Summary
Gener avgjørende for overlevelse utgjør teknisk hekk for opprettelse av mutant linjer. Sprang framover omgår dødelighet ved å kombinere genomet redigering med primordial celletransplantasjon opprette vill-type dyr bærer germline mutasjoner. Sprang framover tillater også effektiv generering av homozygous null mutanter i F1 generasjon. Her, er transplantasjon trinnet demonstrert.
Abstract
Etableringen av mutant linjer av genomet redigering er akselererende genetisk analyse i mange organismer. CRISPR/Cas9 metoder har blitt tilpasset for bruk i den afrikanske klorte frosken, Xenopus, en langvarig modell organisme for biomedisinsk forskning. Tradisjonelle avl ordninger for å skape homozygous mutant linjer med CRISPR/Cas9-målrettet mutagenese har flere tidkrevende og arbeidskrevende trinn. For å forenkle etableringen av mutant embryoer, spesielt å overkomme tilknyttet fortrenging gener som er avgjørende for embryogenesis, utviklet en ny metode kalt sprang framover. Denne teknikken utnytter robust Xenopus embryo å "klippe og lime" embryologiske metoder. Sprang framover benytter overføring av primordial bakterie celler (PGCs) fra effektivt mutagenized donor embryo i PGC-ablated wildtype søsken. Denne metoden gir effektiv mutasjon av viktige gener ved å opprette chimeric dyr med wildtype somatiske celler som bærer en mutant germline. Når to F0 dyr bære "leapfrog transplantasjoner" (dvs. mutant bakterie celler) er intercrossed, de produserer homozygous eller sammensatte heterozygote, null F1 embryoer, sparer en hele generasjonstid å få fenotypiske data. Sprang framover, gir det også en ny tilnærming for å analysere mors effekt gener som er ildfaste til F0 fenotypiske analyse etter CRISPR/Cas9 mutagenese. Dette manuskriptet detaljer metoden sprang framover, med spesiell vekt på hvor å utføre PGC transplantasjon.
Introduction
Hvordan genotype koder fenotypen har vært store spørsmål i biologi siden gjenoppdagelsen av pangener. En forståelse av rollene gener, deres regulering og interaksjoner i genet nettverk og funksjonene av kodet produkter lover å gi verktøy for avdekke nye biologi og ameliorating sykdomstilstander. For over et halvt århundre1, har den afrikanske klorte frosken, Xenopus, vært en ledende modell for studier på en rekke emner i grunnleggende biologi og biomedisin, inkludert genetisk kontroll av utvikling. Historisk mest forskning på Xenopus har brukt allotetraploid frosk, X. laevis, men mer nylig, på grunn av sin diploidy, X. tropicalis har blitt utviklet som en amfibier genetisk modell. Komplett genomet sekvenser har blitt samlet fra begge Xenopus arter2,3. "Frosk samfunnet" er nå på et vendepunkt hvor grunnleggende genomet endring teknologi tillater studiet av gen funksjon, nesten på vilje. Programmerbare CRISPR/Cas9 endonucleases har gjort mutagenese av gener svært effektiv, med biallelic mutasjon mulig i de fleste celler av dyr4,5,6,7, 8,9,10,11. Disse studiene, understreket av Bhattacharya et al. 12 og Shigeta et al. 13, har vist at funksjonen til mange gener kan studeres ved mutagenese i F0 mosaikk dyr. Denne tilnærmingen har mange fordeler; Cas9-sgRNA-microinjected embryo vises imidlertid ofte variabel fenotyper skyldes ufullstendig tap av funksjon (LOF). Mer betydelig, generering av mutant linjer er svært fordelaktig for enkelte programmer, spesielt når studere gener som har en mors mRNA bidrag. Mors mRNAs og proteiner og deres innflytelse på epigenetics, vedvarer for en lengre periode i embryogenesis14,15,16, rendering tidlig utviklingsmessige bidrag av mange gener ildfast til F0 analyser. Derfor er andre LOF tilnærminger nødvendig.
Når søker å opprette mutant, har banen til å skaffe homozygous LOF embryoer flere hindringer. Første, effektiv mutagenese å produsere biallelic mutasjoner kan være uheldig fordi tap av viktig genet funksjoner resulterer i manglende evne til å overleve til seksuell modenhet, forstyrrer produksjonen av en levedyktig linje. En felles løsning er forsiktig Serine mengden av Cas9-sgRNA leveres. Her er målet å oppnå en balanse mellom å redusere dødelighet samtidig også maksimere germline mutagenese effektivitet. Det andre problemet oppstår fra standard avl ordningen, der fenotypiske analyser er utsatt til F2 generasjon. Ved hjelp av standard tilnærming, seksuelt moden F0 dyr som overfører mutant alleler gjennom germline er outcrossed for å produsere F1 heterozygote "operatører", som er da vokst til seksuell modenhet. To F1 heterozygotes er så intercrossed for å produsere F2 mutant embryo med en forventet Mendelian frekvens på 25%. Dermed er to generasjoner av avl nødvendig for analyse av mutant fenotyper. Mutant dyr kan være homozygotes eller sammensatte heterozygotes (dvs. avkom som inneholder to forskjellige mutant alleler, som avhenger av genotyper av foreldrenes dyrene i F1 intercross).
Disse hindringene kan overvinnes ved å avgrense programmerbare nuclease-mediert mutagenese bakterie celler, som ligger under en ny metode kalt sprang framover17. Sprang framover har to hovedkomponenter: (1) microinjection av Cas mRNA sammen med sgRNA eller nuclease-sgRNA komplekser (eller, i prinsippet, TALENs eller sink finger nucleases) på én celle scenen å effektivt mutagenize embryonale genomer, etterfulgt av (2) transplantasjon av PGCs i wildtype søsken embryo, der de endogene PGCs ble fjernet. Når begge er effektiv, fullstendig germline erstatning med mutant bakterie celler kan oppnås. Blackler viste tidlig på 1960-tallet at Xenopus PGCs kan transplanteres mellom embryoer på slutten neurula og tidlig tailbud stadier18,19. For sprang framover, ble Blacklers tilnærming endret ved å utføre transplantasjoner dannelse scenen17, når PGCs er lokalisert i vegetal Polen av embryo20,21. Transplantasjon før gastrulation har to hovedfordeler. Først ble engraftment transplantasjoner og påfølgende normal utvikling funnet for å være mer effektive når transplantasjon utføres på dannelse scenen (upubliserte observasjoner). Andre, ved å utføre dannelse-trinns transplantasjoner kort tid etter zygotic transkripsjon har begynt, kan man unngå lethality fremkommer fra utviklingsmessige genet mutasjoner som forstyrrer gastrulation eller som ellers fører til misformet sen neurulae. PGC transplantasjon rentebærende ("leapfrogged") embryo dyrkes til seksuell modenhet og intercrosses mellom disse F0 dyrene har vist at, i mange tilfeller viser 100% av F1 avkommet LOF fenotypen (de fleste blir sammensatt heterozygotes), som angir fullstendig germline erstatning med målrettet mutasjoner.
Det forventes at sprang framover vil akselerere genetisk tilnærminger i Xenopus. Sprang framover også gir et alternativ til "host overføring" metoden22 for LOF analyse av mors-effekt gener (upubliserte observasjoner). Den gjeldende publikasjonen presenteres en detaljert beskrivelse av metoden, med særlig fokus på PGC transplantasjon, i X. tropicalis (med mindre endringer for X. laevis). Transplantasjon av PGCs demonstrert her til rette for en raskere overføring av denne teknologien til andre laboratorier arbeider med Xenopus. Prinsippene i denne metoden bør være vellykket i andre amfibier (f.eks urodeles), og organisme-spesifikke endringer i metodikk bør tillate programmet mange andre dyr som effektive mutagenese kan oppnås og PGCs er lett transplantable.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metodene som er beskrevet her er godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komiteen av University of California, Irvine.
1. forberedelser for PGC transplantasjon
- Forberede disseksjon verktøy på forhånd, som beskrevet tidligere23.
Merk: Øyenbrynet hår kniver brukes til å lage snitt med hjelp av et hår loop å stabilisere fosteret ved utføring av operasjoner. Øyenbrynet hår og hår buer er limt inn Borosilikatglass Pasteur Pipetter som først har blitt trukket i en flamme og brutt på tynnet delen (se figur 1A, pilspiss) opprette et kortere, smalere tips (figur 1B) for større fingerferdighet Når du utfører operasjoner. - Generere sgRNAs ved hjelp av prosedyrer beskrevet tidligere24 .
Merk: Kort, kort DNA maler koding for sgRNAs opprettes med overlappende deoxyoligonucleotides inneholder 5' bacteriophage T7 arrangører, som er herdet og "fylt" ved en feil, thermostable DNA polymerase. In vitro sgRNA syntese reaksjoner er ruges i flere timer å (avhengig av settet brukes). Reaksjoner er DNAse-behandlet fjerne malen. SgRNAs blir renset ved standard metoder for fenol/kloroform utvinning og ammonium acetate/isopropanol-nedbør, ifølge kit produsentens instruksjoner24. - Kort tid før du utfører microinjections, forberede Cas9-sgRNA komplekser av første denaturing ~ 250 ng av sgRNA i et 3 µL totalvolum på RNAse-fri (diethylpyrocarbonate-behandlet) H2O 60-65 ° C i 5 min, etterfulgt av rask-kjøling på is 5 min. Sentrifuge sgRNA for et par sekunder, Legg 1 µL 1 µg/µL Cas9 protein, og ruge i 10 min på 37 ° C å fremme komplekse formasjon.
Merk: Etter denne inkubasjon røret kan holdes på is mens forbereder embryoene microinjection. - Få X. tropicalis embryo ved i vitro fertilisering med standard metoder beskrevet tidligere25. De gelé25,26 embryoer på 10 min etter befruktning.
Merk: Gjødsling tiden regnes tiden etter sperm suspensjon legges til eggene og parabolen er oversvømmet med 1/9thX Marc endret Ringers (MMR)26. For X. tropicalis25, i motsetning til X. laevis, utføre de jellying i 1/9 x MMR med 3% cystein gratis base (ikke HCl salt), pH justert til 7,8-8.0, etterfulgt av flere vasker i 1/9 x MMR. Overføre embryoene til en agarose (1%)-belagt tallerken med 1/9 x MMR ved romtemperatur. - Øyeblikkelig overføre embryoene skal injiseres til en 1% agarose-belagt rett som inneholder 1 x MMR bruker en Pasteur pipette.
-
Sprøyte på 1-celle scenen. Se referanser26,27 detaljerte beskrivelser av Xenopus microinjection metoder.
- Injisere hver embryo på ett enkelt sted i dyr pole, med 4 nL av Cas9-sgRNA komplekset (sluttbeløpet = 1 ng Cas9 og ~ 250 pg av sgRNA, se diskusjonen)24. Etter 10-20 min injeksjon området healing, overføre embryoene til en agarose-belagt rett som inneholder 1/9 x MMR og Inkuber på 25 ° C. Også opprette et fat med uninjected søsken embryo som skal fungere som pode mottakere.
-
Forberede Petri plater (60 mm) som inneholder en ~ 5 mm-tykt lag med 1% agarose i 0,3 x MMR, hvis gjør transplantasjoner i X. tropicaliseller 1 x MMR for X. laevis.
- Opprette depresjoner ~ 3-4 mm dyp ved å sette inn en 3-x 4-og mold (opprettet ved å kutte en 96-brønns PCR plate) i smeltet agarose når helle plater (se figur 1 c og D). Hold mold flere millimeter over bunnen av Petriskål med en klemme knyttet til ringen stå til agarose har herdet.
- I tillegg gjøre en 24-vel plate huset personlige embryo ved belegg brønner med et tynt lag med 1% agarose i 1/9 x MMR.
Merk: Kultur medium lagt til disse brønnene er 1/9 x MMR supplert med 50 µg gentamycin sulfate/ml.
2. transplantasjon av PGCs
- Når embryoene akkurat nå Nieuwkoop og Faber28 dannelse stadium 9 (figur 2A), ~4.5 h etter befruktning (hpf) for X. tropicalis, fjerne dem fra 25 ° C inkubator og tillate dem å equilibrate til romtemperatur ekstra 0,5 h.
- Å begynne transplantasjon på 5 hpf (figur 2B), bruke en Pasteur pipette for å overføre en PGC donor embryo (injisert med Cas9-sgRNA) på 60 mm agarose maten som inneholder groper (opprettet i trinn 1.7) på 0,3 x MMR (eller 1 x MMR hvis bruker X. laevis). Også overføre en uninjected søsken embryo, pode mottakeren, denne parabolen.
Merk: Det er viktig at identiteten til hver av disse Foster ikke er forvirret. - Manuelt fjerne eggeplomme konvolutter fra hver fosteret ved hjelp av pinsett og rotere både embryo slik at deres vegetal polakkene er i visningen og tilgjengelig for kirurgi.
Merk: En beskrivelse av manuell de-vitellination av embryo har tidligere blitt beskrevet26. - Bruke skarp spissen av en øyenbrynet hår kniv, lage fire grunne incisions i form av en firkant i vegetal pole av mottakeren embryoet, i sonen hvor fremtidige flaske celler som markerer blastopore vil danne. Gjør incisions ved å stikke tuppen av øyenbrynet hår kniven inn embryoet, like under overflaten, og gjøre slicing oppover bevegelser samtidig stabilisere embryoet med hår loop.
Merk: Figur 2 viser grønne utsikt over et embryo på med intervaller fra 4.5 7.0 hpf viser cellen og gi en guide for å estimere hvor flasker cellene vil danne (stiplet hvit sirkel). Målet er å gjøre incisions der den stiplede svarte boksen er angitt. - Når de fire sidene av plassen er avgrenset av snitt, utdype hvert snitt med øyenbrynet hår kniven bruker lignende kutte bevegelser for å nå en dybde på ca 1/3 til 1/2 av avstanden til blastocoel gulvet.
- Gratis den grønne vev explant fra mottakeren embryoet (figur 3A og B) ved å gjøre en horisontal (parallelt til grønne overflaten) cut (e) i regionen dype grønne.
Merk: Størrelsen på den PGC inneholder grønne explant er ca 0,4-0.45 mm per side og 0,25-0,3 mm i dybde. Denne grønne explant fra mottakeren embryoet er ikke lenger nødvendig og bør derfor settes til side forkastes. - Arbeider raskt, Gjenta dette (trinn 2.4-2.6) på PGC donor embryoet opprette en tilsvarende størrelse grønne vev fragment for transplantasjon.
Merk: Det er viktig å utføre dette andre disseksjon med liten forsinkelse å minimere tiden for mottakeren embryoet å helbrede sin åpent sår. - Når vev som inneholder PGCs fjernes fra donor fosteret, bruke øyenbrynet hår kniv og hår loop for å flytte denne explant på plass i åpningen opprettet i mottakerens fosteret.
Merk: Overflaten av donor graft må stå overfor indre av mottakeren fosteret. Det er ikke nødvendig å matche retningene av dorsal ventrale og venstre høyre aksene av graft med mottaker fosteret. - Bruk langsiden av akselen på øyenbrynet hår kniven, holdt parallell til overflaten av graften, forsiktig trykke pode inn i åpningen i grønne overflaten av mottakeren fosteret.
- Når graftet er plassert, kan du bruke en hairloop eller akselen av en øyenbrynet hår kniv til Skyv "carcass" av donor embryoet over agarose overflaten og inn i en agarose depresjon. Kontroller at det åpne såret i Carcass vender bulk væsken. Hvis ikke, bruk øyenbrynet hår kniv til å rotere embryoet for å oppnå denne retningen.
- Skyv mottaker embryoet, med graftet healing på plass, inn i en tilstøtende depresjon og likeledes sikre at podet vegetal pole vevet vender bulk væsken.
- Gjenta denne fremgangsmåten (trinn 2.1-2.11) bruker et par giver og mottaker embryo til å opprette en annen transplantasjon/carcass nøkkelparet. overføre disse tomme depresjoner.
Merk: Det er viktig at man gir notasjoner å holde oversikt over samsvarende par skrotter og transplantasjon rentebærende embryoer. Donor skrottene skal brukes som en proxy for effektiviteten av Cas9-sgRNA-indusert mutagenese i de transplanterte PGCs, som kan være lett assayed til transplantasjon-bærende dyr når seksuell modenhet (se trinn 3.3 nedenfor, og diskusjon ). - Fortsette å gjøre transplantasjon til embryoene kommer ca gastrula stadium 10, som er ca 6,5 hpf i X. tropicalis (se figur 2E).
3. etter-helbredelse av embryo
Merk: Grafts helbrede på plass innen ~ 30 min, og det er vanlig å observere noen yolky rester fra cellen lysis væskende fra embryoet (Figur 3 c).
-
Når helbredet, kan du bruke en Pasteur pipette til svært forsiktig overføring embryoer fra fordypninger individuelle brønner av en agarose-belagt 24-vel plate. Sårvæske blir fjernet (figur 3D) av væske blande under overføringen.
- Rotere embryoene slik at de er plassert grønne-pol opp, overfor bulk løsning. Igjen, plassere donor skrottene og pode mottakere i tilstøtende brønner å hjelpe holder bane av embryoet par; registrere denne informasjonen.
- Overføre 24-vel platen inneholder embryo til en 25 ° C inkubator for natten kultur.
Merk: Dagen embryoene ville ha nådd tailbud stadier. - Flytte pode mottakerne å rengjøre belagte agarose 6-vel plater som inneholder 1/9 x MMR supplert med 50 µg gentamycin sulfate/ml, med 1 embryoet per brønn. Opprettholde en helt fortegnelse av donor skrotter som samsvarer med disse pode mottakere.
- For å vurdere mutagenese effektivitet ved sekvensering PCR amplicons5,17,24 eller andre metoder som bruker PCR amplicons (se diskusjon), flytter du individuelle skrotter til 0,2 mL PCR stripe rør. Fjerne det meste av mediet og homogenize i 100 µL lysis buffer24 som inneholder proteinasen K (PK) ved gjentatt opp pipettering bruker en P200 pipette.
- Utføre embryoet lysis24 på 56 ° C 6t overnight for å tillate PK fordøyelsen. Deaktiver PK ved å varme det 90-95 ° c i 10 min, etterfulgt av rask nedkjøling til 4 ° C. Bruk lysates uten ytterligere rengjøring trinn for å frø PCR reaksjonene å få kort amplicons direkte Sanger DNA sekvensering24. Lagre lysates på 20 ° C.
Merk: I flere dager, i rumpetroll kommer fôring stadier (ca scenen 45-46) og kan matet en suspensjon av planktoniske pulver (sera mikron). - Etter ~ 1 uke, med daglige endringer av kultur medium å opprettholde renslighet og minimere mikrobiell overvekst, flytte rumpetroll til små tanker i en sirkulerende akvatiske system med drypp flyt. Bruk datatypen sekvensering for å skille rumpetroll med svært effektivt mutagenized PGCs fra rumpetroll med lavere mutagenese effektivitet. Når forvandlingen er fullført, kan du flytte froglets voksen akvatiske systemet i laboratoriet.
Merk: Regimer utviklet av National Xenopus ressursen (marin biologi laboratorium, Woods Hole, MA) gir en guide for rumpetroll fôring29 og voksen frosk vedlikehold30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter transplantasjon, kvalitativ fastsettelse av effekten av CRISPR/Cas9 mutagenese skal utføres før expending innsats i husdyrhold å vokse og opprettholde dyr til seksuell modenhet. Fordi dyrene bærer leapfrog transplantasjoner er somatically wildtype og germline er vanskelig å få tilgang for direkte målinger, blir lagre skrottene av donor embryo viktig. DNA-analyse fra skrottene fungerer som en proxy for omfanget av mutagenese som oppstår i de transplanterte germline17.
En tilnærming til å vurdere hvor vellykket mutagenese er direkte sekvensen PCR amplicons spenner genomisk regionen målrettet. Dette blir spesielt kostbare og ineffektive hvis man ønsker å sekvens mange individuelt klonet DNA fragmenter fra mange dyr. I stedet brukes sekvensering amplicons heterogene på målområdet, som de er utledet fra genetisk mosaikk embryo, til å vurdere mutagenese effektivitet i hver embryoet19. Visualisering av chromatograms viser wild type sekvensen (topper) oppstrøms av målet sekvensen og topper bli "scrambled" (dvs. samtidig forekomst av toppene tilsvarer flere baser på hver nucleotide posisjon) nedstrøms stedet av Cas9-katalysert dobbel-strand pause. Slike eksempler finnes i figur S1 av Blitz et al. 17. nøyaktig kvantifisering av omfanget av mutagenese representert ved disse kryptert topper kan oppnås ved hjelp av en sekvens nedbryting algoritme, TIDEVANNET (https://tide-calculator.nki.nl/)31. Screening personlige embryo bruker denne teknikken gir tillit at hver embryo var riktig injisert og mål for mutagenese. En tracer, for eksempel en fluorescently merket dekstran, kan brukes til å bekrefte vellykket injeksjon24 og kan også hjelpe med å etablere at en rumpetroll faktisk bærer transplantert vev (upubliserte data). Det er viktig å merke seg at formell muligheten at coinjection av en fluorescerende dekstran sammen med Cas9-sgRNA kan endre Cas9 mutagenese effektivitet ikke har blitt undersøkt. Noen "leapfrogged" embryo som inneholder transplantasjoner fra dårlig eller unmutagenized givere kan kastes.
Sprang framover omgår behovet for F2 generasjon analyse i standard genetisk avl ordninger, ved å tillate effektiv fenotypiske analyser i F1 embryoer. Når du bruker standard tilnærmingen for å mutere viktig gener, er forsiktig titrering av Cas9-sgRNA dose nødvendig for å sikre levedyktigheten til grunnleggeren embryoer, noe som resulterer i en redusert mutagenese effektivitet. Gjenlevende F0 er dyr fra denne standard ordningen så outcrossed med wildtypes å få levedyktig F1 embryoer, som er vist for å identifisere bærere. Endelig er disse F1 heterozygotes vokst til seksuell modenhet og intercrossed for å få homozygous F2 personer viser mutant fenotyper. I kontrast, fordi sprang framover produserer dyr som har fullstendig utskifting av deres germlines med mutant alleler, produserer intercrossing disse F0 dyr mutant fenotyper i F1 generasjon. Blitz et al. 17 rapportert at et flertall av F0 dyr rettet mot tyrosinase (tyr) locus, som kreves for pigmentering melanocytter og netthinnen, viste 100% germline overføring (målt ved outcrossing med Tyr- / - albino dyr) av donor-avledet mutant genomer (se Figur 4A-B og tabell 1). Dermed vil intercrossing to dyr produsert av sprang framover gi homozygous eller sammensatte heterozygote mutant F1 embryoer.
Lignende resultater ble oppnådd17 av intercrossing F0 leapfrogged dyr bære mutasjoner i homeobox (koding DNA-bindende homeodomain) av goosecoid (gsc) genet (se figur 4A, C-H). Bokseren Gsc uttrykk ved hjelp av morpholino antisense oligonucleotides i X. laevis foreslo at gsc genet er nødvendig for hele utviklingen av fremre hodet32, og Cas9-sgRNA injisert rumpetroll også Vis embryonale dødelige fenotyper17. Imidlertid leapfrogged F0 dyrene, blir somatically wild type, er levedyktig og robuste, og F1 intercross produsert embryo med identiske LOF fenotyper de publisert i X. laevis bokseren17. Disse dataene fra genetisk bekreftelse for morpholino fenotypen, så vel som et bevis på prinsippet som sprang framover kan brukes å overvinne embryonale dødelige fenotyper.
Figur 1: nødvendig materiale for transplantasjon. (A) Borosilikatglass Pasteur Pipetter brukes til å lage øyenbrynet hår kniver og hår looper for mikrokirurgi på tidlig embryo. Tegningen ut glass med en Bunsen brenner tillater en smalere slutt for innsetting av håret. Rød pilspissen markerer omtrentlig posisjon på å bryte glasset. (B) et eksempel på en øyenbrynet hår kniv (øverst) og hår loop (nederst), fast i Pipetter med hurtigtørkende limet. (C) en del av en 96-brønns PCR plate brukes til å opprette fordypninger i en agarose plate ved at 1% agarose å størkne rundt mold (agarose er laget i 0.3 x eller 1 x MMR, avhengig av om transplantasjoner blir utført i X. tropicalis eller X. laevis, henholdsvis). Tykkelsen på agarose er ~ 5 mm, med 3-4 mm-dype brønner. (D) et eksempel på en agarose plate for transplantasjon, med 12 depresjoner, som vist i panelet C. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: morfologi av vegetal pole under den avdøde dannelse gastrula tidligfasen og strategien for disseksjon. (A-F) Xenopus tropicalis embryo vises i grønne visning på halv time tidsintervaller, fra begynnelsen av dannelse SS9 (4,5 hpf) til tidlig gastrula scenen ~10.25 (7 hpf). Før 5 hpf, blastomeres er store og lettere skadet. Hvitt, stiplet sirkel markerer den forventede posisjonen av flaske celle formasjon under gastrulation, som kan sees danner begynnelsen på dorsal side (øverst) i paneler (E og F). For sprang framover, fire Snittene lages innenfor en firkant, avbildet av svart stiplede linjer, med et kutt laget parallell til overflaten av vev (ikke illustrert) å frigjøre den grønne explant. Skala bar = 400 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: transplantasjon. (A) et eksempel på en ~5.5 hpf embryoet etter fjerning av grønne PGC inneholder vev. Svart stiplede boksen og hvite stiplede sirkelen er samme relative dimensjoner som vist i figur 2. (B) den grønne explant fjernet fra embryoet i panelet A, overflatebehandling overfor betrakteren, er ca 0,4-0.45 mm per side og 0,25-0,3 mm i dybde. (C) et embryo med transplantert grønne vev. Bildet ble kjøpt ~ 10 min etter transplantasjon. (D) 30 min etter transplantasjon, den grønne vev er sett å ha helbredet på plass (mild virvlende med en øyenbrynet hår kniv ovenfor fosteret ble brukt til å opprette en vortex som feide bort rusk i panelet C). Etter overføring til 1/9 x MMR og inkubasjon ved 25 ° C ferdig de fleste embryo gastrulation normalt. Skala bar = 400 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Germline overføring fra F0 dyr produsert av sprang framover. (A) For sprang framover, to gener var målrettet av CRISPR/Cas9, tyrosinase (øverst) og goosecoid (nederst). Tyr genet var målrettet4,5 i den koding sekvensering (blå skygge) for en N-terminal signal peptid (SP, rød skygge), mens gsc genet var målrettet17 i koding sekvensen ved den begynnelsen av homeobox (rød skygge), som er delt mellom to exons. Uoversatt 5' og 3 exonic regionene er ikke skyggelagt. (B) alle 160 F1 tadpoles fra (se tabell 1) en mating av leapfrogged F0 menn (LF1) og en albino (tyr-/-) kvinnelige var albino, som angir at det hele germline fra det leapfrogged mannlige hadde vært erstattet med tyr mutant bakterie celler. Rammemargen viser en vill-type rumpetroll med normal retinal og melanocyte pigmentering. (C-H) F1 embryoer fra en intercross mellom to F0 leapfrogged Xenopus målretting homeobox genet gsc. Omtrent 2/3rds av embryoene var svært mutant for gsc, med fenotypen er varierende grad av fremre trunkering av hodet (Eh). Halvparten av mutanter var enten cyclopic eller hadde kryr øyne (F), mens den andre halvparten var eyeless (H). Genotyperingteknologi viste dette å være homozygotes eller sammensatte heterozygotes. 1/3rd av embryo viser vill-type fenotypen (C, D) var homozygous vill-type eller heterozygotes. In situ hybridisering for otx2 (en markør forebrain, mellomhjernen og øyne), egr2 (en markør for hindbrain rhombomeres 3 og 5, og en strøm av neural crest) og hoxb9 (en markør i ryggmargen) viser at tap av GSC funksjonen påvirker bare den fremre delen av otx2 domenet. Disse dataene er gjengitt fra Blitz et al. 17 med tillatelse fra selskapet av biologer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Cross | Mann | Kvinne | Albino | Wild type | Totalt | % Albino |
| 1 | LF1 | Tyr-/- | 160 | 0 | 160 | 100 |
| 2 | LF2 | Tyr-/- | 148 | 0 | 148 | 100 |
| 3 | Tyr-/- | LF3 | 409 | 0 | 409 | 100 |
| 4 | Tyr-/- | LF4 | 0 | 519 | 519 | 0 |
| 5 | Tyr-/- | LF5 | 223 | 0 | 223 | 100 |
| 6 | LF6 | Tyr-/- | 493 | 703 | 1196 | 41.2 |
| 7 | Tyr-/- | LF7 | 1 | 94 | 95 | 1.1 |
| 8 | Tyr-/- | LF8 | 125 | 0 | 125 | 100 |
| 9 | Tyr-/- | LF9 | 0 | 417 | 417 | 0 |
| 10 | Tyr-/- | LF10 | 252 | 0 | 252 | 100 |
Tabell 1: Effektiv germline utskifting av leapfrog transplantasjoner bærer mutasjoner i tyrosinase. Rettet mot tyrosinase, transplantasjon-bærende dyr av begge kjønn ble innhentet. Disse dyrene var korslagt med albinos, som er homozygous tyr- / -, å teste effektiviteten av germline overføring av mutant alleler og prosent av F1 embryo som viste albinisme var assayed i rumpetroll scenen. Oppføringer i kolonnene merket "Mann" og "Kvinnelige" Angi hvilken forelder er tyr- /- eller test dyret avledet fra sprang framover (LF). Prosent av embryo innenfor en cross viser albino fenotypen angis under "% Albino." Merk at 6 av 10 dyr med leapfrog transplants viste fullstendig (100%) utskifting med mutant alleler. Denne tabellen er gjengitt fra Blitz et al. 17, med tillatelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne rapporten gir en detaljert protokoll for transplantasjon av grønne vev som inneholder PGCs. transplantasjon av PGCs brukes i forbindelse med genomet-redigering teknologier (f.eks CRISPR/Cas9) til å endre germline av et dyr mens opprettholde nesten alle sine somatiske vev som genetisk wild type. For sprang framover for å lykkes, finnes det en rekke kritiske faktorer å vurdere før du utfører resultater transplantasjoner.
For å sikre fullstendig utskifting av germline med mutant alleler, anbefales det at en først bestemmer i vivo effektiviteten av sgRNAs. Erfaring tilsier at de fleste sgRNAs designet av CRISPRDirect (https://crispr.dbcls.jp/) eller CRISPRScan (http://www.crisprscan.org/) er effektive når de brukes på 250 pg/fosteret. Men i noen tilfeller kan det være nødvendig å bruke høyere konsentrasjoner (f.eks gsc sgRNA publisert av Blitz et al17, kreves ~ 1 ng/embryoet). Vurdere effektiviteten av mutagenese for målområdet er viktig og bruk av TIDEVANNET tillater en kvantitativ vurdering31. Mens metoden understreket her bruker direkte Sanger har sekvensering av PCR amplicons (representerer befolkningen i mutant alleler i F0 embryoer), mange andre metoder blitt brukt i genomet-redigering litteraturen for dette formålet. Andre lav til moderat pris teknikker som brukes ofte inkluderer fragment lengde polymorfisme analyse med enten tap begrensning enzymer33 eller Cas9/TALEN cleavage nettsteder34, T7 endonuclease 135 og Surveyor 36 analyser, heteroduplex mobilitet analysen37, høyoppløselig smelte analysen38, fragmentere analyse av kapillær geleelektroforese39,40, og qPCR-baserte metoder41, 42.
En andre er valget av nettstedet plassering i målet genet. For å tillate effektiv utvinning av mutant fenotyper i F1 generasjon, er det viktig å maksimere sjansen for komplett LOF alleler. Når du gjør mutant linjer med klassisk tilnærminger er det en felles strategi å målrette Cas9 cleavage 5' slutten av koding regioner, for å lokke fram tidlig oversettelse oppsigelse nær begynnelsen av proteinet koding regionen. F1 heterozygotes ville bli identifisert frameshift mutasjoner, og disse dyrene ville velges for videre arbeid fordi de forventes å bære null alleler. Leapfrogging strategi bruker F0 intercrosses, ville tilnærming av målretting 5' slutten av koding sekvensen være svært ineffektive. F0 embryoer har mosaikk germlines, og intercrossing resultater bestander av F1 mutanter som for det meste sammensatte heterozygotes17. Siden storskala analyse bekrefter at gjennomsnittlig forventet ~1/3rd av mutasjoner produsert av dobbel-strand bryter er i-ramme43, ville de fleste F1 embryo produsert på denne måten ha minst én allelet med en i-ramme mutasjon som kunne beholde wild type aktivitet. Derfor for en annen strategi å sikre at selv disse i-ramme mutant alleler er sannsynlig å være nullverdier. Målretting dobbel strand bryter i protein-folding domener som er essensielle for normal protein funksjonen forventes å resultere i en høyere sjanse for komplett LOF (null alleler)17,44. Nøye overveielse å Atom-nivå structure(s) av protein domener, kan når hjelpe i å identifisere områder av sekundær struktur som, selv når inneholder en enkelt aminosyre i-ramme sletting, kan forventes å forstyrre domene struktur ( f.eksΔ3bp mutasjon i gsc publisert av Blitz et al17). Hvis CRISPR/Cas9 målområder kan identifiseres i disse regionene, har en høyere sjanse for hell å skape null alleler. Liten slettinger i løsemiddel-eksponerte looper mellom protein sekundære strukturelle komponenter er mindre ønskelig fordi mutasjoner i mer fleksibel regioner kan fortsatt føre til funksjonell proteiner.
En tredje vurdering for sprang framover er effektiviteten av PGC fjerning fra mottakeren fosteret. Dette trinnet må være effektive for å sikre fullstendig germline erstatning. Det er foreløpig uklart om alle pode mottaker embryo produsert av metoden beskrevet her har fullstendig fjerning av deres PGCs. hele-mount i situ hybridizations viser variasjon i lokalisering av PGC markører i dannelse-trinns embryoer. I mange tilfeller alle eller nesten alle signalet er funnet nær grønne lengst slutten av embryoet og derfor fjernes av operasjonen skissert her (Blitz et al.17 og sitater der). Men viser noen embryo PGC markør uttrykk i noen celler nærmere blastocoel gulvet. Bakterie plasm første coalesces på vegetal Polen etter befruktning og deretter er feide langs cleavage furer under tidlig cleavages. Noen bakterie-plasm kan bli distribuert i cellene i den grønne halvkulen og fjernes ikke effektivt uten å bruke transplantasjoner som strekker seg til blastocoel. Men er det også viktig å merke seg at disse dype cellene som inneholder bakterie celle indikatorer ikke kan bidra til germline, som microRNAs er kjent for å fjerne PGC mRNAs fra somatiske celler45,46. Disse dype cellene flekker positivt for PGC indikatorer kan være somatiske celler under slik klarering. For tiden er utviklet metoder for å sikre fullstendig PGC fjerning fra mottakeren embryo.
Til slutt, det er også viktig å vurdere hvor mange F0 dyr å generere ved sprang framover. Som et variabelt antall dyr ikke vil overleve til seksuell modenhet, anbefales det at mer enn 20 embryo som inneholder transplantasjoner er opprettet. Det vil være nødvendig å ha nok overlevende dyr å sikre (1) at tilstrekkelig antall av begge kjønn skal hentes og (2) at disse overføre mutant alleler på en tilstrekkelig høy frekvens for å være egnet for analysene planlagt av forskeren.
Ved hjelp av protokollen som er beskrevet her, med litt øvelse, skal amfibier embryologists kunne mestre PGC transplantasjoner teknikken med litt øvelse. Sprang framover skal være mulig, ikke bare i andre amfibier, men også andre organismer som inneholder PGCs som er lett transplantable mellom individer i tidlige stadier av embryogenesis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatteren har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble utført med støtte fra tilskudd, 5R21HD080684-02, fra National Institute of Child Health and Human Development. Forfatteren ønsker å takke Ken Cho for hans fortsatte entusiasme og støtte. Forfatteren ønsker også å erkjenne Bruce Blumberg for bruk av hans kamera, Rebekka Charney, for kritisk lesing av manuskriptet, og Sean McNamara og Marcin Wlizla på National Xenopus ressursen (RRID:SCR_013731), verdifulle samtaler om X. tropicalis fôring og dyr omsorg regimer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 or 11252-30 | |
| Eyebrow hair knife | Homemade | ||
| Hair loop | Homemade | ||
| Pasteur pipettes, borosilicate glass | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| Krazy Glue (Cyanoacrylate-based) | Elmer's Products, Inc. | KG581 | To affix eyebrow hair and hair loops into Pasteur pipettes, other similar glues can be used. |
| Oligodeoxynucleotides, custom ordered | Integrated DNA Technologies | Custom ordered | Template oligos for sgRNA synthesis, see Nakayama et al., 2014 for design details. |
| Megascript T7 kit | Ambion/ThermoFisher | AM1334 | Or use Megashortscript T7 (AM1354) kit |
| Phenol, Tris buffered | High quality distilled phenol from any commercial supplier | ||
| Chloroform | High quality chloroform from any commercial supplier | ||
| Ethanol | High quality ethanol from any commercial supplier | ||
| Diethylpyrocarbonate (DEPC) | Sigma Chemical Co. | D5758-50ML | |
| Cas9 protein, with nuclear localization signal | PNA Bio, Inc. | CP01 | Reconstituted using DEPC-treated water according to manufacturer's recommendations |
| 10X Marc's Modified Ringers solution | Homemade. Recipe (ref 26) for 1X MMR (lacking EDTA) is 100mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES. Solution is pH adjusted to 7.4. | ||
| Agarose | Any Molecular Biology grade agarose is sufficient | ||
| 60 X15 mm Petri plates | Falcon | 351007 | |
| 24-well plates | Falcon | 3047 | |
| L-Cysteine | Sigma Chemical Co. | C7352-100G | Free base, not HCl salt |
| Proteinase K | Roche | 03 115 828 001 | Typically ~20mg/ml from Roche |
| sera Micron | sera | Tadpole food. Resuspend in growth medium. Can be purchased from a variety of online retailers |
References
- Gurdon, J. B., Hopwood, N. The introduction of Xenopus laevis into developmental biology: of empire, pregnancy testing and ribosomal genes. Int J Dev Biol. 44 (1), 43-50 (2000).
- Hellsten, U., et al. The genome of the Western clawed frog Xenopus tropicalis. Science. 328 (5978), 633-636 (2010).
- Session, A. M., et al. Genome evolution in the allotetraploid frog Xenopus laevis. Nature. 538 (7625), 336-343 (2016).
- Blitz, I. L., Biesinger, J., Xie, X., Cho, K. W. Biallelic genome modification in F(0) Xenopus tropicalis embryos using the CRISPR/Cas system. Genesis. 51 (12), 827-834 (2013).
- Nakayama, T., Fish, M. B., Fisher, M., Oomen-Hajagos, J., Thomsen, G. H., Grainger, R. M. Simple and efficient CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Xenopus tropicalis. Genesis. 51 (12), 835-843 (2013).
- Guo, X., et al. Efficient RNA/Cas9-mediated genome editing in Xenopus tropicalis. Development. 141 (3), 707-714 (2014).
- Wang, F., Shi, Z., Cui, Y., Guo, X., Shi, Y. B., Chen, Y. Targeted gene disruption in Xenopus laevis using CRISPR/Cas9. Cell Biosci. 5, 15 (2015).
- Jaffe, K. M., et al. c21orf59/kurly Controls Both Cilia Motility and Polarization. Cell Rep. 14 (8), 1841-1849 (2016).
- Liu, Z., et al. Efficient genome editing of genes involved in neural crest development using the CRISPR/Cas9 system in Xenopus embryos. Cell Biosci. 6, 22 (2016).
- Naert, T., et al. CRISPR/Cas9 mediated knockout of rb1 and rbl1 leads to rapid and penetrant retinoblastoma development in Xenopus tropicalis. Sci Rep. 6 (35264), (2016).
- Ratzan, W., Falco, R., Salanga, C., Salanga, M., Horb, M. E. Generation of a Xenopus laevis F1 albino J strain by genome editing and oocyte host-transfer. Dev Biol. 426 (2), (2016).
- Bhattacharya, D., Marfo, C. A., Li, D., Lane, M., Khokha, M. K. CRISPR/Cas9: An inexpensive, efficient loss of function tool to screen human disease genes in Xenopus. Dev Biol. 408 (2), 196-204 (2015).
- Shigeta, M., et al. Rapid and efficient analysis of gene function using CRISPR-Cas9 in Xenopus tropicalis founders. Genes Cells. 21 (7), 755-771 (2016).
- Hontelez, S., et al. Embryonic transcription is controlled by maternally defined chromatin state. Nat Commun. 6, 10148 (2015).
- Peshkin, L., et al. On the Relationship of Protein and mRNA Dynamics in Vertebrate Embryonic Development. Dev Cell. 35 (3), 383-394 (2015).
- Owens, N. D., et al. Measuring Absolute RNA Copy Numbers at High Temporal Resolution Reveals Transcriptome Kinetics in Development. Cell Rep. 14 (3), 632-647 (2016).
- Blitz, I. L., Fish, M. B., Cho, K. W. Leapfrogging: primordial germ cell transplantation permits recovery of CRISPR/Cas9-induced mutations in essential genes. Development. 143 (15), 2868-2875 (2016).
- Blackler, A. W. Transfer of germ-cells in Xenopus laevis. Nature. 185, 859-860 (1960).
- Blackler, A. W., Fischberg, M. Transfer of primordial germ-cells in Xenopus laevis. J Embryol. Exp Morph. 9, 634-641 (1961).
- Bounoure, L. L'origine des cellules reproductrices et le problem de la lignee germinale. , Gauthier-Villars. Paris. (1939).
- Nieuwkoop, P. D., Sutasurya, L. A. Primordial Germ Cells in the Chordates: Embryogenesis and phylogenesis. , Cambridge University Press. Cambridge. (1979).
- Heasman, J., Holwill, S., Wylie, C. C. Fertilization of cultured Xenopus oocytes and use in studies of maternally inherited molecules. Methods Cell Biol. 36, 213-230 (1991).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Embryo dissection and micromanipulation tools. CSH Protoc. , (2007).
- Nakayama, T., et al. Cas9-based genome editing in Xenopus tropicalis. Methods Enzymol. 546, 355-375 (2014).
- Ogino, H., McConnell, W. B., Grainger, R. M. High-throughput transgenesis in Xenopus using I-SceI meganuclease. Nat Protoc. 1 (4), 1703-1710 (2006).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early development of Xenopus laevis.: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2000).
- Kay, B. K. Injection of oocytes and embryos. Xenopus laevis: Practical Uses in Cell and Molecular Biology (Methods in Cell Biology Vol. 36). Kay, B. K., Peng, H. B. , Academic Press. San Diego. (1991).
- Normal Table of Xenopus laevis. (Daudin): A Systematical and Chronological Survey of the Development from the Fertilized Egg till the End of Metomorphosis. Nieuwkoop, P., Faber, J. , Garland Publishing Inc. New York. (1994).
- Xenopus Tadpole Feeding. , Available from: http://www.mbl.edu/xenopus/files/2016/06/Xenopus-Tadpole.pdf (2017).
- Xenopus tropicalis Animal Care. , Available from: http://www.mbl.edu/xenopus/files/2016/06/Xenopus-Tropicalis.pdf (2017).
- Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Res. 42 (22), e168- (2014).
- Sander, V., Reversade, B., De Robertis, E. M. The opposing homeobox genes Goosecoid and Vent1/2 self-regulate Xenopus patterning. EMBO J. 26 (12), 2955-2965 (2007).
- Bedell, V. M., et al. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).
- Kim, J. M., Kim, D., Kim, S., Kim, J. S. Genotyping with CRISPR-Cas-derived RNA-guided endonucleases. Nat Commun. 5, 3157 (2014).
- Kim, H. J., Lee, H. J., Kim, H., Cho, S. W., Kim, J. S. Targeted genome editing in human cells with zinc finger nucleases constructed via modular assembly. Genome Res. 19 (7), 1279-1288 (2009).
- Qiu, P., Shandilya, H., D'Alessio, J. M., O'Connor, K., Durocher, J., Gerard, G. F. Mutation detection using Surveyor nuclease. Biotechniques. 36 (4), 702-707 (2004).
- Ota, S., et al. Efficient identification of TALEN-mediated genome modifications using heteroduplex mobility assays. Genes Cells. 18 (6), 450-458 (2013).
- Dahlem, T. J., et al. Simple Methods for Generating and Detecting Locus- Specific Mutations Induced with TALENs in the Zebrafish Genome. PLoS Genet. 8 (8), e1002861 (2012).
- Ramlee, M. K., Yan, T., Cheung, A. M., Chuah, C. T., Li, S. High-throughput genotyping of CRISPR/Cas9-mediated mutants using fluorescent PCR-capillary gel electrophoresis. Sci Rep. 5, 15587 (2015).
- Bhattacharya, D., Marfo, C. A., Li, D., Lane, M., Khokha, M. K. CRISPR/Cas9: An inexpensive, efficient loss of function tool to screen human disease genes in Xenopus. Dev Biol. 408 (2), 196-204 (2015).
- Yu, C., Zhang, Y., Yao, S., Wei, Y. A PCR Based Protocol for Detecting Indel Mutations Induced by TALENs and CRISPR/Cas9 in Zebrafish. PLoS ONE. 9 (6), e98282 (2014).
- Mock, U., Hauber, I., Fehse, B. Digital PCR to assess gene-editing frequencies (GEF-dPCR) mediated by designer nucleases. Nat Protoc. 11 (3), 598-615 (2016).
- Varshney, G. K., et al. High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9. Genome Res. 25 (7), 1030-1042 (2015).
- Shi, J., Wang, E., Milazzo, J. P., Wang, Z., Kinney, J. B., Vakoc, C. R. Discovery of cancer drug targets by CRISPR-Cas9 screening of protein domains. Nat Biotechnol. 33 (6), 661-667 (2015).
- Koebernick, K., Loeber, J., Arthur, P. K., Tarbashevich, K., Pieler, T. Elr-type proteins protect Xenopus Dead end mRNA from miR-18-mediated clearance in the soma. Proc Natl Acad Sci USA. 107, 16148-16153 (2010).
- Yang, J., Aguero, T., King, M. L. The Xenopus maternal-to-zygotic transition from the perspective of the germline. Curr Top Dev Biol. 113, 271-303 (2015).
