht door CRISPR/Cas9, tyrosinase (boven) en goosecoid (onder). Het gen tyr was gerichte4,,5 binnen de codering sequencing (blauwe arcering) voor een N-terminal signaal peptide (SP, rode arcering), terwijl het SGR gen gerichte17 binnen het coderen van opeenvolgende was de het begin van de homeobox (rode arcering), die is verdeeld in twee exons. Onvertaalde 5' en 3' exonic regio's zijn glimmende. (B) alle 160 F1 kikkervisjes uit (Zie ook tabel 1) een paring van een leapfrogged F0 man (LF1) en een albino (tyr-/-) vrouwelijke waren albino, waaruit blijkt dat de gehele germline uit de leapfrogged man was geweest vervangen en de tyr mutant geslachtscellen. De inzet toont een wild-type tadpole met normale Retina en melanocyt pigmentatie. (C-H) F1 embryo's afgeleid van een intercross tussen twee F0 leapfrogged Xenopus gericht op het homeobox-gen SGR. Ongeveer 2/3rds van de embryo's waren fenotypische mutant voor SGR, met het fenotype zijn wisselend van anterior afkappen van het hoofd (E-H). De helft van de mutanten waren ofwel cyclopic of had nauw-spaced ogen (F), terwijl de andere helft waren eyeless (H). Genotypering toonde deze aan homozygotes of samengestelde heterozygoten. De 1/3rd van embryo's met wild-type fenotype (C, D) waren ofwel homozygoot wild type of heterozygoten. In situ hybridisatie voor otx2 (een marker van reukkolf, veroorzaakt en ogen), egr2 (een marker van hindbrain rhombomeres 3 en 5, en een stroom van neurale crest) en hoxb9 (een marker van het ruggenmerg) toont dat verlies van SGR functie beïnvloedt alleen het voorste gedeelte van het otx2 domein. Deze gegevens worden overgenomen uit de Blitz et al. 17 met toestemming van de onderneming van biologen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Kruis | Man | Vrouw | Albino | Wild type | Totaal | % Albino |
| 1 | LF1 | Tyr-/- | 160 | 0 | 160 | 100 |
| 2 | LF2 | Tyr-/- | 148 | 0 | 148 | 100 |
| 3 | Tyr-/- | LF3 | 409 | 0 | 409 | 100 |
| 4 | Tyr-/- | LF4 | 0 | 519 | 519 | 0 |
| 5 | Tyr-/- | LF5 | 223 | 0 | 223 | 100 |
| 6 | LF6 | Tyr-/- | 493 | 703 | 1196 | 41.2 |
| 7 | Tyr-/- | LF7 | 1 | 94 | 95 | 1.1 |
| 8 | Tyr-/- | LF8 | 125 | 0 | 125 | 100 |
| 9 | Tyr-/- | LF9 | 0 | 417 | 417 | 0 |
| 10 | Tyr-/- | LF10 | 252 | 0 | 252 | 100 |
Tabel 1: Efficiënte germline vervanging door leapfrog transplantaties uitvoering van mutaties in tyrosinase. Targeting tyrosinase, transplantatie-dragende dieren van beide geslachten zijn verkregen. Deze dieren werden gekruist met de albino's, die homozygoot tyr- / -, om te testen voor de doeltreffendheid van de germline transmissie van mutant allelen en het percentage van de F-1 embryo's die toonde albinisme was vehiculumcontrolegroep tadpole stadium. Vermeldingen in de kolommen met de labels 'Mannelijk' en 'Vrouwelijk' geven aan welke ouder tyr- /- of het proefdier afgeleid van sprongsgewijze (LF). Het percentage van embryo's binnen een kruis weergegeven: het fenotype albino worden aangegeven onder "% Albino." Opmerking dat 6 van 10 dieren met leapfrog transplantaties volledige (100%) vervanging met mutant allelen toonde. Deze tabel is opgenomen van Blitz et al. 17, met toestemming.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit rapport bevat een gedetailleerd protocol voor de transplantatie van plantaardig weefsel bevattende PGCs. transplantatie van PGCs wordt gebruikt in combinatie met bewerken van genoom technologieën (b.v., CRISPR/Cas9) te wijzigen van de kiemcellen van een dier terwijl behoud van bijna alle van de somatische weefsels als genetisch wild type. Voor sprongen om succesvol te zijn, zijn er een aantal kritische factoren om te overwegen voordat presterende transplantaties wordt uitgevoerd.
Om ervoor te zorgen de volledige vervanging van de germline met mutant allelen, is het aanbevolen dat men eerst de in vivo efficiëntie van sgRNAs bepaalt. Ervaring leert dat de meeste sgRNAs ontworpen door CRISPRDirect (https://crispr.dbcls.jp/) of CRISPRScan (http://www.crisprscan.org/) efficiënt zijn wanneer gebruikt op 250 pg/embryo. Echter in sommige gevallen wellicht gebruik van hogere concentraties (bijvoorbeeldhet SGR sgRNA uitgegeven door Blitz et al.17, vereist ~ 1 ng/embryo). Beoordeling van de efficiëntie van de mutagenese van de doelsite is essentieel en het gebruik van TIDE toelaat een kwantitatieve beoordeling31. Terwijl de methode benadrukt hier de directe Sanger gebruikt zijn sequencing van het PCR waarbij (namens de bevolking van mutant allelen in F0 embryo's), tal van andere methoden gebruikt in de literatuur van genoom-bewerken voor dit doel. Andere aan-matig-goedkope technieken die vaak worden gebruikt omvatten fragment lengte polymorfisme analyse met behulp van hetzij het verlies van beperkingsenzymen33 of Cas9/TALEN decollete sites34,35 endonuclease 1 T7 en landmeter 36 testen, de heteroduplex mobility assay37, de high-resolution smelt assay38, fragment analyse door capillaire elektroforese39,40, en qPCR gebaseerde methoden41, 42.
Een tweede overweging is de keuze van de doellocatie van de site binnen het target-gen. Om toe te staan de efficiënt herstel van mutant fenotypen de F1 generatie, is het belangrijk om te maximaliseren van de kans op volledige LOF allelen. Bij het maken van mutant lijnen met behulp van klassieke benaderingen is het een gemeenschappelijke strategie te richten Cas9 decollete in de buurt van het einde 5' van de regio's, om te ontlokken voorbarig vertaling beëindiging in de buurt van het begin van het eiwit regio codering codering. F1 heterozygoten zou worden geïdentificeerd met frameshift mutaties en deze dieren zou worden geselecteerd voor de verdere werkzaamheden, omdat wordt verwacht dat ze voeren null allelen. Omdat de sprongsgewijze strategie F0 intercrosses gebruikt, zou de aanpak van de doelgerichtheid van het einde 5' van de codering reeks zeer inefficiënt zijn. F0 embryo's hebben mozaïek germlines, en intercrossing resultaten in populaties van F1 mutanten die meestal zijn samengestelde heterozygoten17. Aangezien grootschalige analyse heeft geverifieerd dat de verwachte ~1/3rd van mutaties geproduceerd door double-strand einden zijn gemiddeld in-frame43, zou meeste F1 embryo's geproduceerd op deze manier hebben ten minste één allel met een in-frame mutatie die wild type activiteit kan behouden. Daarom is een andere strategie nodig om ervoor te zorgen dat zelfs deze mutant allelen van in-frame dreigen te worden Null-waarden. Gericht op dubbele strand einden binnen eiwitvouwing domeinen die essentieel voor normale eiwitfunctie zijn zal naar verwachting leiden tot een hogere kans op volledige LOF (null allelen)-17,44. Zorgvuldige afweging aan de structure(s) van de atomaire-niveau van eiwit domeinen, kan indien beschikbaar, helpen bij het identificeren van de regio's van de secundaire structuur die, zelfs wanneer één aminozuur in-frame verwijderd, die naar verwachting kunnen verstoren (structuur) domein bijvoorbeeld, de Δ3bp mutatie bij SGR uitgegeven door Blitz et al.17). Als CRISPR/Cas9 doel sites kunnen worden geïdentificeerd binnen deze regio's, heeft een hogere kans op null allelen succesvol te maken. Kleine deleties binnen oplosmiddel-blootgesteld lussen tussen eiwit secundaire constructiedelen zijn minder wenselijk omdat mutaties in flexibele regio's nog steeds leiden functionele eiwitten tot kunnen.
Een derde overweging voor sprongen is de efficiëntie van de PGC verwijdering uit het ontvangende embryo. Deze stap moet efficiënt met het oog op een volledige germline vervanging. Het is nog onduidelijk of alle graft ontvangende embryo's geproduceerd door de hier beschreven methode volledige verwijdering van hun PGCs geheel-mount in situ kruisingen Toon variabiliteit in de lokalisatie van PGC markers in blastocyste-fase embryo's. In veel gevallen alle of bijna alle het signaal is gevonden in de buurt van het einde van de plantaardige-de meeste van het embryo en zou daarom worden verwijderd door de hier geschetste chirurgie (Blitz et al.17 en citaten daarin). Echter, sommige embryo's vertonen PGC marker expressie een paar cellen dichter naar de blastocoel vloer. Kiem plasm eerst coalesces bij de vegetal pole na de bevruchting en vervolgens wordt meegesleept decollete furrows tijdens de vroege breuklijnen. Sommige kiem-plasm in cellen in het midden van het plantaardige halfrond mag worden verspreid en niet effectief worden verwijderd zonder gebruik te maken van transplantaties die uit te tot de blastocoel breiden. Het is echter ook belangrijk op te merken dat deze diepe cellen met geslachtscellen markeringen niet aan de kiemcellen bijdragen kunnen, zoals microRNAs zijn bekend om te ontruimen PGC mRNAs van somatische cellen45,46. Deze diepe cellen kleuring positief voor PGC markeringen mogelijk somatische cellen die een dergelijke goedkeuring. Methoden om ervoor te zorgen volledige PGC verwijdering van geadresseerden embryo's zijn momenteel ontwikkeld.
Tenslotte is het ook belangrijk om te overwegen hoeveel F0 dieren te genereren door sprongen. Als een variabel aantal dieren niet naar seksuele volwassenheid overleven zullen, is het aanbevolen dat meer dan 20 met transplantaties zijn embryo's. Het is noodzakelijk om te hebben genoeg overlevende dieren om (1) dat voldoende aantallen van beide geslachten zullen worden verkregen en (2) dat deze mutant allelen op een voldoende hoge frequentie om te zijn geschikt voor de analyses die zijn gepland door de onderzoeker doorgeven.
Met behulp van het protocol beschreven hier, met wat oefening, moeten amfibieën embryologists zitten kundig voor meester de PGC transplantaties techniek met wat oefening. Sprongen moet mogelijk zijn, niet alleen in andere amfibieën, maar ook andere organismen met PGCs die gemakkelijk transplanteerbaar tussen individuen in vroege stadia van embryogenese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteur heeft niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd uitgevoerd met de steun van een subsidie, 5R21HD080684-02, van de National Institute of Child Health en menselijke ontwikkeling. De auteur wil Ken Cho bedanken voor zijn voortdurende enthousiasme en ondersteuning. De auteur wil ook Bruce Blumberg erkennen voor het gebruik van zijn camera, Rebekka Charney, voor de kritische lezing van het manuscript, en Sean McNamara en Marcin Wlizla de nationale Xenopus bron (RRID:SCR_013731), voor de waardevolle gesprekken met betrekking tot X. tropicalis voeding en verzorging van de dieren regimes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 or 11252-30 | |
| Eyebrow hair knife | Homemade | ||
| Hair loop | Homemade | ||
| Pasteur pipettes, borosilicate glass | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| Krazy Glue (Cyanoacrylate-based) | Elmer's Products, Inc. | KG581 | To affix eyebrow hair and hair loops into Pasteur pipettes, other similar glues can be used. |
| Oligodeoxynucleotides, custom ordered | Integrated DNA Technologies | Custom ordered | Template oligos for sgRNA synthesis, see Nakayama et al., 2014 for design details. |
| Megascript T7 kit | Ambion/ThermoFisher | AM1334 | Or use Megashortscript T7 (AM1354) kit |
| Phenol, Tris buffered | High quality distilled phenol from any commercial supplier | ||
| Chloroform | High quality chloroform from any commercial supplier | ||
| Ethanol | High quality ethanol from any commercial supplier | ||
| Diethylpyrocarbonate (DEPC) | Sigma Chemical Co. | D5758-50ML | |
| Cas9 protein, with nuclear localization signal | PNA Bio, Inc. | CP01 | Reconstituted using DEPC-treated water according to manufacturer's recommendations |
| 10X Marc's Modified Ringers solution | Homemade. Recipe (ref 26) for 1X MMR (lacking EDTA) is 100mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES. Solution is pH adjusted to 7.4. | ||
| Agarose | Any Molecular Biology grade agarose is sufficient | ||
| 60 X15 mm Petri plates | Falcon | 351007 | |
| 24-well plates | Falcon | 3047 | |
| L-Cysteine | Sigma Chemical Co. | C7352-100G | Free base, not HCl salt |
| Proteinase K | Roche | 03 115 828 001 | Typically ~20mg/ml from Roche |
| sera Micron | sera | Tadpole food. Resuspend in growth medium. Can be purchased from a variety of online retailers |
References
- Gurdon, J. B., Hopwood, N. The introduction of Xenopus laevis into developmental biology: of empire, pregnancy testing and ribosomal genes. Int J Dev Biol. 44 (1), 43-50 (2000).
- Hellsten, U., et al. The genome of the Western clawed frog Xenopus tropicalis. Science. 328 (5978), 633-636 (2010).
- Session, A. M., et al. Genome evolution in the allotetraploid frog Xenopus laevis. Nature. 538 (7625), 336-343 (2016).
- Blitz, I. L., Biesinger, J., Xie, X., Cho, K. W. Biallelic genome modification in F(0) Xenopus tropicalis embryos using the CRISPR/Cas system. Genesis. 51 (12), 827-834 (2013).
- Nakayama, T., Fish, M. B., Fisher, M., Oomen-Hajagos, J., Thomsen, G. H., Grainger, R. M. Simple and efficient CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Xenopus tropicalis. Genesis. 51 (12), 835-843 (2013).
- Guo, X., et al. Efficient RNA/Cas9-mediated genome editing in Xenopus tropicalis. Development. 141 (3), 707-714 (2014).
- Wang, F., Shi, Z., Cui, Y., Guo, X., Shi, Y. B., Chen, Y. Targeted gene disruption in Xenopus laevis using CRISPR/Cas9. Cell Biosci. 5, 15 (2015).
- Jaffe, K. M., et al. c21orf59/kurly Controls Both Cilia Motility and Polarization. Cell Rep. 14 (8), 1841-1849 (2016).
- Liu, Z., et al. Efficient genome editing of genes involved in neural crest development using the CRISPR/Cas9 system in Xenopus embryos. Cell Biosci. 6, 22 (2016).
- Naert, T., et al. CRISPR/Cas9 mediated knockout of rb1 and rbl1 leads to rapid and penetrant retinoblastoma development in Xenopus tropicalis. Sci Rep. 6 (35264), (2016).
- Ratzan, W., Falco, R., Salanga, C., Salanga, M., Horb, M. E. Generation of a Xenopus laevis F1 albino J strain by genome editing and oocyte host-transfer. Dev Biol. 426 (2), (2016).
- Bhattacharya, D., Marfo, C. A., Li, D., Lane, M., Khokha, M. K. CRISPR/Cas9: An inexpensive, efficient loss of function tool to screen human disease genes in Xenopus. Dev Biol. 408 (2), 196-204 (2015).
- Shigeta, M., et al. Rapid and efficient analysis of gene function using CRISPR-Cas9 in Xenopus tropicalis founders. Genes Cells. 21 (7), 755-771 (2016).
- Hontelez, S., et al. Embryonic transcription is controlled by maternally defined chromatin state. Nat Commun. 6, 10148 (2015).
- Peshkin, L., et al. On the Relationship of Protein and mRNA Dynamics in Vertebrate Embryonic Development. Dev Cell. 35 (3), 383-394 (2015).
- Owens, N. D., et al. Measuring Absolute RNA Copy Numbers at High Temporal Resolution Reveals Transcriptome Kinetics in Development. Cell Rep. 14 (3), 632-647 (2016).
- Blitz, I. L., Fish, M. B., Cho, K. W. Leapfrogging: primordial germ cell transplantation permits recovery of CRISPR/Cas9-induced mutations in essential genes. Development. 143 (15), 2868-2875 (2016).
- Blackler, A. W. Transfer of germ-cells in Xenopus laevis. Nature. 185, 859-860 (1960).
- Blackler, A. W., Fischberg, M. Transfer of primordial germ-cells in Xenopus laevis. J Embryol. Exp Morph. 9, 634-641 (1961).
- Bounoure, L. L'origine des cellules reproductrices et le problem de la lignee germinale. , Gauthier-Villars. Paris. (1939).
- Nieuwkoop, P. D., Sutasurya, L. A. Primordial Germ Cells in the Chordates: Embryogenesis and phylogenesis. , Cambridge University Press. Cambridge. (1979).
- Heasman, J., Holwill, S., Wylie, C. C. Fertilization of cultured Xenopus oocytes and use in studies of maternally inherited molecules. Methods Cell Biol. 36, 213-230 (1991).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Embryo dissection and micromanipulation tools. CSH Protoc. , (2007).
- Nakayama, T., et al. Cas9-based genome editing in Xenopus tropicalis. Methods Enzymol. 546, 355-375 (2014).
- Ogino, H., McConnell, W. B., Grainger, R. M. High-throughput transgenesis in Xenopus using I-SceI meganuclease. Nat Protoc. 1 (4), 1703-1710 (2006).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early development of Xenopus laevis.: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2000).
- Kay, B. K. Injection of oocytes and embryos. Xenopus laevis: Practical Uses in Cell and Molecular Biology (Methods in Cell Biology Vol. 36). Kay, B. K., Peng, H. B. , Academic Press. San Diego. (1991).
- Normal Table of Xenopus laevis. (Daudin): A Systematical and Chronological Survey of the Development from the Fertilized Egg till the End of Metomorphosis. Nieuwkoop, P., Faber, J. , Garland Publishing Inc. New York. (1994).
- Xenopus Tadpole Feeding. , Available from: http://www.mbl.edu/xenopus/files/2016/06/Xenopus-Tadpole.pdf (2017).
- Xenopus tropicalis Animal Care. , Available from: http://www.mbl.edu/xenopus/files/2016/06/Xenopus-Tropicalis.pdf (2017).
- Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Res. 42 (22), e168- (2014).
- Sander, V., Reversade, B., De Robertis, E. M. The opposing homeobox genes Goosecoid and Vent1/2 self-regulate Xenopus patterning. EMBO J. 26 (12), 2955-2965 (2007).
- Bedell, V. M., et al. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).
- Kim, J. M., Kim, D., Kim, S., Kim, J. S. Genotyping with CRISPR-Cas-derived RNA-guided endonucleases. Nat Commun. 5, 3157 (2014).
- Kim, H. J., Lee, H. J., Kim, H., Cho, S. W., Kim, J. S. Targeted genome editing in human cells with zinc finger nucleases constructed via modular assembly. Genome Res. 19 (7), 1279-1288 (2009).
- Qiu, P., Shandilya, H., D'Alessio, J. M., O'Connor, K., Durocher, J., Gerard, G. F. Mutation detection using Surveyor nuclease. Biotechniques. 36 (4), 702-707 (2004).
- Ota, S., et al. Efficient identification of TALEN-mediated genome modifications using heteroduplex mobility assays. Genes Cells. 18 (6), 450-458 (2013).
- Dahlem, T. J., et al. Simple Methods for Generating and Detecting Locus- Specific Mutations Induced with TALENs in the Zebrafish Genome. PLoS Genet. 8 (8), e1002861 (2012).
- Ramlee, M. K., Yan, T., Cheung, A. M., Chuah, C. T., Li, S. High-throughput genotyping of CRISPR/Cas9-mediated mutants using fluorescent PCR-capillary gel electrophoresis. Sci Rep. 5, 15587 (2015).
- Bhattacharya, D., Marfo, C. A., Li, D., Lane, M., Khokha, M. K. CRISPR/Cas9: An inexpensive, efficient loss of function tool to screen human disease genes in Xenopus. Dev Biol. 408 (2), 196-204 (2015).
- Yu, C., Zhang, Y., Yao, S., Wei, Y. A PCR Based Protocol for Detecting Indel Mutations Induced by TALENs and CRISPR/Cas9 in Zebrafish. PLoS ONE. 9 (6), e98282 (2014).
- Mock, U., Hauber, I., Fehse, B. Digital PCR to assess gene-editing frequencies (GEF-dPCR) mediated by designer nucleases. Nat Protoc. 11 (3), 598-615 (2016).
- Varshney, G. K., et al. High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9. Genome Res. 25 (7), 1030-1042 (2015).
- Shi, J., Wang, E., Milazzo, J. P., Wang, Z., Kinney, J. B., Vakoc, C. R. Discovery of cancer drug targets by CRISPR-Cas9 screening of protein domains. Nat Biotechnol. 33 (6), 661-667 (2015).
- Koebernick, K., Loeber, J., Arthur, P. K., Tarbashevich, K., Pieler, T. Elr-type proteins protect Xenopus Dead end mRNA from miR-18-mediated clearance in the soma. Proc Natl Acad Sci USA. 107, 16148-16153 (2010).
- Yang, J., Aguero, T., King, M. L. The Xenopus maternal-to-zygotic transition from the perspective of the germline. Curr Top Dev Biol. 113, 271-303 (2015).
