Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

השתלת תא נבט הקדמוני עבור מבוססת על CRISPR/Cas9 וקפיצת המדרגה של צפרדע רפואית

Published: February 1, 2018 doi: 10.3791/56035
Automatic Translation
1
1Department of Developmental and Cell Biology, University of California, Irvine

Summary

גנים חיוניים להישרדות מהווים מכשולים טכניים עבור יצירת שורות מוטציה. קפיצת מדרגה עוקף קטלני על-ידי שילוב הגנום עריכה עם השתלת תא נבט הקדמונים ליצירת חיות פראי-סוג נושאת germline מוטציות. קפיצת מדרגה מאפשרת גם הדור יעיל של מוטציות null homozygous דור1 F. . הנה, הצעד השתלת הוא הפגין.

Abstract

היצירה של מוטציה שורות על-ידי עריכת הגנום מאיצה ניתוח גנטי של אורגניזמים רבים. CRISPR/Cas9 שיטות הותאמו לשימוש באפריקה שנחטף ייזרק צפרדע, צפרדע רפואית, אורגניזם מודל ארוכת שנים המחקר הביו-רפואי. רבייה מסורתיים ערכות ליצירת קווים מוטציה homozygous עם CRISPR/Cas9-ממוקד מוטגנזה מכוונת יש מספר שלבים ההגדרה המפורטת. כדי להקל על יצירת עוברים מוטציה, במיוחד כדי להתגבר על מכשולים הקשורים לדפוק גנים חיוניים מופרה, פותחה שיטה חדשה הנקראת קפיצת מדרגה. טכניקה זו ממנפת את היציבות של עוברי צפרדע רפואית כדי "גזור והדבק" שיטות embryological. קפיצת מדרגה מנצל את העברת בתאי הנבט הקדמוני (PGCs) מעוברים התורם mutagenized ביעילות לתוך wildtype PGC ablated אחים. שיטה זו מאפשרת המוטציה יעיל של גנים חיוניים על-ידי יצירת חיות chimeric עם תאים סומטיים wildtype שנושאים germline מוטציה. כאשר שתי חיות F0 נושאים "" קפיצות חמור "השתלות" (קרי, מוטציה בתאי הנבט) הם intercrossed, הם מייצרים homozygous, או מתחם משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים, null F1 עוברי, ובכך לחסוך זמן דור מלא כדי לקבל נתונים פנוטיפי. קפיצת מדרגה מספק גם גישה חדשה לניתוח אפקט אימהי גנים, אשר הם דברים מעוותים F0 פנוטיפי ניתוח בעקבות מוטגנזה מכוונת CRISPR/Cas9. כתב יד זה מפרט את שיטת קפיצת מדרגה, עם דגש מיוחד על איך לבצע בהצלחה השתלת PGC.

Introduction

איך מקודד גנוטיפ פנוטיפ כבר שאלה גדולה בביולוגיה מאז גילויה מחדש של חוקי מנדל. הבנה של התפקידים של גנים, רגולציה שלהם ואינטראקציות בתוך רשתות ג'ין, הפונקציות של מוצרים מקודד הבטחות כדי לספק כלים עבור חשיפת ביולוגיה חדש ועם מצבי מחלה ameliorating. במשך יותר מחצי מאה1, הצפרדע שנחטף ייזרק אפריקאי, צפרדע רפואית, כבר דוגמנית מובילה ללימודי במגוון רחב של נושאים בסיסיים בביולוגיה, וההתערבות, כולל הבקרה הגנטית של פיתוח. מבחינה היסטורית, רוב המחקרים על צפרדע רפואית השתמשה הצפרדע allotetraploid, X. laevis, אך לאחרונה, בשל diploidy שלה, X. tropicalis פותחה כמודל גנטי דו-חיים. רצף הגנום המלא יש הורכב מ2,שני מינים צפרדע רפואית 3. "קהילה צפרדע" הוא עכשיו נקודת מפנה שבו הגנום בסיסי שינוי הטכנולוגיה מאפשרת המחקר של תפקוד הגן, כמעט כרצונו. Endonucleases CRISPR/Cas9 לתכנות הפכו את מוטגנזה מכוונת של גנים יעילים ביותר, עם biallelic מוטציה אפשרית בתאים רוב של בעלי חיים4,5,6,7, 8,9,10,11. מחקרים אלה, על-ידי Bhattacharya. et al. 12 ו. Shigeta et al. 13, הראו כי הפונקציה של גנים רבים ניתן יהיה ללמוד על ידי מוטגנזה מכוונת בבעלי פסיפס של F0 . גישה זו יש יתרונות רבים; עם זאת, Cas9-sgRNA-microinjected עוברי מוצג לרוב פנוטיפים משתנה בשל אובדן לא שלם של פונקציה (LOF). יותר באופן משמעותי, של קווים מוטציה הדור יש יתרון מאוד עבור יישומים מסוימים — בפרט לומדים גנים בעלי תרומה mRNA אימהית. MRNAs האימהי ואת החלבונים והשפעות שלהם על אפיגנטיקה, נמשכות לתקופה ממושכת לתוך מופרה14,15,16, מתן תרומות התפתחותי מוקדם של גנים רבים חסיני אש ל F0 ניתוחים. לכן, גישות אחרות LOF נדרשים.

כאשר המבקשים ליצור קווים מוטציה, הדרך להשגת עוברי LOF homozygous יש מספר מכשולים. מוטגנזה מכוונת הראשון, יעיל לייצר מוטציות biallelic יכול להיות חסרון כי אובדן של גנים חיוניים פונקציות התוצאה היא כשל כדי לשרוד עד לבגרות מינית, הפרעה בייצור קו קיימא. פתרון משותף הוא טיטרציה זהירה של כמות Cas9-sgRNA משלוח. כאן, המטרה היא להשיג איזון בין הפחתת lethality תוך מיקסום גם germline מוטגנזה מכוונת יעילות. בעיה נוספת נובעת ערכת גידול רגיל, איפה ניתוחים פנוטיפי הם נדחים עד הדור2 F. באמצעות גישה סטנדרטי, בוגרת מינית F0 חיות המעבירים מוטציה אללים דרך germline הם outcrossed כדי לייצר F1 "שירות heterozygous", אשר לאחר מכן גדלים לבגרות מינית. שני F1 heterozygotes הם intercrossed ואז לייצר F2 עוברים מוטציה בתדר Mendelian הצפויה של 25%. לכן, שני דורות של רבייה נחוצים לצורך ניתוח של פנוטיפים מוטציה. חיות יכול להיות homozygotes או תרכובת heterozygotes (קרי, כשהיא המכיל שני אללים mutant שונים, תלוי אחרים של החיות הורים המשמשים את intercross1 F).

מכשולים אלה ניתן להתגבר על ידי כליאת לתכנות בתיווך נוקלאז מוטגנזה מכוונת לתאי נבט, המונחת שיטה חדשה הנקראת קפיצת מדרגה17. קפיצת מדרגה מכיל שני רכיבים מרכזיים: (1) microinjection של mRNA Cas יחד עם sgRNA, או קומפלקסים נוקלאז-sgRNA (או, עקרון, TALENs או אבץ אצבע nucleases) בשלב תא בודד כדי ביעילות mutagenize הגנום העוברי, ואחריו (2) השתלת של PGCs לתוך wildtype עוברי אח, איפה PGCs אנדוגני הוסרו. ניתן להשיג בשני שלבים את מועד החלפת germline יעילה, להשלים עם מוטציה בתאי הנבט. Blackler הפגינו בשנות ה-60 המוקדמות כי יכול להיות מושתלים צפרדע רפואית PGCs בין עוברי-neurula מאחר מוקדם tailbud שלבים18,19. עבור קפיצת מדרגה, הגישה של Blackler שונתה על-ידי ביצוע של השתלות על הבמה blastula17, כאשר PGCs מותאמים במוט vegetal20,עובר21. השתלת לפני gastrulation יש שני יתרונות עיקריים. קודם כל, engraftment של השתלות, להתפתחות תקינה לאחר מכן נמצאה כדי להיות יעיל יותר כאשר השתלת מבוצע בשלב blastula (שלא פורסמו תצפיות). שנית, על ידי ביצוע השתלות blastula-שלב זמן קצר לאחר תחילת שעתוק zygotic, אחד לא יכול למנוע את הקטלניות הנובעים ג'ין התפתחותית מוטציות לשבש gastrulation או אחרת להוביל neurulae מאוחר בעלת מבנה פגום. עוברי ("עד") השתלת מניבי PGC בוגרים לבגרות מינית, intercrosses בין בעלי חיים אלה F0 הדגימו כי, במקרים רבים, 100% צאצאים1 F להציג את פנוטיפ LOF (רוב להיות מורכבים heterozygotes), המציינת את החלפת germline להשלים עם מוטציות יישוב.

הוא צפוי כי קפיצת מדרגה נאיץ את גישות גנטיות בצפרדע רפואית. קפיצת מדרגה גם מספק אלטרנטיבה שיטת "לארח העברה"22 לניתוח LOF של גנים אמהי-אפקט (שלא פורסמו תצפיות). בפרסום הנוכחי, מוצג תיאור מפורט של השיטה, במיוחד התמקדות PGC ההשתלה, X. tropicalis (עם שינויים מזעריים עבור X. laevis). ההשתלה של PGCs הוא הפגין כאן כדי להקל על העברה מהירה יותר של טכנולוגיה זו למעבדות אחרות לעבוד עם צפרדע רפואית. עקרונות שיטה זו צריכה להיות מוצלחת דו-חיים אחרים (למשל, urodeles), וגם שינויים האורגניזם הספציפי של המתודולוגיה צריכה מאפשרים ליישום חיות רבות אחרות שבהן מוטגנזה מכוונת יעיל יכול להתבצע, PGCs הם ברצון שיפותחו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה אוניברסיטת קליפורניה באירוויין.

1. הערכות לקראת השתלת PGC

  1. להכין כלי ניתוח מראש, כפי שתואר לעיל23.
    הערה: סכינים שיער הגבות משמשות ליצירת חתכים בסיועם של לולאה שיער כדי לייצב את העובר בעת ביצוע הניתוחים. שערות הגבה ולולאות שיער הם מודבקים לתוך זכוכית בורוסיליקט פסטר סיליקון זה קודם נמשכו ב להבה ושבר בחלק ורקמת (ראה איור 1A, ראש חץ) כדי ליצור קצר, צר יותר טיפ (איור 1B) עבור זריזות גדולה יותר בעת ביצוע ניתוחים.
  2. צור sgRNAs באמצעות הליכים שתואר לעיל24 .
    הערה: לזמן קצר, קצר תבניות DNA קידוד sgRNAs נוצרים באמצעות deoxyoligonucleotides חופפים המכילה 5' bacteriophage T7 היזמים, אשר הם annealed, "מילא" מאת פולימראז DNA ללא שגיאות, thermostable. במבחנה sgRNA סינתזה תגובות מודגרת למשך מספר שעות, למשך הלילה (בהתאם הערכה בשימוש). תגובות הן שטופלו DNAse כדי להסיר את התבנית. SgRNAs כבר טהור על ידי בשיטות הרגילות של פנול/כלורופורם החילוץ, אמוניום אצטט/אלכוהול איזופרופיל משקעים, על פי הוראות היצרן ערכת24.
  3. זמן קצר לפני ביצוע microinjections, להכין קומפלקסים Cas9-sgRNA הראשון denaturing ~ 250 ננוגרם של sgRNA ב 3 µL הנפח הכולל של נטול RNAse (שטופלו diethylpyrocarbonate) H2O ב- 60-65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ואחריו קירור מהירה על קרח למשך 5 דקות. Centrifuge את sgRNA למשך כמה שניות, להוסיף 1 µL 1 µg/µL Cas9 החלבון, תקופת דגירה של 10 דקות ב 37 ° C כדי לקדם היווצרות מורכבות.
    הערה: בעקבות זה דגירה, הצינור ניתן לשמור על קרח בעת הכנת העוברים microinjection.
  4. להשיג X. tropicalis העוברים על ידי במבחנה הפריה תוך שימוש בשיטות הרגילות, כפי שתואר לעיל25. מבטל את ג'לי25,26 העוברים על הפריה לאחר 10 דקות.
    הערה: זמן ההפריה נחשב הזמן אחרי ההשעיה זרע נוסף את הביצים ואת המנה מוצף 1/9thX של מארק ששינה רינגר (MMR)26. עבור X. tropicalis25, בניגוד X. laevis, לבצע את jellying דה ב- 1/9 x MMR המכיל 3% ציסטאין חינם בסיס (לא מלח HCl), pH להתאים ל- 7.8-8.0, ואחריו שוטף מרובים ב- 1/9 x MMR. להעביר את העוברים agarose (1%)-מאכל מצופה המכילה 1/9 x MMR בטמפרטורת החדר.
  5. להעביר מיד את העוברים כדי להיות מוזרק כדי 1% מצופה agarose מנה המכילה 1 x MMR באמצעות פיפטה של פסטר.
  6. להזריק בשלב 1-cell. ראה הפניות26,,27 , על תיאורים מפורטים של שיטות microinjection צפרדע רפואית .
    1. להזריק כל העובר באתר אחד בקוטב חיה, עם 4 nL של Cas9-sgRNA קומפלקס (הסכום הסופי = 1 ng של Cas9 ו פ ג ~ 250 של sgRNA; ראה הדיון)24. לאחר 10-20 דקות של הזרקת אתר ריפוי, להעביר את העוברים צלחת מצופים agarose המכילה 1/9 x MMR דגירה ב 25 º C. גם ליצור מנה של אחים uninjected עוברי אשר ישמש שתל נמענים.
  7. הכינו צלחות פטרי (60 מ מ) המכילים של ~ 5 מ משכבה עבה של 1% agarose ב 0.3 x MMR, אם עושים השתלות X. tropicalis, או 1 x MMR עבור X. laevis.
    1. ליצור שקעים ~ 3-4 מ מ עמוק על-ידי הוספת 3-x 4-ובכן עובש (נוצר על ידי חיתוך צלחת PCR 96-ובכן) לתוך agarose מותכת כאשר מוזג את הצלחות (ראה איור 1C ו- D). החזק את התבנית מספר מילימטרים מעל החלק התחתון של הפטרי באמצעות מלחציים המצורפת עמדה הטבעת עד agarose שנוקשה.
    2. בנוסף, תעשה צלחת 24-ובכן העוברים הבודדים הבית על-ידי ציפוי הבארות עם שכבה דקה של 1% agarose ב 1/9 x MMR.
      הערה: המדיום תרבות נוספו הבארות הללו הוא x 1/9 ש-MMR בתוספת 50 µg של gentamycin סולפט/mL.

2. השתלת של PGCs

  1. מתי העוברים פשוט להגיע Nieuwkoop, פאבר28 blastula שלב 9 (איור 2 א), ~4.5 h שלאחר ההפריה (hpf) עבור X. tropicalis, להסיר אותם מן החממה 25 ° C, לאפשר להם equilibrate לטמפרטורת החדר עבור נוספים 0.5 h.
  2. כדי להתחיל את השתלת בחמש hpf (איור 2B), להשתמש פיפטה פסטר להעביר אחד העובר התורם PGC (הזריק Cas9-sgRNA) למנה agarose 60 מ מ המכילים שקעים (שנוצרו בשלב 1.7) ב- 0.3 x MMR (או x MMR אם משתמש X. laevis). גם להעביר אחד העובר בין אחים uninjected, המטופל שתל, זה מאכל.
    הערה: זה קריטי כי זהותם של כל אחד העוברים האלה לא מבולבל.
  3. באופן ידני להסיר את המעטפות vitelline כל העובר באמצעות מלקחיים וסובב שני העוברים כך הפולנים vegetal שלהם הם בתצוגת ונגיש לניתוח.
    הערה: תיאור של דה-vitellination ידני של עוברי בעבר כבר את המתואר26.
  4. משתמש קצה הסכין שיער גבות חדה, להפוך ארבעה חתכים רדודים בצורת ריבוע על הקוטב vegetal של העובר הנמען, בתוך האזור שבו יהוו תאים בקבוק בעתיד המסמנות את blastopore. להפוך את החתכים על-ידי הוספת קצה הסכין שיער הגבה העובר, מתחת השטח, ולעשות כלפי מעלה עם פרוסות תנועות תוך ייצוב העובר עם הלולאה שיער.
    הערה: איור 2 מציג תצוגות פוליאותן של העובר במרווחי זמן חצי שעה מ- 4.5-7.0 hpf כדי להציג את גודל התא וכדי לספק מדריך עבור הערכת שבו התאים בקבוקים יהוו (עיגול לבן מקווקו). המטרה היא לעשות חתכים איפה הקופסה השחורה מקווקווים מציינים.
  5. פעם אחת מארבעת הצדדים של הכיכר מפורטים לפי חתכים, להעמיק בכל חתך עם הסכין שיער הגבות באמצעות תנועות חיתוך דומה כדי להגיע לעומק של 1/3 עד 1/2 המרחק על הרצפה blastocoel.
  6. לשחרר את explant רקמות פוליאותן של העובר הנמען (איור 3 א ו- B) על-ידי הפיכת אופקי (מקביל פני השטח צמחי) cut(s) באזור פוליאותן עמוק.
    הערה: גודל explant צמחי המכילות PGC הוא כ 0.4-0.45 מ מ בכל צד, 0.25-0.3 מ מ לעומק. זה explant פוליאותן של העובר הנמען אינו נחוץ עוד, ולכן יש להגדיר הצידה להיות מושלך.
  7. עובד מהר, חזור על הליך זה (שלבים 2.4-2.6) על העובר התורם PGC ליצור קטע רקמה פוליאותן בגודל דומה עבור השתלת.
    הערה: חשוב לבצע את זה דיסקציה השני עם השהיה קטן כדי למזער את הזמן העובר הנמען לרפא את הפצע פתוח.
  8. לאחר הרקמה המכילה PGCs יוסר העובר התורם, להשתמש הגבה שיער סכין והשיער הלולאה כדי להזיז את explant למקומן בפתיחה נוצר העובר הנמען.
    הערה: השטח הפנימי של שתל הפנים של התורם חייב להיות מול הפנים של העובר הנמען. . זה לא הכרחי להתאים את כיווני של הצירים הגבי הגחוני / ו משמאל של השתל עם העובר הנמען.
  9. השתמש האורכי של מוט של הסכין שיער הגבה, שנערך במקביל פני השטח של השתל, ללחוץ בעדינות את השתל לתוך הפתח השטח פוליאותן של העובר הנמען.
  10. לאחר השתל הושם, להשתמש hairloop או מוט של הסכין שיער גבות להחליק בעדינות "הגופה" של העובר התורם על פני השטח agarose ולתוך של דיכאון agarose. ודא כי הפצע הפתוח של הגופה פונה הנוזל בכמות גדולה. אם לא, להשתמש בסכין שיער הגבה כדי לסובב את העובר כדי להשיג את הכיוון הזה.
  11. להחליק העובר הנמען, עם השתל ריפוי במקום, בדיכאון סמוכים וודא באופן דומה כי הרקמה המושתל vegetal הקוטב פונה הנוזל בכמות גדולה.
  12. חזור על הליך זה (2.1 שלבים-2.11) באמצעות זוג נוסף של התורם ואת עוברי הנמען כדי ליצור זוג נוסף של השתלת/קארקאס; . להעביר אותם שקעים ריק.
    הערה: זה קריטי כי אחד גורם סימונים כדי לעקוב אחר זוגות תואמים של פגרי ו מניבי השתלת העוברים. הגוויות התורם ישמש כמדד עבור היעילות של Cas9-sgRNA-induced מוטגנזה מכוונת ב PGCs מושתל, אשר לא יכול להיות בקלות לבדיקה עד החיות מניבי להשתלה מגיעים לבגרות מינית (ראה שלב 3.3, להלן, ו את הדיון ).
  13. המשך ביצוע השתלות עד העוברים מגיעים כ מוקדם הבמה gastrula 10, אשר כ 6.5 hpf ב- X. tropicalis (ראה איור 2E).

3. פוסט-ריפוי על העוברים

הערה: שתלים לרפא למקומו בתוך ~ 30 דקות, זה נורמלי לצפות כמה פסולת yolky פירוק התא מקרין מן העובר (איור 3C).

  1. לאחר החלימו, משתמשת פיפטה של פסטר בעדינות העברת העוברים מן שהמפלצת כדי בארות בודדים של צלחת 24-ובכן מצופים agarose. תפליט יהיה להסירו (איור תלת ממדי) על ידי נוזל ערבוב במהלך ההעברה.
    1. לסובב את העוברים, כך הם ממוקמים פוליאותן מוט למעלה, מול הפתרון בצובר. שוב, למקם את הגוויות התורם, להשתיל נמענים בבארות סמוכים כדי לסייע שמירה על מסלול של זוגות העובר; לתעד מידע זה.
  2. להעביר את הצלחת 24-ובכן המכיל העוברים אל חממה 25 ° C לתרבות לילה.
    הערה: למחרת, העוברים הגיעו tailbud בשלבים.
  3. להעביר לנמענים שתל לנקות 6-ובכן צלחות מצופה agarose המכיל x 1/9 ש-MMR בתוספת 50 µg של gentamycin סולפט/mL, עם העובר 1 לכל טוב. לשמור על תיעוד ברור של פגרי התורם התואמים את אלה להשתיל נמענים.
  4. כדי להעריך את יעילות מוטגנזה מכוונת על ידי רצף ה-PCR amplicons5,17,24 או בשיטות אחרות המסתמכות על PCR amplicons (ראה את הדיון), להעביר הגוויות בודדים 0.2 מ"ל רצועת המבחנות. להסיר את מרבית המדיום, homogenize 100 µL פירוק מאגר24 המכיל proteinase K (PK) על ידי חזר שיהיה pipetting באמצעות פיפטה P200.
  5. לבצע פירוק העובר24 ב 56 ° C עבור 6-אייץ ' ללון כדי לאפשר עיכול PK. בטל PK על ידי חימום זה 90-95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ואחריו קירור מהיר עד 4 ° C. השתמש lysates ללא יותר ניקוי מדרגות כדי להפיץ את תגובות PCR כדי לקבל amplicons קצר עבור רצפי DNA סנגר ישירה24. לאחסן את lysates ב-20 ° C.
    הערה: תוך מספר ימים, הראשנים יגיע האכלה שלבים (כ שלב 45-46), יכולים להיות מוזנים השעיה של אבקת פלנקטוניים (סרה מיקרון).
  6. אחרי שבוע ~ 1, בשינויים יומי של תרבות מדיום כדי לשמור על ניקיון ולצמצם את יתר מיקרוביאלי, להעביר ראשנים טנקים קטנים במערכת הימית במחזור בתזרים בטפטוף. להשתמש בנתונים רצף הפרדת ראשנים עם PGCs יעילה מאוד mutagenized של ראשנים ביעילות מוטגנזה מכוונת נמוך יותר. לאחר המטמורפוזה הושלמה, להעביר froglets את המערכת הימית למבוגרים במעבדה.
    הערה: משטרי שפותחה על-ידי המשאב הלאומי צפרדע רפואית (המעבדה לביולוגיה ימית, חור וודס, MA) מספקים מדריך ראשן האכלה29 וצפרדע למבוגרים תחזוקה30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בעקבות ההשתלה, הקביעה איכותי יעילות של CRISPR/Cas9 מוטגנזה מכוונת צריכה להתבצע לפני משקיעים את המאמץ של גידול בעלי חיים לגדול ולשמור את החיות לבגרות מינית. מאחר חיות נושא השתלות קפיצת מדרגה הן תחושתיים wildtype germline קשה לגישה ישירה מעבדתיים, להציל את הגוויות העובר התורם הופכת לחשובה. ניתוח הדנ א מ הגוויות משמש proxy עבור היקף מוטגנזה מכוונת המתרחשת ב germline המושתלים ה-17.

גישה אחת כדי להעריך את ההצלחה של מוטגנזה מכוונת היא ישירות רצף amplicons PCR המתפרסות על-פני האזור גנומית מסומנים. זה הופך להיות יקר במיוחד ולא יעיל אם אחד שרוצה רצף רבים בנפרד לשכפל DNA שברי בעלי חיים רבים. במקום זאת, קביעת רצף amplicons הטרוגנית באתר היעד, כפי שהם נגזרות גנטית פסיפס עוברי, משמש כדי להעריך את היעילות מוטגנזה מכוונת כל העובר19. ויזואליזציה של chromatograms מראה פראי סוג הרצף (פסגות) במעלה הזרם של היעד רצף ושל פסגות להפוך "מקושקשות" (קרי, המופע שיתוף של פסגות המתאים מספר בסיסים המופיעים במיקום כל נוקלאוטיד) במורד הזרם של האתר של מעבר כפול-strand מזורז-Cas9. ניתן למצוא דוגמאות כאלה פרופילים S1 איור של בליץ ואח. 17. כימות מדויקת של היקף מוטגנזה מכוונת מיוצג על ידי פסגות מקושקשות אלה ניתן להשיג באמצעות האלגוריתם פירוק רצף, גאות (https://tide-calculator.nki.nl/)31. הקרנת עוברי בודדים בעזרת טכניקה זו מעניקה ביטחון כי כל העובר כראוי מוזרק, שמיועד מוטגנזה מכוונת. מכשיר מעקב, כגון לתוספי מתויג fluorescently, יכול לשמש כדי לאשר זריקה מוצלחת24 , יכול גם לסייע בהקמת כי ראשן אכן נושאת את הרקמה המושתלים (נתונים שלא פורסמו). חשוב לציין כי האפשרות רשמית coinjection של לתוספי פלורסנט יחד עם Cas9-sgRNA עלולה לשנות את יעילות מוטגנזה מכוונת Cas9 לא נחקרו. יכול להיות מושלך כל העוברים "leapfrogged" המכיל השתלות מתורמים גרוע או unmutagenized.

קפיצת מדרגה עוקף את הצורך ניתוח דור2 F במזימות סטנדרטי השבחה גנטית, ידי התרת ניתוחים פנוטיפי יעיל ב- F1 העוברים. בעת שימוש רגיל הגישה שהוא מתכוון להפוך למוטציות גנים חיוניים, טיטור זהיר במינון Cas9-sgRNA נדרש כדי להבטיח הכדאיות של מייסד עוברי, וכתוצאה מכך יעילות מופחתת מוטגנזה מכוונת. לשרוד F0 חיות מכל זו כערכה רגילה הם outcrossed ואז עם wildtypes כדי להשיג F1 עוברים קיימא, אשר מוקרנים לזיהוי נשאים. בסופו של דבר, אלה heterozygotes1 F גדל לבגרות מינית, intercrossed לקבל homozygous יחידים2 F הצגת פנוטיפים מוטציה. לעומת זאת, כי קפיצת מדרגה חיות מפיק שיש החלפה מלאה של germlines שלהם עם אללים mutant, intercrossing בעלי חיים אלה F0 מייצרת פנוטיפים מוטציה דור1 F. בליץ. et al. 17 דיווחו כי רוב F0 חיות מכוון את לוקוס tyrosinase (tyr), אשר נדרש עבור פיגמנטציה של מלנוציטים ואת הרשתית, הראה 100% germline שידור (נמדד על ידי outcrossing עם tyr- / - בעלי חיים לבקנים) של התורם, נגזר הגנום מוטציה (ראה איור 4A-B , טבלה 1). לפיכך, intercrossing שתי חיות המיוצר על ידי קפיצת מדרגה יניב homozygous או תרכובת משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים מוטציה F1 עוברי.

תוצאות דומות התקבלו17 מאת intercrossing F0 שראש חיות סוחבת מוטציות גנים homeobox (קידוד את homeodomain מחייב DNA) של הגן goosecoid (gsc) (ראה איור 4A, C-H). נפילות Gsc הביטוי באמצעות oligonucleotides antisense מורפולינו ב X. laevis הציע כי הגן gsc הכרחית לפיתוח מלא של ראש קדמי32, Cas9-sgRNA מוזרק ראשנים גם הצג פנוטיפים קטלני עובריים17. עם זאת, leapfrogged F0 , להיות תחושתיים פראי סוג, שהחיות קיימא וחזק, והפיקה intercross1 F העוברים עם פנוטיפים LOF זהים לאלה שפורסמו נפילות X. laevis 17. אלה נתונים שסופקו ועיונים גנטי של פנוטיפ מורפולינו, כמו גם הוכחה של עיקרון זה קפיצת מדרגה יכול לשמש כדי להתגבר על עובריים פנוטיפים קטלני.

Figure 1
איור 1: החומרים הדרושים עבור השתלת. (א) זכוכית בורוסיליקט פיפטות פסטר משמשות ליצירת סכינים שיער גבות ושיער לולאות עבור למיקרו-עוברים בשלב מוקדם. משיכה החוצה זכוכית באמצעות מבער בונזן מאפשר עבור קצה צר יותר עבור ההוספה של השיער. החץ האדום מסמן את המיקום המשוער שבו צריך לשבור את הזכוכית. (B) דוגמה של הסכין שיער הגבה (למעלה) ושל שיער לולאה (למטה), קבוע לתוך פיפטות עם דבק ייבוש מהיר. חלק (C) של צלחת PCR 96-ובכן משמש כדי ליצור שקעים צלחת agarose על-ידי ומאפשר את agarose 1% שבמהלכו סביב העובש (agarose עשוי 0.3 x או 1 x MMR, תלוי אם השתלות מבוצעות ב- X. tropicalis או X. laevis, בהתאמה). העובי של agarose זה ~ 5 מ"מ, עם 3-4 מ מבארות עמוקים. (ד) דוגמה של צלחת agarose עבור ההשתלה, עם 12 שקעים, כפי שמוצג בלוח C. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: מורפולוגיה של הקוטב vegetal במהלך blastula מאחר בשלבים המוקדמים של gastrula, את האסטרטגיה לנתיחה. (A-F) צפרדע רפואית tropicalis עוברי מוצגים בתצוגת פוליאותן במרווחי זמן מדי חצי שעה, מתחילת blastula במה 9 (4.5 hpf) כדי ~10.25 הבמה gastrula מוקדם (7 hpf). לפני 5 hpf, blastomeres הינם גדולים יותר בקלות פגומות. הלבן, עיגול מקווקו מסמן את המיקום הצפוי של הבקבוק כדוריות במהלך gastrulation, אשר ניתן לראות ויוצרים ההתחלה בצד הגבי (למעלה) פאנלים (E ו- F). עבור קפיצת מדרגה, ארבעה חתכים נעשים בתוך ריבוע, מתואר באמצעות קווים מקווקווים שחור, עם סופית גזור עשה במקביל למשטח של הרקמה (לא מאויר) כדי לשחרר את explant צמחי. סרגל קנה מידה = 400 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: השתלת. (א) הוא דוגמה העובר hpf ~5.5 לאחר הסרת הרקמה PGC המכילים צמחי. תיבת מקווקו שחור לבן עיגול מקווקו הם מידות יחסית זהות לאלה באיור 2. (B) צמחי explant להסיר מן העובר בלוח A, השטח הפנימי מול הצופה, הוא כ 0.4-0.45 מ מ בכל צד, 0.25-0.3 מ מ לעומק. (ג) העובר עם רקמת פוליאותן המושתלים. התמונה נרכשה ~ 10 דקות לאחר ההשתלה. (ד) 30 דקות לאחר ההשתלה, צמחי רקמות נתפסת הגלידו למקומו (מתערבל עדין בסכין הגבה שיער לעיל שהעובר נעשה שימוש ליצירת מערבולת אשר סחפה את הלכלוך ראיתי בלוח C). לאחר העברה ל- 1/9-MMR ו הדגירה 25 ° c, רוב העוברים להשלים gastrulation בדרך כלל. סרגל קנה מידה = 400 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: שידור Germline מחיות0 F המיוצר על ידי קפיצת מדרגה. (A) עבור קפיצת מדרגה, שני גנים ממוקדים על-ידי CRISPR/Cas9, tyrosinase (למעלה), goosecoid (למטה). הגן טיר היה יישוב4,5 בתוך רצף קידוד (צללית כחולה) פפטיד האות N-מסוף (SP, אדום הצללה), ואילו הגן gsc היה יישוב17 בתוך קידוד רצף- תחילת גנים homeobox (צללית אדומה), אשר מחולקים בין שני exons. לא מתורגם 5' 3' exonic ואזורים הם שאינם מוצללים. (B) כל 160 F1 ראשנים (ראה גם טבלה 1) הזדווגות זכר0 F leapfrogged (LF1), לבקן (טיר-/-) נשים היו לבקן, המציין germline כולו מן הזכר leapfrogged היה יוחלף tyr מוטציה בתאי הנבט. שיבוץ מראה פראי-סוג ראשן עם פיגמנטציה נורמלית רשתית ו מלנוציט. (C-H) F1 עוברי נגזר של intercross בין שני F0 שראש צפרדע רפואית מיקוד הגן גנים homeobox gsc. כ 2/3 srdשל העוברים היו מוטנטים phenotypically עבור gsc, עם פנוטיפ להיות בדרגות שונות של חיתוך הקדמי של הראש (E-H). מחצית המוטנטים היו גם cyclopic או היו עיניים במרווחים מקרוב (F), בעוד החצי השני היו עכבישי־הענק (H). Genotyping הראה את זה כדי להיות homozygotes או heterozygotes מורכבים. 1/3rd העובר מראה פראי-סוג פנוטיפ (C, D) היו סוג בר homozygous, או heterozygotes. הכלאה בחיי עיר otx2 (סמן הקדמי, המוח האמצעי ואת העיניים), egr2 (סימן hindbrain rhombomeres 3, 5, ו זרם של הרכס העצבי) של hoxb9 (סמן של חוט השדרה) מראה כי אובדן של gsc פונקציה משפיע רק את החלק הקדמי של התחום otx2 . נתונים אלה משוחזרות של בליץ. et al. 17 , ברשות החברה של הביולוגים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

לחצות זכר נקבה לבקן פראי סוג סה % לבקן
1 LF1 טיר-/- 160 0 160 100
2 LF2 טיר-/- 148 0 148 100
3 טיר-/- LF3 409 0 409 100
4 טיר-/- LF4 0 519 519 0
5 טיר-/- LF5 223 0 223 100
6 LF6 טיר-/- 493 703 1196 41.2
7 טיר-/- LF7 1 94 95 1.1
8 טיר-/- LF8 125 0 125 100
9 טיר-/- LF9 0 417 417 0
10 טיר-/- LF10 252 0 252 100

טבלה 1: החלפת germline יעיל על ידי קפיצת מדרגה השתלות נשיאת מוטציות ב- tyrosinase. מיקוד tyrosinase, השתלת מניבי חיות משני המינים התקבלו. בעלי חיים אלה היו חצה עם הלבקנים, אשר homozygous טיר- / -, כדי לבדוק היעילות של השידור germline של אללים mutant, את אחוז העוברים1 F הראה לבקנות היה לבדיקה בשלב ראשן. ערכים בעמודות המסומנות "זכר", "נקבה" לציין מי משני ההורים יש טיר- / - או החיה מבחן המופק קפיצת מדרגה (LF). אחוז העוברים בתוך הצגה לחצות פנוטיפ לבקן מסומנות תחת "% הלבקן" שימו לב כי 6 10 חיות עם קפיצת מדרגה השתלות הראו החלפה מלאה (100%) עם אללים mutant. טבלה זו המופקת מן בליץ. et al. 17, עם הרשאה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

דוח זה מספק את פרוטוקול מפורט עבור השתלת רקמת צמחי המכיל PGCs. השתלת של PGCs נמצא בשימוש בשילוב עם טכנולוגיות לעריכת הגנום (לדוגמה, CRISPR/Cas9) כדי לשנות את germline של חיה בזמן שמירה על כמעט את כל הרקמות סומאטית שלה כסוג הפרוע גנטית. עבור קפיצת מדרגה מוצלח, ישנם מספר גורמים קריטיים שיש לקחת בחשבון לפני ביצוע השתלות ביצוע.

כדי להבטיח החלפת להשלים germline עם אללים mutant, מומלץ כי אחד קובע תחילה את יעילות ויוו sgRNAs. ניסיון עולה כי רוב sgRNAs שעוצב על ידי CRISPRDirect (https://crispr.dbcls.jp/) או CRISPRScan (http://www.crisprscan.org/) יעילים בעת שימוש ב- 250 pg/העובר. עם זאת, במקרים מסוימים, ייתכן צורך להשתמש ריכוז גבוה (למשל, sgRNA gsc בהוצאת בליץ ואח17, חובה ~ 1 ng/העובר). הערכת יעילות מוטגנזה מכוונת של אתר יעד חיוני וההיתרים השימוש הגאות של הערכה כמותית31. בעוד השיטה הדגיש משתמשת כאן סנגר ישיר את רצף של amplicons ה-PCR (ייצוג האוכלוסייה של אללים mutant ב F0 עוברי), אינספור שיטות אחרות שימשו בספרות לעריכת הגנום למטרה זו. טכניקות אחרות-עד-בינוני-נמוכים המשמשים בדרך כלל כוללים שבר אורך פולימורפיזם ניתוח שימוש או אובדן של אנזימי הגבלה33 או Cas9/TALEN המחשוף אתרי34, T7 endonuclease 135 מודד 36 מבחני, heteroduplex ניידות assay37, וזמינותו להמיס ברזולוציה גבוהה38, קטע ניתוח על ידי אלקטרופורזה נימי39,40, שיטות מבוססות-qPCR41, 42.

שיקול נוסף הוא הבחירה של היעד מיקום האתר בתוך הגן היעד. כדי להתיר את ההתאוששות יעיל של פנוטיפים מוטציה דור1 F, חשוב למקסם את הסיכוי אללים LOF מלאה. בעת ביצוע קווי מוטציה באמצעות גישות קלאסיות זה אסטרטגיה משותפת למטרה Cas9 המחשוף, לקראת סיום 5' של קידוד אזורים, להפיק תרגום מוקדמת סיום קרוב להתחלה של החלבון קידוד האזור. F1 heterozygotes להיות מזוהה עם מוטציות frameshift, החיות האלה שייבחר עבור עבודה נוספת כי הם צפויים לשאת אללים null. מאחר האסטרטגיה leapfrogging משתמש F0 intercrosses, הגישה של פילוח 5' סוף הרצף קידוד יהיה יעיל מאוד. F0 עוברי יש פסיפס germlines, תוצאות intercrossing באוכלוסיות של מוטציות1 F שברובה מורכבת heterozygotes17. מאז ניתוח בקנה מידה גדול מאמתת, בממוצע, הצפוי ~1/3רואד של מוטציות המיוצר על ידי מעברי כפול-strand הם במסגרת43, רוב עוברי1 F, המיוצר באופן כזה שיהיה אלל אחד לפחות עם מסגרת מוטציה עשויה לשמור פראי סוג פעילות. לכן, אסטרטגיה שונה נחוץ כדי להבטיח כי אפילו אלה אללים mutant במסגרת עשויה להיות ערכי null. מיקוד כפול סטרנד מעברי תחומים קיפול חלבונים, החיוניים לתפקוד נורמלי החלבון צפויה לגרום להם סיכוי גבוה יותר מלאה LOF (אללים null)17,44. התחשבות זהירה structure(s) אטומי ברמה של חלבון תחומים, כאשר היא זמינה, יכול לסייע בזיהוי אזורים של מבנה שניוני זה, גם כאשר המכיל חומצה אמינית בודדת במסגרת מחיקה, עשוי להיות צפוי לשבש (מבנה מחשבים למשל, Δ3bp המוטציה ב- gsc בהוצאת בליץ ואח '17). אם ניתן לזהות אתרי היעד CRISPR/Cas9 בתוך האזורים הללו, יש סיכוי גבוה יותר בהצלחה ליצירת אללים null. מחיקות קטן בתוך לולאות הממס החשופים בין רכיבים מבניים משני חלבונים הם לא רצויות כי מוטציות באזורים יותר גמיש עשוי להתבטא עדיין חלבונים פונקציונליים.

שיקול שלישי עבור קפיצת מדרגה היא היעילות של הסרת PGC מן העובר הנמען. שלב זה צריך להיות יעיל על מנת להבטיח החלפת germline מלאה. לא ברור כרגע כל שתל הנמען העוברים המיוצר על ידי השיטה המתוארת כאן יש הסרה מלאה של שלהם-הצג השתנות בחיי עיר hybridizations PGCs. כולה-הר הלוקליזציה של סמני PGC blastula-שלב עוברי. במקרים רבים, כל או כמעט כל האות נמצא ליד הסוף פוליאותן ביותר של העובר, ולכן ניתן להסיר על ידי ניתוח שמפורטות כאן (בליץ ואח17 ו אזכורים בו). עם זאת, כמה עוברי הצג PGC סמן ביטוי כמה תאים קרוב לרצפה blastocoel. Plasm נבט קודם מתלכד בקוטב vegetal לאחר ההפריה, ואז הוא נסחף לאורך המחשוף תלמים במהלך אדמירל מוקדם. Plasm חיידקים מסוימים עשויים להיות מופץ בתאים באמצע הכדור צמחי, לא יוסרו באופן יעיל ללא שימוש השתלות זה להאריך blastocoel. עם זאת, חשוב גם לציין כי תאים אלה עמוק המכילה סמנים תא הנבט יכול לתרום לא germline, כמו מיקרו Rna ידועים כדי לנקות PGC mRNAs של תאים סומטיים45,46. אלו תאים עמוק מכתים חיובי עבור סמני PGC ייתכן תאים סומטיים שעברו אישור כזה. שיטות כדי להבטיח הסרה מלאה PGC מעוברים הנמענים כיום מפותחים.

לבסוף, חשוב גם לקחת בחשבון כמה F0 בעלי-חיים כדי לייצר על ידי קפיצת מדרגה. כמו מספר משתנה של בעלי חיים לא תשרוד לבגרות המינית, מומלץ כי יותר מ-20 עוברי המכיל השתלות נוצרים. זה יהיה חייב להיות חיות ששרדו מספיק כדי להבטיח כי (1) מספיקים לשני המינים ניתן להשיג ולהעביר (2) כי אלה אללים mutant ועם תדירות גבוהה מספיק להיות מתאים עבור הבדיקות שתוכננו על ידי החוקר.

באמצעות פרוטוקול המתוארת כאן, עם קצת תרגול, דו-חיים embryologists צריך להיות מסוגל לשלוט בטכניקה השתלות PGC עם קצת אימון. קפיצת מדרגה צריך להיות אפשרי, לא רק דו-חיים אחרים, אלא גם אורגניזמים אחרים המכילים PGCs כי הם ברצון שיפותחו בין יחידים בשלבים המוקדמים של מופרה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחבר אין לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו בוצעה עם התמיכה של מענק, 5R21HD080684-02, מן המכון הלאומי לבריאות הילד והתפתחות האדם. המחבר מבקש להודות קן צ'ו שלו התלהבות ותמיכה מתמשכת. המחבר גם רוצה להכיר ברוס בלומברג לשימוש של המצלמה שלו, רבקה צ'רני, לקריאה ביקורתית של כתב היד, ואת שון מקנמרה, מרצ'ין Wlizla-המשאב הלאומי צפרדע רפואית (RRID:SCR_013731), עבור היקרה ערך שיחות בנוגע X. tropicalis האכלה, טיפול בבעלי חיים משטרי.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dumont #5 forceps Fine Science Tools 11252-20 or 11252-30
Eyebrow hair knife Homemade
Hair loop Homemade
Pasteur pipettes, borosilicate glass Fisher Scientific 13-678-20A
Krazy Glue (Cyanoacrylate-based) Elmer's Products, Inc. KG581 To affix eyebrow hair and hair loops into Pasteur pipettes, other similar glues can be used.
Oligodeoxynucleotides, custom ordered Integrated DNA Technologies Custom ordered Template oligos for sgRNA synthesis, see Nakayama et al., 2014 for design details.
Megascript T7 kit Ambion/ThermoFisher AM1334 Or use Megashortscript T7 (AM1354) kit
Phenol, Tris buffered High quality distilled phenol from any commercial supplier
Chloroform High quality chloroform from any commercial supplier
Ethanol High quality ethanol from any commercial supplier
Diethylpyrocarbonate (DEPC) Sigma Chemical Co. D5758-50ML
Cas9 protein, with nuclear localization signal PNA Bio, Inc. CP01 Reconstituted using DEPC-treated water according to manufacturer's recommendations
10X Marc's Modified Ringers solution Homemade. Recipe (ref 26) for 1X MMR (lacking EDTA) is 100mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES. Solution is pH adjusted to 7.4.
Agarose Any Molecular Biology grade agarose is sufficient
60 X15 mm Petri plates Falcon 351007
24-well plates Falcon 3047
L-Cysteine Sigma Chemical Co. C7352-100G Free base, not HCl salt
Proteinase K Roche 03 115 828 001 Typically ~20mg/ml from Roche
sera Micron sera Tadpole food. Resuspend in growth medium. Can be purchased from a variety of online retailers

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gurdon, J. B., Hopwood, N. The introduction of Xenopus laevis into developmental biology: of empire, pregnancy testing and ribosomal genes. Int J Dev Biol. 44 (1), 43-50 (2000).
  2. Hellsten, U., et al. The genome of the Western clawed frog Xenopus tropicalis. Science. 328 (5978), 633-636 (2010).
  3. Session, A. M., et al. Genome evolution in the allotetraploid frog Xenopus laevis. Nature. 538 (7625), 336-343 (2016).
  4. Blitz, I. L., Biesinger, J., Xie, X., Cho, K. W. Biallelic genome modification in F(0) Xenopus tropicalis embryos using the CRISPR/Cas system. Genesis. 51 (12), 827-834 (2013).
  5. Nakayama, T., Fish, M. B., Fisher, M., Oomen-Hajagos, J., Thomsen, G. H., Grainger, R. M. Simple and efficient CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Xenopus tropicalis. Genesis. 51 (12), 835-843 (2013).
  6. Guo, X., et al. Efficient RNA/Cas9-mediated genome editing in Xenopus tropicalis. Development. 141 (3), 707-714 (2014).
  7. Wang, F., Shi, Z., Cui, Y., Guo, X., Shi, Y. B., Chen, Y. Targeted gene disruption in Xenopus laevis using CRISPR/Cas9. Cell Biosci. 5, 15 (2015).
  8. Jaffe, K. M., et al. c21orf59/kurly Controls Both Cilia Motility and Polarization. Cell Rep. 14 (8), 1841-1849 (2016).
  9. Liu, Z., et al. Efficient genome editing of genes involved in neural crest development using the CRISPR/Cas9 system in Xenopus embryos. Cell Biosci. 6, 22 (2016).
  10. Naert, T., et al. CRISPR/Cas9 mediated knockout of rb1 and rbl1 leads to rapid and penetrant retinoblastoma development in Xenopus tropicalis. Sci Rep. 6 (35264), (2016).
  11. Ratzan, W., Falco, R., Salanga, C., Salanga, M., Horb, M. E. Generation of a Xenopus laevis F1 albino J strain by genome editing and oocyte host-transfer. Dev Biol. 426 (2), (2016).
  12. Bhattacharya, D., Marfo, C. A., Li, D., Lane, M., Khokha, M. K. CRISPR/Cas9: An inexpensive, efficient loss of function tool to screen human disease genes in Xenopus. Dev Biol. 408 (2), 196-204 (2015).
  13. Shigeta, M., et al. Rapid and efficient analysis of gene function using CRISPR-Cas9 in Xenopus tropicalis founders. Genes Cells. 21 (7), 755-771 (2016).
  14. Hontelez, S., et al. Embryonic transcription is controlled by maternally defined chromatin state. Nat Commun. 6, 10148 (2015).
  15. Peshkin, L., et al. On the Relationship of Protein and mRNA Dynamics in Vertebrate Embryonic Development. Dev Cell. 35 (3), 383-394 (2015).
  16. Owens, N. D., et al. Measuring Absolute RNA Copy Numbers at High Temporal Resolution Reveals Transcriptome Kinetics in Development. Cell Rep. 14 (3), 632-647 (2016).
  17. Blitz, I. L., Fish, M. B., Cho, K. W. Leapfrogging: primordial germ cell transplantation permits recovery of CRISPR/Cas9-induced mutations in essential genes. Development. 143 (15), 2868-2875 (2016).
  18. Blackler, A. W. Transfer of germ-cells in Xenopus laevis. Nature. 185, 859-860 (1960).
  19. Blackler, A. W., Fischberg, M. Transfer of primordial germ-cells in Xenopus laevis. J Embryol. Exp Morph. 9, 634-641 (1961).
  20. Bounoure, L. L'origine des cellules reproductrices et le problem de la lignee germinale. , Gauthier-Villars. Paris. (1939).
  21. Nieuwkoop, P. D., Sutasurya, L. A. Primordial Germ Cells in the Chordates: Embryogenesis and phylogenesis. , Cambridge University Press. Cambridge. (1979).
  22. Heasman, J., Holwill, S., Wylie, C. C. Fertilization of cultured Xenopus oocytes and use in studies of maternally inherited molecules. Methods Cell Biol. 36, 213-230 (1991).
  23. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Embryo dissection and micromanipulation tools. CSH Protoc. , (2007).
  24. Nakayama, T., et al. Cas9-based genome editing in Xenopus tropicalis. Methods Enzymol. 546, 355-375 (2014).
  25. Ogino, H., McConnell, W. B., Grainger, R. M. High-throughput transgenesis in Xenopus using I-SceI meganuclease. Nat Protoc. 1 (4), 1703-1710 (2006).
  26. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early development of Xenopus laevis.: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2000).
  27. Kay, B. K. Injection of oocytes and embryos. Xenopus laevis: Practical Uses in Cell and Molecular Biology (Methods in Cell Biology Vol. 36). Kay, B. K., Peng, H. B. , Academic Press. San Diego. (1991).
  28. Normal Table of Xenopus laevis. (Daudin): A Systematical and Chronological Survey of the Development from the Fertilized Egg till the End of Metomorphosis. Nieuwkoop, P., Faber, J. , Garland Publishing Inc. New York. (1994).
  29. Xenopus Tadpole Feeding. , Available from: http://www.mbl.edu/xenopus/files/2016/06/Xenopus-Tadpole.pdf (2017).
  30. Xenopus tropicalis Animal Care. , Available from: http://www.mbl.edu/xenopus/files/2016/06/Xenopus-Tropicalis.pdf (2017).
  31. Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Res. 42 (22), e168- (2014).
  32. Sander, V., Reversade, B., De Robertis, E. M. The opposing homeobox genes Goosecoid and Vent1/2 self-regulate Xenopus patterning. EMBO J. 26 (12), 2955-2965 (2007).
  33. Bedell, V. M., et al. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).
  34. Kim, J. M., Kim, D., Kim, S., Kim, J. S. Genotyping with CRISPR-Cas-derived RNA-guided endonucleases. Nat Commun. 5, 3157 (2014).
  35. Kim, H. J., Lee, H. J., Kim, H., Cho, S. W., Kim, J. S. Targeted genome editing in human cells with zinc finger nucleases constructed via modular assembly. Genome Res. 19 (7), 1279-1288 (2009).
  36. Qiu, P., Shandilya, H., D'Alessio, J. M., O'Connor, K., Durocher, J., Gerard, G. F. Mutation detection using Surveyor nuclease. Biotechniques. 36 (4), 702-707 (2004).
  37. Ota, S., et al. Efficient identification of TALEN-mediated genome modifications using heteroduplex mobility assays. Genes Cells. 18 (6), 450-458 (2013).
  38. Dahlem, T. J., et al. Simple Methods for Generating and Detecting Locus- Specific Mutations Induced with TALENs in the Zebrafish Genome. PLoS Genet. 8 (8), e1002861 (2012).
  39. Ramlee, M. K., Yan, T., Cheung, A. M., Chuah, C. T., Li, S. High-throughput genotyping of CRISPR/Cas9-mediated mutants using fluorescent PCR-capillary gel electrophoresis. Sci Rep. 5, 15587 (2015).
  40. Bhattacharya, D., Marfo, C. A., Li, D., Lane, M., Khokha, M. K. CRISPR/Cas9: An inexpensive, efficient loss of function tool to screen human disease genes in Xenopus. Dev Biol. 408 (2), 196-204 (2015).
  41. Yu, C., Zhang, Y., Yao, S., Wei, Y. A PCR Based Protocol for Detecting Indel Mutations Induced by TALENs and CRISPR/Cas9 in Zebrafish. PLoS ONE. 9 (6), e98282 (2014).
  42. Mock, U., Hauber, I., Fehse, B. Digital PCR to assess gene-editing frequencies (GEF-dPCR) mediated by designer nucleases. Nat Protoc. 11 (3), 598-615 (2016).
  43. Varshney, G. K., et al. High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9. Genome Res. 25 (7), 1030-1042 (2015).
  44. Shi, J., Wang, E., Milazzo, J. P., Wang, Z., Kinney, J. B., Vakoc, C. R. Discovery of cancer drug targets by CRISPR-Cas9 screening of protein domains. Nat Biotechnol. 33 (6), 661-667 (2015).
  45. Koebernick, K., Loeber, J., Arthur, P. K., Tarbashevich, K., Pieler, T. Elr-type proteins protect Xenopus Dead end mRNA from miR-18-mediated clearance in the soma. Proc Natl Acad Sci USA. 107, 16148-16153 (2010).
  46. Yang, J., Aguero, T., King, M. L. The Xenopus maternal-to-zygotic transition from the perspective of the germline. Curr Top Dev Biol. 113, 271-303 (2015).

Tags

גנטיקה גיליון 132 צפרדע רפואית גנטיקה מוטציות CRISPR/Cas9 TALEN הגנום עריכה מוטגנזה מכוונת אובדן התפקוד
השתלת תא נבט הקדמוני עבור מבוססת על CRISPR/Cas9 וקפיצת המדרגה של <em>צפרדע רפואית</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Blitz, I. L. Primordial Germ Cell… More

Blitz, I. L. Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus. J. Vis. Exp. (132), e56035, doi:10.3791/56035 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter