Summary
Gene überlebensnotwendig stellen technische Hürden für die Erstellung von mutierter Linien. Leap Frogging umgeht Letalität durch die Kombination von Genom-Bearbeitung mit Keim Urzelle Transplantation Wildtyp Tiere Keimbahn-Mutationen zu erstellen. Leap Frogging erlaubt auch die effiziente Erzeugung von homozygot null Mutanten in der F-1 -Generation. Hier wird die Transplantation Schritt demonstriert.
Abstract
Die Schaffung von mutierten Linien von Genom-Bearbeitung beschleunigt genetische Analyse in vielen Organismen. CRISPR/Cas9 Methoden wurden für den Einsatz in der afrikanischen krallenbewehrten Frosch, Xenopus, langjährige Modellorganismus für die biomedizinische Forschung angepasst. Klassische Züchtung Regelungen für die Erstellung von homozygoter Mutante Linien mit CRISPR/Cas9-gezielte Mutagenese haben mehrere zeitaufwändige und mühsame Schritte. Zur Erleichterung der Schaffung von mutierten Embryonen, besonders um die Hindernisse, die Gene, die für die Embryogenese, ausschlagen zugeordnet wurde eine neue Methode namens Leap Frogging entwickelt. Diese Technik nutzt die Robustheit des Xenopus Embryonen "Ausschneiden und einfügen" embryologischen Methoden. Leap Frogging nutzt die Übertragung der primordialen Keimzellen (PGCs) aus effizient mutagenisierter Spender Embryonen in PGC abgetragen Wildtyp Geschwister. Diese Methode ermöglicht die effiziente Mutation des wesentlichen Gene durch die Schaffung von Chimären Tiere mit Wildtyp-Körperzellen, die ein mutiertes Keimbahn tragen. Wenn zwei F0 Tiere tragen "leapfrog Transplantationen" (d. h. mutierten Keimzellen) sind intercrossed, sie produzieren homozygote oder compound heterozygote, null F1 Embryonen, spart eine ganze Generationszeit, phänotypische Daten zu erhalten. Leap Frogging bietet auch einen neuen Ansatz für die Analyse von mütterlicher Effekt Gene, die refraktär gegenüber F0 phänotypische Analyse nach CRISPR/Cas9 Mutagenese sind. Dieses Manuskript beschreibt die Methode der Leap Frogging, mit besonderem Schwerpunkt auf PGC Transplantation erfolgreich durchführen.
Introduction
Wie Genotyp Phänotyp kodiert wurde eine wichtige Frage in der Biologie seit der Wiederentdeckung der Mendelschen Regeln. Ein Verständnis für die Rolle der Gene, deren Regulation und Interaktionen innerhalb von Gen-Netzwerken und die Funktionen der codierte Produkte versprechen die Werkzeuge für Aufdeckung neue Biologie und bessernde Krankheitszustände. Mehr als die Hälfte ein Jahrhundert1seit der afrikanischen krallenbewehrten Frosch, Xenopus, eine führende Modell für Studien zu den unterschiedlichsten Themen in grundlegende Biologie und Biomedizin, einschließlich die genetische Kontrolle der Entwicklung. Historisch hat die meiste Forschung auf Xenopus Allotetraploid Frosch, laevis, verwendet aber in jüngerer Zeit, aufgrund seiner Diploidie X. tropicalis wurde entwickelt als Amphibien genetisches Modell. Vollständige Genomsequenzen sind von beiden Xenopus Arten2,3zusammengestellt. Die "Frog-Community" ist jetzt an einem Wendepunkt angelangt wo ermöglicht grundlegende Genom Änderung Technologie das Studium der Genfunktion, praktisch nach Belieben. Programmierbare CRISPR/Cas9 jedoch haben die Mutagenese von Genen hocheffizient mit biallelische Mutationen möglich in den meisten Zellen der Tier4,5,6,7gemacht, 8,9,10,11. Diese Studien, untermalt von Bhattacharya Et al. 12 und Shigeta Et al. 13, haben gezeigt, dass die Funktion vieler Gene durch Mutagenese in F0 Mosaik Tiere untersucht werden kann. Dieser Ansatz hat viele Vorteile; Cas9-SgRNA-mikroinjiziert Embryonen werden jedoch oft Variable Phänotypen aufgrund unvollständiger Funktionsverlust (LOF) angezeigt. Noch bedeutsamer ist, die Generation der mutierten Linien ist ein großer Vorteil für einige Anwendungen – insbesondere bei der Gene, die einen mütterliche mRNA-Beitrag zu studieren. Mütterliche mRNAs und Proteine und ihre Einflüsse auf die Epigenetik, bleiben über einen längeren Zeitraum in Embryogenese14,15,16, Darstellung der frühen Entwicklungsstörungen Beiträge vieler Gene feuerfeste F0 Analysen. Daher sind andere LOF Ansätze erforderlich.
Bei der Suche nach mutierten Linien zu erstellen, muss der Pfad auf die Erlangung von homozygot LOF Embryonen mehrere Hindernisse. Erste, effiziente Mutagenese biallelische Mutationen produzieren kann nachteilig sein, weil Verlust von wesentlichen Genfunktionen scheitern, Geschlechtsreife, stören die Herstellung einer tragfähigen Linie überleben führt. Eine gemeinsame Lösung ist die sorgfältige Titration der Höhe der Cas9-SgRNA geliefert. Hier ist das Ziel, ein Gleichgewicht zwischen reduziert Letalität bei gleichzeitiger Maximierung der Keimbahn Mutagenese Effizienz auch. Ein zweites Problem ergibt sich aus der standard Zucht-Schema, wo phänotypische Analysen bis F-2 -Generation aufgeschoben. Mit dem standard-Ansatz, sexuell Reifen Sie F0 Tiere, die Mutante zu übertragen, die Allele durch die Keimbahn outcrossed sind zur Herstellung F1 heterozygote "Träger", die dann zur Geschlechtsreife angebaut werden. Zwei F-1 -heterozygot sind dann intercrossed, um F2 mutierten Embryonen mit einer erwarteten Mendelian Frequenz von 25 % zu produzieren. So sind zwei Generationen der Zucht notwendig für die Analyse der Mutanten Phänotypen. Mutierte Tiere könnte entweder homozygoten oder compound-heterozygot (d. h. nachkommen, enthält zwei verschiedene mutierten Allele, die abhängig von der Genotypen der Elterntiere in der F1 Intercross verwendet).
Diese Hindernisse können überwunden werden, durch die Beschränkung programmierbare Nuklease-vermittelten Mutagenese, Keimzellen, die eine neue Methode namens sprunghaften17zugrunde liegt. Leap Frogging besteht aus zwei Hauptkomponenten: (1) die Mikroinjektion von Cas-mRNA zusammen mit SgRNA oder Nuklease-SgRNA-komplexe (oder, im Prinzip, TALENs oder Zink-Finger-Nukleasen) Zeitpunkt der einzelligen effizient embryonale Genom mutagenize, gefolgt von (2) die Transplantation von PGCs auf Wildtyp Geschwister Embryonen, wo die endogenen PGCs entfernt wurden. Wenn beide Schritte sind effiziente und vollständige Keimbahn-Ersatz mit mutierten Keimzellen erhalten. Blackler bewiesen in den frühen 1960er Jahren, dass Xenopus PGCs zwischen den Embryonen im späten Neurula und frühen Tailbud Stufen18,19transplantiert werden konnte. Für Leap Frogging, wurde Blacklers Ansatz modifiziert durch Ausführen der Transplantationen im Blastozystenstadium Stufe17, wenn PGCs im Vegetal Pol der Embryo20,21lokalisiert sind. Transplantation vor Gastrulation hat zwei wesentliche Vorteile. Zunächst fand das Engraftment Transplantationen und die anschließende normale Entwicklung effizienter sein, wenn die Transplantation im Blastozystenstadium (unveröffentlichte Beobachtungen) durchgeführt wird. Zweitens durch Blastozystenstadium Transplantationen durchführen, kurz nachdem zygotic Transkription begonnen hat, vermeiden man die Letalität aus Entwicklungsstörungen Gen-Mutationen, die Gastrulation oder das stören sonst zu fehlerhaften späten Neurulae führen. PGC Transplantation-Lager ("leapfrogged") Embryonen sind gewachsen, Geschlechtsreife und Intercrosses zwischen diesen F0 Tieren haben gezeigt, dass in vielen Fällen 100 % der F-1 -Nachkommen den LOF-Phänotyp (die meisten werden zusammengesetzte anzeigen Heterozygoten), komplette Keimbahn Ersetzung durch gezielte Mutationen angibt.
Es wird erwartet, dass Leap Frogging gentechnische Ansätze im Xenopusbeschleunigen wird. Leap Frogging bietet auch eine Alternative zu den "host-Transfer" Methode22 für die LOF-Analyse von Genen mütterlicherseits-Effekt (unveröffentlichte Beobachtungen). In der aktuellen Publikation präsentiert eine detaillierte Beschreibung der Methode, vor allem mit Schwerpunkt auf PGC Transplantation, in X. tropicalis (mit geringfügigen Änderungen für laevis). Die Transplantation von PGCs beweist hier um einen schnelleren Transfer dieser Technologie an andere Laboratorien arbeiten mit Xenopuszu erleichtern. Die Prinzipien dieser Methode sollte erfolgreich in anderen Amphibien (z.B. Urodeles) und Organismus-spezifische Änderungen in der Methodik dürfen für die Anwendung auf vielen anderen Tieren, die in der effizienten Mutagenese erreicht werden kann und PGCs sind leicht transplantierbaren.
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Protocol
Alle hier beschriebene Methoden wurden von der institutionellen Animal Care und Verwendung von der University of California, Irvine genehmigt.
1. Vorbereitungen für PGC-Transplantation
- Dissektion Werkzeuge als zuvor beschriebenen23im Voraus vorbereiten.
Hinweis: Augenbrauen Haare Messer dienen dazu, Einschnitte mit Hilfe einer Haar Schleife um den Embryo zu stabilisieren, während der Durchführung der Operationen zu machen. Augenbrauehaare Haare Schleifen in Borosilikatglas Pasteur Pipetten, die zuerst in eine Flamme gezogen wurden eingeklebt und sind auf den ausgedünnten Teil gebrochen (siehe Abbildung 1A, Pfeilspitze) erstelle ich eine kürzere, schmalere Spitze (Abbildung 1 b) für größere Geschicklichkeit Wenn Operationen durchführen. - SgRNAs mit Verfahren beschriebenen24 zu generieren.
Hinweis: Kurz, kurze DNA-Templates, die Codierung für SgRNAs entstehen mit überlappenden Deoxyoligonucleotides mit 5' Bakteriophagen T7 Promotoren, die getempert werden und "ausgefüllt" durch eine fehlerfreie, thermostabile DNA-Polymerase. In-vitro- SgRNA Synthesereaktionen sind für mehrere Stunden (je nach dem Kit verwendet) über Nacht inkubiert. Reaktionen sind DNAse behandelt, um die Vorlage zu entfernen. Die SgRNAs sind durch Standardmethoden Phenol/Chloroform Extraktion und Ammonium Acetat/Isopropanol Niederschlag, nach der Kit-Hersteller Anweisungen24gereinigt. - Kurz vor der Durchführung Mikroinjektionen, bereiten Cas9-SgRNA-komplexe durch erste denaturierenden ~ 250 ng der SgRNA in einem Gesamtvolumen von 3 µL RNAse-freie (Diethylpyrocarbonate-behandelt) H2O bei 60-65 ° C für 5 min, gefolgt von schnellen Kühlung für 5 min auf Eis. Zentrifugieren Sie die SgRNA für ein paar Sekunden, fügen Sie 1 µL 1 µg/µL Cas9 Eiweiß hinzu und inkubieren Sie für 10 min bei 37 ° C, Komplexbildung zu fördern.
Hinweis: Im Anschluss an diese Inkubation kann das Rohr auf Eis gehalten werden, während der Vorbereitung der Embryonen für die Mikroinjektion. - X. tropicalis Embryonen durch in-vitro- Befruchtung mit Standardmethoden, wie zuvor beschrieben25zu erhalten. De-Gelee25,26 die Embryonen im 10 min nach Befruchtung.
Hinweis: Befruchtung Zeit gilt die Zeit nach die Sperma-Suspension mit den Eiern hinzugefügt wird und die Schüssel überschwemmt mit 1/9thX ist Marcs geändert Klingeltöne (MMR)26. Für X. tropicalis25, im Gegensatz zu laevis, führen Sie die de-Gelier-in 1/9 X MMR mit 3 % Cystein freie Base (nicht das HCl-Salz), pH 7,8-8,0 angepasst folgten mehrere Wäschen in 1/9 X MMR. Transfer der Embryonen nach einer Agarose (1 %)-beschichtete Schale mit 1/9 X MMR bei Raumtemperatur. - Sofortüberweisung die Embryonen injiziert werden, um eine 1 % Agarose-beschichtete Schale mit 1 X MMR mit einer Pasteurpipette.
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Spritzen Sie im 1-Zell-Stadium. Siehe Referenzen26,27 für detaillierte Beschreibungen der Xenopus Mikroinjektion Methoden.
- Jeder Embryo an einem einzigen Standort in der Tier-Pole, mit 4 Spritzen nL Cas9-SgRNA-Komplex (Endbetrag = 1 ng von Cas9 und ~ 250 Pg SgRNA; siehe die Diskussion)24. Nach 10-20 min der Injektion Website Heilung, transfer der Embryonen zu einer Agarose-beschichtete Schale mit 1/9 X MMR und inkubieren Sie bei 25 ° C. Auch erstellen Sie eine Schüssel mit uninjected Geschwister Embryonen, die als Transplantat-Empfänger dienen wird.
-
Bereiten Sie Petri Platten (60 mm), die enthalten eine ~ 5 mm-dicke Schicht von 1 % Agarose in 0,3 gemacht X MMR, wenn Transplantationen in X. tropicalisoder 1 X MMR für laevis.
- Erstellen Sie Depressionen ~ 3-4 mm tief durch das Einfügen eines 3-x 4-Well Schimmel (erstellt durch das Schneiden einer 96-Well-PCR-Platte) in der geschmolzenen Agarose, wenn die Platten Gießen (siehe Abbildung 1 und D). Halten Sie die Form einige Millimeter über dem Boden der Petrischale mit einer Schelle befestigt an einem Ring-Ständer, bis die Agarose verhärtet hat.
- Stellen Sie außerdem eine 24-Well-Platte zu Haus einzelnen Embryonen durch die Beschichtung der Brunnen mit einer dünnen Schicht von 1 % Agarose Baujahr 1/9 X MMR.
Hinweis: Das Kulturmedium hinzugefügt, um diese Brunnen ist 1/9 X MMR mit 50 µg von Gentamycin Sulfat/mL ergänzt.
2. Transplantation von PGCs
- Wenn die Embryonen erreichen nur Nieuwkoop und Faber28 Blastozystenstadium 9 (Abb. 2A), ~4.5-h nach Befruchtung (hpf) für X. tropicalis, entfernen Sie sie aus dem Inkubator 25 ° C und es ihnen ermöglichen, auf Raumtemperatur für eine zusätzliche equilibrate 0,5 h.
- Die Transplantation bei 5 beginnen hpf (Abb. 2 b), mithilfe einer Pasteurpipette eine PGC-Spender-Embryo (injiziert mit Cas9-SgRNA) übertragen, die 60 mm-Agarose-Schale mit Depressionen (erstellt in Schritt 1,7) in 0,3 X MMR (oder 1 X MMR wenn laevisverwenden). Auch ein uninjected Geschwister Embryo, der Transplantat-Empfänger, um dieses Gericht zu übertragen.
Hinweis: Es ist wichtig, dass die Identität eines jeden dieser Embryonen nicht verwechselt werden. - Manuell entfernen Sie die Dotterhäutchen Umschläge von jedem Embryo mit Pinzette und drehen Sie beide Embryonen zu, so dass ihre Vegetal Pfosten in Ansicht und für Chirurgie zugänglich sind.
Hinweis: Eine Beschreibung der manuellen de-Vitellination von Embryonen wurde zuvor beschriebenen26. - Mit der scharfen Spitze eine Augenbraue Haare Messer, stellen Sie vier flache Einschnitte in der Form eines Quadrats auf den Vegetal Pfosten des Empfängers Embryos innerhalb der Zone, wo zukünftige Flasche Zellen, die die Blastopore markieren bilden werden. Stellen Sie die Einschnitte durch die Spitze des Messers Augenbrauen Haare in den Embryo, knapp unterhalb der Oberfläche, und stellen nach oben schneiden Bewegungen während der Stabilisierung des Embryos mit der Haar-Schleife einfügen.
Hinweis: Abbildung 2 zeigt pflanzliche Ansichten eines Embryos im Halbstunden-Takt von 4,5-7,0 hpf, die Zellengröße zu zeigen und bieten eine Anleitung für die Schätzung, wo die Flaschen-Zellen (gestrichelte weiße Kreis) bilden werden. Das Ziel ist es, Einschnitte zu machen, wo die gestrichelte Black-Box angezeigt. - Sobald die vier Seiten des Platzes durch Ritzlinien abgegrenzt sind, vertiefen Sie jeder Schnitt mit dem Augenbrauen Haare Messer mit ähnlichen schneiden Bewegungen um zu eine Tiefe von ca. 1/3 bis 1/2 der Abstand zum Blastocöl Boden zu erreichen.
- Frei von pflanzlichen Gewebe Explant vom Empfänger Embryo (Abbildung 3A und B) indem man eine horizontale (parallel zur pflanzlichen Oberfläche) Cut(s) in der Tiefe pflanzlichen Region.
Hinweis: Die Größe der PGC-haltigen pflanzlichen Explant ist ca. 0,4-0,45 mm pro Seite und 0,25-0,3 mm in die Tiefe. Diese pflanzlichen Explant vom Empfänger Embryo wird nicht mehr benötigt und daher aufzuheben verworfen werden. - Arbeiten schnell, wiederholen Sie diesen Vorgang (Schritte 2.4-2.6) auf der PGC Spender Embryo um ein Fragment der ähnlich großen pflanzlichen Gewebe für Transplantationen zu erstellen.
Hinweis: Es ist wichtig für die Durchführung dieser zweiten Dissektion mit etwas Verspätung zur Minimierung der Zeit für den Empfänger Embryo um seine Wunde zu heilen. - Sobald das Gewebe mit PGCs vom Spender Embryo entfernt wird, verwenden Sie die Augenbrauen Haare Messer und Haar Schleife dieser modellabhängigen in Position in die im Empfänger Embryo entstandene Öffnung bewegen.
Hinweis: Die innere Oberfläche des Transplantats Spender muss das Innere des Empfängers Embryos zeigen. Es ist nicht notwendig, entsprechend die Leitlinien der dorsal-Ventral und rechts-links-Achse des Transplantats mit dem Empfänger Embryo. - Das Transplantat in die Öffnung in der pflanzlichen Oberfläche des Empfängers Embryos sanft drücken Sie mit der langen Kante des Schachtes der Augenbraue Haare Messer, statt parallel zur Oberfläche des Transplantats.
- Sobald das Transplantat gelegt wurde, verwenden Sie eine Hairloop oder die Welle eine Augenbraue Haare Messer um zu schieben "Rohbau" des Embryos Spender über die Agarose-Oberfläche und in einer Agarose-Depression. Stellen Sie sicher, dass die offene Wunde der Karkasse die Masse Flüssigkeit gegenübersteht. Wenn dies nicht der Fall ist, verwenden Sie die Augenbrauen Haare Messer um zu drehen, den Embryo um diese Ausrichtung zu erreichen.
- Schieben Sie den Empfänger Embryo mit der Transplantation Heilung im Ort, in einem angrenzenden Depression und ebenso darauf achten Sie, dass das veredelte Vegetal Pole Gewebe die Masse Flüssigkeit gegenübersteht.
- Wiederholen Sie diesen Vorgang (Schritte 2.1-2.11) über ein weiteres paar von Spender und Empfänger Embryonen erstelle ich eine weitere Transplantation/Karkasse paar; übertragen Sie diese zu leeren Depressionen.
Hinweis: Es ist wichtig, dass man Notationen zu behalten paarweise von Schlachtkörpern und Transplantation tragenden Embryonen macht. Die Spender-Kadaver werden als Proxy verwendet werden, für die Effizienz der Cas9-SgRNA-induzierte Mutagenese in den transplantierten PGCs, die leicht untersucht werden kann nicht, bis die Transplantation tragenden Tiere die Geschlechtsreife erreichen (s.u. Schritt 3.3, und die Diskussion ). - Weiter Transplantationen zu machen, bis die Embryonen etwa frühen Gastrula-Stadium 10, erreichen die etwa 6,5 hpf in X. tropicalis (siehe Abbildung 2E).
3. Post-Heilung Pflege von Embryonen
Hinweis: Transplantationen heilen innerhalb von ~ 30 min einrastet, und es ist normal, dass einige yolky Trümmer aus Zelle Lysis strahlt aus dem Embryo (Abbildung 3) zu beobachten.
-
Sobald geheilt, verwenden einer Pasteurpipette sehr sanft Transfer Embryonen aus den Vertiefungen zu einzelnen Wells eine Agarose-beschichteten 24-Well-Platte. Das Exsudat werden (Abbildung 3D) durch Flüssigkeit mischen während der Übertragung entfernt.
- Drehen Sie die Embryonen, so dass sie pflanzliche-polig, mit Blick auf die Bulk-Lösung gelegt werden. Wieder, legen Sie die Spender-Kadaver und Transplantat-Empfänger im benachbarten Brunnen, bei der Verfolgung der Embryo Paare; Zeichnen Sie diese Informationen.
- Übertragen Sie die 24-Well-Platte mit Embryonen bis 25 ° C-Inkubator für Übernachtung Kultur.
Hinweis: Am nächsten Tag die Embryonen werden Tailbud Stufen erreicht haben. - Verschieben Sie die Transplantat-Empfänger zu reinigen Agarose-beschichteten 6-Well-Platten mit 1/9 X MMR mit 50 µg von Gentamycin Sulfat/mL, mit 1 Embryo pro Bohrloch ergänzt. Pflegen Sie einen klaren Datensatz der Spender Schlachtkörper, die diese entsprechen Transplantat-Empfänger.
- Bewerten Sie Mutagenese Effizienz durch Sequenzierung PCR Amplifikate5,17,24 oder mit anderen Methoden, die auf PCR Amplifikate verlassen (siehe Diskussion), bewegen Sie einzelne Schlachtkörper nach 0,2 mL PCR-Streifen Röhren Entfernen Sie die meisten des Mediums und homogenisieren in 100 µL Lyse Puffer24 mit Proteinase K (PK) durch wiederholte wechselvollen Pipettieren mit einer Pipette P200.
- Führen Sie Embryo Lyse24 bei 56 ° C für 6 h über Nacht um PK Verdauung zu ermöglichen. PK zu inaktivieren, durch Erhitzen auf 90-95 ° C für 10 min, gefolgt von schnellen Abkühlung auf 4 ° C. Verwenden Sie Lysates ohne weitere Bereinigung Schritte der PCR-Reaktionen zu kurzen Amplifikate für direkte DNA Sanger-Sequenzierung24säen. Speichern der Lysates bei-20 ° C.
Hinweis: Innerhalb von einigen Tagen die Kaulquappen erreichen Fütterung Stadien (etwa Stufe 45-46) und eine Aussetzung der planktonischen Pulver (Sera Micron) eingespeist werden können. - Bewegen Sie nach ~ 1 Woche mit täglichen Änderungen Kulturmedium Sauberkeit und mikrobielle Überwucherung zu minimieren Kaulquappen zu kleinen Tanks in einer zirkulierenden aquatischen System mit Tropf-Fluss. Verwenden Sie die Sequenzierungsdaten Kaulquappen mit hocheffizient mutagenisierter PGCs von Kaulquappen mit geringerer Mutagenese Effizienz zu trennen. Sobald die Metamorphose abgeschlossen ist, die Froglets zum Bewegen der Erwachsenen aquatischen Systems im Labor
Hinweis: Therapien entwickelt, von der nationalen Xenopus -Ressource (Marine Biology Laboratory Woods Hole, MA) bieten einen Leitfaden für Kaulquappe Fütterung29 und Erwachsenen Frosch Wartung30.
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Representative Results
Nach Transplantation sollte die qualitative Bestimmung der Wirksamkeit von CRISPR/Cas9 Mutagenese vor Aufwendung den Aufwand bei der Tierhaltung zu wachsen und pflegen die Tiere zur Geschlechtsreife durchgeführt werden. Weil Tiere tragen Leapfrog Transplantationen somatisch Wildtyp sind und Keimbahn für direkte Messungen schwer zugänglich ist, wird das speichern die Kadaver von Spender-Embryonen wichtig. DNA-Analyse aus Kadavern dient als Proxy für den Umfang der Mutagenese, die in den transplantierten Keimbahn17auftritt.
Ein Ansatz, um den Erfolg der Mutagenese beurteilen soll direkt Sequenz PCR Amplifikate überspannt die genomische Region angestrebt. Dies wird besonders kostspielig und ineffizient, wenn man Wünsche um zahlreiche individuell geklonte DNA-Fragmente von vielen Tieren zu sequenzieren. Stattdessen Sequenzierung Amplifikate heterogenen an die Ziel-Site, wie sie von genetisch Mosaik Embryonen abstammen dient zur Mutagenese Effizienz in jeder Embryo19Bewertung. Visualisierung der Chromatogramme zeigt der Wildtyp-Sequenz (Peaks) stromaufwärts des Ziels Sequenz und Spitzen werden "verschlüsselt" (d. h. das gleichzeitige Auftreten von Gipfeln, mehrere Basen erscheint an jedem Nukleotid-Position entspricht) nachgeschaltet der Standort des Cas9-katalysierte Doppel-Strang brechen. Beispiele für solche Profile finden Sie in Abbildung S1 der Blitz Et Al. 17. genaue Quantifizierung des Ausmaßes der Mutagenese vertreten durch diese verschlüsselten Spitzen erhalten Sie mit einer Sequenz Zersetzung Algorithmus, TIDE (https://tide-calculator.nki.nl/)31. Screening von einzelnen Embryonen, die mit dieser Technik gibt Zuversicht, dass jeder Embryo war richtig injiziert und für Mutagenese gezielt. Eine Tracer, z. B. ein Eindringmittel tagged Dextran kann verwendet werden, um erfolgreiche Injektion24 bestätigen und kann auch Hilfe bei der Feststellung, dass eine Kaulquappe in der Tat das transplantierte Gewebe (unveröffentlichte Daten trägt). Es ist wichtig zu beachten, dass die formale Möglichkeit, dass die Coinjektion von einem fluoreszierenden Dextran zusammen mit Cas9-SgRNA Cas9 Mutagenese Effizienz verändern könnten nicht erforscht worden ist. Alle "leapfrogged" Embryonen mit Transplantationen von schlecht oder unmutagenized Spendern können verworfen werden.
Leap Frogging umgeht die Notwendigkeit F2 Generation Analyse in standard genetischen Zucht-Systeme, durch effiziente phänotypische Analysen in der F-1 -Embryonen erlaubt. Wenn die Standardtherapie mit wesentlichen Gene mutieren, ist sorgfältige Titration von Cas9-SgRNA-Dosis erforderlich, um die Lebensfähigkeit der Embryonen Gründer, was zu einer reduzierten Mutagenese-Effizienz gewährleistet. F0 zu überleben sind Tiere aus diesem standard Schema dann outcrossed mit Fitnessverlust, F1 Embryonen, erwirken durchleuchtet werden, um Träger zu identifizieren. Schließlich sind diese F-1 -heterozygot gewachsen, Geschlechtsreife und intercrossed um homozygot F2 Personen anzeigen mutierte Phänotypen zu erhalten. Im Gegensatz dazu erzeugt, da produziert Tiere überspringen, die den Komplettaustausch von ihren Germlines mit mutierten Allele haben, intercrossing F0 Tiere mutierte Phänotypen in der F-1 -Generation. Blitz Et al. 17 berichtet, dass eine Mehrheit der F0 Tiere richtet sich an die Tyrosinase (Tyr) Locus, der für die Pigmentierung der Melanozyten und Netzhaut benötigt, 100 % Germline Übertragung zeigte (gemessen durch Auskreuzung mit Tyr- / - Albino Tiere) der Spender abgeleitet mutierten Genome (siehe Abbildung 4A-B und Tabelle 1). So würden zwei Tiere produziert von Leap Frogging kreuzende homozygote oder compound heterozygote mutierte F1 Embryonen führen.
Ähnliche Ergebnisse wurden17 durch kreuzende F0 übersprungen Tiere tragen Mutationen in der Homeobox (Kodierung der DNA-Bindung Homeodomäne) des Gens Goosecoid (gsc) (siehe Abbildung 4A, C-H). Niederschlägen von Gsc-Ausdruck mit Hilfe Morpholino antisense Oligonukleotide in laevis vorgeschlagen, dass der gsc -gen notwendig für die Komplettentwicklung von der vorderen Kopf32 ist, und Cas9-SgRNA Kaulquappen auch zeigen injiziert embryonalen tödliche Phänotypen17. Jedoch, leapfrogged F0 Tiere, als somatisch Wildtyp, sind tragfähig und robust, und F1 Intercross produziert Embryonen mit identischen LOF Phänotypen, die im laevis Niederschlägen17veröffentlicht. Diese Angaben genetische Bestätigung der Morpholino Phänotypus, sowie ein Nachweis der Grundsatz, dass Leap Frogging kann verwendet werden, um embryonale tödliche Phänotypen zu überwinden.
Abbildung 1: benötigte Materialien für Transplantationen. (A) Borosilikatglas Pasteur Pipetten verwendet werden, um die Augenbrauen Haare Messer und Haare machen Schleifen für Mikrochirurgie am frühen Embryo. Zeichnung aus dem Glas mit dem Bunsenbrenner ermöglicht eine schmalere Ende für die Einfügung des Haares. Der rote Pfeil markiert die ungefähre Position, an der das Glas zerbrechen. (B) ein Beispiel für eine Augenbraue Haare Messer (oben) und Haar Schleife (unten), in Pipetten mit schnell trocknenden Kleber fixiert. (C) A Teil einer 96-Well-PCR-Platte wird verwendet, um Depressionen in eine Agarose-Platte zu erstellen, dadurch, dass die 1 % Agarose, um die Form zu festigen (Agarose erfolgt in 0,3 x oder 1 X MMR, je nachdem, ob die Transplantationen in X. tropicalis ausgeführt werden oder laevis, beziehungsweise). Die Dicke der Agarose ist ~ 5 mm, mit 3-4 mm-tiefe Brunnen. (D) ein Beispiel für eine Agarose-Platte für die Transplantation, mit 12 Vertiefungen, wie in Feld Cgezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Morphologie der Vegetal Stange während der späten Blastula frühen Gastrula-Stadium und die Strategie für die Dissektion. (A-F) Xenopus Tropicalis Embryonen sind in pflanzlichen Ansicht Halbstundentakt zeitversetzt, ab Blastozystenstadium 9 angezeigt (4.5 hpf) zur frühen Gastrula-Stadium-~10.25 (7 hpf). Vor 5 hpf, Blastomeren sind groß und leicht beschädigt. Die weiße gestrichelte Kreis markiert die erwartete Position der Flasche Zellbildung während Gastrulation, die Bildung von Anfang an der dorsalen Seite (oben) in Platten (E und F) gesehen werden kann. Für Leap Frogging, vier Einschnitte werden innerhalb eines Quadrats, von schwarzen gestrichelten Linien dargestellt, mit einer abschließenden Schnitt gemacht Parallel zur Oberfläche des Gewebes (nicht dargestellt), die pflanzlichen Explant zu befreien. Maßstabsleiste = 400 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Transplantation. (A) ein Beispiel für eine ~5.5 hpf Embryo nach der Entfernung des PGC-haltigen pflanzlichen Gewebes. Die schwarz gestrichelte Feld und weiß gestrichelter Kreis sind die gleichen relativen Dimensionen wie in Abbildung 2gezeigt. (B) die pflanzlichen Explant entfernt vom Embryo im Bedienfeld "A," innere Oberfläche, die dem Betrachter zugewandt ist ca. 0,4-0,45 mm pro Seite und 0,25-0,3 mm in die Tiefe. (C) ein Embryo mit dem transplantierten pflanzlichen Gewebe. Das Bild wurde ca. 10 min nach der Transplantation aufgenommen. (D) 30 min nach der Transplantation, die pflanzlichen Gewebe sieht einrastet (sanfte Verwirbelung mit einem Augenbrauen Haare Messer oben, die Embryos verwendet wurde, um einen Strudel zu erstellen, der die Trümmer gesehen im Bedienfeld " C" weggefegt) geheilt haben. Nach Übertragung auf 1/9 x MMR und Inkubation bei 25 ° C runden die meisten Embryonen normalerweise Gastrulation. Maßstabsleiste = 400 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Germline Übertragung von F0 Tieren produziert von Leap Frogging. (A) für Leap Frogging, wurden zwei Gene gezielt durch CRISPR/Cas9, Tyrosinase (oben) und Goosecoid (unten). Tyr -Gens wurde gezielt4,5 in die kodierenden Sequenzen (blaue Schattierung) für eine N-terminalen Signalpeptid (SP, rote Schattierung), während die gsc -gen gezielt17 innerhalb der Sequenz bei Codierung der Beginn der Homeobox (rote Schattierung), die beiden Exons aufgeteilt. Nicht übersetzte 5' und 3' exonic Regionen sind nicht schattierten. (B) alle 160 F1 Kaulquappen aus (siehe auch Tabelle 1) eine Verpaarung von einem leapfrogged F0 männlich (LF1) und ein Albino (Tyr-/-) weibliche Albino, darauf hinweist, dass die gesamte Keimbahn aus das leapfrogged Männchen hatten wurden mit Tyr mutierten Keimzellen ersetzt. Der Inset zeigt eine Wildtyp Kaulquappe mit normalen Pigmentierung der Netzhaut und Melanozyten. (C-H) F1 Embryonen abgeleitet von einer Intercross zwischen zwei F0 übersprungen Xenopus Homeobox Gene targeting gsc. Etwa 2/3rds der Embryonen wurden phänotypisch mutierte für gsc, der Phänotyp, wobei unterschiedliche Grade der vorderen Abschneiden des Kopfes (E-H). Die Hälfte der Mutanten waren entweder zyklopischen oder hatten eng beieinander liegender Augen (F), während die andere Hälfte waren augenlosen (H). Genotypisierung zeigten diese homozygoten oder compound-heterozygot sein. 1/3rd Embryonen zeigen Wildtyp Phänotyp (C, D) waren entweder homozygoter Wildtyp oder Heterozygoten. In Situ Hybridisierung für otx2 (eine Markierung des Vorderhirns, Mittelhirn und Augen), egr2 (ein Marker für Hinterhirn Rhombomeres 3 und 5, und ein Strom der Neuralleiste) und hoxb9 (eine Markierung des Rückenmarks) zeigt, dass der Verlust des GSC Funktion wirkt sich nur den vorderen Teil des otx2 -Bereichs. Diese Daten werden von Blitz Et Al. reproduziert. 17 mit freundlicher Genehmigung von der Firma Biologen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Kreuz | Männlich | Weiblich | Albino | Wildtyp | Insgesamt | % Albino |
| 1 | LF1 | Tyr-/- | 160 | 0 | 160 | 100 |
| 2 | LF2 | Tyr-/- | 148 | 0 | 148 | 100 |
| 3 | Tyr-/- | LF3 | 409 | 0 | 409 | 100 |
| 4 | Tyr-/- | LF4 | 0 | 519 | 519 | 0 |
| 5 | Tyr-/- | LF5 | 223 | 0 | 223 | 100 |
| 6 | LF6 | Tyr-/- | 493 | 703 | 1196 | 41,2 |
| 7 | Tyr-/- | LF7 | 1 | 94 | 95 | 1.1 |
| 8 | Tyr-/- | LF8 | 125 | 0 | 125 | 100 |
| 9 | Tyr-/- | LF9 | 0 | 417 | 417 | 0 |
| 10 | Tyr-/- | LF10 | 252 | 0 | 252 | 100 |
Tabelle 1: Effiziente Keimbahn Ersatz von Leapfrog Transplantationen mit Mutationen im Tyrosinase. Targeting Tyrosinase, Transplantation tragenden Tiere beider Geschlechter stammen. Diese Tiere wurden mit Albinos, gekreuzt, die homozygot Tyr- / -, zum Testen für die Effizienz der Keimbahn-Übertragung von mutierten Allelen und den Prozentsatz der die F-1 -Embryonen, die zeigte, dass Albinismus bei der Kaulquappe untersucht wurde. Einträge in den Spalten mit der Bezeichnung "Männlich" und "Weiblich" angeben, welcher Elternteil entweder Tyr- /- oder das Versuchstier sprunghaften (LF) abgeleitet ist. Prozent der Embryonen in ein Kreuz mit der Albino Phänotyp werden unter "% Albino." angezeigt Beachten Sie, dass 6 von 10 Tieren mit Leapfrog Transplantationen Komplettaustausch (100 %) mit mutierten Allele zeigte. Diese Tabelle wird vom Blitz Et Al. reproduziert. 17, mit freundlicher Genehmigung.
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Discussion
Dieser Bericht enthält ein detailliertes Protokoll für die Transplantation von pflanzlichen Gewebe mit PGCs. Transplantation PGCs in Verbindung mit Genom-Bearbeitung Technologien (z. B. CRISPR/Cas9) verwendet, um die Keimbahn ändern eines Tieres während fast alle seiner somatischen Gewebe aufrechtzuerhalten als genetisch Wildtyp. Für Leap Frogging um erfolgreich zu sein, gibt es eine Reihe von kritischen Faktoren, die vor der Durchführung darstellender Transplantationen.
Um den Komplettaustausch der Keimbahn mit mutierten Allele zu gewährleisten, empfiehlt es sich, dass man zuerst die in Vivo -Effizienz der SgRNAs bestimmt. Die Erfahrung zeigt, dass die meisten SgRNAs, entworfen von CRISPRDirect (https://crispr.dbcls.jp/) oder CRISPRScan (http://www.crisprscan.org/) effizient bei 250 Pg/Embryo. Jedoch in einigen Fällen es möglicherweise erforderlich, höhere Konzentrationen (z.B.der gsc SgRNA herausgegeben von Blitz Et Al17, ~ 1 ng/Embryo) zu verwenden. Bewertung der Effizienz der Mutagenese der Ziel-Site ist wichtig und die Nutzung der Gezeiten erlaubt eine quantitative Bewertung31. Während die Methode betont hier die direkte Sanger verwendet haben Sequenzierung PCR Amplifikate (stellvertretend für die Bevölkerung von mutierten Allelen in F0 Embryonen), zahlreiche andere Methoden in der Genom-Bearbeitung Literatur für diesen Zweck verwendet. Ndere niedrig zu moderaten Kosten, die häufig verwendet werden, umfassen Fragment Länge Polymorphie Analyse mit entweder den Verlust der Restriktionsenzyme33 oder Cas9/TALEN Spaltung Seiten34, T7 Endonuklease 135 und Landvermesser 36 Assays, die Heteroduplex Mobility Assay37, die hochauflösende Schmelze Assay38, fragment Analyse durch Kapillarelektrophorese39,40und qPCR-basierte Methoden41, 42.
Eine zweite Überlegung ist die Wahl des Ziel-Standort innerhalb des Zielgens. Um die effiziente Verwertung von mutierten Phänotypen in der F-1 Generation zu ermöglichen, ist es wichtig, die Chance für komplette LOF Allele zu maximieren. Bei der mutierten Linien mit klassischen Ansätzen ist es eine gemeinsame Strategie zur Spaltung der Cas9 in der Nähe von 5'-Ende der Codierung Regionen, um vorzeitige Übersetzung Kündigung nahe dem Anfang des Proteins Codierung Region wecken Ziel. F-1 -heterozygot wäre mit Frameshift-Mutationen identifiziert werden, und diese Tiere würden für die weitere Arbeit ausgewählt werden, da sie null Allele tragen sollen. Da die sprunghaften Strategie F0 Intercrosses verwendet wird, wäre der Ansatz des Zielens der 5'-Ende der kodierenden Sequenz höchst ineffizient. Kreuzende Ergebnisse in den Bevölkerungen der F-1 -Mutanten, die meist compound heterozygoten17F0 Embryonen haben Mosaik Germlines Da groß angelegte Analyse überprüft, ob die erwarteten ~1/3rd von Mutationen von Doppel-Strangbrüchen produziert sind im Durchschnitt im Rahmen43, würden die meisten F-1 -Embryonen produziert auf diese Weise mindestens ein Allel mit einem Rahmen haben. Mutation, die Wildtyp-Aktivität behalten könnte. Daher ist eine andere Strategie erforderlich, um sicherzustellen, dass auch diese in-Frame mutierten Allele Null sein dürften. Targeting doppelte Strangbrüche innerhalb Proteinfalte Domänen, die für normale Proteinfunktion unerlässlich sind wird voraussichtlich eine höhere Chance auf vollständige LOF (null-Allele)17,44führen. Reiflicher Überlegung auf atomarer Ebene Struktur(en) Protein-Domains kann bei Verfügbarkeit, helfen bei der Identifizierung Regionen der Sekundärstruktur, die, selbst wenn eine einzelne Aminosäure im Rahmen löschen, mit erwartet werden kann, um Domain-Struktur (zu stören zum Beispiel, die Δ3bp Mutation im gsc herausgegeben von Blitz Et Al17). Wenn CRISPR/Cas9 Ziel-Sites innerhalb dieser Regionen identifiziert werden können, muss man eine höhere Chance auf null Allele erfolgreich zu gestalten. Kleine Deletionen innerhalb von Lösungsmittel-exponierten Schleifen zwischen sekundären strukturellen Eiweißbausteine sind weniger wünschenswert, da Mutationen in flexibler Regionen noch Funktionsproteine führen könnte.
Eine dritte Überlegung für Leap Frogging ist die Effizienz der PGC Entfernung vom Empfänger Embryo. Dieser Schritt muss effizient um komplette Keimbahn Austausch zu gewährleisten. Es ist derzeit unklar, ob alle Transplantat Empfänger durch das hier beschriebene Verfahren erzeugte Embryonen haben vollständige Entfernung ihrer PGCs. vollständig-hängen in Situ Hybridisierungen zeigen Variabilität in der Lokalisierung der PGC Marker im Blastozystenstadium Embryonen. In vielen Fällen alle oder fast alle, die das Signal gefunden in der Nähe von pflanzlichen-die meisten Ende des Embryos und würde daher hier skizzierten chirurgisch entfernt werden (Blitz Et Al.17 und Zitate darin). Allerdings zeigen einige Embryonen PGC Marker Ausdruck in ein paar Zellen näher zum Boden Blastocöl. Keimplasma zuerst am Vegetal Pol nach der Befruchtung verschmilzt und wird dann an Spaltung Furchen während frühen Spaltungen gefegt. Einige Keimplasma in Zellen in der Mitte der pflanzlichen Hemisphäre verteilt werden können und nicht wirksam entfernt werden, ohne Verwendung von Transplantationen, die das Blastocöl erweitern. Jedoch ist es auch wichtig zu beachten, dass diese tiefen Zellen, die Keimzelle Marker nicht in die Keimbahn beitragen könnten, wie Micro-RNAs PGC mRNAs von somatischen Zellen45,46klar bekannt sind. Diese tiefen Zellen beflecken für PGC Marker positiv möglicherweise somatischen Zellen solche Abstand. Methoden, um vollständige PGC Entfernung vom Empfänger Embryonen zu gewährleisten werden derzeit entwickelt.
Schließlich ist es auch wichtig zu überlegen, wie viele F0 Tiere von Leap Frogging generieren. Wie eine Variable Anzahl von Tieren nicht Geschlechtsreife überleben wird, empfiehlt es sich, dass mehr als 20 Embryonen mit Transplantationen erstellt werden. Notwendig, haben genug überlebende Tiere zu gewährleisten (1) die ausreichende Zahl von beiden Geschlechtern gewonnen werden, und (2), dass diese mutierten Allele auf eine ausreichend hohe Frequenz für die Analysen der Forscher geplant sein übertragen werden.
Mithilfe des Protokolls, die hier beschrieben wird, mit etwas Übung sollte Amphibien Embryologen PGC Transplantationen Technik mit etwas Übung zu meistern können. Leap Frogging sollte möglich sein, nicht nur in anderen Amphibien, sondern auch andere Organismen mit PGCs, die bereitwillig transplantierbaren zwischen Individuen in frühen Stadien der Embryogenese sind.
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Disclosures
Der Autor hat nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde mit der Unterstützung eines Zuschusses durchgeführt 5R21HD080684-02, aus dem National Institute of Child Health and Human Development. Der Autor bedankt sich bei Ken Cho für seine anhaltende Begeisterung und Unterstützung. Der Autor möchte auch Bruce Blumberg für die Verwendung seiner Kamera, Rebekka Charney, für die kritische Lesung der Handschrift, und Sean McNamara und Marcin Wlizla an der nationalen Xenopus -Ressource (RRID:SCR_013731), bestätigen für die wertvollen Gespräche über X. tropicalis Fütterung und Pflege der Tiere-Regimen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 or 11252-30 | |
| Eyebrow hair knife | Homemade | ||
| Hair loop | Homemade | ||
| Pasteur pipettes, borosilicate glass | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| Krazy Glue (Cyanoacrylate-based) | Elmer's Products, Inc. | KG581 | To affix eyebrow hair and hair loops into Pasteur pipettes, other similar glues can be used. |
| Oligodeoxynucleotides, custom ordered | Integrated DNA Technologies | Custom ordered | Template oligos for sgRNA synthesis, see Nakayama et al., 2014 for design details. |
| Megascript T7 kit | Ambion/ThermoFisher | AM1334 | Or use Megashortscript T7 (AM1354) kit |
| Phenol, Tris buffered | High quality distilled phenol from any commercial supplier | ||
| Chloroform | High quality chloroform from any commercial supplier | ||
| Ethanol | High quality ethanol from any commercial supplier | ||
| Diethylpyrocarbonate (DEPC) | Sigma Chemical Co. | D5758-50ML | |
| Cas9 protein, with nuclear localization signal | PNA Bio, Inc. | CP01 | Reconstituted using DEPC-treated water according to manufacturer's recommendations |
| 10X Marc's Modified Ringers solution | Homemade. Recipe (ref 26) for 1X MMR (lacking EDTA) is 100mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES. Solution is pH adjusted to 7.4. | ||
| Agarose | Any Molecular Biology grade agarose is sufficient | ||
| 60 X15 mm Petri plates | Falcon | 351007 | |
| 24-well plates | Falcon | 3047 | |
| L-Cysteine | Sigma Chemical Co. | C7352-100G | Free base, not HCl salt |
| Proteinase K | Roche | 03 115 828 001 | Typically ~20mg/ml from Roche |
| sera Micron | sera | Tadpole food. Resuspend in growth medium. Can be purchased from a variety of online retailers |
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