Summary
Генов, необходимых для выживания создают технические препятствия для создания мутантных линий. Скачка обходит летальность, объединяя генома, редактирование с помощью первичных зародышевых клеток трансплантации для создания одичал тип животных, перевозящих герминальных мутаций. Прорыва также позволяет эффективно поколения гомозиготных null мутантов в поколении1 F. Здесь трансплантация шаг продемонстрировал.
Abstract
Создание мутантных линий путем изменения генома ускорения генетического анализа у многих организмов. ТРИФОСФАТЫ/Cas9 методы были адаптированы для использования в африканских когтистые лягушка Xenopus, давно модельный организм для биомедицинских исследований. Традиционными для выведения схемы для создания гомозиготных мутантных линий с ТРИФОСФАТЫ/Cas9-пристрелнных мутагенеза имеют несколько шагов длительным и трудоемким. Чтобы облегчить создание эмбрионов мутантов, особенно в том, чтобы преодолеть препятствия, связанные с выбивания генов, которые необходимы для эмбриогенеза, был разработан новый метод под названием скачка. Этот метод использует надежность зародыши Xenopus «вырезать и вставить» эмбрионального методы. Скачка использует передачи первичных зародышевых клеток (PGCs) от эффективно mutagenized донорских эмбрионов в удаленной PGC wildtype братьев и сестер. Этот метод позволяет эффективно мутации важно генов путем создания химерных животных с wildtype соматические клетки, которые несут мутант микрофлорой. Когда два животных0 F ношение «чехарда трансплантации» (то есть, мутантные клетки семенозачатка) являются intercrossed, они производят гомозиготных, или составные гетерозиготных, null F1 эмбрионов, тем самым экономя время полной поколения для получения фенотипические данных. Прорыва также предоставляет новый подход для анализа гены материнского эффекта, которые являются тугоплавкие F фенотипического анализа0 после ТРИФОСФАТЫ/Cas9 мутагенеза. Эта рукопись подробно метод прорыва, с уделением особого внимания как успешно выполнять PGC трансплантации.
Introduction
Как генотип кодирует фенотип был основной вопрос в биологии с момента повторного законов Менделя. Понимание роли генов, их регулирования и взаимодействия в рамках генных сетей и функции закодированные продуктов обещания предоставить инструменты для выявления новой биологии и совершенствуясь болезни государства. Для более чем половины столетия1африканских когтистые лягушка Xenopus, был ведущим модель для исследования на самые разнообразные темы в базовой биологии и биомедицины, включая генетического контроля развития. Исторически большинство исследований по Xenopus использовала интрогрессии лягушка, X. laevis, но совсем недавно, благодаря своей diploidy, X. tropicalis был разработан как амфибии генетической модели. Полный геном последовательности были собраны от обоих видов Xenopus 2,3. «Лягушка сообщества» является теперь в поворотный момент где основные генома модификации технологии позволяет исследование функции гена, практически на волю. Программируемый ТРИФОСФАТЫ/Cas9 эндонуклеазами сделали мутагенез генов высокоэффективных, с biallelic мутации возможно в большинстве клеток животных4,5,6,7, 8,9,10,11. Эти исследования, подчеркнул Бхаттачарья и др. 12 и Шигета и др. 13, показали, что функции многих генов может быть изучен мутагенеза в F0 мозаика животных. Этот подход имеет множество преимуществ; Однако Cas9-sgRNA-microinjected эмбрионы часто отображения переменной фенотипов из-за неполной потери функции (LOF). Более значительно, поколение мутантных линий является весьма выгодным для некоторых приложений — в частности, при изучении генов, которые имеют материнской вклад мРНК. Матери мРНК и белки и их влияния на epigenetics, сохраняются для длительного периода в эмбриогенезе14,15,16, предоставление раннего развития вклад многих генов Огнеупорные материалы для F0 анализы. Таким образом необходимы другие подходы LOF.
При поиске для создания мутантных линий, путь для получения гомозиготных LOF эмбрионы есть несколько препятствий. Во-первых, эффективное мутагенеза производить biallelic перегласовок может быть невыгодно, поскольку потеря функций важно генов приводит к сбою дожить до половой зрелости, мешая производства жизнеспособных линии. Общее решение является тщательное титрования количество доставлены Cas9-sgRNA. Здесь цель – добиться баланса между снижение летальности также максимизируя эффективность мутагенеза микрофлорой. Вторая проблема возникает от стандартного разведения схемы, где фенотипические анализы откладываются до F2 поколения. Используя стандартный подход, сексуально зрелых F0 животных, которые передают мутант аллели через микрофлорой outcrossed для производства F1 гетерозиготных «носители», которые затем выросла до половой зрелости. Два F1 heterozygotes затем intercrossed производить F2 черепашки эмбрионов на ожидаемый Менделевское частоте 25%. Таким образом два поколения размножения необходимых для анализа мутант фенотипов. Мутанта животных может быть рецессивной или составные heterozygotes (т.е., потомства содержащий два разных мутантные аллели, которая зависит от генотипы родителей животных, используемых в Интеркросс1 F).
Эти препятствия могут быть преодолены, ограничивая программируемые нуклеиназы опосредованной мутагенеза в зародышевых клеток, которая лежит в основе новый метод под названием скачок17. Скачка имеет два основных компонента: (1 микроинъекции мРНК Cas вместе с sgRNA, или нуклеиназы sgRNA комплексов (или, в принципе, Таленс или цинка палец nucleases) на стадии одноклеточных, эффективно mutagenize эмбриональных геномов, следуют (2) Трансплантация PGCs в wildtype сестру эмбрионов, где эндогенного PGCs были удалены. Когда оба шаги являются эффективным, полный микрофлорой замена мутант зародышевые клетки могут быть получены. Blackler в начале 1960-х годов показал, что Xenopus PGCs могут быть трансплантированы между эмбрионов в конце Нейрула и раннего tailbud этапов18,19. Для скачка, Blackler подход был изменен путем выполнения пересадки на стадии Бластула17, когда PGCs локализованы в растительный полюс эмбриона20,21. Трансплантация перед гаструляция имеет два основных преимущества. Во-первых приживления трансплантатов и последующего нормального развития было установлено быть более эффективным, когда Трансплантация проводится на этапе Бластула (неопубликованные наблюдения). Во-вторых выполняя Бластула этап трансплантаций вскоре после того, как началась zygotic транскрипции, можно избежать летальность, вытекающие из развития генных мутаций, которые нарушают гаструляция или что в противном случае привести к искаженной конце neurulae. PGC трансплантации подшипник («leapfrogged») эмбрионов выращиваются для половой зрелости, и intercrosses между этими животными0 F показали, что во многих случаях 100% F1 потомства отображения LOF фенотипу (большинство из них составные heterozygotes), указав полный микрофлорой замена с целевой мутации.
Ожидается, что скачок ускорит генетических подходов в Xenopus. Прорыва также предоставляет альтернативу «хозяин передачи» метод22 для анализа LOF гены материнского эффекта (неопубликованные наблюдения). В текущей публикации подробное описание метода, особенно упором на трансплантации PGC, представлен в X. tropicalis (с незначительными изменениями на X. laevis). Трансплантация PGCs продемонстрировали здесь для облегчения более быстрой передачи этой технологии других лабораторий, работающих с Xenopus. Принципы этого метода должен быть успешными в других амфибий (например, urodeles), и организм конкретных изменений в методологии следует предусматривать приложения для многих других животных, в которых может быть достигнуто эффективное мутагенеза и PGCs легко которые спасаютжизньпритрансплантации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все методы, описанные здесь были одобрены институциональный уход животных и использования Комитетом из университета Калифорнии в Ирвине.
1. Подготовка к трансплантации PGC
- Подготовьте заранее, рассечение инструменты как описано23.
Примечание: Бровь волос ножи используются для делать надрезы с помощью цикла волос для стабилизации эмбриона при выполнении операции. Волоски бровей и волос петли склеиваются в боросиликатного стекла, пипетки Пастера, были впервые разработаны в пламени и разбит на части разбавлять (см. рис. 1A, стрелки) для создания более коротких, более узкий кончик (рис. 1B) для большей подвижности При выполнении операции. - Создание sgRNAs, используя ранее описанные процедуры24 .
Примечание: Кратко, короткие ДНК шаблоны кодирования для sgRNAs создаются с помощью перекрытия deoxyoligonucleotides, содержащие 5' бактериофага Т7 промоутеров, которые являются отожженных и «заполнить», ошибка бесплатно, термостабильной полимеразы дна. В пробирке sgRNA синтез реакции инкубируют на несколько часов на ночь (в зависимости от комплекта используется). Реакции, DNAse лечение для удаления шаблона. SgRNAs очищаются стандартными методами фенол/хлороформ добычи и аммония ацетат/изопропанол осадков, согласно инструкции производителя комплект24. - Незадолго перед проведением микроинъекции, подготовить Cas9-sgRNA комплексов, Первый денатурируя ~ 250 нг sgRNA в 3 мкл суммарный объем свободных РНКазы (Диэтилпирокарбонат лечение) H2O на 60-65 ° C за 5 мин, затем быстрого охлаждения на льду на 5 мин. Центрифуга sgRNA на несколько секунд, 1 мкл 1 мкг/мкл Cas9 белка и инкубировать в течение 10 минут при 37 ° C для поощрения формирования комплекса.
Примечание: После инкубации, трубка может храниться на льду при подготовке эмбрионы микроинъекции. - Получите X. tropicalis эмбрионов в экстракорпорального оплодотворения с помощью стандартных методов, как описано выше25. Исключения из желе25,26 эмбрионов на 10 мин после оплодотворения.
Примечание: Время оплодотворения считается время после подвеска сперма добавляется яйца и блюдо залита 1/9thX Марк изменения Ringers (MMR)26. X. tropicalis25, в отличие от X. laevis, выполняют де застывания в 1/9 x MMR содержащие 3% хвоща бесплатная база (не соль HCl), рН 7,8-8.0, с учетом следуют несколько стирок в 1/9 x MMR. Трансфер эмбрионов в агарозном (1%)-с покрытием блюдо, содержащие 1/9 x MMR при комнатной температуре. - Немедленно переноса эмбрионов для инъекций для блюдо покрытием агарозы 1%, содержащие 1 x MMR с помощью пипетки Пастера.
-
Залить на этапе 1-клетка. Смотрите ссылки26,27 для подробного описания методов микроинъекции Xenopus .
- Придать каждой эмбриона в одном месте в животное полюса, с 4 nL Cas9-sgRNA комплекса (окончательная сумма = 1 нг Cas9 и pg ~ 250 sgRNA; см. обсуждение)24. После 10-20 мин инъекции сайте исцеления, переноса эмбрионов агарозы покрытием блюдо, содержащие 1/9 x MMR и температуре в 25 ° C. Также создайте блюдо uninjected сестру эмбрионов, которые будут служить в качестве трансплантата получателей.
-
Подготовить Петри пластины (60 мм), которые содержат ~ 5 мм-толстый слой агарозы 1%, в 0,3 x MMR, если делать пересадки в X. tropicalis, или 1 x MMR для X. laevis.
- Создание депрессий ~ 3-4 мм глубоко вставляя 3-x 4-ну плесень (созданные режущие пластины ПЦР 96-луночных) в расплавленном агарозы при заливке пластины (см. Рисунок 1 c и D). Держите плесень несколько миллиметров выше нижней части Петри с помощью зажима придается стенд кольцо, пока не затвердеет агарозы.
- Кроме того, сделать 24-ну пластины для дома отдельных эмбрионов, покрытие скважин с тонким слоем агарозы 1%, в 1/9 x MMR.
Примечание: Культура среднего добавлен в этих скважин является x 1/9, которую MMR дополнена 50 мкг гентамицина сульфат/мл.
2. трансплантация PGCs
- Когда эмбрионы просто достичь Nieuwkoop и Фабер28 Бластула этап 9 (рисунок 2A), ~4.5 h после оплодотворения (hpf) для X. tropicalis, удалите их из инкубатора 25 ° C и позволяют им сбалансировать до комнатной температуры для дополнительной 0,5 ч.
- Чтобы начать трансплантации в 5 hpf (рис. 2B), использовать пипетку Pasteur для передачи одного эмбриона донора PGC (вводится с Cas9-sgRNA) на блюдо агарозы 60 мм, содержащие депрессий (создана на шаге 1.7) в 0,3 x MMR (или 1 x MMR при использовании X. laevis). Также передача одного uninjected сестру эмбриона, Трансплантат получателю, это блюдо.
Примечание: Очень важно не путать личность каждого из этих эмбрионов. - Вручную удалите vitelline конверты из каждого эмбриона, с помощью щипцов и вращаться как эмбрионы, так что их растительный полюса находятся в режиме и доступны для хирургии.
Примечание: Описание ручной де vitellination эмбрионов ранее был описан26. - Используя острый кончик ножа волос брови, сделайте четыре неглубокие надрезы в форме квадрата на растительный полюс получателя эмбриона, внутри зоны, где будет форма будущей бутылки клетки, которые отмечают бластопор. Сделайте разрезы, вставив кончик ножа волосы бровей в эмбрион, чуть ниже поверхности и сделать вверх нарезки движений во время стабилизации эмбриона с цикла волос.
Примечание: На рисунке 2 показывает растительные виды эмбриона через каждые полчаса от 4.5-7.0 hpf Показать размер ячейки и служить ориентиром для оценки, где клетки бутылки будет форма (пунктирная белый круг). Цель состоит в том, чтобы сделать разрезы, где указано пунктирной черный ящик. - После того, как четыре стороны квадрата проведенная путем разрезов, углубите каждый разрез с ножом волосы бровей, с использованием аналогичных движений резки для достигать глубины из примерно 1/3 до 1/2 расстояния на blastocoel пол.
- Бесплатные растительных тканях экспланта от получателя эмбриона (Рисунок 3А и B), сделав горизонтальные (параллельно поверхности растительного происхождения) cut(s) в регионе глубоко растительного происхождения.
Примечание: Размер PGC-содержащих растительные экспланта составляет примерно 0,4 0,45 мм на стороне и 0,25-0,3 мм в глубину. Этот растительный экспланта от получателя эмбриона больше не нужен и поэтому должно быть отложите в сторону для отмены. - Работать быстро, повторите эту процедуру (шаги 2.4-2.6) на эмбрион PGC доноров создать фрагмент аналогично размера растительных тканей для трансплантации.
Примечание: Важно выполнять этот второй диссекции с небольшой задержкой, чтобы свести к минимуму время для получателя эмбриона исцелить свою открытую рану. - Как только ткани, содержащие PGCs удаляется из эмбриона донора, используйте цикл нож и волос волосы бровей для перемещения этот экспланта в позицию в созданную в получателя эмбриона.
Примечание: Внутренней поверхности трансплантата доноров необходимо перед внутренних получателей эмбриона. Это не нужно соответствовать ориентации осей спинной вентральной и влево вправо лоскута с получателя эмбриона. - Используйте длинный край вала бровь волос нож, проведенных параллельно поверхности трансплантата, аккуратно нажмите трансплантата в отверстие в поверхности растительного происхождения получателей эмбриона.
- После того, как был сделан трансплантата, используйте hairloop или вал ножа бровь волос мягко скользить «каркаса» эмбриона донора по всей поверхности агарозы и в депрессию агарозы. Убедитесь, что открытая рана тушу сталкивается Основная жидкость. Если нет, то используйте нож волосы бровей для поворота эмбриона для достижения этой ориентации.
- Сдвиньте получателя эмбриона, с трансплантата, исцеление в месте, в прилегающих депрессии и также убедитесь, что привитые полюс растительных тканей сталкивается Основная жидкость.
- Повторите эту процедуру (шаги 2.1-2.11), используя другую пару доноров и получателей эмбрионов для создания другой пары трансплантации/каркаса; передача их в пустой депрессий.
Примечание: Очень важно, что один делает нотации для отслеживания соответствия пар туши и трансплантации подшипник эмбрионов. Туши доноров будет использоваться как прокси-сервер для эффективности Cas9-sgRNA индуцированного мутагенеза в трансплантированы PGCs, которые не могут быть assayed легко до трансплантации подшипник животные достигают половой зрелости (см. шаг 3.3, ниже и обсуждение ). - Продолжать делать пересадки эмбрионов до приблизительно ранней стадии братскую 10, который приблизительно 6.5 ФВЧ в X. tropicalis (см. Рисунок 2E).
3. после исцеления ухода эмбрионов
Примечание: Графтов исцелить на место в течение ~ 30 мин, и это нормально, чтобы наблюдать некоторые yolky мусора от lysis клетки, источая из эмбриона (рис. 3 c).
-
После исцеления, используйте пипетки Пастера очень осторожно переноса эмбрионов от депрессии для отдельных скважин пластины с покрытием агарозы 24-хорошо. Экссудат будет снят жидкость смешивания во время передачи (рис. 3D).
- Вращаться эмбрионы, так что они помещены растительного происхождения полюс вверх, стоящих перед массовых решения. Опять же место доноров туши и взяточничество получателей в соседних скважин для оказания помощи в отслеживании эмбриона пар; Запишите эту информацию.
- Передача пластину 24-а, содержащий эмбрионов до 25 ° C-инкубатор для ночь культуры.
Примечание: Следующий день, эмбрионы будут достигли стадии tailbud. - Переместите трансплантата получателей для очистки агарозы покрытием 6-ну пластины, содержащий x 1/9, которую MMR дополнена 50 мкг гентамицина сульфат/мл, с 1 эмбриона на хорошо. Четкое ведение туш доноров, которые соответствуют эти графт получателей.
- Чтобы оценить эффективность мутагенеза последовательности ПЦР ампликонов5,17,24 или с помощью других методов, которые полагаются на ПЦР ампликонов (см. обсуждение), переместите отдельные туши 0.2 мл ПЦР газа трубы. Удалить большую часть среднего и гомогенизации в 100 мкл лизис буфера24 содержащие протеиназы K (PK), повторил прихваченного дозирование с помощью пипетки P200.
- Выполняйте эмбриона лизис24 56 ° C в течение 6 ч в одночасье разрешить PK пищеварение. Инактивирует PK путем нагревать его к 90-95 ° C в течение 10 минут, а затем быстрое охлаждение до 4 ° C. Используйте лизатов без дальнейших шагов очистки для семян ПЦР-реакции для получения коротких ампликонов для прямой последовательности ДНК Сэнгер24. Магазин лизатов при-20 ° C.
Примечание: В течение нескольких дней, головастиков достигнет кормления стадий (около этап 45-46) и может быть использована подвеска планктонных порошка (sera микрон). - После ~ 1 неделю, с ежедневных изменений питательной среды для поддержания чистоты и свести к минимуму микробных избыточный рост переместите головастиков небольших резервуаров в циркулирующих водной системы капельного потоком. Используйте данные последовательности отделить головастиков с весьма эффективно mutagenized PGCs от головастиков с более низкой эффективности мутагенеза. После метаморфоза, переместите froglets взрослых водной системы в лаборатории.
Примечание: Схемы, разработанный Национальным Xenopus ресурсов (Лаборатория морской биологии, Вудс-Хол, MA) служить ориентиром для головастика, кормление взрослых лягушка обслуживания30и29 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
После трансплантации качественное определение эффективности ТРИФОСФАТЫ/Cas9 мутагенеза должны быть выполнены перед затратив усилия в животноводстве расти и поддерживать животных к половой зрелости. Потому что животные, перевозящих чехарда трансплантации соматически wildtype и микрофлорой труднодоступных для выполнения прямых измерений, экономя туши донорских эмбрионов становится важным. Анализ ДНК от туши выступает в качестве прокси для степени мутагенеза, что происходит в трансплантированы микрофлорой17.
Один из подходов к оценке успеха мутагенеза является непосредственно последовательности ПЦР ампликонами, охватывающих регионе геномный мишенью. Это становится особенно дорого и неэффективно, если одно хотело последовательности многочисленные индивидуально клонированные фрагменты ДНК из многих животных. Вместо этого секвенирование ампликонов гетерогенных на целевой сайт, как они являются производными от генетически мозаика эмбрионов, используется для оценки эффективности мутагенеза в каждом эмбриона19. Визуализация хроматограммы показывает дикого типа последовательности (пики) вверх по течению целевого объекта последовательности и вершины стать «яичница» (т.е., совместного наступления пиков, соответствует несколько баз, появляясь в каждом нуклеотидной позиции) вниз по течению от сайт Cas9-катализированное двухручьевой перерыв. Примеры таких профилей можно найти в рисунке S1 блиц и др. 17. точный количественный степени мутагенеза, представленных этими кинулись пиками могут быть получены с помощью алгоритма декомпозиции последовательностей, ПРИЛИВ (https://tide-calculator.nki.nl/)31. Скрининг отдельных эмбрионов, используя этот метод дает уверенность, что каждый эмбрион был правильно вводят и предназначенных для мутагенеза. Трассировщик, таких как дневно тегами декстрана, может использоваться для подтверждения успешного впрыска24 и может также помочь в создании, что головастиков действительно реализует пересаженных тканей (неопубликованные данные). Важно отметить, что официальное возможность, что coinjection флуоресцентные декстрана вместе с Cas9-sgRNA может изменить Cas9 мутагенеза эффективности не были изучены. Любой «leapfrogged» эмбрионы, содержащие пересадке плохо или unmutagenized доноров может быть удален.
Скачка обходит необходимость анализа поколения2 F в стандартных генетической селекции схемы, разрешив эффективной фенотипические анализы в F1 эмбрионов. При использовании стандартного подхода к мутировать важно генов, тщательно титрования дозы Cas9-sgRNA требуется для обеспечения жизнеспособности основатель эмбрионов, в результате мутагенеза снижение эффективности. Выжившие F0 животных от этой стандартной схемы затем outcrossed с wildtypes для получения жизнеспособных эмбрионов1 F, которые проверяются для идентификации носителей. Наконец эти heterozygotes1 F выросла до половой зрелости и intercrossed для получения гомозиготных F2 лиц отображение мутант фенотипов. В противоположность этому потому что скачка производит животных, которые имеют полную замену их germlines с мутантные аллели, intercrossing этих животных0 F производит мутант фенотипы в поколении1 F. Блиц и др. 17 сообщили, что большинство животных0 F, ориентированные на Локус тирозиназы (Тира), который необходим для пигментации меланоцитов и сетчатки, показал 100% микрофлорой передачи (измеряется ауткроссинга с Tyr- / - альбинос животных) доноров, полученных мутантных геномов (см. Рисунок 4A-B и Таблица 1). Таким образом основанные двух животных, производимые скачка принесет гомозиготных или составные гетерозиготных мутант F1 эмбрионов.
Аналогичные результаты были получены17 основанные F0 поднялась животных, перевозящих мутации в Гомеобокс (кодирования ДНК связывающих гомеодомен) гена goosecoid (gsc) (см. рис. 4A, C-H). Нокдаунов Gsc выражения, используя Морфолино антисмысловых олигонуклеотидов в X. laevis предложил необходимые для полного развития передней головы32ген gsc , и Cas9-sgRNA вводят головастиков также шоу эмбриональных смертоносных фенотипов17. Однако leapfrogged F0 животных, будучи соматически дикого типа, жизнеспособный и надежный, и F1 Интеркросс производимых эмбрионов с идентичными LOF фенотипов для тех, опубликованные в X. laevis нокдаунов17. Эти данные генетических подтверждения Морфолино фенотипа, также является подтверждением принципа, что скачок может использоваться для преодоления эмбриональных смертоносных фенотипов.
Рисунок 1: материалы, необходимые для трансплантации. (A) боросиликатного стекла пипетки Пастера используются для волос и бровей волос ножи петли для микрохирургии ранних эмбрионов. Рисунок из стекла, с помощью горелки Бунзена позволяет более узкий конец для вставки волос. Красная стрелка отмечает приблизительное положение, в котором для ломки стекла. (B) пример бровь волос нож (вверху) и волос цикл (внизу), зафиксированной в пипетки с Быстросохнущий клей. (C) A часть 96-луночных ПЦР-планшете используется для создания депрессии в пластине агарозы, позволяя агарозы 1% закрепить вокруг плесень (агарозы производится в 0,3 x или 1 x MMR, в зависимости от того, выполняются ли трансплантация в X. tropicalis или X. laevis, соответственно). Толщина агарозы составляет ~ 5 мм, с 3-4 мм-глубоких скважин. (D) пример агарозы пластины для трансплантации, с 12 депрессий, как показано на панели C. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: морфология растительный полюса в конце Бластула ранних стадиях братскую и стратегия для рассечения. (A-F) Xenopus tropicalis зародыши приведены в растительный вид промежутки времени каждые полчаса, с самого начала этапа 9 Бластула (4.5 hpf) на ранней стадии ~10.25 братскую (7 hpf). До 5 hpf, бластомеров большие и более легко повреждены. Белый, пунктирной окружности знаменует ожидаемое положение формирования клеток бутылку во время гаструляция, который можно увидеть формирование начала на спинной стороне (сверху) в панели (E и F). Для скачка, четыре разрезы производятся внутри квадрата, изображены черные пунктирные линии, с окончательным вырезать сделал параллельно поверхности ткани (не показано) освободить растительного экспланта. Шкалы бар = 400 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: трансплантация. (A) пример ~5.5 hpf эмбриона после удаления растительных тканей PGC-содержащих. Черной пунктирной коробки и белой пунктирной окружности являются те же относительные размеры, как те, показано на рисунке 2. (B) растительного экспланта удалены из эмбриона Группа A, внутренняя поверхность, наклоняясь в сторону зрителя, является примерно 0,4 0,45 мм на стороне и 0,25-0,3 мм в глубину. (C) эмбрион с пересаженной растительной ткани. Изображение было приобретено ~ 10 мин после пересадки. (D) 30 мин после трансплантации, растительной ткани видели зажили в место (нежный закрученного с бровей волос нож выше эмбрион был использован для создания вихрь, который сметены мусора, видели в панель C). После передачи 1/9 x MMR и инкубации при 25 ° C большинство эмбрионов завершить гаструляция нормально. Шкалы бар = 400 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: Микрофлорой передачи от F0 животных производимые скачка. (A) для скачка, два генов были мишенью ТРИФОСФАТЫ/Cas9, тирозиназы (вверху) и goosecoid (внизу). Tyr ген был5 целевых4,в пределах последовательности кодирования (синяя заливка) для пептида сигнал N-терминальный (SP, красный заливки), в то время как gsc ген был целенаправленной17 в кодировании последовательности на Начало Гомеобокс (красных моделировок), который делится между двумя экзонов. Непереведенные 5' и 3' exonic регионы незатененный. (B) все 160 F1 головастиков от (см. также таблицу 1) спаривания leapfrogged мужчин0 F (LF1) и Альбино (tyr-/-) девушки были Альбино, указывая, что весь микрофлорой от leapfrogged мужчин были заменены tyr мутант зародышевых клеток. Врезные показывает одичал тип головастиков с нормальной пигментации сетчатки и меланоцитов. (C-H) F1 эмбрионов, полученных от Интеркросс между двумя F0 поднялась Xenopus ориентации гомеобокс гена gsc. Приблизительно 2/3rds эмбрионы были фенотипически черепашки для РКГ, с фенотипом различной степени передней усечение головы (E-H). Половина из мутантов были либо циклопской или близко расположенных глаза (F), в то время как другая половина были eyeless (H). Генотипирование показали эти рецессивной или составных heterozygotes. 1/3rd эмбрионов, показаны фенотип одичал типа (C, D) были гомозиготных дикого типа или heterozygotes. В situ гибридизация otx2 (маркер переднего, среднего мозга и глаз), egr2 (маркер rhombomeres задний мозг 3 и 5 и поток нейронные крест) и hoxb9 (маркер спинного мозга) показывает, что потеря GSC функция влияет только передняя часть домена otx2 . Эти данные приводятся с блиц и др. 17 с разрешения компании биологов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Крест | Мужчины | Девушки | Альбинос | Дикого типа | Итого | % Альбинос |
| 1 | LF1 | Tyr-/- | 160 | 0 | 160 | 100 |
| 2 | LF2 | Tyr-/- | 148 | 0 | 148 | 100 |
| 3 | Tyr-/- | LF3 | 409 | 0 | 409 | 100 |
| 4 | Tyr-/- | LF4 | 0 | 519 | 519 | 0 |
| 5 | Tyr-/- | LF5 | 223 | 0 | 223 | 100 |
| 6 | LF6 | Tyr-/- | 493 | 703 | 1196 | 41.2 |
| 7 | Tyr-/- | LF7 | 1 | 94 | 95 | 1.1 |
| 8 | Tyr-/- | LF8 | 125 | 0 | 125 | 100 |
| 9 | Tyr-/- | LF9 | 0 | 417 | 417 | 0 |
| 10 | Tyr-/- | LF10 | 252 | 0 | 252 | 100 |
Таблица 1: Эффективное микрофлорой замена пересадки чехарда, перевозящих мутации в тирозиназы. Ориентация тирозиназы, пересадка подшипник животных обоих полов были получены. Эти животные были скрещены с Альбиносы, которые являются гомозиготных tyr- / -, для проверки эффективности передачи микрофлорой мутантные аллели и процент F1 эмбрионов, которые показали, что альбинизм был assayed на стадии головастика. Записи в столбцах с надписью «Мужской» и «Женские» указывают, какой родитель является tyr- / - или тест животных, полученных от скачков (LF). % Эмбрионов в крест показаны альбинос фенотип, указаны под «% альбинос.» Обратите внимание, что 6 из 10 животных с чехарда трансплантации показал (100%), мульчирование с мутантные аллели. Эта таблица воспроизводится от Блиц и др. 17, с разрешения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот отчет содержит подробный протокол для трансплантации растительной ткани, содержащие PGCs. трансплантация PGCs используется в сочетании с геном редактирования технологий (например, ТРИФОСФАТЫ/Cas9) для изменения микрофлорой животного во время поддержание почти все его соматического тканей как генетически дикого типа. Для скачка, чтобы быть успешным, существует ряд критических факторов, чтобы рассмотреть перед выполнением исполняющая трансплантаций.
Чтобы обеспечить полную замену микрофлорой мутантные аллели, рекомендуется, что один сначала определяет эффективность в vivo sgRNAs. Опыт показывает, что большинство sgRNAs, разработанная CRISPRDirect (https://crispr.dbcls.jp/) или CRISPRScan (http://www.crisprscan.org/) являются эффективными при использовании на 250 ПГ/эмбриона. Однако в некоторых случаях, может быть необходимо использовать более высокие концентрации (например, РКГ -sgRNA, опубликованном17блиц et al, требуется ~ 1 нг/эмбриона). Оценка эффективности мутагенеза целевого сайта имеет важное значение и ПРИЛИВ позволяет количественная оценка31. В то время как метод подчеркнул здесь использует прямые Сэнгер секвенирование ампликонов ПЦР (представляющие население мутантных аллелей в F0 эмбрионов), многочисленные другие методы были использованы в литературе геном редактирования для этой цели. Другие в умеренно малозатратных методов часто используемых включают фрагмент длиной полиморфизм анализ с использованием либо потери энзимов ограничения33 или Cas9/TALEN расщепления сайтов34, T7 эндонуклеазы 135 и геодезист 36 анализов, гетеродуплексного мобильность пробирного37, с высоким разрешением расплава пробирного38, фрагмент анализ капиллярного электрофореза39,40, и методы на основе ПЦР41, 42.
Вторым соображением является выбор целевого сайта расположение в пределах целевого гена. Чтобы разрешить эффективного восстановления мутант фенотипы в поколении1 F, важно максимально повысить шанс для полного LOF аллелей. При создании мутантных линий, используя классические подходы это общую стратегию для расщепления Cas9 около 5' конца кодирования регионов, чтобы добиться прекращения преждевременный перевод в начале белка кодирования региона. F1 heterozygotes будет определяться с фреймшифт мутации, и эти животные будут отбираться для дальнейшей работы, потому что они, как ожидается, нести null аллелей. Потому что скачок стратегия использует F0 intercrosses, подход ориентации к 5' концу кодирующая последовательность будет крайне неэффективно. F0 эмбрионы имеют мозаики germlines и основанные результаты в популяциях F1 мутантов, которые в основном подворье heterozygotes17. Так как масштабный анализ проверяет, в среднем, ожидаемого ~1/3rd мутаций, производимые двухнитевые разрывы в кадр43, большинство F1 зародышей в этой моде будет иметь по крайней мере один из аллелей с рама мутации, которые могут сохранять активность дикого типа. Таким образом другая стратегия необходима для обеспечения того, чтобы даже эти мутантных аллелей в кадр может быть значения NULL. Ориентация двойной стренги перерывы в доменах, сворачивание белков, которые необходимы для нормального белка функции, как ожидается, привести к более высокий шанс полного LOF (null аллели)17,-44. Тщательного рассмотрения на атомном уровне регистрируете домены белка, при наличии, может помочь в выявлении областей вторичной структуры, что, даже когда содержащий удаления в рамки одной аминокислоты, можно ожидать сорвать (структуры домена например, Δ3bp мутации в gsc , опубликованном17блиц et al). Если ТРИФОСФАТЫ/Cas9 целевые сайты могут быть определены в рамках этих регионов, один имеет более высокий шанс успешного создания null аллелей. Небольшие удалений в пределах воздействию растворителей петли между вторичных структурных компонентов белка менее желательны, потому что мутации в более гибких регионах по-прежнему может привести к функциональных белков.
Третье соображение для скачка является эффективность удаления PGC от получателя эмбриона. Этот шаг должен быть эффективным, с тем чтобы обеспечить полный микрофлорой замены. В настоящее время неясно, имеют ли все трансплантат получателей зародышей методом, описанным здесь полное удаление изменчивости их PGCs целом гора в situ гибридизациях шоу в локализации PGC маркеров в Бластула этап эмбрионов. Во многих случаях, все или почти все сигнал найден в конце растительного происхождения большинство эмбриона и поэтому будут удалены по хирургии, изложенные здесь (блиц et al.17 и цитаты нем). Однако некоторые эмбрионов Показать PGC маркер выражения в несколько ячеек, ближе к blastocoel полу. Зародышевой впервые объединяет на растительный полюса после оплодотворения и затем заметен вдоль борозды расщеплении во время ранних разобщенности. Некоторые зародышевой плазмы могут стать распределены в клетках в середине растительного полушария и не эффективно удаляться без использования трансплантатов, которые распространяются на blastocoel. Однако важно также отметить, что эти глубокие клетки, содержащие маркеры зародышевых клеток может не способствовать микрофлорой, как микроРНК известны очистить PGC mRNAs от соматические клетки45,46. Эти глубокие клетки, окрашивание позитивные для PGC маркеры могут быть соматические клетки проходят такие специальные акции. В настоящее время разрабатываются методы для обеспечения полного удаления PGC от получателей эмбрионов.
Наконец важно также рассмотреть сколько F0 животных для создания, скачок. Как переменное количество животных не выживет до половой зрелости, рекомендуется, что создаются более чем 20 содержащие трансплантации эмбрионов. Это будет необходимо иметь достаточно живых животных для обеспечения (1) что достаточное число лиц обоих полов, которые будут получены, и (2) что они передают мутантных аллелей с достаточно высокой частотой пригодны для анализа запланированных на исследователя.
Используя протокол, описанных здесь, с некоторой практики, амфибия эмбриологи должны быть в состоянии освоить технику трансплантаций PGC с некоторой практики. Скачка должно быть возможным, не только в других амфибий, но и другие организмы, содержащие PGCs, которые легко которые спасаютжизньпритрансплантации между людьми на ранних стадиях эмбриогенеза.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Автор не имеет ничего, чтобы раскрыть.
Acknowledgments
Эта работа была выполнена при поддержке гранта, 5R21HD080684-02, из Национального института здоровья ребенка и развития человеческого потенциала. Автор хотела бы поблагодарить Кена Чо за его неизменную энтузиазм и поддержку. Автор также хотели бы признать Брюс Blumberg, для использования его камеры, Ревекка Чарни, для критических чтении рукопись и Шон Макнамара и Marcin Wlizla в национальном Xenopus ресурсов (RRID:SCR_013731), для ценных разговоры о X. tropicalis кормления и ухода за животными схемы.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 or 11252-30 | |
| Eyebrow hair knife | Homemade | ||
| Hair loop | Homemade | ||
| Pasteur pipettes, borosilicate glass | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| Krazy Glue (Cyanoacrylate-based) | Elmer's Products, Inc. | KG581 | To affix eyebrow hair and hair loops into Pasteur pipettes, other similar glues can be used. |
| Oligodeoxynucleotides, custom ordered | Integrated DNA Technologies | Custom ordered | Template oligos for sgRNA synthesis, see Nakayama et al., 2014 for design details. |
| Megascript T7 kit | Ambion/ThermoFisher | AM1334 | Or use Megashortscript T7 (AM1354) kit |
| Phenol, Tris buffered | High quality distilled phenol from any commercial supplier | ||
| Chloroform | High quality chloroform from any commercial supplier | ||
| Ethanol | High quality ethanol from any commercial supplier | ||
| Diethylpyrocarbonate (DEPC) | Sigma Chemical Co. | D5758-50ML | |
| Cas9 protein, with nuclear localization signal | PNA Bio, Inc. | CP01 | Reconstituted using DEPC-treated water according to manufacturer's recommendations |
| 10X Marc's Modified Ringers solution | Homemade. Recipe (ref 26) for 1X MMR (lacking EDTA) is 100mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES. Solution is pH adjusted to 7.4. | ||
| Agarose | Any Molecular Biology grade agarose is sufficient | ||
| 60 X15 mm Petri plates | Falcon | 351007 | |
| 24-well plates | Falcon | 3047 | |
| L-Cysteine | Sigma Chemical Co. | C7352-100G | Free base, not HCl salt |
| Proteinase K | Roche | 03 115 828 001 | Typically ~20mg/ml from Roche |
| sera Micron | sera | Tadpole food. Resuspend in growth medium. Can be purchased from a variety of online retailers |
References
- Gurdon, J. B., Hopwood, N. The introduction of Xenopus laevis into developmental biology: of empire, pregnancy testing and ribosomal genes. Int J Dev Biol. 44 (1), 43-50 (2000).
- Hellsten, U., et al. The genome of the Western clawed frog Xenopus tropicalis. Science. 328 (5978), 633-636 (2010).
- Session, A. M., et al. Genome evolution in the allotetraploid frog Xenopus laevis. Nature. 538 (7625), 336-343 (2016).
- Blitz, I. L., Biesinger, J., Xie, X., Cho, K. W. Biallelic genome modification in F(0) Xenopus tropicalis embryos using the CRISPR/Cas system. Genesis. 51 (12), 827-834 (2013).
- Nakayama, T., Fish, M. B., Fisher, M., Oomen-Hajagos, J., Thomsen, G. H., Grainger, R. M. Simple and efficient CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Xenopus tropicalis. Genesis. 51 (12), 835-843 (2013).
- Guo, X., et al. Efficient RNA/Cas9-mediated genome editing in Xenopus tropicalis. Development. 141 (3), 707-714 (2014).
- Wang, F., Shi, Z., Cui, Y., Guo, X., Shi, Y. B., Chen, Y. Targeted gene disruption in Xenopus laevis using CRISPR/Cas9. Cell Biosci. 5, 15 (2015).
- Jaffe, K. M., et al. c21orf59/kurly Controls Both Cilia Motility and Polarization. Cell Rep. 14 (8), 1841-1849 (2016).
- Liu, Z., et al. Efficient genome editing of genes involved in neural crest development using the CRISPR/Cas9 system in Xenopus embryos. Cell Biosci. 6, 22 (2016).
- Naert, T., et al. CRISPR/Cas9 mediated knockout of rb1 and rbl1 leads to rapid and penetrant retinoblastoma development in Xenopus tropicalis. Sci Rep. 6 (35264), (2016).
- Ratzan, W., Falco, R., Salanga, C., Salanga, M., Horb, M. E. Generation of a Xenopus laevis F1 albino J strain by genome editing and oocyte host-transfer. Dev Biol. 426 (2), (2016).
- Bhattacharya, D., Marfo, C. A., Li, D., Lane, M., Khokha, M. K. CRISPR/Cas9: An inexpensive, efficient loss of function tool to screen human disease genes in Xenopus. Dev Biol. 408 (2), 196-204 (2015).
- Shigeta, M., et al. Rapid and efficient analysis of gene function using CRISPR-Cas9 in Xenopus tropicalis founders. Genes Cells. 21 (7), 755-771 (2016).
- Hontelez, S., et al. Embryonic transcription is controlled by maternally defined chromatin state. Nat Commun. 6, 10148 (2015).
- Peshkin, L., et al. On the Relationship of Protein and mRNA Dynamics in Vertebrate Embryonic Development. Dev Cell. 35 (3), 383-394 (2015).
- Owens, N. D., et al. Measuring Absolute RNA Copy Numbers at High Temporal Resolution Reveals Transcriptome Kinetics in Development. Cell Rep. 14 (3), 632-647 (2016).
- Blitz, I. L., Fish, M. B., Cho, K. W. Leapfrogging: primordial germ cell transplantation permits recovery of CRISPR/Cas9-induced mutations in essential genes. Development. 143 (15), 2868-2875 (2016).
- Blackler, A. W. Transfer of germ-cells in Xenopus laevis. Nature. 185, 859-860 (1960).
- Blackler, A. W., Fischberg, M. Transfer of primordial germ-cells in Xenopus laevis. J Embryol. Exp Morph. 9, 634-641 (1961).
- Bounoure, L. L'origine des cellules reproductrices et le problem de la lignee germinale. , Gauthier-Villars. Paris. (1939).
- Nieuwkoop, P. D., Sutasurya, L. A. Primordial Germ Cells in the Chordates: Embryogenesis and phylogenesis. , Cambridge University Press. Cambridge. (1979).
- Heasman, J., Holwill, S., Wylie, C. C. Fertilization of cultured Xenopus oocytes and use in studies of maternally inherited molecules. Methods Cell Biol. 36, 213-230 (1991).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Embryo dissection and micromanipulation tools. CSH Protoc. , (2007).
- Nakayama, T., et al. Cas9-based genome editing in Xenopus tropicalis. Methods Enzymol. 546, 355-375 (2014).
- Ogino, H., McConnell, W. B., Grainger, R. M. High-throughput transgenesis in Xenopus using I-SceI meganuclease. Nat Protoc. 1 (4), 1703-1710 (2006).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early development of Xenopus laevis.: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2000).
- Kay, B. K. Injection of oocytes and embryos. Xenopus laevis: Practical Uses in Cell and Molecular Biology (Methods in Cell Biology Vol. 36). Kay, B. K., Peng, H. B. , Academic Press. San Diego. (1991).
- Normal Table of Xenopus laevis. (Daudin): A Systematical and Chronological Survey of the Development from the Fertilized Egg till the End of Metomorphosis. Nieuwkoop, P., Faber, J. , Garland Publishing Inc. New York. (1994).
- Xenopus Tadpole Feeding. , Available from: http://www.mbl.edu/xenopus/files/2016/06/Xenopus-Tadpole.pdf (2017).
- Xenopus tropicalis Animal Care. , Available from: http://www.mbl.edu/xenopus/files/2016/06/Xenopus-Tropicalis.pdf (2017).
- Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Res. 42 (22), e168- (2014).
- Sander, V., Reversade, B., De Robertis, E. M. The opposing homeobox genes Goosecoid and Vent1/2 self-regulate Xenopus patterning. EMBO J. 26 (12), 2955-2965 (2007).
- Bedell, V. M., et al. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).
- Kim, J. M., Kim, D., Kim, S., Kim, J. S. Genotyping with CRISPR-Cas-derived RNA-guided endonucleases. Nat Commun. 5, 3157 (2014).
- Kim, H. J., Lee, H. J., Kim, H., Cho, S. W., Kim, J. S. Targeted genome editing in human cells with zinc finger nucleases constructed via modular assembly. Genome Res. 19 (7), 1279-1288 (2009).
- Qiu, P., Shandilya, H., D'Alessio, J. M., O'Connor, K., Durocher, J., Gerard, G. F. Mutation detection using Surveyor nuclease. Biotechniques. 36 (4), 702-707 (2004).
- Ota, S., et al. Efficient identification of TALEN-mediated genome modifications using heteroduplex mobility assays. Genes Cells. 18 (6), 450-458 (2013).
- Dahlem, T. J., et al. Simple Methods for Generating and Detecting Locus- Specific Mutations Induced with TALENs in the Zebrafish Genome. PLoS Genet. 8 (8), e1002861 (2012).
- Ramlee, M. K., Yan, T., Cheung, A. M., Chuah, C. T., Li, S. High-throughput genotyping of CRISPR/Cas9-mediated mutants using fluorescent PCR-capillary gel electrophoresis. Sci Rep. 5, 15587 (2015).
- Bhattacharya, D., Marfo, C. A., Li, D., Lane, M., Khokha, M. K. CRISPR/Cas9: An inexpensive, efficient loss of function tool to screen human disease genes in Xenopus. Dev Biol. 408 (2), 196-204 (2015).
- Yu, C., Zhang, Y., Yao, S., Wei, Y. A PCR Based Protocol for Detecting Indel Mutations Induced by TALENs and CRISPR/Cas9 in Zebrafish. PLoS ONE. 9 (6), e98282 (2014).
- Mock, U., Hauber, I., Fehse, B. Digital PCR to assess gene-editing frequencies (GEF-dPCR) mediated by designer nucleases. Nat Protoc. 11 (3), 598-615 (2016).
- Varshney, G. K., et al. High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9. Genome Res. 25 (7), 1030-1042 (2015).
- Shi, J., Wang, E., Milazzo, J. P., Wang, Z., Kinney, J. B., Vakoc, C. R. Discovery of cancer drug targets by CRISPR-Cas9 screening of protein domains. Nat Biotechnol. 33 (6), 661-667 (2015).
- Koebernick, K., Loeber, J., Arthur, P. K., Tarbashevich, K., Pieler, T. Elr-type proteins protect Xenopus Dead end mRNA from miR-18-mediated clearance in the soma. Proc Natl Acad Sci USA. 107, 16148-16153 (2010).
- Yang, J., Aguero, T., King, M. L. The Xenopus maternal-to-zygotic transition from the perspective of the germline. Curr Top Dev Biol. 113, 271-303 (2015).
