Summary
Genes essenciais para a sobrevivência colocam obstáculos técnicos para a criação de linhas de mutantes. Saltos contorna a letalidade combinando genoma edição com transplante de células de germes primordial para criar animais selvagem-tipo carregando mutações do germline. Saltos também permite a geração eficiente de homozigotos mutantes nulos na geração1 F. Aqui, o passo de transplante é demonstrado.
Abstract
A criação de linhas de mutante editando genoma está acelerando a análise genética em muitos organismos. CRISPR/Cas9 métodos foram adaptados para o uso na africana Xenopus, Xenopus, um organismo de longa data modelo para investigação biomédica. Os regimes tradicionais de reprodução para criar linhas mutantes homozigotos com mutagénese CRISPR/Cas9-alvo têm várias etapas demoradas e trabalhosas. Para facilitar a criação de embriões mutantes, particularmente para superar os obstáculos associados a bater para fora os genes que são essenciais para a embriogênese, foi desenvolvido um novo método chamado saltos. Esta técnica utiliza a robustez dos embriões de Xenopus "cortar e colar" métodos embriológicos. Saltos utiliza a transferência de células germinativas primordiais (PGCs) de embriões de doador de forma eficiente-mutagenized em sua PGC-ablated irmãos. Este método permite a eficiente mutação de genes essenciais criando animais quiméricoes com sua células somáticas que carregam uma mutante da linha germinal. Quando dois animais de0 F carregando "saltar transplantes" (isto é, células germinativas mutante) são intercrossed, eles produzem homozigotos, ou compostos heterozigotos, nulos F1 embriões, economizando assim um tempo de geração completo para obter dados fenotípicos. Saltos também fornece uma nova abordagem para a análise de genes de efeito materno, que são refratários à análise fenotípica de0 F seguindo CRISPR/Cas9 mutagênese. Este manuscrito detalha o método dos saltos, com especial ênfase em como executar com sucesso o transplante de PGC.
Introduction
Como genótipo codifica o fenótipo tem sido uma grande questão em biologia desde a redescoberta de leis de Mendel. Uma compreensão das funções dos genes, sua regulação e interações nas redes do gene e as funções das promessas de produtos codificado para fornecer ferramentas para descobrir nova biologia e melhorar Estados de doença. Para mais de meio século1, a africana Xenopus, Xenopus, tem sido um líder modelo para estudos sobre uma grande variedade de tópicos em biologia básica e biomedicina, incluindo o controle genético do desenvolvimento. Historicamente, a maioria das pesquisas sobre Xenopus tem usado o sapo allotetraploid, X. laevis, mas mais recentemente, devido à sua Diploidia, X. tropicalis desenvolveu-se como um modelo genético de anfíbios. Foram montadas sequências do genoma completo de ambas as espécies de Xenopus 2,3. A comunidade de"sapo" é agora um ponto de viragem onde tecnologia de modificação do genoma básicos permite o estudo da função do gene, praticamente à vontade. Programável CRISPR/Cas9 endonucleases fizeram o mutagenesis de genes altamente eficiente, com biallelic mutação possível na maioria das células do animal4,5,6,7, 8,9,10,11. Estes estudos, sublinhados por Bhattacharya et al 12 e Shigeta et al 13, têm mostrado que a função de muitos genes pode ser estudada por mutagênese em animais de mosaico F0 . Esta abordagem tem muitas vantagens; no entanto, Cas9-sgRNA-injetadas embriões frequentemente exibem fenótipos variáveis devido a perda incompleta da função (LOF). Mais significativamente, a geração de linhas mutantes é altamente vantajosa para alguns aplicativos — em especial, ao estudar os genes que têm uma contribuição materna do mRNA. MRNAs maternos e proteínas e suas influências na epigenética, persistirem por um período prolongado na embriogênese14,15,16, tornando as contribuições do desenvolvimento precoce de muitos genes refratários para análises de F0 . Portanto, outras abordagens LOF são necessárias.
Quando pretendem criar linhas mutantes, o caminho para obtenção de embriões LOF homozigotos tem vários obstáculos. Mutagênese em primeiro lugar, eficiente para produzir mutações biallelic pode ser desvantajoso porque a perda das funções essenciais do gene resulta em falha para sobreviver à maturidade sexual, interferindo com a produção de uma linha viável. Uma solução comum é a titulação cuidadosa da quantidade de Cas9-sgRNA entregado. Aqui, o objetivo é alcançar um equilíbrio entre reduzir letalidade enquanto também maximiza a eficiência de mutagénese germline. Um segundo problema surge a partir do esquema de reprodução padrão, onde análises fenotípicas são diferidas até à geração2 de F. Usando a abordagem padrão, sexualmente maduras animais de0 F que transmitem mutante alelos através do germline são outcrossed para produzir F1 heterozigoto "transportadoras", que em seguida são cultivadas para a maturidade sexual. Dois heterozigotos de1 F são então intercrossed para produzir embriões mutantes de F2 com uma frequência mendeliana esperada de 25%. Assim, duas gerações de reprodução são necessárias para a análise de fenótipos mutantes. Animais mutantes poderiam ser homozigotos ou heterozigotos compostos (ou seja, a descendência que contém dois alelos mutantes diferentes, que depende dos genótipos dos animais parentais utilizados em intercross de1 a F).
Estes obstáculos podem ser superados por confinar programável mediada por nuclease mutagênese de células germinativas, que está subjacente a um novo método chamado saltando17. Saltos tem dois componentes principais: (1) a microinjeção de mRNA Cas juntamente com sgRNA, ou sgRNA-nuclease complexos (ou, em princípio, TALENs ou zinco nucleases de dedo) na fase de célula única para eficientemente mutagenize embrionárias genomas, seguido por (2) o transplante de PGCs em embriões de sua irmã, onde os PGCs endógenos foram removidos. Quando os dois passos são germline eficiente, completa substituição com mutantes de células germinativas pode ser obtido. Blackler demonstrado na década de 1960 que Xenopus PGCs poderiam ser transplantadas entre embriões no neurula atrasado e cedo tailbud fases18,19. Para saltos, abordagem do Blackler foi modificada por realizar os transplantes para o estágio de blástula17, quando PGCs são localizadas no polo vegetal do embrião20,21. Transplante antes gastrulação tem duas vantagens principais. Primeiro, a enxertia de transplantes e o subsequente desenvolvimento normal foi encontrada para ser mais eficiente quando o transplante é realizado na fase de blástula (observações não publicadas). Em segundo lugar, realizando transplantes de blástula-palco logo após a transcrição zigóticos começou, um pode evitar a letalidade decorrentes do desenvolvimento gene mutações que interrompem a gastrulação ou que caso contrário levar ao neurulae tarde malformado. PGC transplante-rolamento ("leapfrogged") embriões são cultivados a maturidade sexual, e inter-cruzamentos entre estes animais de0 F têm demonstrado que, em muitos casos, 100% da descendência F1 exibir o fenótipo LOF (a maioria sendo composto heterozigotos), indicando a substituição completa do germline com as mutações específicas.
Espera-se que saltos acelerará abordagens genéticas em Xenopus. Saltos também fornece uma alternativa para o método de "transferência de acolhimento"22 para a análise LOF dos genes maternos-efeito (observações não publicadas). Na atual publicação, uma descrição detalhada do método, concentrando-se especialmente na transplantação de PGC, é apresentada em X. tropicalis (com pequenas modificações para X. laevis). O transplante de PGCs é demonstrado aqui para facilitar uma mais rápida transferência desta tecnologia para outros laboratórios que trabalham com Xenopus. Os princípios deste método devem ser bem sucedidos em outros anfíbios (por exemplo, urodeles), e modificações do organismo específico na metodologia permitir aplicação para muitos outros animais na qual mutagênese eficiente pode ser realizado e PGCs são prontamente para transplante.
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Protocol
Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de uso da Universidade da Califórnia, Irvine e institucional Cuidado Animal.
1. os preparativos para o transplante de PGC
- Prepare ferramentas de dissecação com antecedência, como descrito anteriormente,23.
Nota: Facas de sobrancelha cabelo são usadas para fazer incisões com o auxílio de um laço de cabelo para estabilizar o embrião durante a realização das cirurgias. Os pelos da sobrancelha e cabelo loops são colados no vidro de borosilicato pipetas Pasteur que ter sido desenhado pela primeira em uma chama e quebrados na porção diluída (ver figura 1A, ponta de seta) para criar uma ponta menor, mais estreita (figura 1B) para maior destreza ao realizar cirurgias. - Gere sgRNAs usando os procedimentos descritos anteriormente24 .
Nota: Brevemente, curtos modelos de DNA que codifica para sgRNAs são criados usando sobreposição deoxyoligonucleotides contendo 5' promotores do bacteriófago T7, que são recozidos e "preenchido" por uma DNA-polimerase termoestável, livre de erros. Reações da síntese in vitro sgRNA são incubadas durante várias horas durante a noite (dependendo do kit usado). As reações são DNAse-tratada para remover o modelo. Os sgRNAs são purificados por métodos padrão de fenol/clorofórmio extração e amônio acetato/isopropanol precipitação, de acordo com instruções24 do fabricante kit. - Logo antes de executar microinjeções, preparar Cas9-sgRNA complexos pela primeira desnaturação ~ 250 ng de sgRNA em um volume total de 3 µ l de RNAse-livre (diethylpyrocarbonate-tratada) H2O a 60-65 ° C por 5 min, seguido de resfriamento rápido no gelo por 5 min. Centrifugue a sgRNA por alguns segundos, adicionar 1 µ l de 1 proteína de Cas9 µ g / µ l e incubar durante 10 minutos a 37 ° C, para promover a formação do complexo.
Nota: Após esta incubação, o tubo pode ser mantido no gelo enquanto prepara os embriões para o microinjection. - Obter X. tropicalis de embriões, fertilização in vitro usando métodos padrão, como descrito anteriormente,25. Geleia de25,26 os embriões na pós-fertilização 10 min.
Nota: O tempo de fertilização é considerado o tempo após a suspensão de esperma é adicionada para os ovos e o prato é inundado com 1/9thX modificado Ringers (MMR)26 de Marc. X. tropicalis25, ao contrário de X. laevis, realizar a eliminação jellying em 1/9 x MMR contendo 3% base cisteína livre (não o sal de HCl), pH ajustado para 7,8-8.0, seguido por várias lavagens em 1/9 x MMR. Transferir os embriões para um agarose (1%)-prato revestido contendo 1/9 x MMR à temperatura ambiente. - Transferir imediatamente os embriões deve ser injetado para um prato revestido de agarose 1%, contendo 1 x MMR com uma pipeta Pasteur.
-
Injete na fase 1-célula. Ver referências26,27 para obter descrições detalhadas de métodos de microinjeção de Xenopus .
- Injetar cada embrião em um único local no polo animal, com 4 nL do complexo Cas9-sgRNA (quantidade final = 1 ng de Cas9 e ~ 250 pg de sgRNA; ver a discussão)24. Após 10-20 min de injeção local de cura, transferir os embriões para um prato de agarose-revestido contendo 1/9 x MMR e incubar a 25 ° C. Também crie um prato de uninjected irmão embriões que servirão como destinatários do enxerto.
-
Prepare-se placas de Petri (60 mm) que contêm um mm ~ 5-camada espessa de agarose a 1% em 0,3 x MMR, se fazer transplantes em X. tropicalis, ou 1 x MMR para X. laevis.
- Criar depressões ~ 3-4 mm de profundidade através da inserção de um 3-x 4-poço molde (criado por um corte de uma placa PCR de 96 poços) no agarose derretido quando deitar as placas (ver Figura 1 e D). Segure o molde vários milímetros acima do fundo da caixa de Petri usando uma pinça anexada a um carrinho de anel até a agarose endureceu.
- Além disso, fazer uma placa de 24 para embriões individual casa revestindo as cavidades com uma fina camada de agarose a 1% em 1/9 x MMR.
Nota: O meio de cultura adicionado a esses poços é 1/9 x que MMR suplementado com 50 µ g de sulfato de gentamicina/mL.
2. transplante de PGCs
- Quando os embriões só chegar Nieuwkoop e Faber28 blástula fase 9 (Figura 2A), ~4.5 h pós-fecundação (hpf) para X. tropicalis, removê-los da incubadora a 25 ° C e permitir-lhes equilibrar a temperatura ambiente por um período adicional 0,5 h.
- Para começar o transplante em 5 hpf (Figura 2B), usar uma pipeta Pasteur para transferir um embrião de doador PGC (injetado com Cas9-sgRNA) para o prato de agarose 60mm contendo depressões (criadas na etapa 1.7) em 0.3 x MMR (ou 1 x MMR se usando X. laevis). Também transferi um embrião do irmão uninjected, o destinatário do enxerto, para este prato.
Nota: É fundamental que as identidades de cada um destes embriões não são confundidas. - Manualmente remover os vitelínico envelopes de cada embrião usando fórceps e girar ambos os embriões, de modo que seus polos vegetal estão no modo de exibição e acessível para a cirurgia.
Nota: Uma descrição de-vitellination manual de embriões já havia sido descrito26. - Usando a ponta afiada da faca de cabelo sobrancelha, faça quatro incisões rasas em forma de um quadrado no polo vegetal do embrião destinatário, dentro da zona onde o futuro garrafa células que marcam o Blastóporo irão formar. Fazer as incisões por inserir a ponta da faca sobrancelha cabelo do embrião, logo abaixo da superfície e fazer movimentos de corte para cima enquanto estabilizando o embrião com o laço de cabelo.
Nota: A Figura 2 mostra vegetais vistas de um embrião em intervalos médios de 4.5-7.0 hpf para mostrar o tamanho da célula e para fornecer um guia para estimar onde as células de garrafas formarão (círculo branco tracejado). O objectivo é fazer incisões onde caixa tracejada de preto é indicada. - Uma vez que os quatro lados do quadrado são delineados por incisões, aprofunde cada incisão com a faca de sobrancelha cabelo usando movimentos de corte semelhante para chegar a uma profundidade de aproximadamente 1/3 a 1/2 da distância até o chão blastocoel.
- Livre o explante de tecido vegetal do embrião do destinatário (Figura 3A e B) fazendo uma horizontal (paralela à superfície vegetal) cut(s) na região profunda vegetal.
Nota: O tamanho do explante vegetal contendo PGC é aproximadamente 0,4-0,45 mm por lado e 0,25-0.3 mm de profundidade. Este vegetal explante de embrião o destinatário não é mais necessária e, portanto, deve ser anulado para serem descartados. - Trabalhando rapidamente, repita este procedimento (etapas 2.4-2.6), sobre o embrião de doador do PGC para criar um fragmento de tecido vegetal similarmente feito sob medida para transplante.
Nota: É importante realizar esta segunda dissecação com pequeno atraso para minimizar o tempo para o embrião do destinatário curar sua ferida aberta. - Uma vez que o tecido contendo PGCs é retirado do embrião doador, use o sobrancelha cabelo faca e cabelo laço para mover este explante em posição na abertura criada no embrião destinatário.
Nota: A superfície interior do enxerto doador deve estar virado para o interior do embrião do destinatário. Não é necessário corresponder as orientações dos eixos dorso-ventral e direitas do enxerto com o embrião do destinatário. - Use a borda longa do eixo da faca sobrancelha cabelo, mantida paralelamente à superfície do enxerto, pressione suavemente o enxerto na abertura na superfície vegetal do embrião destinatário.
- Uma vez que o enxerto foi colocado, use um hairloop ou o eixo de uma faca de cabelo de sobrancelha para deslizar suavemente a "carcaça" do embrião doador através da superfície de agarose e em uma depressão de agarose. Certifique-se de que a ferida aberta da carcaça está enfrentando o líquido em massa. Se não, use a faca de cabelo de sobrancelha para girar o embrião para alcançar esta orientação.
- Deslize o embrião do destinatário, com o enxerto de cura no lugar, em uma depressão adjacente e do mesmo modo certifique-se de que o tecido transplantado polo vegetal está enfrentando o líquido em massa.
- Repita este procedimento (passos 2.1-2.11) usando um outro par de doador e receptor embriões para criar outro par de transplante/carcaça; transferi a estes a depressões vazias.
Nota: É fundamental que faz anotações para manter o controle de pares correspondentes de carcaças e rolamento de transplante de embriões. As carcaças do doador serão usadas como um proxy para a eficiência de Cas9 sgRNA-induzida mutagênese nos PGCs transplantados, o que não pode facilmente ser analisada até os transplante-rolamento animais atingem a maturidade sexual (ver passo 3.3, abaixo e a discussão ). - Continuar a fazer transplantes de embriões alcançará aproximadamente gástrula precoce 10, que é aproximadamente 6.5 hpf em X. tropicalis (ver Figura 2E).
3. pós-cura de embriões
Nota: Enxertos curam no lugar dentro ~ 30 min, e é normal observar alguns destroços yolky de lise celular exsudação do embrião (Figura 3).
-
Uma vez curada, use uma pipeta Pasteur para suavemente de transferência de embriões desde as depressões individuais aos poços de uma placa de 24 Poços revestidos de agarose. O exsudato será removido (figura 3D) pelo fluido durante a transferência de mistura.
- Gire os embriões para que são colocados vegetal-polo acima, enfrentando a solução em massa. Novamente, coloque as carcaças de doador e enxertar destinatários em poços adjacentes para ajudar a manter o controle dos pares do embrião; grave esta informação.
- Transferi a placa de 24 contendo embriões para uma incubadora de 25 ° C para a cultura durante a noite.
Nota: No dia seguinte, os embriões terá atingido estágios tailbud. - Mova os destinatários de enxerto para limpar placas com revestimento em agarose 6-poços contendo 1/9 x que MMR suplementado com 50 µ g de sulfato de gentamicina/mL, com 1 embrião por bem. Manter um registro claro de carcaças de doador que correspondam a estes destinatários do enxerto.
- Para avaliar a eficiência de mutagénese sequenciamento PCR amplicons5,17,24 ou usando outros métodos que dependem de PCR amplicons (veja a discussão), mova as carcaças individuais para 0,2 mL tira da polimerase. Remover a maioria do meio e homogeneizar em 100 µ l do lysis buffer24 contendo proteinase K (PK) por repetidas pipetagem altos e baixos, com uma pipeta P200.
- Execute o embrião lise24 a 56 ° C, durante 6 h durante a noite para permitir a digestão de PK. Inactivar PK aquecendo a 90-95 ° C por 10 min, seguido de rápido resfriamento a 4 ° C. Use lysates sem outras medidas de limpeza para propagar as reações de PCR para obter amplicons curto para direto de sequenciamento Sanger DNA24. Armazenar os lysates a-20 ° C.
Nota: Dentro de alguns dias, os girinos vão chegar a fases de alimentação (fase aproximadamente 45-46) e podem ser alimentados a uma suspensão de pó planctônico (sera Micron). - Depois de ~ 1 semana, com alterações diárias de meio de cultura para manter a limpeza e minimizar o crescimento microbiano excessivo, mova girinos para tanques pequenos em um sistema aquático circulante com fluxo de gotejamento. Use os dados de sequenciamento para segregar os girinos com PGCs altamente eficiente mutagenized de girinos com menor eficiência de mutagénese. Uma vez que a metamorfose é completa, mova o froglets para o sistema aquático adulto no laboratório.
Nota: Regimes desenvolvidos pelo recurso de Xenopus nacional (laboratório de biologia marinha, Woods Hole, MA) fornecem um guia para alimentação29 e sapo adulto manutenção30de girino.
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Representative Results
Após o transplante, a determinação qualitativa da eficácia de mutagénese CRISPR/Cas9 deve ser executada antes de despender o esforço na pecuária de crescer e manter os animais a maturidade sexual. Porque animais portadores leapfrog transplantes são somaticamente sua e do germline é difícil acesso para medições directas, salvar os cadáveres de embriões de dador torna-se importante. Análise de DNA de carcaças serve como um proxy para a extensão de mutagênese que ocorre no germline transplantado17.
Uma abordagem para avaliar o sucesso de mutagênese é diretamente a sequência do PCR amplicons, abrangendo a região genômica visada. Isso se torna especialmente caros e ineficientes se um desejos para sequenciar numerosos fragmentos de DNA clonado individualmente de muitos animais. Em vez disso, sequenciamento amplicons heterogêneos no local de destino, como eles são derivados de geneticamente embriões de mosaico, é usado para avaliar a eficiência de mutagênese em cada embrião19. Visualização dos cromatogramas mostra a sequência de tipo selvagem (picos) contra a corrente do destino sequência e picos tornam-se "mexidos" (ou seja, a co-ocorrência de picos correspondentes a várias bases, aparecendo em cada posição do nucleotídeo) a jusante da o site da dobro-Costa quebra Cas9-catalisada. Exemplos de tais perfis podem ser encontrados na figura S1 de Blitz et al. 17. a quantificação exata da extensão da mutagénese representado por estes picos mexidos pode ser obtida usando um algoritmo de decomposição de sequência, a maré (https://tide-calculator.nki.nl/)31. Triagem de embriões individuais usando esta técnica dá confiança que cada embrião foi corretamente injetado e alvo de mutagénese. Um tracer, tais como um fluorescente etiquetado dextrano, pode ser usado para confirmar o sucesso da injeção24 e também pode ajudar a estabelecer que um girino de fato carrega o tecido transplantado (dados não publicados). É importante notar que a possibilidade formal que o coinjeção de uma fluorescente dextrano juntamente com Cas9-sgRNA pode alterar a eficiência de mutagénese Cas9 não tem sido explorada. Qualquer "leapfrogged" embriões contendo transplantes de doadores mal ou unmutagenized podem ser descartados.
Saltos contorna a necessidade da análise de geração F2 em programas de melhoramento genético padrão, permitindo a análise fenotípica eficiente nos embriões F1 . Ao usar a abordagem padrão de mutação de genes essenciais, titulação cuidadosa da dose Cas9-sgRNA é necessária para garantir a viabilidade dos embriões de fundador, resultando em uma eficiência reduzida mutagênese. Sobrevivendo F0 animais deste regime padrão são então outcrossed com wildtypes para obter embriões viáveis de1 F, que são selecionados para identificar portadores. Finalmente, esses heterozigotos de1 F são crescidos para a maturidade sexual e intercrossed para obter os indivíduos2 F homozigotos exibindo fenótipos mutantes. Em contraste, porque saltos produz animais que têm a substituição completa de seus germlines com alelos mutantes, intercrossing estes animais de0 F produz fenótipos mutantes na geração1 F. Blitz et al 17 relatou que a maioria dos animais de0 F visados o locus de tirosinase (tyr), que é necessário para a pigmentação de melanócitos e retina, mostrou 100% de transmissão da linha germinal (medido pelo cruzamento com Tyr- / - animais albinos) de genomas mutantes doador-derivado (ver Figura 4A-B e tabela 1). Assim, intercrossing dois animais produzidos por saltos renderia homozigotos ou compostos heterozigotos mutante F1 embriões.
Resultados semelhantes foram obtidos17 por intercrossing F0 saltar animais carregando mutações no homeobox (codificação do DNA-ligando homeodomínio) do gene goosecoid (gsc) (ver Figura 4A, C-H). Knockdowns de expressão SGC usando oligonucleotídeos antisenso Morpholinos em X. laevis sugeriram que o gene do SGC é necessário para o desenvolvimento completo da cabeça anterior32, e sgRNA-Cas9 injetado girinos também mostrar fenótipos letal embrionário17. No entanto, os leapfrogged F0 animais sendo somaticamente tipo selvagem, são viáveis e robusto, e o intercross de1 F produzidos embriões com fenótipos LOF idênticos àqueles publicados no X. laevis knockdowns17. Esses dados fornecidos genética corroboração do fenótipo Morpholinos, bem como uma prova de princípio que saltos pode ser usado para superar fenótipos letais embrionários.
Figura 1: materiais necessários para a transplantação. (A) de vidro de borosilicato pipetas Pasteur são usadas para fazer o cabelo e sobrancelha cabelo facas loops para microcirurgia em embriões adiantados. Desenho o vidro usando um bico de Bunsen permite um final mais estreito para a inserção dos cabelos. A seta vermelha da marca a posição aproximada em que para quebrar o vidro. (B) um exemplo de uma sobrancelha cabelo faca (topo) e o laço do cabelo (parte inferior), fixado em pipetas com cola de secagem rápida. (C) A parte de uma placa PCR de 96 poços é usado para criar depressões em uma placa de agarose, permitindo que a agarose 1% solidificar em torno do molde (agarose é feito em 0.3 x ou 1 x MMR, dependendo se os transplantes estão sendo realizadas em X. tropicalis ou X. laevis, respectivamente). A espessura da agarose é ~ 5 mm, com 3-4 mm-poços profundos. (D) um exemplo de uma placa de agarose para transplante, com 12 depressões, conforme mostrado no painel C. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: morfologia do polo vegetal durante a blástula atrasado para estágios iniciais de gástrula e a estratégia para dissecação. (A-F) Embriões de Xenopus tropicalis são mostrados na vista vegetal em intervalos médios, desde o início da fase de blástula 9 (4.5 hpf) para início gástrula palco ~10.25 (7 hpf). Antes 5 hpf, blastómeros são grandes e mais facilmente danificados. O branco, círculo tracejado marca a posição esperada de formação de células de garrafa durante a gastrulação, que pode ser vista formando início no lado dorsal (superior) em painéis (E e F). Para saltos, quatro incisões são feitas dentro de um quadrado, representado por linhas tracejadas pretas, com um final corte feito paralelo à superfície do tecido (não ilustrado) para libertar o explante vegetal. Barra de escala = 400 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: transplante. (A) um exemplo de um embrião de hpf ~5.5 após a remoção do tecido vegetal contendo PGC. A caixa tracejada de preta e branco círculo tracejado são as mesmas dimensões relativas como as mostradas na Figura 2. (B) o vegetal explante removido do embrião no painel A, superfície interna de frente para o espectador, é aproximadamente 0,4-0,45 mm por lado e 0,25-0.3 mm de profundidade. (C) um embrião com o tecido transplantado vegetal. A imagem foi adquirida ~ 10 min após o transplante. (D) 30 min após o transplante, o vegetal tecido é visto ter curado no lugar (rodando suave com uma faca de cabelo sobrancelha acima que o embrião foi usado para criar um vórtice que varreu os detritos visto no painel C). Após a transferência de 1/9 x MMR e incubação a 25 ° C, a maioria dos embriões completam gastrulação normalmente. Barra de escala = 400 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Transmissão do Germline de animais de0 F produzido por saltos. (A) para saltos, dois genes foram alvejados por CRISPR/Cas9, tirosinase (topo) e goosecoid (baixo). O gene tyr foi alvo de4,5 dentro o sequenciamento de codificação (sombreamento azul) para um peptídeo sinal de N-terminal (sombreamento de SP, vermelha), enquanto o gene gsc foi alvo17 dentro de codificação sequência na começando da homeobox (sombreamento vermelho), que é dividido entre dois exões. Untranslated regiões exônicos 5' e 3' são habitat. (B) os girinos de1 todos os 160 F de (Veja também a tabela 1) um acasalamento de um macho de0 F leapfrogged (LF1) e um albino (tyr-/-) feminino foram albino, indicando que o germline inteira do macho leapfrogged tinha sido substituído com células germinativas mutante de tyr . A inserção mostra um girino selvagem-tipo com pigmentação da retina e dos melanócitos normal. (C-H) Embriões de F1 derivados um intercross entre dois F0 saltar Xenopus como alvo o gene homeobox SGC. Aproximadamente 2/3rds dos embriões eram fenotipicamente mutante para SGC, sendo o fenótipo diferentes graus de truncamento anterior da cabeça (E-H). Metade dos mutantes foram ambos ciclópico ou tinha olhos espaçadas (F), enquanto a outra metade estava sem olhos (H). Determinação do genótipo mostrou estas ser homozigotos ou heterozigotos compostos. O 1/3rd de embriões mostrando fenótipo tipo selvagem (C, D) eram heterozigotos ou homozigoto tipo selvagem. Hibridação in situ por otx2 (um marcador do prosencéfalo, mesencéfalo e olhos), egr2 (um marcador do rombencéfalo rhombomeres 3 e 5 e uma corrente de crista neural) e hoxb9 (um marcador da medula espinhal) mostra que a perda de GSC função afeta apenas a porção anterior do domínio otx2 . Estes dados são reproduzidos de Blitz et al 17 com permissão da empresa de biólogos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Cruz | Macho | Fêmea | Albino | Tipo selvagem | Total | % Albino |
| 1 | LF1 | Tyr-/- | 160 | 0 | 160 | 100 |
| 2 | LF2 | Tyr-/- | 148 | 0 | 148 | 100 |
| 3 | Tyr-/- | LF3 | 409 | 0 | 409 | 100 |
| 4 | Tyr-/- | LF4 | 0 | 519 | 519 | 0 |
| 5 | Tyr-/- | LF5 | 223 | 0 | 223 | 100 |
| 6 | LF6 | Tyr-/- | 493 | 703 | 1196 | 41,2 |
| 7 | Tyr-/- | LF7 | 1 | 94 | 95 | 1.1 |
| 8 | Tyr-/- | LF8 | 125 | 0 | 125 | 100 |
| 9 | Tyr-/- | LF9 | 0 | 417 | 417 | 0 |
| 10 | Tyr-/- | LF10 | 252 | 0 | 252 | 100 |
Tabela 1: Germline eficiente substituição por leapfrog transplantes carregando mutações na tirosinase. Visando a tirosinase, transplante-rolamento animais de ambos os sexos foram obtidos. Estes animais foram cruzados com os albinos, que são homozigotos tyr- / -, para testar a eficiência de transmissão germline de alelos mutantes e a porcentagem de embriões F1 que mostrou o albinismo foi analisado na fase de girino. As entradas nas colunas rotuladas "Masculino" e "Feminino" indicarem qual dos pais é tyr- / - ou o teste animal derivado saltando (LF). A porcentagem de embriões dentro de um cruz apresentando o fenótipo albino são indicadas sob "% Albino". Observe que 6 dos 10 animais com transplantes leapfrog mostrou completa substituição (100%) com alelos mutantes. Esta tabela é reproduzida de Blitz et al 17, com permissão.
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Discussion
Este relatório fornece um protocolo detalhado para o transplante de tecido vegetal contendo PGCs. transplante de PGCs é usado em conjunto com tecnologias de edição de genoma (por exemplo, CRISPR/Cas9) para modificar o germline de um animal enquanto mantendo a quase todos os tecidos somáticos como geneticamente tipo selvagem. Para saltos para ser bem sucedido, há um número de fatores críticos a considerar antes de realizar a execução de transplantes.
Para garantir a completa substituição do germline com alelos mutantes, recomenda-se que um primeiro determina a eficiência na vivo de sgRNAs. Experiência sugere que a maioria dos sgRNAs desenhados por CRISPRDirect (https://crispr.dbcls.jp/) ou CRISPRScan (http://www.crisprscan.org/) são eficientes quando usados em 250 pg/embrião. No entanto, em alguns casos, pode ser necessário usar concentrações mais elevadas (por exemplo, o SGC sgRNA publicado pela Blitz et al17, necessário ~ 1 ng/embrião). Avaliar a eficiência de mutagênese do site alvo é essencial e o uso da maré permite uma avaliação quantitativa de31. Enquanto o método enfatizado aqui usa o Sanger direto sequenciamento de PCR amplicons (representando a população de alelos mutantes em embriões de0 F), inúmeros outros métodos utilizámos na literatura edição de genoma para essa finalidade. Outras técnicas de baixo-à-moderado-custo que são comumente usadas incluem análise de polimorfismo de comprimento fragmento usando também a perda de enzimas de restrição33 ou Cas9/TALEN clivagem sites34, o T7 endonuclease 135 e agrimensor 36 ensaios, o doheteroduplex mobilidade ensaio37, o derretimento de alta resolução do ensaio38, fragmentam de análise por eletroforese capilar39,40e métodos baseados em qPCR41, 42.
Uma segunda consideração é a escolha do local de destino dentro do gene alvo. Para permitir a recuperação eficiente de fenótipos mutantes na geração1 F, é importante maximizar a chance de alelos LOF completas. Quando fazendo linhas mutantes usando abordagens clássicas é uma estratégia comum de clivagem Cas9 perto da extremidade 5' de regiões, para eliciar a terminação prematura da tradução no início da proteína codificação região de codificação de destino. Heterozigotos de1 F seriam identificados com mutações frameshift, e estes animais deve ser selecionados para trabalhos futuros, porque se espera que carregam alelos nulos. Porque a estratégia saltando usa F0 inter-cruzamentos, a abordagem de segmentação a extremidade 5' da sequência de codificação seria altamente ineficiente. F0 embriões têm mosaico germlines, e intercrossing resultados em populações de mutantes de F1 que são na sua maioria composto de heterozigotos17. Desde que análise em larga escala verifica que, em média, o esperado ~1/3rd de mutações produzidas por rupturas da dobro-costa são em-frame43, a maioria dos embriões de1 F produzidos desta forma teria pelo menos um alelo com um quadro de em- mutação que pode manter a atividade de tipo selvagem. Portanto, é necessária uma estratégia diferente para garantir que mesmo estes alelos mutantes em-frame são susceptíveis de ser nulos. Direcionamento de quebras da cadeia dupla dentro de domínios de enrolamento de proteínas que são essenciais para a função normal da proteína é esperado para resultar em uma maior chance de completa LOF (alelos nulos)17,44. Consideração cuidadosa para o nível atômico afigurem de domínios da proteína, quando disponível, pode ajudar a identificar regiões de estrutura secundária que, mesmo quando contendo uma exclusão de em-frame único aminoácido, pode ser esperado para perturbar (estrutura de domínio por exemplo, a mutação Δ3bp no SGC publicado pelo Blitz et al.17). Se CRISPR/Cas9 sites de destino podem ser identificados dentro destas regiões, um tem uma maior chance de criar com êxito alelos nulos. Pequenas deleções dentro de loops expostas ao solvente entre componentes estruturais secundários de proteína são menos desejáveis porque mutações nas regiões mais flexíveis ainda podem resultar em proteínas funcionais.
Uma terceira consideração para saltos é a eficiência de remoção de PGC do embrião do destinatário. Esta etapa precisa ser eficiente para assegurar a substituição completa da linha germinal. É atualmente incerto se todos os embriões de enxerto de destinatário produzidos pelo método descrito aqui tem remoção completa de seu PGCs. toda a montagem em situ hibridação mostrar variabilidade a localização de marcadores PGC em blástula-estágio. Em muitos casos, todos ou quase todos, o sinal é encontrado perto do fim de vegetais-a maioria do embrião em, portanto, seria removidos pela cirurgia descrita aqui (Blitz et al.17 e citações nele). No entanto, alguns embriões mostram expressão do marcador PGC em algumas células mais perto ao piso blastocoel. Germoplasma primeiro transforma-se no polo vegetal após a fecundação e então é varrida ao longo do sulco de clivagem durante primeiras clivagens. Alguns germoplasma pode tornar-se distribuída em células no meio do hemisfério vegetal e não ser efetivamente removida sem o uso de transplantes que se estendem até o blastocoel. No entanto, também é importante notar que estas células profundas contendo marcadores de células germinativas não podem contribuir para o germline, como microRNAs são conhecidos para limpar PGC mRNAs de células somáticas45,46. Estas células profundas coloração positiva para marcadores PGC podem estar passando por tal autorização de células somáticas. Atualmente estão sendo desenvolvidos métodos para assegurar a completa remoção de PGC de embriões de destinatário.
Finalmente, é também importante considerar quantos animais de0 F para gerar por saltos. Como um número variável de animais não sobreviverá à maturidade sexual, recomenda-se que mais de 20 embriões contendo transplantes são criados. Será necessário ter animais sobreviventes suficiente para assegurar a (1) que um número suficiente de ambos os sexos serão obtidos e (2) que estes transmitam alelos mutantes com uma frequência suficientemente alta para ser adequado para as análises previstas pelo pesquisador.
Usando o protocolo descrito aqui, com alguma prática, embriologistas anfíbios devem ser capazes de dominar a técnica de transplantes PGC com alguma prática. Saltos devem ser possível, não só em outros anfíbios, mas também a outros organismos contendo PGCs que são prontamente para transplante entre indivíduos de estágios iniciais da embriogênese.
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Disclosures
O autor não tem nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi realizado com o apoio de uma subvenção, 5R21HD080684-02, do Instituto Nacional de saúde infantil e desenvolvimento humano. O autor deseja agradecer a Ken Cho para seu contínuo entusiasmo e apoio. O autor também gostaria de reconhecer Bruce Blumberg para uso da sua câmera, Rebekah Charney, para a leitura crítica do manuscrito e Sean McNamara e Marcin Wlizla o recurso de Xenopus nacional (RRID:SCR_013731), para o valioso conversas sobre X. tropicalis alimentar e regimes de cuidados com animais.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 or 11252-30 | |
| Eyebrow hair knife | Homemade | ||
| Hair loop | Homemade | ||
| Pasteur pipettes, borosilicate glass | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| Krazy Glue (Cyanoacrylate-based) | Elmer's Products, Inc. | KG581 | To affix eyebrow hair and hair loops into Pasteur pipettes, other similar glues can be used. |
| Oligodeoxynucleotides, custom ordered | Integrated DNA Technologies | Custom ordered | Template oligos for sgRNA synthesis, see Nakayama et al., 2014 for design details. |
| Megascript T7 kit | Ambion/ThermoFisher | AM1334 | Or use Megashortscript T7 (AM1354) kit |
| Phenol, Tris buffered | High quality distilled phenol from any commercial supplier | ||
| Chloroform | High quality chloroform from any commercial supplier | ||
| Ethanol | High quality ethanol from any commercial supplier | ||
| Diethylpyrocarbonate (DEPC) | Sigma Chemical Co. | D5758-50ML | |
| Cas9 protein, with nuclear localization signal | PNA Bio, Inc. | CP01 | Reconstituted using DEPC-treated water according to manufacturer's recommendations |
| 10X Marc's Modified Ringers solution | Homemade. Recipe (ref 26) for 1X MMR (lacking EDTA) is 100mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES. Solution is pH adjusted to 7.4. | ||
| Agarose | Any Molecular Biology grade agarose is sufficient | ||
| 60 X15 mm Petri plates | Falcon | 351007 | |
| 24-well plates | Falcon | 3047 | |
| L-Cysteine | Sigma Chemical Co. | C7352-100G | Free base, not HCl salt |
| Proteinase K | Roche | 03 115 828 001 | Typically ~20mg/ml from Roche |
| sera Micron | sera | Tadpole food. Resuspend in growth medium. Can be purchased from a variety of online retailers |
References
- Gurdon, J. B., Hopwood, N. The introduction of Xenopus laevis into developmental biology: of empire, pregnancy testing and ribosomal genes. Int J Dev Biol. 44 (1), 43-50 (2000).
- Hellsten, U., et al. The genome of the Western clawed frog Xenopus tropicalis. Science. 328 (5978), 633-636 (2010).
- Session, A. M., et al. Genome evolution in the allotetraploid frog Xenopus laevis. Nature. 538 (7625), 336-343 (2016).
- Blitz, I. L., Biesinger, J., Xie, X., Cho, K. W. Biallelic genome modification in F(0) Xenopus tropicalis embryos using the CRISPR/Cas system. Genesis. 51 (12), 827-834 (2013).
- Nakayama, T., Fish, M. B., Fisher, M., Oomen-Hajagos, J., Thomsen, G. H., Grainger, R. M. Simple and efficient CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Xenopus tropicalis. Genesis. 51 (12), 835-843 (2013).
- Guo, X., et al. Efficient RNA/Cas9-mediated genome editing in Xenopus tropicalis. Development. 141 (3), 707-714 (2014).
- Wang, F., Shi, Z., Cui, Y., Guo, X., Shi, Y. B., Chen, Y. Targeted gene disruption in Xenopus laevis using CRISPR/Cas9. Cell Biosci. 5, 15 (2015).
- Jaffe, K. M., et al. c21orf59/kurly Controls Both Cilia Motility and Polarization. Cell Rep. 14 (8), 1841-1849 (2016).
- Liu, Z., et al. Efficient genome editing of genes involved in neural crest development using the CRISPR/Cas9 system in Xenopus embryos. Cell Biosci. 6, 22 (2016).
- Naert, T., et al. CRISPR/Cas9 mediated knockout of rb1 and rbl1 leads to rapid and penetrant retinoblastoma development in Xenopus tropicalis. Sci Rep. 6 (35264), (2016).
- Ratzan, W., Falco, R., Salanga, C., Salanga, M., Horb, M. E. Generation of a Xenopus laevis F1 albino J strain by genome editing and oocyte host-transfer. Dev Biol. 426 (2), (2016).
- Bhattacharya, D., Marfo, C. A., Li, D., Lane, M., Khokha, M. K. CRISPR/Cas9: An inexpensive, efficient loss of function tool to screen human disease genes in Xenopus. Dev Biol. 408 (2), 196-204 (2015).
- Shigeta, M., et al. Rapid and efficient analysis of gene function using CRISPR-Cas9 in Xenopus tropicalis founders. Genes Cells. 21 (7), 755-771 (2016).
- Hontelez, S., et al. Embryonic transcription is controlled by maternally defined chromatin state. Nat Commun. 6, 10148 (2015).
- Peshkin, L., et al. On the Relationship of Protein and mRNA Dynamics in Vertebrate Embryonic Development. Dev Cell. 35 (3), 383-394 (2015).
- Owens, N. D., et al. Measuring Absolute RNA Copy Numbers at High Temporal Resolution Reveals Transcriptome Kinetics in Development. Cell Rep. 14 (3), 632-647 (2016).
- Blitz, I. L., Fish, M. B., Cho, K. W. Leapfrogging: primordial germ cell transplantation permits recovery of CRISPR/Cas9-induced mutations in essential genes. Development. 143 (15), 2868-2875 (2016).
- Blackler, A. W. Transfer of germ-cells in Xenopus laevis. Nature. 185, 859-860 (1960).
- Blackler, A. W., Fischberg, M. Transfer of primordial germ-cells in Xenopus laevis. J Embryol. Exp Morph. 9, 634-641 (1961).
- Bounoure, L. L'origine des cellules reproductrices et le problem de la lignee germinale. , Gauthier-Villars. Paris. (1939).
- Nieuwkoop, P. D., Sutasurya, L. A. Primordial Germ Cells in the Chordates: Embryogenesis and phylogenesis. , Cambridge University Press. Cambridge. (1979).
- Heasman, J., Holwill, S., Wylie, C. C. Fertilization of cultured Xenopus oocytes and use in studies of maternally inherited molecules. Methods Cell Biol. 36, 213-230 (1991).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Embryo dissection and micromanipulation tools. CSH Protoc. , (2007).
- Nakayama, T., et al. Cas9-based genome editing in Xenopus tropicalis. Methods Enzymol. 546, 355-375 (2014).
- Ogino, H., McConnell, W. B., Grainger, R. M. High-throughput transgenesis in Xenopus using I-SceI meganuclease. Nat Protoc. 1 (4), 1703-1710 (2006).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early development of Xenopus laevis.: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2000).
- Kay, B. K. Injection of oocytes and embryos. Xenopus laevis: Practical Uses in Cell and Molecular Biology (Methods in Cell Biology Vol. 36). Kay, B. K., Peng, H. B. , Academic Press. San Diego. (1991).
- Normal Table of Xenopus laevis. (Daudin): A Systematical and Chronological Survey of the Development from the Fertilized Egg till the End of Metomorphosis. Nieuwkoop, P., Faber, J. , Garland Publishing Inc. New York. (1994).
- Xenopus Tadpole Feeding. , Available from: http://www.mbl.edu/xenopus/files/2016/06/Xenopus-Tadpole.pdf (2017).
- Xenopus tropicalis Animal Care. , Available from: http://www.mbl.edu/xenopus/files/2016/06/Xenopus-Tropicalis.pdf (2017).
- Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Res. 42 (22), e168- (2014).
- Sander, V., Reversade, B., De Robertis, E. M. The opposing homeobox genes Goosecoid and Vent1/2 self-regulate Xenopus patterning. EMBO J. 26 (12), 2955-2965 (2007).
- Bedell, V. M., et al. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).
- Kim, J. M., Kim, D., Kim, S., Kim, J. S. Genotyping with CRISPR-Cas-derived RNA-guided endonucleases. Nat Commun. 5, 3157 (2014).
- Kim, H. J., Lee, H. J., Kim, H., Cho, S. W., Kim, J. S. Targeted genome editing in human cells with zinc finger nucleases constructed via modular assembly. Genome Res. 19 (7), 1279-1288 (2009).
- Qiu, P., Shandilya, H., D'Alessio, J. M., O'Connor, K., Durocher, J., Gerard, G. F. Mutation detection using Surveyor nuclease. Biotechniques. 36 (4), 702-707 (2004).
- Ota, S., et al. Efficient identification of TALEN-mediated genome modifications using heteroduplex mobility assays. Genes Cells. 18 (6), 450-458 (2013).
- Dahlem, T. J., et al. Simple Methods for Generating and Detecting Locus- Specific Mutations Induced with TALENs in the Zebrafish Genome. PLoS Genet. 8 (8), e1002861 (2012).
- Ramlee, M. K., Yan, T., Cheung, A. M., Chuah, C. T., Li, S. High-throughput genotyping of CRISPR/Cas9-mediated mutants using fluorescent PCR-capillary gel electrophoresis. Sci Rep. 5, 15587 (2015).
- Bhattacharya, D., Marfo, C. A., Li, D., Lane, M., Khokha, M. K. CRISPR/Cas9: An inexpensive, efficient loss of function tool to screen human disease genes in Xenopus. Dev Biol. 408 (2), 196-204 (2015).
- Yu, C., Zhang, Y., Yao, S., Wei, Y. A PCR Based Protocol for Detecting Indel Mutations Induced by TALENs and CRISPR/Cas9 in Zebrafish. PLoS ONE. 9 (6), e98282 (2014).
- Mock, U., Hauber, I., Fehse, B. Digital PCR to assess gene-editing frequencies (GEF-dPCR) mediated by designer nucleases. Nat Protoc. 11 (3), 598-615 (2016).
- Varshney, G. K., et al. High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9. Genome Res. 25 (7), 1030-1042 (2015).
- Shi, J., Wang, E., Milazzo, J. P., Wang, Z., Kinney, J. B., Vakoc, C. R. Discovery of cancer drug targets by CRISPR-Cas9 screening of protein domains. Nat Biotechnol. 33 (6), 661-667 (2015).
- Koebernick, K., Loeber, J., Arthur, P. K., Tarbashevich, K., Pieler, T. Elr-type proteins protect Xenopus Dead end mRNA from miR-18-mediated clearance in the soma. Proc Natl Acad Sci USA. 107, 16148-16153 (2010).
- Yang, J., Aguero, T., King, M. L. The Xenopus maternal-to-zygotic transition from the perspective of the germline. Curr Top Dev Biol. 113, 271-303 (2015).
