Summary
Gener afgørende for overlevelse udgør tekniske forhindringer for at skabe mutant linjer. Kvantespring omgår dødelighed ved at kombinere genom-redigering med primordiale kønsceller transplantation til skabe wild-type dyr transporterer kønscelleoverførsel mutationer. Kvantespring også tillader den effektive generation af homozygot null mutanter i F1 generation. Her, er trinnet transplantation påvist.
Abstract
Oprettelsen af mutant linjer af genom-redigering er accelererende genetisk analyse i mange organismer. CRISPR/Cas9 metoder er blevet tilpasset til brug i den afrikanske jeg frøen, Xenopus, en mangeårige model organisme for biomedicinsk forskning. Traditionelle avl ordninger for at skabe homozygot mutant linjer med CRISPR/Cas9-målrettet mutagenese har flere tidskrævende og besværlige trin. For at lette oprettelsen af mutant embryoner, især at overvinde de hindringer, der er tilknyttet udskære gener, der er afgørende for embryogenese, blev der udviklet en ny metode kaldet kvantespring. Denne teknik udnytter robustheden af Xenopus embryoner til at "klippe og klistre" embryologiske metoder. Kvantespring udnytter overførsel af primordiale kønsceller (PGCs) fra effektivt mutagenized donorembryoner i PGC-ablated vildtype søskende. Denne metode giver mulighed for effektiv mutation af væsentlige gener ved at oprette kimære dyr med vildtype somatiske celler, der bærer en mutant kønscelleoverførsel. Når to F0 dyr transporterer "leapfrog transplantationer" (dvs. mutant kønsceller) er intercrossed, de producerer homozygote eller sammensatte heterozygous, null F1 embryoner, hvilket sparer en fuld generationstid at opnå fænotypiske data. Kvantespring giver også en ny tilgang til at analysere moderens effekt gener, som er refraktære over for F0 fænotypiske analyser efter CRISPR/Cas9 mutagenese. Dette manuskript detaljer metoden for kvantespring, med særlig vægt på hvordan man med held udføre PGC transplantation.
Introduction
Hvordan genotype koder fænotype har været et vigtigt spørgsmål i biologi da genopdagelsen af Mendels love. En forståelse af gener, deres forordning og interaktioner inden for genet netværk roller og funktioner af kodede produkter løfter at levere værktøjer til afsløring nye biologi og mildne sygdomstilstande. For over et halvt århundrede1været afrikanske jeg frøen, Xenopus, en førende model for undersøgelser på en bred vifte af emner i grundlæggende biologi og biomedicin, herunder den genetiske kontrol af udviklingen. Historisk set, de fleste forskning på Xenopus har brugt allotetraploid frøen, X. laevis, men mere for nylig, på grund af dens diploidy, X. tropicalis er blevet udviklet som en padde genetiske model. Komplet genom sekvenser er blevet samlet fra begge Xenopus arter2,3. Fællesskabets"frøen" er nu på et vendepunkt hvor grundlæggende genom ændring teknologi tillader undersøgelse af genfunktioner, næsten efter behag. Programmerbare CRISPR/Cas9 endonucleases har gjort mutagenese af gener højeffektive, med biallelic mutation muligt i de fleste celler af animalsk4,5,6,7, 8,9,10,11. Disse undersøgelser, understreget af Bhattacharya et al. 12 og Shigeta et al. 13, har vist, at funktionen af mange gener kan studeres af mutagenese i F0 mosaik dyr. Denne tilgang har mange fordele; Cas9-sgRNA-microinjected embryoner vises dog ofte variable fænotyper som følge af ufuldstændig tab af funktion (LOF). Flere betydeligt, generation af mutant linjer er meget fordelagtige for nogle programmer — især når man studerer gener, der har en maternel mRNA bidrag. Maternel mRNAs og proteiner og deres påvirkninger på Epigenetik, fortsætter i en længere periode i embryogenese14,15,16, gengivelse de tidlige udviklingsmæssige bidrag af mange gener Ildfaste F0 analyser. Andre LOF tilgange er derfor påkrævet.
Når de forsøger at oprette mutant linjer, har stien til at opnå homozygot LOF embryoner flere forhindringer. Første, effektiv mutagenese at producere biallelic mutationer kan være ufordelagtige, fordi tab af væsentlige genet funktioner resulterer i manglende evne til at overleve til seksuel modenhed, at blande sig med produktion af en levedygtig linje. En fælles løsning er omhyggelig med titrering af mængden af Cas9-sgRNA leveres. Her er målet at opnå en balance mellem at reducere dødelighed samtidig også maksimere kønscelleoverførsel mutagenese effektivitet. Et andet problem opstår fra standard avl ordningen, hvor fænotypiske analyser er udskudt indtil F2 generation. Ved hjælp af standardmetoden, kønsmodne F0 dyr, der overfører muterede alleler gennem germline er outcrossed til at producere F1 heterozygous "bærere", som dyrkes derefter til seksuel modenhed. To F1 heterozygote er derefter intercrossed til at producere F2 mutant embryoner med en forventet mendelske hyppighed på 25%. To generationer af avl er således nødvendige for analyse af mutant fænotyper. Mutant dyr kunne være enten homozygote eller sammensatte heterozygote (dvs. afkom der indeholder to forskellige mutante alleler, der afhænger af genotyper af forældrenes dyrene bruges i F1 intercross).
Disse hindringer kan overvindes ved at begrænse programmerbare nukleasen-medieret mutagenese til kønsceller, der ligger til grund for en ny metode kaldet kassationsdomstolen17. Kvantespring har to hovedelementer: (1) mikroinjektion af Cas mRNA sammen med sgRNA eller nukleasen-sgRNA komplekser (eller i princippet, TALENs eller zink finger nukleaser) på én celle stadium til effektivt mutagenize embryonale genomer, efterfulgt af (2) transplantation af PGCs til vildtype søskende embryoner, hvor de endogene PGCs blev fjernet. Når begge trin er effektiv, komplet kønscelleoverførsel udskiftning med mutant kønsceller kan opnås. Blackler viste tidligt i 1960 ' erne at Xenopus PGCs kunne transplanteres mellem embryoner på den sene neurula og tidlige tailbud stadier18,19. For kvantespring, blev Blacklers tilgang ændret ved at udføre transplantationscentrene blastula fase17, når PGCs er lokaliseret i vegetal pole embryo20,21. Transplantation før gastrulation har to store fordele. Første blev engraftment transplantationer og den efterfølgende normale udvikling fundet for at være mere effektiv, når transplantation udføres på stadiet blastula (upublicerede observationer). For det andet ved at udføre blastula-fase transplantationscentre, kort tid efter zygotisk transskription er begyndt, kan man undgå dødelighed som følge af udviklingsmæssige gen mutationer, der forstyrrer gastrulation eller som ellers fører til forkert udformede sene neurulae. PGC transplantation-bærende ("leapfrogged") embryoner dyrkes til seksuel modenhed, og intercrosses mellem disse F0 dyr har vist, at 100% F1 afkom i mange tilfælde vise LOF fænotype (de fleste er sammensat heterozygote), der angiver komplet kønscelleoverførsel udskiftning med de målrettede mutationer.
Det forventes, at kvantespring vil fremskynde genetiske metoder i Xenopus. Kvantespring også udgør et alternativ til "host overførsel" metode22 til LOF analyse af maternel-effekt gener (upublicerede observationer). I den aktuelle publikation præsenteres en detaljeret beskrivelse af den metode, især med fokus på PGC transplantation, i X. tropicalis (med mindre ændringer til X. laevis). Transplantation af PGCs er vist her for at lette en mere hurtig overførsel af denne teknologi til andre laboratorier, der arbejder med Xenopus. Principperne i denne metode skal være vellykket i andre padder (f.eks. urodeles), og organisme-specifikke ændringer i metoden bør give mulighed for anvendelse til mange andre dyr, hvor der kan opnås effektive mutagenese og PGCs er let transplanterbare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder beskrevet her er blevet godkendt af institutionelle Animal Care og brug Udvalget af University of California, Irvine.
1. forberede PGC Transplantation
- Forberede dissektion værktøjer på forhånd, som tidligere beskrevet23.
Bemærk: Øjenbryn hår knive bruges til at gøre indsnit med bistand fra en hår løkke til at stabilisere fosteret under udførelse af operationer. Øjenbryn hår og hår sløjfer er limet til borsilikatglas Pasteur pipetter, der først er blevet trukket i en flamme og brudt på den tyndet del (Se figur 1A, pilespids) til at oprette en kortere og smallere tip (figur 1B) for større smidighed Når du udfører operationer. - Generere sgRNAs ved hjælp af procedurer tidligere beskrevet24 .
Bemærk: Kort, korte DNA skabeloner koder for sgRNAs er skabt ved hjælp af overlappende deoxyoligonucleotides indeholdende 5' bacteriophage T7 initiativtagere, som er udglødet og "udfyldt" ved en fejl-fri, termostabil DNA-polymerase. In vitro- sgRNA syntese reaktioner inkuberes i flere timer at overnatte (afhængigt af kit bruges). Reaktioner er DNAse-behandlet for at fjerne skabelonen. SgRNAs er renset af standardmetoder fenol/chloroform udvinding og ammonium acetat/isopropanol nedbør, ifølge kit producentens instruktioner24. - Kort før udfører microinjections, forberede Cas9-sgRNA komplekser af første denaturering ~ 250 ng af sgRNA i en 3 µL samlede volumen af RNAse-fri (diethylpyrocarbonate-behandlet) H2O ved 60-65 ° C i 5 min, efterfulgt af hurtig afkøling i isbad i 5 min. Centrifugeres sgRNA i et par sekunder, tilføje 1 µL 1 µg/µL Cas9 protein og inkuberes i 10 min. ved 37 ° C at fremme kompleks dannelse.
Bemærk: Efter denne inkubation, røret kan opbevares på is samtidig forberede mikroinjektion af embryoner. - Få X. tropicalis embryoner ved in vitro- befrugtning ved hjælp af standard metoder, som tidligere beskrevet25. De-jelly25,26 embryoner på 10 min efter befrugtning.
Bemærk: Befrugtning tid betragtes som tid efter sæd suspension er tilføjet til æg og fadet er oversvømmet med 1/9thX Marcs modificerede Ringers (MFR)26. For X. tropicalis25, i modsætning til X. laevis, udføre den de-Gelédannende i 1/9 x MMR der indeholder 3% cystein gratis base (ikke HCl-salt), pH justeret til 7,8-8,0, efterfulgt af flere vasker i 1/9 x MMR. Overførsel af embryoner til en Agarosen (1%)-belagte fad indeholdende 1/9 x MMR ved stuetemperatur. - Straks overføre embryoner skal injiceres til en 1% Agarosen-belagte fad indeholdende 1 x MMR ved hjælp af Pasteurs pipette.
-
Injicere på 1-celle stadium. Se referencer26,27 for detaljerede beskrivelser af Xenopus mikroinjektion metoder.
- Injicere hvert embryon på et enkelt websted i den animalsk pol, med 4 nL af Cas9-sgRNA complex (endelige beløb = 1 ng i Cas9 og ~ 250 pg i sgRNA; Se diskussion)24. Efter 10-20 min af injektion site healing, overførsel af embryoner til en Agarosen-belagte fad indeholdende 1/9 x MMR og inkuberes ved 25 ° C. Også skabe en parabol af uninjected søskende embryoner, der vil tjene som graft modtagere.
-
Forberede Petri plader (60 mm), der indeholder en ~ 5 mm-tykke lag af 1% Agarosen i 0,3 x MMR, hvis gør transplantationscentre i X. tropicaliseller 1 x MMR for X. laevis.
- Oprette depressioner ~ 3-4 mm dyb ved indsættelse af en 3-x 4-godt mug (skabt ved at skære en 96-brønd PCR plade) i de smeltede Agarosen når hælde pladerne (Se figur 1 c og D). Hold formen flere millimeter over bunden af petriskålen ved hjælp af en klemme, der er knyttet til en ring stå indtil Agarosen er størknet.
- Desuden foretage en 24-godt plade hus individuelt embryoner ved belægning brønde med et tyndt lag af 1% Agarosen lavet i 1/9 x MMR.
Bemærk: Næringssubstratet tilføjet disse brønde er 1/9 x MFR suppleret med 50 µg phosphatbufferet sulfat/ml.
2. transplantation af PGCs
- Når embryoner kun når Nieuwkoop og Faber28 blastula etape 9 (figur 2A), ~4.5 h efter befrugtning (hpf) for X. tropicalis, fjerne dem fra 25 ° C inkubator og tillade dem at reagensglasset stuetemperatur for en yderligere 0,5 h.
- Til at begynde transplantation på 5 hpf (figur 2B), bruge Pasteur pipette til at overføre en PGC donor embryoner (sprøjtes med Cas9-sgRNA) til 60 mm Agarosen fadet indeholdende depressioner (skabt taktfast 1,7) i 0,3 x MMR (eller 1 x MMR hvis ved hjælp af X. laevis). Også overføre ét uninjected søskende embryon, graft-modtageren til denne parabol.
Bemærk: Det er afgørende, at identiteten af hver af disse embryoner ikke er forvirret. - Manuelt fjerne de vitelline konvolutter fra hvert foster med pincet og rotere begge embryoner, så deres vegetal polakkerne er i udsigt og let tilgængeligt for kirurgi.
Bemærk: En beskrivelse af manuel de-vitellination af embryoner tidligere har været beskrevet26. - Brug den skarpe spids af en øjenbryn hår kniv, lave fire lavvandede indsnit i form af en firkant på vegetal pol på den modtagende embryoner, inde i zonen hvor fremtidige flaske celler, der markerer blastopore vil danne. Gør indsnit ved at indsætte spidsen af øjenbryn hår kniv i embryo, lige under overfladen, og gøre opad udskæring bevægelser samtidig med at stabilisere embryo med hår løkke.
Bemærk: Figur 2 viser vegetabilsk udsigt over et foster med halv time intervaller fra 4,5-7,0 hpf Vis i Cellestørrelse og give en guide til vurdering af hvor flasker celler vil danne (stiplet hvid cirkel). Formålet er at gøre indsnit hvor den stiplede sorte boks er angivet. - Når de fire sider af pladsen er afgrænset af indsnit, uddybe hver snittet med øjenbryn hår kniven ved hjælp af lignende skæring bevægelser at nå frem til en dybde af ca 1/3 til 1/2 af afstanden til blastocoel gulv.
- Gratis vegetabilsk væv eksplantat fra den modtagende Foster (figur 3A og B) ved at gøre en vandret (parallel med den overflade, vegetabilsk) cut(s) i den dybe vegetabilsk region.
Bemærk: Størrelsen af den PGC-holdige vegetabilsk eksplantat er cirka 0,4-0,45 mm pr. side og 0,25-0,3 mm i dybden. Denne vegetabilsk eksplantat fra det modtagende embryonet ikke længere er nødvendig og bør derfor sættes til side til at blive kasseret. - Arbejder hurtigt, Gentag denne procedure (trin 2,4-2,6) på PGC donor embryoner til at skabe en tilsvarende størrelse vegetabilsk væv fragment til transplantation.
Bemærk: Det er vigtigt at foretage denne anden dissektion med lille forsinkelse for at minimere tid for modtagerens embryonet til at helbrede sine åbent sår. - Når det væv, som indeholder PGCs er fjernet fra donor embryoner, bruge øjenbryn hår kniv og hår løkke til at flytte denne eksplantat i position i åbningen lavet i modtagerens embryo.
Bemærk: Den indre overflade af donor graften skal stå indre af den modtagende embryo. Det er ikke nødvendigt at matche retningslinjerne for graft med modtagerens embryonet dorsal-ventral og venstre-højre akser. - Bruge den lange kant af skaftet af øjenbryn hår kniv, afholdt parallelt med overfladen af graften, at trykke forsigtigt på graft i åbningen i vegetal overfladen af den modtagende embryo.
- Når podekvisten er blevet placeret, bruge en hairloop eller skaftet af en øjenbryn hår kniv til forsigtigt glide "slagtekroppe" af donor embryoner over Agarosen overfladen og ind i en Agarosen depression. Sørg for, at det åbne sår af slagtekroppen vender bulk væske. Hvis ikke, bruges øjenbryn hår kniv til at rotere Foster for at opnå denne orientering.
- Skub den modtagende embryo, med transplantat healing i sted, ind i en tilstødende depression og ligeledes Sørg for, at den podede vegetal pole væv vender bulk væske.
- Gentag denne procedure (trin 2.1-2.11) ved hjælp af et andet par af donor og recipient embryoner til at skabe en anden transplantation/slagtet par; overføre disse til tomme depressioner.
Bemærk: Det er afgørende, at man gør notationer til at holde styr på matchede par af slagtekroppe og transplantation-bærende embryoner. Donor slagtekroppe skal bruges som en proxy for effektiviteten af Cas9-sgRNA-induceret mutagenese i de transplanterede PGCs, som nemt ikke kan analyseres, indtil dyrenes transplantation-bærende kønsmodne (Se trin 3.3, nedenfor, og diskussion ). - Fortsætte med at foretage transplantationer indtil embryonerne nå ca gastrula tidligt 10, hvilket er cirka 6,5 hpf i X. tropicalis (Se figur 2E).
3. healing post af embryoner
Bemærk: Grafts helbrede på plads inden for ~ 30 min, og det er normalt at observere nogle yolky vragrester fra celle lysis væskende fra Foster (figur 3 c).
-
Når helet, bruge Pasteur pipette til meget forsigtigt overførsel embryoner fra depressioner til individuelle brønde af en Agarosen-belagt 24-godt plade. Ekssudat bliver fjernet (figur 3D) af væske blanding under overførslen.
- Rotere embryonerne, så de placeres vegetabilsk-polet op, vender bulk løsningen. Igen, Placer donor slagtekroppe og pode modtagere i tilstødende wells til at hjælpe med at holde styr på embryo par; registrere disse oplysninger.
- Overføre den 24-godt plade der indeholder embryoner til 25 ° C inkubator for natten kultur.
Bemærk: Den næste dag, embryoner har nået tailbud stadier. - Flytte graft modtagerne til at rense Agarosen-belagt 6-godt plader der indeholder 1/9 x MFR suppleret med 50 µg phosphatbufferet sulfat/ml, med 1 embryon pr. brønd. Opretholde en klar registrering af donor slagtekroppe, der matcher disse pode modtagere.
- For at vurdere mutagenese effektivitet ved sekventering PCR amplikoner5,17,24 eller bruge andre metoder, der er afhængige af PCR-amplikoner (Se diskussion), skal du flytte enkelte slagtekroppe til 0,2 mL PCR strip rør. Fjerne de fleste af medium og homogeniseres i 100 µL lysis buffer24 indeholdende proteinase K (PK) ved gentaget up-and-down pipettering ved hjælp af en P200 pipette.
- Udføre embryo lysis24 ved 56 ° C i 6 h til natten for at tillade PK fordøjelsen. Inaktivere PK ved at opvarme det til 90-95 ° C i 10 min, efterfulgt af hurtig afkøling til 4 ° C. Bruge lysates uden yderligere oprydning trin til frø PCR reaktioner for at få kort amplikoner for direkte Sanger DNA-sekventering24. Butik lysates ved-20 ° C.
Bemærk: Inden for flere dage, haletudser vil nå fodring faser (ca scene 45-46) og kan fodres en suspension af planktoniske pulver (sera Micron). - Efter ~ 1 uge, med daglige ændringer af næringssubstratet at bevare renlighed og minimere mikrobielle overvækst, flytte haletudser til små tanke i en cirkulerende akvatiske system med drop flow. Bruge sequencing data for at adskille haletudser med meget effektivt mutagenized PGCs fra haletudser med lavere mutagenese effektivitet. Når metamorfose er fuldført, skal du flytte froglets til voksen akvatiske systemet i laboratoriet.
Bemærk: Regimer udviklet af den nationale Xenopus ressource (Marine biologi laboratorium, Woods Hole, MA) giver en guide til haletudse fodring29 og voksen frøen vedligeholdelse30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter transplantation, kvalitativ bestemmelse af effektiviteten af CRISPR/Cas9 mutagenese bør udføres før expending indsats i dyrehold at dyrke og vedligeholde dyr til seksuel modenhed. Fordi dyr transporterer leapfrog transplantationer er somatically vildtype og germline er vanskeligt at få adgang til direkte målinger, bliver gemme slagtekroppe af donorembryoer vigtigt. DNA-analyser fra kroppe fungerer som en proxy for omfanget af mutagenese, der opstår i den transplanterede kønscelleoverførsel17.
En tilgang til at vurdere mutagenese succes er til direkte sekvens PCR-amplikoner spanning genomisk regionen bliver målrettet. Dette bliver specielt dyre og ineffektive, hvis man ønsker at sekvens talrige individuelt klonede DNA fragmenter fra mange dyr. I stedet, sekventering amplikoner heterogene på mål-webstedet, som de stammer fra genetisk mosaik embryoner, bruges til at vurdere mutagenese effektivitet i hver embryo19. Visualisering af kromatogrammer viser vildtype sekvens (toppe) opstrøms af målet sekvens og toppe bliver "forvrænget" (dvs. samtidig forekomsten af toppe svarende til flere retsgrundlag optræder på hver nukleotid position) neden for site af Cas9-katalyseret dobbelt-strenget pause. Eksempler på sådanne profiler kan findes i figur S1 af Blitz mfl. 17. nøjagtig kvantificering af omfanget af mutagenese repræsenteret ved disse scrambled toppe kan opnås ved hjælp af en sekvens nedbrydning algoritme, tidevand (https://tide-calculator.nki.nl/)31. Screening individuelt embryoner ved hjælp af denne teknik giver tillid til, at hver embryo korrekt blev injiceret og indskyde nemlig mutagenese. En tracer, såsom en fluorescently tagged dextran, kan bruges til at bekræfte vellykket injektion24 og kan også støtte til etablering af, at en tadpole faktisk bærer det transplanterede væv (ikke-offentliggjorte data). Det er vigtigt at bemærke, at den formelle mulighed for at coinjection af en fluorescerende dextran sammen med Cas9-sgRNA kan ændre Cas9 mutagenese effektivitet ikke er blevet undersøgt. Enhver "leapfrogged" embryoner indeholdende transplantationer fra dårligt eller unmutagenized donorer kan kasseres.
Kvantespring omgår behovet for F2 generation analyse i standard genetiske avl ordninger, ved at tillade effektiv fænotypiske analyser i F1 embryoner. Når den normale metode til at mutere væsentlige gener, er omhyggelig titrering af Cas9-sgRNA dosis forpligtet til at sikre levedygtigheden af grundlægger embryoner, hvilket resulterer i en reduceret mutagenese effektivitet. Overlevende F0 er dyr fra denne standard ordning derefter outcrossed med wildtypes at få levedygtigt F1 embryoner, der er screenet for at identificere luftfartsselskaber. Endelig er disse F1 heterozygote vokset til seksuel modenhed og intercrossed for at få homozygot F2 individer vise mutant fænotyper. I modsætning hertil, fordi kvantespring producerer dyr, der har fuldstændig udskiftning af deres germlines med mutante alleler, producerer intercrossing disse F0 dyr mutant fænotyper i F1 generation. Blitz et al. 17 rapporterede, at et flertal af F0 dyr rettet mod tyrosinase (tyr) locus, som er nødvendig for pigmentering af melanocytter og nethinden, viste 100% kønscelleoverførsel transmission (målt ved outcrossing med tyr- / - albino dyr) af donor-stammer mutant genomer (jf. Figur 4A-B og tabel 1). Således ville intercrossing to dyr produceret af kvantespring give homozygote eller sammensatte heterozygous mutant F1 embryoner.
Lignende resultater blev opnået17 af intercrossing F0 leapfrogged dyr bærer mutationer i HOXD (kodning DNA-bindende homeodomain) af goosecoid (GSR) genet (jf. figur 4A, C-H). Knockdowns af GSR 's udtryk ved hjælp af morpholino antisense oligonukleotider i X. laevis foreslog, at GSR gen er nødvendige for en fuldstændig udvikling af de forreste hoved32, og Cas9-sgRNA indsprøjtet haletudser også Vis embryonale dødbringende fænotyper17. Men de leapfrogged F0 dyr, bliver somatically vildtype, er levedygtig og robuste, og F1 intercross producerede embryoner med identiske LOF fænotyper til dem, der offentliggøres i X. laevis knockdowns17. Disse oplysninger genetiske bestyrkelse af morpholino fænotype, såvel som et bevis på princippet at kvantespring kan bruges til at overvinde embryonale dødbringende fænotyper.
Figur 1: der skal bruges ved transplantation. (A) borsilikatglas Pasteur pipetter bruges til at lave øjenbryn hår knive og hår sløjfer for mikrokirurgi på tidlige embryoner. Tegning ud glasset ved hjælp af en bunsenbrænder giver mulighed for en smallere end til indsættelse af hår. Den røde pilespids markerer den omtrentlige position ved at bryde glas. (B) et eksempel på et øjenbryn hår kniv (øverst) og hår loop (nederst), fast i pipetter med fast-tørring lim. (C) en del af en 96-brønd PCR plade bruges til at oprette depressioner i en Agarosen pladen ved at tillade 1% Agarosen størkne omkring formen (Agarosen er lavet i 0,3 x eller 1 x MMR, afhængigt af om transplantationscentrene udføres i X. tropicalis eller X. laevis, henholdsvis). Tykkelsen af Agarosen er ~ 5 mm, med 3-4 mm-dybe brønde. (D) et eksempel på en Agarosen plade til transplantation, med 12 depressioner, som vist i panelet C. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: morfologi af vegetal pole under den sene blastula gastrula vorden og strategien for dissektion. (A-F) Xenopus tropicalis embryoner er vist i vegetal se på halv time tidsintervaller, fra begyndelsen af blastula etape 9 (4.5 hpf) til tidlig gastrula fase ~10.25 (7 hpf). Før 5 hpf, blastomeres er stor og lettere beskadiget. Hvidt, stiplede cirkel markerer den forventede position af flaske celle dannelse under gastrulation, som kan ses danner begyndelsen på den dorsale side (øverst) i paneler (E og F). For kvantespring, fire indsnit er lavet i et kvadrat, skildret af sort stiplede linjer, med en endelig skåret lavet parallelt med overfladen af vævet (ikke illustreret) til gratis vegetabilsk eksplantat. Skalalinjen = 400 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Transplantation. (A) et eksempel på en ~5.5 hpf embryo efter fjernelse af vegetabilsk PGC-holdige væv. Sort stiplet boks og hvide stiplede cirkel er de samme relative dimensioner som vist i figur 2. (B) den vegetabilsk eksplantat fjernet fra foster i panelet A, indvendige overflade, vender ud mod beskueren, er cirka 0,4-0,45 mm pr. side og 0,25-0,3 mm i dybden. (C) et foster med den transplanterede vegetabilsk væv. Billedet blev erhvervet ~ 10 min efter transplantation. (D) 30 min efter transplantation, den vegetabilsk væv er set har helbredt på plads (blid hvirvlende med et øjenbryn hår kniv ovennævnte embryoner blev brugt til at skabe en vortex, der skyllede væk debris set i panelet C). Efter overførslen til 1/9 x MFR og inkubation ved 25 ° C komplet de fleste embryoner gastrulation normalt. Skalalinjen = 400 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Kønscelleoverførsel transmission fra F0 dyr produceret af kvantespring. (A) For kvantespring, to gener var målrettet ved CRISPR/Cas9, tyrosinase (øverst) og goosecoid (nederst). Tyr -gen var målrettet4,5 i den kodning sekventering (blå skygge) for en N-terminale signal peptid (SP, rød skygge), mens GSR -gen var målrettet17 inden for kodende sekvens på den begyndelsen af HOXD (rød skygge), som er delt mellem to exons. Utranslaterede 5' og 3' exonic regioner er uden skygge. (B) alle 160 F1 haletudser fra (Se også tabel 1) en parring af en leapfrogged F0 mand (LF1) og en albino (tyr-/-) kvinde blev albino, der angiver, at den hele genom fra leapfrogged hannen havde været erstattet med tyr mutant kønsceller. Indsatsen viser en vildtype haletudse med normal nethinde og melanocyte pigmentering. (C-H) F1 embryoner stammer fra en intercross mellem to F0 leapfrogged Xenopus målretning HOXD gen Generalsekretariatet. Ca 2/3rds af embryoner blev fænotype mutant for GSR, med Fænotypen er varierende grader af anterior trunkering af hovedet (E-H). Halvdelen af mutanter var enten cyclopic eller havde nøje fordelt øjne (F), mens anden halvdelen var eyeless (H). Genotypebestemmelse viste disse homozygote eller sammensatte heterozygote. 1/3rd af embryoner viser vildtype fænotype (C, D) blev enten homozygot vildtype eller heterozygote. In situ hybridisering til otx2 (en markør af forhjernen, midthjernen og øjne), egr2 (en markør for baghjernen rhombomeres 3 og 5, og en strøm af neural crest) og hoxb9 (en markør af rygmarven) viser, at tab af GSR funktion påvirker kun den forreste del af domænet otx2 . Disse data er gengivet fra Blitz et al. 17 med tilladelse fra selskabet biologer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Cross | Mand | Kvinde | Albino | Vildtype | I alt | % Albino |
| 1 | LF1 | tyr-/- | 160 | 0 | 160 | 100 |
| 2 | LF2 | tyr-/- | 148 | 0 | 148 | 100 |
| 3 | tyr-/- | LF3 | 409 | 0 | 409 | 100 |
| 4 | tyr-/- | LF4 | 0 | 519 | 519 | 0 |
| 5 | tyr-/- | LF5 | 223 | 0 | 223 | 100 |
| 6 | LF6 | tyr-/- | 493 | 703 | 1196 | 41.2 |
| 7 | tyr-/- | LF7 | 1 | 94 | 95 | 1.1 |
| 8 | tyr-/- | LF8 | 125 | 0 | 125 | 100 |
| 9 | tyr-/- | LF9 | 0 | 417 | 417 | 0 |
| 10 | tyr-/- | LF10 | 252 | 0 | 252 | 100 |
Tabel 1: Effektiv kønscelleoverførsel udskiftning af leapfrog transplantationer bærer mutationer i tyrosinase. Rettet mod tyrosinase, transplantation-bærende dyr af begge køn blev indhentet. Disse dyr blev krydset med albinoer, der er homozygot tyr- / -, at teste for effektiviteten af germline transmissionen af muterede alleler, og procentdelen af F1 embryoner, der viste albinisme blev analyseret på stadiet haletudse. Poster i kolonnerne mærket "Mandlige" og "Kvindelige" angiver, hvilken forælder er enten tyr- /- eller test dyret stammer fra kassationsdomstolen (LF). Procent af embryoner i en kryds viser albino fænotype er angivet under "% Albino." Bemærk, at 6 af 10 dyr med leapfrog transplantationer viste fuldstændig (100%) udskiftning med mutante alleler. Denne tabel er gengivet fra Blitz et al. 17, med tilladelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne rapport indeholder en detaljeret protokol for transplantation af vegetabilsk væv indeholdende PGCer. Transplantation PGCs bruges sammen med genom-redigering teknologier (f.eks. CRISPR/Cas9) til at ændre germline dyrets mens opretholde næsten alle dens somatiske væv som genetisk vildtype. For kvantespring for at blive en succes, er der en række kritiske faktorer at overveje, inden du udfører udfører transplantationscentre.
For at sikre komplet udskiftning af germline med mutante alleler, anbefales det, at man først bestemmer i vivo effektivitet af sgRNAs. Erfaringerne tyder på, at de fleste sgRNAs designet af CRISPRDirect (https://crispr.dbcls.jp/) eller CRISPRScan (http://www.crisprscan.org/) er effektive, når de anvendes på 250 pg/embryoner. Dog i nogle tilfælde kan det være nødvendigt at bruge højere koncentrationer (fx GSR sgRNA udgivet af Blitz al.17, kræves ~ 1 ng/Foster). Vurdering af effektiviteten af mutagenese på destinationsstedet er væsentlige og brugen af TIDEVANDET tillader en kvantitativ vurdering31. Mens metoden understreget her bruger den direkte Sanger har sekventering af PCR-amplikoner (der repræsenterer befolkningen af muterede alleler i F0 embryoner), talrige andre metoder været anvendt i genom-redigering litteratur til dette formål. Andre lav til moderat omkostninger teknikker, der er almindeligt anvendt omfatter fragment længde polymorfi analyse ved hjælp af enten tab af restriktionsenzymer33 eller Cas9/TALEN kavalergang websteder34, T7 liv1975 135 og landmåler 36 assays, heteroduplex mobilitet assay37høj opløsning smelte assay38, fragment analyse af kapillær elektroforese39,40, og qPCR-baserede metoder41, 42.
En anden overvejelse er valget af målet site placering i target-genet. For at muliggøre effektiv inddrivelse af mutant fænotyper i F1 generation, er det vigtigt at maksimere chancer for komplet LOF alleler. Når du foretager mutant linjerne ved hjælp af klassisk tilgange er det en fælles strategi til at målrette Cas9 kavalergang nær 5'-enden af kodende regioner, for at fremkalde tidlig oversættelse opsigelse nær begyndelsen af protein kodende region. F1 heterozygote vil blive identificeret med frameshift mutationer, og disse dyr ville udvalgt til yderligere arbejde, fordi de forventes at bære null alleler. Fordi den kassationsdomstolen strategi bruger F0 intercrosses, ville tilgang af målretning 5'-slutningen af den kodende sekvens være meget ineffektiv. F0 embryoner har mosaik germlines, og intercrossing resultater i bestande af F1 mutanter, der er for det meste sammensatte heterozygote17. Da omfattende analyse bekræfter, at gennemsnitlig forventet ~1/3rd af mutationer produceret af dobbelt-strenget pauser er i-frame43, ville de fleste F1 embryoner produceret på denne måde have mindst én allel med en i-frame mutation, der kan bevare vildtype aktivitet. Derfor, en anden strategi er nødvendig for at sikre, at selv disse i-frame mutante alleler er tilbøjelige til at være null-værdier. Målretning dobbelt strand pauser i proteinfoldning domæner, der er nødvendige for normale protein funktion forventes at resultere i en højere chance for komplet LOF (null alleler)17,44. Omhyggelig overvejelse til det atomare niveau structure(s) af protein domæner, kan når de er tilgængelige, hjælpe med at identificere regioner af sekundær struktur, der, selv når der indeholder en enkelt aminosyre i-frame sletning, kan forventes at forstyrre domæne struktur ( f.eks.Δ3bp mutation i GSR udgivet af Blitz al.17). Hvis CRISPR/Cas9 målwebsteder kan blive identificeret inden for disse regioner, har en højere chance for med held at oprette null alleler. Lille sletninger i opløsningsmiddel-eksponerede sløjfer mellem protein sekundære bygningsdele er færre attråværdig fordi mutationer fleksibilisering dyrkningsområder kan stadig resultere i funktionelle proteiner.
En tredje overvejelse for kvantespring er effektiviteten af PGC fjernelse fra den modtagende Foster. Dette trin skal være effektiv for at sikre komplet kønscelleoverførsel udskiftning. Det er i øjeblikket uklart, om alle graft modtager embryoner produceret af metoden beskrevet her har fuldstændig fjernelse af deres PGCer. hele-mount i situ hybridizations vis variation i lokaliseringen af PGC markører i blastula-fase embryoner. I mange tilfælde hele eller næsten hele signalet er fundet nær vegetabilsk de fleste slutningen af fosteret og ville derfor fjernes ved operation her skitserede (Blitz et al.17 og citater deri). Men nogle embryoner vise PGC markør udtryk i et par celler tættere på blastocoel gulvet. Kim plasm første coalesces på vegetal pole efter befrugtning og derefter er fejet langs kavalergang furer under tidlige splittelser. Nogle Kim plasm kan blive fordelt i celler i den vegetabilske halvkugle og ikke fjernes effektivt uden brug af transplantationer, som strækker sig til blastocoel. Det er imidlertid også vigtigt at bemærke, at disse dybe celler, der indeholder kønscelle markører ikke kan bidrage til genom, som MicroRNA er kendt for at rydde PGC mRNAs fra somatiske celler45,46. Disse dybe celler farvning positive for PGC markører kan være somatiske celler gennemgår sikkerhedsgodkendelse. Metoder til at sikre fuldstændig PGC fjernelse fra modtagerens embryoner er i øjeblikket ved at blive udviklet.
Endelig er det også vigtigt at overveje, hvor mange F0 dyr til at generere af kvantespring. Som et variabelt antal dyr ikke vil overleve til seksuel modenhed, anbefales det, at mere end 20 embryoner indeholdende transplantationer er lavet. Det vil være nødvendigt at have tilstrækkelig overlevende dyr at sikre (1) at tilstrækkeligt mange af begge køn vil blive opnået og (2) at disse sender mutante alleler i en tilstrækkeligt høj frekvens for at være egnet til de påtænkte forskeren analyser.
Ved hjælp af den protokol, der er beskrevet her, med nogle praksis, bør padde embryologerne kunne mestre PGC transplantationscentrene teknik med nogle praksis. Kvantespring bør være mulig, ikke kun i andre padder, men også andre organismer, der indeholder PGCs, der er let ender mellem individer i tidlige faser af embryogenese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatteren har intet at videregive.
Acknowledgments
Dette arbejde blev udført med støtte fra et tilskud, 5R21HD080684-02, fra National Institute of Child Health og menneskelig udvikling. Forfatteren ønsker at takke Ken Cho for hans fortsatte entusiasme og støtte. Forfatteren ønsker også at anerkende Bruce Blumberg for brug af sit kamera, Rebekka Charney, for kritisk læsning af manuskript, og Sean McNamara og Marcin Wlizla på de nationale Xenopus ressource (RRID:SCR_013731), for værdifuldt samtaler om X. tropicalis fodring og pasning af dyr regimer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 or 11252-30 | |
| Eyebrow hair knife | Homemade | ||
| Hair loop | Homemade | ||
| Pasteur pipettes, borosilicate glass | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| Krazy Glue (Cyanoacrylate-based) | Elmer's Products, Inc. | KG581 | To affix eyebrow hair and hair loops into Pasteur pipettes, other similar glues can be used. |
| Oligodeoxynucleotides, custom ordered | Integrated DNA Technologies | Custom ordered | Template oligos for sgRNA synthesis, see Nakayama et al., 2014 for design details. |
| Megascript T7 kit | Ambion/ThermoFisher | AM1334 | Or use Megashortscript T7 (AM1354) kit |
| Phenol, Tris buffered | High quality distilled phenol from any commercial supplier | ||
| Chloroform | High quality chloroform from any commercial supplier | ||
| Ethanol | High quality ethanol from any commercial supplier | ||
| Diethylpyrocarbonate (DEPC) | Sigma Chemical Co. | D5758-50ML | |
| Cas9 protein, with nuclear localization signal | PNA Bio, Inc. | CP01 | Reconstituted using DEPC-treated water according to manufacturer's recommendations |
| 10X Marc's Modified Ringers solution | Homemade. Recipe (ref 26) for 1X MMR (lacking EDTA) is 100mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES. Solution is pH adjusted to 7.4. | ||
| Agarose | Any Molecular Biology grade agarose is sufficient | ||
| 60 X15 mm Petri plates | Falcon | 351007 | |
| 24-well plates | Falcon | 3047 | |
| L-Cysteine | Sigma Chemical Co. | C7352-100G | Free base, not HCl salt |
| Proteinase K | Roche | 03 115 828 001 | Typically ~20mg/ml from Roche |
| sera Micron | sera | Tadpole food. Resuspend in growth medium. Can be purchased from a variety of online retailers |
References
- Gurdon, J. B., Hopwood, N. The introduction of Xenopus laevis into developmental biology: of empire, pregnancy testing and ribosomal genes. Int J Dev Biol. 44 (1), 43-50 (2000).
- Hellsten, U., et al. The genome of the Western clawed frog Xenopus tropicalis. Science. 328 (5978), 633-636 (2010).
- Session, A. M., et al. Genome evolution in the allotetraploid frog Xenopus laevis. Nature. 538 (7625), 336-343 (2016).
- Blitz, I. L., Biesinger, J., Xie, X., Cho, K. W. Biallelic genome modification in F(0) Xenopus tropicalis embryos using the CRISPR/Cas system. Genesis. 51 (12), 827-834 (2013).
- Nakayama, T., Fish, M. B., Fisher, M., Oomen-Hajagos, J., Thomsen, G. H., Grainger, R. M. Simple and efficient CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Xenopus tropicalis. Genesis. 51 (12), 835-843 (2013).
- Guo, X., et al. Efficient RNA/Cas9-mediated genome editing in Xenopus tropicalis. Development. 141 (3), 707-714 (2014).
- Wang, F., Shi, Z., Cui, Y., Guo, X., Shi, Y. B., Chen, Y. Targeted gene disruption in Xenopus laevis using CRISPR/Cas9. Cell Biosci. 5, 15 (2015).
- Jaffe, K. M., et al. c21orf59/kurly Controls Both Cilia Motility and Polarization. Cell Rep. 14 (8), 1841-1849 (2016).
- Liu, Z., et al. Efficient genome editing of genes involved in neural crest development using the CRISPR/Cas9 system in Xenopus embryos. Cell Biosci. 6, 22 (2016).
- Naert, T., et al. CRISPR/Cas9 mediated knockout of rb1 and rbl1 leads to rapid and penetrant retinoblastoma development in Xenopus tropicalis. Sci Rep. 6 (35264), (2016).
- Ratzan, W., Falco, R., Salanga, C., Salanga, M., Horb, M. E. Generation of a Xenopus laevis F1 albino J strain by genome editing and oocyte host-transfer. Dev Biol. 426 (2), (2016).
- Bhattacharya, D., Marfo, C. A., Li, D., Lane, M., Khokha, M. K. CRISPR/Cas9: An inexpensive, efficient loss of function tool to screen human disease genes in Xenopus. Dev Biol. 408 (2), 196-204 (2015).
- Shigeta, M., et al. Rapid and efficient analysis of gene function using CRISPR-Cas9 in Xenopus tropicalis founders. Genes Cells. 21 (7), 755-771 (2016).
- Hontelez, S., et al. Embryonic transcription is controlled by maternally defined chromatin state. Nat Commun. 6, 10148 (2015).
- Peshkin, L., et al. On the Relationship of Protein and mRNA Dynamics in Vertebrate Embryonic Development. Dev Cell. 35 (3), 383-394 (2015).
- Owens, N. D., et al. Measuring Absolute RNA Copy Numbers at High Temporal Resolution Reveals Transcriptome Kinetics in Development. Cell Rep. 14 (3), 632-647 (2016).
- Blitz, I. L., Fish, M. B., Cho, K. W. Leapfrogging: primordial germ cell transplantation permits recovery of CRISPR/Cas9-induced mutations in essential genes. Development. 143 (15), 2868-2875 (2016).
- Blackler, A. W. Transfer of germ-cells in Xenopus laevis. Nature. 185, 859-860 (1960).
- Blackler, A. W., Fischberg, M. Transfer of primordial germ-cells in Xenopus laevis. J Embryol. Exp Morph. 9, 634-641 (1961).
- Bounoure, L. L'origine des cellules reproductrices et le problem de la lignee germinale. , Gauthier-Villars. Paris. (1939).
- Nieuwkoop, P. D., Sutasurya, L. A. Primordial Germ Cells in the Chordates: Embryogenesis and phylogenesis. , Cambridge University Press. Cambridge. (1979).
- Heasman, J., Holwill, S., Wylie, C. C. Fertilization of cultured Xenopus oocytes and use in studies of maternally inherited molecules. Methods Cell Biol. 36, 213-230 (1991).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Embryo dissection and micromanipulation tools. CSH Protoc. , (2007).
- Nakayama, T., et al. Cas9-based genome editing in Xenopus tropicalis. Methods Enzymol. 546, 355-375 (2014).
- Ogino, H., McConnell, W. B., Grainger, R. M. High-throughput transgenesis in Xenopus using I-SceI meganuclease. Nat Protoc. 1 (4), 1703-1710 (2006).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early development of Xenopus laevis.: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2000).
- Kay, B. K. Injection of oocytes and embryos. Xenopus laevis: Practical Uses in Cell and Molecular Biology (Methods in Cell Biology Vol. 36). Kay, B. K., Peng, H. B. , Academic Press. San Diego. (1991).
- Normal Table of Xenopus laevis. (Daudin): A Systematical and Chronological Survey of the Development from the Fertilized Egg till the End of Metomorphosis. Nieuwkoop, P., Faber, J. , Garland Publishing Inc. New York. (1994).
- Xenopus Tadpole Feeding. , Available from: http://www.mbl.edu/xenopus/files/2016/06/Xenopus-Tadpole.pdf (2017).
- Xenopus tropicalis Animal Care. , Available from: http://www.mbl.edu/xenopus/files/2016/06/Xenopus-Tropicalis.pdf (2017).
- Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Res. 42 (22), e168- (2014).
- Sander, V., Reversade, B., De Robertis, E. M. The opposing homeobox genes Goosecoid and Vent1/2 self-regulate Xenopus patterning. EMBO J. 26 (12), 2955-2965 (2007).
- Bedell, V. M., et al. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).
- Kim, J. M., Kim, D., Kim, S., Kim, J. S. Genotyping with CRISPR-Cas-derived RNA-guided endonucleases. Nat Commun. 5, 3157 (2014).
- Kim, H. J., Lee, H. J., Kim, H., Cho, S. W., Kim, J. S. Targeted genome editing in human cells with zinc finger nucleases constructed via modular assembly. Genome Res. 19 (7), 1279-1288 (2009).
- Qiu, P., Shandilya, H., D'Alessio, J. M., O'Connor, K., Durocher, J., Gerard, G. F. Mutation detection using Surveyor nuclease. Biotechniques. 36 (4), 702-707 (2004).
- Ota, S., et al. Efficient identification of TALEN-mediated genome modifications using heteroduplex mobility assays. Genes Cells. 18 (6), 450-458 (2013).
- Dahlem, T. J., et al. Simple Methods for Generating and Detecting Locus- Specific Mutations Induced with TALENs in the Zebrafish Genome. PLoS Genet. 8 (8), e1002861 (2012).
- Ramlee, M. K., Yan, T., Cheung, A. M., Chuah, C. T., Li, S. High-throughput genotyping of CRISPR/Cas9-mediated mutants using fluorescent PCR-capillary gel electrophoresis. Sci Rep. 5, 15587 (2015).
- Bhattacharya, D., Marfo, C. A., Li, D., Lane, M., Khokha, M. K. CRISPR/Cas9: An inexpensive, efficient loss of function tool to screen human disease genes in Xenopus. Dev Biol. 408 (2), 196-204 (2015).
- Yu, C., Zhang, Y., Yao, S., Wei, Y. A PCR Based Protocol for Detecting Indel Mutations Induced by TALENs and CRISPR/Cas9 in Zebrafish. PLoS ONE. 9 (6), e98282 (2014).
- Mock, U., Hauber, I., Fehse, B. Digital PCR to assess gene-editing frequencies (GEF-dPCR) mediated by designer nucleases. Nat Protoc. 11 (3), 598-615 (2016).
- Varshney, G. K., et al. High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9. Genome Res. 25 (7), 1030-1042 (2015).
- Shi, J., Wang, E., Milazzo, J. P., Wang, Z., Kinney, J. B., Vakoc, C. R. Discovery of cancer drug targets by CRISPR-Cas9 screening of protein domains. Nat Biotechnol. 33 (6), 661-667 (2015).
- Koebernick, K., Loeber, J., Arthur, P. K., Tarbashevich, K., Pieler, T. Elr-type proteins protect Xenopus Dead end mRNA from miR-18-mediated clearance in the soma. Proc Natl Acad Sci USA. 107, 16148-16153 (2010).
- Yang, J., Aguero, T., King, M. L. The Xenopus maternal-to-zygotic transition from the perspective of the germline. Curr Top Dev Biol. 113, 271-303 (2015).
