Summary
생존을 위해 필수적인 유전자 돌연변이 라인을 만들기 위한 기술 장애물 포즈. Leapfrogging 게놈 야생-타입 동물 생식 변이 들고 만드는 원시 생식 세포 이식으로 편집을 결합 하 여 치 사 율 circumvents. Leapfrogging 또한 F1 세대에서 null homozygous 돌연변이의 효율적인 생성을 허용합니다. 여기, 이식 단계는 보여 줍니다.
Abstract
편집 하는 게놈 돌연변이 라인의 창조 많은 유기 체에서 유전자 분석을 가속. CRISPR/Cas9 메서드가 아프리카 발톱된 개구리, Xenopus, 생물 의학 연구에 대 한 오랜 모델 유기 체에서에서 사용 하기 위해 적응 되었습니다. CRISPR/Cas9-타겟 mutagenesis와 homozygous 돌연변이 라인을 만들기 위한 전통적인 번 식 계획 몇 가지 어렵고 힘 드는 단계 있다. 특히 노크 embryogenesis에 필수적인 유전자와 관련 된 장애를 극복 하기 위해 돌연변이 배아의 생성을 촉진 하기 위하여 leapfrogging 이라는 새로운 방법을 개발 되었다. 이 기술을 활용 하 여 "잘라내기 및 붙여넣기" Xenopus 배아의 견고성 embryological 방법. Leapfrogging PGC 연기나 wildtype 형제에 효율적으로 mutagenized 기증자 배아에서 원시 생식 세포 (PGCs)의 전송을 사용합니다. 이 메서드는 공상 동물 wildtype 체세포 돌연변이 생식을가지고 작성 하 여 필수적인 유전자의 효율적인 돌연변이 대 한 수 있습니다. 때 두 F0 동물 운반 "도약 이식" (즉, 돌연변이 세균 세포)는 intercrossed, 그들은 생산 homozygous, 또는 복합 heterozygous, null F1 배아, phenotypic 데이터를 얻기 위해 전체 생성 시간 절약. F0 phenotypic 분석 CRISPR/Cas9 mutagenesis 다음 내 화물은 임산부 효력 유전자 분석을 위한 새로운 접근 방법을 제공 합니다 또한 leapfrogging. 이 원고 leapfrogging PGC 이식 성공적으로 수행 하는 방법에 대 한 특별 한 강조와 함께 하는 방법을 자세히 설명 합니다.
Introduction
어떻게 유전자 표현 형 인코딩합니다 Mendel의 법률의 재발견 이후 생물학에서 주요 질문 되었습니다. 인코딩된 제품 약속 잠복 새로운 생물학 및 장황 질병 상태에 대 한 도구를 제공 하기의 기능과 유전자, 그들의 규칙 및 유전자 네트워크 내에서 상호 작용의 역할의 이해. 절반 이상이 세기1, 아프리카 발톱된 개구리, Xenopus, 기초 생물학 및 의학, 발달의 유전 통제를 포함 하 여 다양 한 주제에 대 한 연구에 대 한 선도 모델을 하고있다. 역사적으로, Xenopus 에 대부분의 연구는 allotetraploid 개구리, X. laevis, 사용 하지만 더 최근에, 그것의 diploidy 인 X. tropicalis 개발 되었습니다 양서류 유전자 모델. 완전 한 게놈 시퀀스 두 Xenopus 종2,3에서 조립 되어 있다. "개구리 커뮤니티"입니다 지금 전환점에 어디 기본 게놈 수정 기술 허용 유전자 기능 연구 거의 것입니다. 프로그래밍 가능 CRISPR/Cas9 endonucleases 유전자의 mutagenesis를 biallelic 돌연변이 가능한 대부분의 세포에서 동물4,,56,7의 고효율 만들었습니다. 8,9,,1011. Bhattacharya 외 하 여 강조 하는 이러한 연구 12 및 Shigeta 외. 13, 많은 유전자의 기능 mutagenesis F0 모자이크 동물에 의해 공부 될 수 있다 나타났습니다. 이 접근에는 많은 이점이; 그러나, Cas9-sgRNA-microinjected 배아 종종 기능 (LOF)의 불완전 한 손실로 인해 가변 고기를 표시합니다. 더 크게, 돌연변이 라인의 세대는 매우 일부 응용 프로그램에 대 한 유리한-특히 모성 mRNA 기여 있는 유전자를 공부를 할 때. 모성 mRNAs 및 단백질, 그리고 epigenetics에 그들의 영향 embryogenesis14,,1516, 많은 유전자의 초기 발달 기여를 렌더링으로 오랜된 기간 동안 유지 F0 분석에의 내 화 따라서, 다른 LOF 방법이 제시해 주셔야 합니다.
돌연변이 체 라인을 만들 경우, 경로 homozygous LOF 배아를 얻는 몇 가지 장애물 있다. 첫째, 효율적인 mutagenesis biallelic 돌연변이 생산 하는 필수 유전자 기능의 손실이 가능한 라인의 생산을 방해 하는 성적 성숙에 살아남기 위해 실패에서 하기 때문에 불리 한 될 수 있습니다. 일반적인 솔루션은 Cas9-sgRNA 전달 금액의 주의 적정. 여기, 목표는 또한 생식 mutagenesis 효율성을 극대화 하면서 치 사 율 감소 사이의 균형을 달성 하는. 두 번째 문제 표준 사육 체계에서 발생 하는 phenotypic 분석 F2 세대까지 지연 됩니다. 표준 방식을 사용 하 여, 성적 돌연변이 체 대립 유전자는 생식을 통해 F1 heterozygous "캐리어", 성적 성숙 성장 다음 생산 outcrossed는 전송 하는 F0 동물 성숙. 2 F1 heterozygotes는 다음 25%의 예상된 Mendelian 주파수에서 F2 돌연변이 배아를 생산 하기 위해 intercrossed. 따라서, 번 식의 2 세대 돌연변이 고기의 분석을 위해 필요 하다. 돌연변이 동물 homozygotes 또는 복합 heterozygotes (즉, 자손 포함 하는 두 개의 다른 돌연변이 체 대립 유전자 F1 intercross에서 사용 하는 부모의 동물의 genotypes에 달려 있는) 수 있습니다.
프로그래밍 가능한 nuclease 중재 mutagenesis 세균 세포에 기초가 넘기17라는 새 메서드를 제한 하 여 이러한 장애물을 극복할 수 있습니다. 두 가지 주요 구성 요소는 leapfrogging: Cas mRNA sgRNA, 또는 nuclease sgRNA 단지 (또는, 원리, TALENs 또는 아연 손가락 nucleases)의 (1) microinjection 단일 셀 단계에서 효율적으로 배아 유전자 mutagenize를, 다음 (2) PGCs의 생 PGCs 제거 되었습니다 wildtype 형제 배아로 이식. 두 단계는 돌연변이 세균 세포로 효율적이 고 완전 한 생식 보충 때 얻어질 수 있다. Blackler 1960 년대 Xenopus PGCs 늦은 neurula에서 배아 초기 tailbud 단계18,19사이 이식 될 수 있는 시연. Leapfrogging, Blackler의 접근 PGCs 태아20,21의 식물성 극에 지역화는 blastula 단계17, 간이식을 수행 하 여 수정 되었습니다. Gastrulation 전에 이식 두 가지 주요 장점이 있습니다. 첫째, 이식 및 후속 표준 개발의 engraftment 이식 blastula 단계 (관찰 되지 않은)에서 수행 하는 경우 더 효율적으로 발견 되었다. 둘째, zygotic 녹음 방송 시작 직후 blastula 단계 간이식을 수행, 하나 치 발달 유전자 변이 gastrulation 또는 그 방해를 그렇지 않으면 잘못 된 늦은 neurulae 이어질에서 발생을 피할 수 있다. PGC 이식-베어링 ("사간") 배아는 성적 성숙, 성장 및 이러한 F0 동물 사이 intercrosses는, 많은 경우에, F1 자손의 100% (대부분 되 고 복합 LOF 형 표시 증명 heterozygotes), 대상된 돌연변이와 완전 한 생식 교체를 나타내는.
그것 leapfrogging Xenopus에 유전 접근을 가속화 될 것으로 예상 된다. 또한 임산부 효력 유전자 (게시 되지 않은 관찰) LOF 분석에 대 한 "호스트 전송" 방법22 에 대 한 대안을 제공 leapfrogging. 현재 발행물에서 PGC 이식에 초점 특히 방법에 대 한 자세한 설명을 제공 됩니다 X. tropicalis 에서 ( X. laevis에 대 한 작은 수정). Xenopus작업 다른 실험실에 더 빠른이 기술 이전을 촉진 하기 위하여 여기 PGCs의 식은 설명 했다. 이 방법의 원리 (예: urodeles), 다른 양서류에 성공 해야 하 고 방법론에서 유기 체 관련 수정 효율적인 mutagenesis 달성 될 수 있는 다른 많은 동물을 응용 프로그램에 대 한 허용 해야 하 고 PGCs는 쉽게 transplantable.
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Protocol
여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용, Irvine가 주 대학의 위원회에 의해 승인 되었습니다.
1입니다. PGC 식 위한 준비
- 앞에서 설명한23으로 해 부 도구를 사전에 준비 합니다.
참고: 눈 썹 머리 칼 수술을 수행 하는 동안 태아를 안정 시키기 위해 머리 루프의 도움으로 절 개를 만드는 데 사용 됩니다. 눈 썹 머리와 머리 루프 붕 규 산 유리 펫 파스퇴르는 화 염에 그려 왔다 처음으로 붙어 있으며 남았다 부분에 깨진 (참조 그림 1A, 화살촉) 큰 손 재주에 대 한 짧은, 좁은 팁 (그림 1B)를 만들 때 수술을 수행. - SgRNAs 절차 이전 기술된24 을 사용 하 여 생성 합니다.
참고: 짧게, 짧은 DNA 서식 파일 sgRNAs에 대 한 코딩 만들어집니다를 오류-무료, thermostable DNA 중 합 효소 겹치는 deoxyoligonucleotides 5' 살 균 소 T7 발기인, 단련 되 고 "입력"를 포함 하 여. SgRNA 합성 반응 생체 외에서 (키트 사용)에 따라 하룻밤 몇 시간 동안 알을 품는. 반응은 DNAse 처리는 서식 파일을 제거 하는. sgRNAs 페 놀/클로 프롬 추출 및 암모늄 아세테이트/소 프로 파 놀 강수량, 키트 제조 업체의 지침24에 따르면의 표준 방법으로 정화 된다. - Microinjections를 수행 하기 전에 곧 준비 Cas9 sgRNA 단지 첫 번째 변성 ~ 250 여 RNAse 무료 (diethylpyrocarbonate 대우) H2O 60-65 ° C에서 5 분의 3 µ L 전체 볼륨에서 sgRNA의 ng 뒤에 빠른 냉각 5 분 동안 얼음에. 몇 초 동안에 sgRNA 원심 1 µ g / µ L Cas9 단백질의 1 µ L을 추가 하 고 복잡 한 형성을 촉진 하는 37 ° C에서 10 분 동안 품 어.
참고:이 부 화에 따라 튜브 수 보관 얼음에 microinjection에 대 한 배아를 준비 하는 동안. - X. tropicalis 배아 체 외에서 수정 표준 방법을 사용 하 여 앞에서 설명한25얻을. 01-25,26 젤리 10 분 후 수정에서 태아.
참고: 수정 시간 시간 후 정자 현 탁 액 계란에 추가 되 고 접시 1/9thX와 홍수입니다 간주 됩니다 마크의 Ringers 수정 (MMR)26. 1/9에 드 jellying X. tropicalis25, X. laevis, 달리 수행에 대 한 3% 시스테인 무료 자료 (하지 HCl 소금), 포함 된 x MMR pH 7.8-8.0, 조정 뒤에 1/9에 여러 세척 x MMR. Agarose (1%)에 배아를 전송-1/9를 포함 하는 코팅된 접시 실 온에서 x MMR. - 즉시 1 1 %agarose 코팅 접시에 주입 될 배아 전송 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 x MMR.
-
1 세포 단계에서 주입. Xenopus microinjection 방법에 대 한 자세한 설명에 대 한 참조26,27 를 참조 하십시오.
- 4 동물 극에서 단일 사이트에 각 배아 주사 Cas9 sgRNA 복잡의 홀란트 (최종 금액 = 1 Cas9 및 sgRNA의 ~ 250 pg의 ng; 보십시오 토론)24. 사출 사이트 치유의 10-20 분 후 1/9를 포함 하는 agarose 코팅 접시 배아 전송 x MMR 및 25 ° c.에 품 어 또한 배아 이식 받는 사람 역할을 하 uninjected 형제의 접시를 만듭니다.
-
페 트리 접시 (60 m m) ~ 5 m m를 포함 하는 준비-0.3에서 1 %agarose 두꺼운 층 x MMR, X. tropicalis또는 1에서 이식 하 고 X. laevis에 대 한 x MMR.
- 만들기 우울증 ~ 3-4 m m 3를 삽입 하 여 깊은-4 우물 형 (96-잘 PCR 플레이트 절단 하 여 만든) x 녹은 agarose 접시를 붓는 때에 ( 그림 1C 참조 및 D). 몰드는 agarose는 강화 된 때까지 링 스탠드에 부착 된 클램프를 사용 하 여 페 트리 접시의 바닥 위에 몇 밀리미터를 잡으십시오.
- 또한, 우물 1/9에 1 %agarose 얇은 층으로 코팅 하 여 집 개별 배아 24-잘 접시에 게 x MMR.
참고: 이러한 우물에 추가 문화 매체는 MMR 보충 gentamycin 황산/mL의 50 µ g 1/9 x.
2입니다. PGCs의 이식
- 때 배아 그냥 무대에 도달 Nieuwkoop와 페이 버28 blastula 9 (그림 2A), ~4.5 h 후 수정 (hpf) X. tropicalis, 25 ° C 배양 기에서 그들을 제거 하 고 추가 대 한 실내 온도에 equilibrate 수 있도록 0.5 h입니다.
- 5 이식 하려면 hpf (그림 2B)를 사용 하 여 파스퇴르 피 펫 (Cas9-sgRNA 주사) 한 PGC 기증자 배아 전송 0.3에서 (단계 1.7에서에서 만든) 불경기를 포함 하는 60 m m agarose 접시 x MMR (1 또는 x MMR X. laevis를 사용 하는 경우). 또한 한 uninjected 형제 태아,이 접시를 이식 받는 전송.
참고: 그것은 중요 이러한 배아의 각각의 정체성 혼동 하지는. - 수동으로 집게를 사용 하 여 각 배아에서 vitelline 봉투를 제거 하 고 그들의 식물성 극 보기에서 및 수술에 대 한 접근은 모두 배아를 회전.
참고: 배아의 수동 드 vitellination의 설명 이전 되었습니다 설명된26. - 눈 썹 머리 칼의 날카로운 팁을 사용 하 여, 4 개의 얕은 절 개는 blastopore를 표시 하는 미래의 병 셀 형성 됩니다 영역 내부 받는 사람 배아의 식물성 극에 사각형의 형태로 확인 합니다. 태아, 표면, 및 위쪽으로 머리 루프와 배아를 안정화 하는 동안 움직임을 슬라이스 하는 게 바로 아래에 눈 썹 머리 칼 끝을 삽입 하 여 절 개를 확인 합니다.
참고: 그림 2 4.5-7.0 hpf 셀 크기를 보여 병 세포 (점선된 흰색 원)을 형성할 것 이다 예측에 대 한 가이드를 제공 하 고에서 뉴캐슬과 간격 배아의 식물 경관을 보여준다. 목표 파선된 블랙 박스 표시 됩니다 incisions를 만드는 것입니다. - 사각형의 네 면 절 개에 의해 delineated는, 일단의 약 1/3 ~ 1/2 blastocoel 바닥에 거리의 깊이 도달 비슷한 절삭 동작을 사용 하 여 눈 썹 머리 칼으로 각 절을 심화.
- 받는 사람 배아에서 식물 조직 explant 무료 (그림 3A 및 B) 수평 (식물 표면에 평행) 함으로써 깊은 식물 지역에서 cut(s).
참고: PGC 포함 된 식물성 explant의 크기는 약 0.4-0.45 m m 면 당 및 0.25-0.3 m m 깊이에서. 받는 사람 배아에서이 식물 explant 이상 필요 하 고 따라서 옆으로 폐기를 설정 해야. - 신속 하 게 작업,이 절차 (단계 2.4-2.6) 이식에 대 한 비슷한 크기 식물 조직 파편을 만드는 PGC 기증자 배아에 반복 합니다.
참고: 그것은 그것의 열려있는 상처를 치유 받는 사람 배아에 대 한 시간을 최소화 하기 위해 작은 지연으로이 두 번째 해 부를 실시 하는 것이 중요. - 일단 PGCs를 포함 하는 조직 기증자 태아에서 제거, 눈 썹 머리 나이프와 머리 루프를 사용 하 여이 explant 받는 사람 배아에서 만든 오프닝에 위치로 이동.
참고: 기증자 이식의 내부 표면 내부 받는 사람 배아의 직면 한다. 받는 사람 배아를 이식의 등 쪽 복 부와 왼쪽 오른쪽 축의 방향에 맞게 필요는 없습니다. - 눈 썹 머리 칼, 이식의 표면에 병렬 개최의의 긴 가장자리를 사용 하 여 부드럽게 눌러 받는 사람 배아의 식물 표면에 오프닝으로 이식.
- 이식 배치 되었습니다 일단 부드럽게 슬라이드 "시체" 기증자 배아의 agarose 표면에 걸쳐 agarose 우울증으로 하는 hairloop 또는 눈 썹 머리 칼의 샤프트를 사용 합니다. 시체의 오픈 상처 대량 액체를 직면 하 고는 다는 것을 확인 하십시오. 그렇지 않다면, 눈 썹 머리 칼을 사용 하 여이 방향을 달성 하기 위해 배아를 회전.
- 받는 사람 배아 이식 장소에는 인접 한 우울증으로 치유와 슬라이드 하 고 마찬가지로 이식할된 식물성 극 조직 대량 액체를 직면 하 고는 다는 것을 확인 한다.
- 다른 이식/시체 쌍;을 만듭니다 기증자와 받는 사람 배아의 다른 쌍을 사용 하 여이 절차 (단계 2.1-2.11) 반복 이러한 빈 우울증을 전송 합니다.
참고: 중요 한 시체 및 배아 이식-베어링의 일치 쌍을 추적 하는 표기법은 이다. 기증자 시체 이식 베어링 동물 성적인 성숙을 도달할 때까지 쉽게 분석 될 수 없습니다 이식된 PGCs에 Cas9-sgRNA-유도 된 mutagenesis의 효율성에 대 한 프록시로 사용 됩니다 (아래의 단계 3.3, 참조 및 토론 ). - 계속 이식 배아 약 gastrula 조기에 10, 약 6.5는 도달할 때까지 X. tropicalis 에서 hpf ( 그림 2E참조).
3. 후 배아 들 치유
참고: 이식 ~ 30 분 이내에 치료 하 고 정상 세포 세포의 용 해 (그림 3C) 배아에서 풍기에서 일부 yolky 파편을 관찰 하는.
-
일단 치유, agarose 코팅 24-잘 접시의 개별 웰 스에 우울증에서 매우 부드럽게 전송 배아에 파스퇴르 피 펫을 사용 합니다. exudate 됩니다 (그림 3D) 전송 하는 동안 혼합 유체에 의해 제거.
- 대량 해결책에 직면을 식물 극 배치 되도록 배아를 회전 합니다. 다시, 기증자 시체를 놓고 태아 쌍;의 유지에 도움을 받는 인접 한 우물에 이식 이 정보를 기록 합니다.
- 숙박 문화에 대 한 25 ° C 배양 기에 태아를 포함 하는 24-잘 접시를 전송 합니다.
참고: 다음 날, 배아는 도달 했다 tailbud 단계. - Agarose 코팅 6 잘 플레이트 MMR 보충 gentamycin 황산/mL, 잘 당 1 태아의 50 µ g 1/9 x를 포함 시키려면 이식 받는 사람을 이동 합니다. 이러한 일치 하는 기증자 시체의 명확한 기록 유지 이식 받는 사람.
- 시퀀싱 PCR amplicons5,,1724 또는 PCR amplicons ( 토론참조)에 의존 하는 다른 방법을 사용 하 여 의해 mutagenesis 효율성 평가, 0.2 mL PCR 스트립 튜브를 개별 시체를 이동 합니다. 매체의 대부분을 제거 하 고 100 µ L 세포의 용 해 버퍼24 K (PK)으로 위아래 pipetting P200 피 펫을 사용 하 여 반복 하는 성분을 포함 하에서 균질.
- 배아 세포24 PK 소화를 허용 하도록 하룻밤 6 h 56 ° C에서 수행 합니다. 10 분 뒤에 4 ° c 빠른 냉각 90-95 ° C에가 열 하 여 PK를 비활성화 추가 정리 단계 없이 lysates를 사용 하 여 씨를 직접 생어 DNA 시퀀싱24에 대 한 짧은 amplicons PCR 반응. -20 ° c.에 lysates 저장
참고: 몇 일 이내는 tadpoles 먹이 단계 (약 단계 45-46)에 도달 한다 그리고 planktonic 분말 (세라 미크론)의 정지 먹 일 수 있습니다. - 청결을 유지 하 고 미생물 자라 난 최소화를 문화 매체의 매일 변화 ~ 1 주 후 물방울 흐름 순환 수 중 시스템에 tadpoles 작은 탱크를 이동 합니다. 시퀀싱 데이터를 사용 하 여 낮은 mutagenesis 효율 tadpoles에서 매우 효율적으로 mutagenized PGCs와 tadpoles를 분리. 변 태 완료 되 면 연구실에서 성인 수생 시스템에는 froglets를 이동 합니다.
참고: 국가 Xenopus 자원 (해양 생물학 연구소, 나무 구멍, MA)에 의해 개발 된 식이요법 올챙이 먹이29 그리고 성인 개구리 유지 보수30에 대 한 가이드를 제공 합니다.
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Representative Results
이식, 다음 CRISPR/Cas9 mutagenesis의 효능의 질적 결정 축산 성장과 성적 성숙 동물 유지에 노력을 소비 하기 전에 수행 되어야 합니다. 때문에 들고 토끼 뜀 이식 동물 somatically wildtype는 생식은 직접 측정을 위한 접근 하기 어려운, 기증자 태아의 시체를 저장 중요 해 집니다. 시체에서 DNA 분석 이식된 생식17에서 발생 하는 mutagenesis의 범위에 대 한 프록시 역할을 합니다.
Mutagenesis의 성공을 평가 하는 한 가지 방법은 직접 시퀀스 PCR amplicons 대상 게놈 영역에 걸친 것입니다. 이것은 특히 비용과 비효율적인 경우 하고자 많은 동물에서 수많은 개별적으로 복제 된 DNA 파편을 연속 된다. 대신, 그들은 모자이크 배아 유전자에서 파생 된 대로 대상 사이트에서 다른 유형의 amplicons 시퀀싱 각 배아19mutagenesis 효율성을 평가 하기 위해 사용 됩니다. Chromatograms의 시각화 표시 상류는 야생 타입 시퀀스 (봉우리) 대상의 시퀀스와 봉우리 될 "발진" (즉, 각 뉴클레오티드 위치에 나타나는 여러 기초에 해당 하는 봉우리의 동시 발생)의 하류 Cas9 촉매 두 배 물가 틈의 사이트. 이러한 프로 파일의 예는 그림 S1 공습 외에 찾을 수 있습니다. 17. 시퀀스 분해 알고리즘, 조류 (https://tide-calculator.nki.nl/)31를 사용 하 여 정확한 정량 mutagenesis 스크램블된이 봉우리에 표시의 범위를 얻을 수 있습니다. 이 기술을 사용 하 여 개별 배아 상영 자신감 각 배아는 제대로 주입 하 고 mutagenesis에 대 한 대상으로 제공 합니다. 붙일 태그가 dextran 등 추적 성공적인 주입24 를 확인 하는 데 사용 수 고는 올챙이 이식된 조직 (되지 않은 데이터)를 들고 실제로 수립에 도움이 될 수 있습니다. 그것은 Cas9 sgRNA 함께 형광 dextran의 coinjection Cas9 mutagenesis 효율을 변경할 수 있습니다 정식 가능성 탐험 되지 않은 참고 해야 합니다. 저조한 또는 unmutagenized 기증자 로부터 식을 포함 하는 어떤 "leapfrogged" 배아 폐기 수 있습니다.
Leapfrogging F1 배아에서 효율적인 phenotypic 분석을 허용 하 여 F2 세대 분석 표준 유전 번 식 체계를 위한 필요를 circumvents. 표준 접근을 사용 하 여 필수 유전자 변이, Cas9-sgRNA 복용량의 주의 적정이 감소 mutagenesis 효율성이 설립자 배아의 생존 능력을 보장 하기 위해 필요 합니다. 살아남는 F0 를 가능한 F1 배아, 사업자 식별 하는 검사는 wildtypes와 outcrossed 다음는이 표준 체계에서 동물. 마지막으로, 이러한 F1 heterozygotes는 성적 성숙 고 성장 homozygous F2 개인 돌연변이 고기 표시를 intercrossed. 반면, 돌연변이 체 대립 유전자와 그들의 germlines의 완전 한 교체를 생산 동물 leapfrogging, 때문에 F1 세대에서 돌연변이 고기 생산 intercrossing이 F0 동물. 습격 형 외. 17 보고 F0 동물 대상으로 melanocytes와 망막의 색소에 대 한 필요한 tyrosinase (tyr) 로커 스의 대부분 100% 생식 전송 ( 와 outcrossing 측정 했다 tyr-/-알 비 노 동물)의 기증자 파생 된 돌연변이 유전자 ( 그림 4A-B 및 표 1참조). 따라서, 두 동물 leapfrogging 제작한 intercrossing homozygous 또는 복합 heterozygous 돌연변이 F1 배아 얻을 것 이다.
비슷한 결과 F0 사간 동물 homeobox (인코딩 DNA 바인딩 homeodomain) goosecoid (gsc) 유전자의 돌연변이 들고 intercrossing 하 여17 가져온 ( 그림 4A, C H참조). Gsc 식 morpholino 센스 oligonucleotides를 사용 하 여 X. laevis 에 knockdowns 제안 gsc 유전자는 앞쪽 머리32의 완전 한 개발에 필요한 Cas9 sgRNA 주입 tadpoles 또한 쇼 배아 치명적인 고기17. 그러나, leapfrogged F0 동물, 야생 타입, somatically 되는 실용적이 고 강력한, 그리고 F1 intercross X. laevis knockdowns17에 게시 그 동일한 LOF 고기와 배아를 생산. 이러한 데이터 제공 뿐만 아니라 원리의 증거로 그 leapfrogging morpholino 형의 확증을 유전 배아 치명적인 고기를 극복 하기 위해 사용할 수 있습니다.
그림 1: 자료 이식에 필요한. (A) 붕 규 산 유리 파스퇴르 펫 눈 썹 머리 및 머리를 만들기 위해 사용 되는 미세 초기 배아에 대 한 루프. 분 젠 버너를 사용 하 여 유리 밖으로 그리기는 머리의 삽입을 위한 좁은 끝에 대 한 수 있습니다. 빨간색 화살표는 유리를 깰 수 있는 대략적인 위치를 표시 합니다. (B) 예를 들어 눈 썹 머리 칼 (맨 위) 및 헤어 루프 (아래)의 펫으로 빠른 건조 접착제로 고정. PCR 96 잘 접시의 (C) 부분 1 %agarose 금형 주위를 공고히 함으로써 agarose 접시에 우울증을 만드는 데 사용 됩니다 (agarose 0.3 x 또는 1에서 만든 x MMR, X. tropicalis에에서는 간이식 수행 되 고 있는지 여부에 따라 또는 X. laevis각각). agarose의 두께 3-4 m m ~ 5 m m-깊은 우물. (D)는 agarose의 예 12 우울증과 이식에 대 한 패널 C와 같이 접시. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 초기 gastrula 단계를 해 부에 대 한 전략 늦은 blastula 동안 식물성 극의 형태. (A-F) Xenopus tropicalis 배아 blastula 단계 9의 시작 부분에서 뉴캐슬과 시간 간격 식물성 뷰에 표시 (4.5 hpf) 초기 gastrula 단계 ~10.25를 (7 hpf). 5 이전 hpf, blastomeres는 크고 더 쉽게 손상. 흰색, 파선된 원형 패널 (E 와 F)에 등 (위)에 시작을 형성 볼 수 있는 gastrulation 동안 병 세포 형성의 예상된 위치를 표시 합니다. Leapfrogging에 대 한 4 개의 절 개는 사각형 내에서 검은 점선으로 그려져, 최종 잘라 만든된 병렬 조직 (표시 된)의 표면에 식물 explant 무료. 눈금 막대 = 400 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 이식. (A) 식물성 PGC 포함 된 조직의 제거 후 ~5.5 hpf 태아의 예. 검은 점선된 상자와 흰 점선된 동그라미 그림 2에 표시 된 대로 동일한 상대적 차원 이다. (B)는 식물성 explant 패널, 뷰어, 직면 하는 내부 표면에서에서 태아에서 제거 약 0.4-0.45 m m 면 당 0.25-0.3 m m 깊이에서입니다. (C) 배아 이식된 식물 조직으로. 이미지는 이식 후 ~ 10 분을 인수 했다. (D)는 식물 이식 후 30 분 조직 (부드러운 소용돌이 눈 썹 머리 칼으로 위 태아 패널 C에서 파편을 멀리 공중 소탕 하는 소용돌이 만드는 데 사용 된)으로 치료 해야 볼 수 있다. 1/9 x MMR와 25 ° C에 외피를 전송, 후 대부분 배아 일반적으로 gastrulation를 완료합니다. 눈금 막대 = 400 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: F0 동물에서 생식 전송 leapfrogging 제작한. (A) leapfrogging, 대 한 두 개의 유전자 CRISPR/Cas9, tyrosinase (맨 위) 및 goosecoid (아래)에 의해 표적으로 했다. Tyr 유전자는 N 맨끝 신호 펩 티 드 (SP, 빨간색 음영)에 대 한 코딩 시퀀싱 (파란색 음영) 내에서 타겟된4,5 는, gsc 유전자 코딩에 시퀀스 내에서 타겟된17 동안에 homeobox (빨간색 음영)의 시작, 두 개의 exons 사이 분할 되는. 번역 되지 않은 5'과 3' exonic 지역 음영 처리 됩니다. (B)에서 모두 160 F1 tadpoles ( 표 1참조)는 leapfrogged F0 (LF1) 남성과 흰둥이의 짝짓기 (tyr-/-) 여성 했다 나타내는 흰둥이 leapfrogged 남성에서 전체 생식 왔다 tyr 돌연변이 세균 세포로 대체. 삽입 된 정상 망막 및 melanocyte 색소와 야생-타입 올챙이 보여줍니다. (C H) F1 배아 두 F0 사이 intercross에서 파생 된 사간 Xenopus homeobox 유전자를 대상으로 gsc. 배아의 약 2/3rds phenotypically gsc를 위한 돌연변이, 표현 형으로 되 고 (E-H) 머리의 앞쪽 자르기의 다양 한 각도. 돌연변이의 절반 중 cyclopic 또는 밀접 하 게 간격 눈 (F), 나머지 절반은 눈이 (H) 했다. 유전형이 homozygotes 또는 복합 heterozygotes 보였다. 야생-타입 형 (C, D)를 보여주는 배아의 1/3rd homozygous 야생 타입 또는 heterozygotes 했다. 현장에서 교 잡 otx2 (개, midbrain, 및 눈의 표식), egr2 (마커 hindbrain rhombomeres 3와 5, 그리고 신경 크레스트의 흐름) 및 hoxb9 (척수의 마커) 표시 의 손실 gsc 함수 otx2 도메인의 앞쪽 부분에만 영향을 줍니다. 이러한 데이터는 공습 외 에서 재현 생물학의 회사 허가 17 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 크로스 | 남성 | 여성 | 알 비 노 | 야생 타입 | 총 | % 흰둥이 |
| 1 | LF1 | tyr-/- | 160 | 0 | 160 | 100 |
| 2 | LF2 | tyr-/- | 148 | 0 | 148 | 100 |
| 3 | tyr-/- | LF3 | 409 | 0 | 409 | 100 |
| 4 | tyr-/- | LF4 | 0 | 519 | 519 | 0 |
| 5 | tyr-/- | LF5 | 223 | 0 | 223 | 100 |
| 6 | LF6 | tyr-/- | 493 | 703 | 1196 | 41.2 |
| 7 | tyr-/- | LF7 | 1 | 94 | 95 | 1.1 |
| 8 | tyr-/- | LF8 | 125 | 0 | 125 | 100 |
| 9 | tyr-/- | LF9 | 0 | 417 | 417 | 0 |
| 10 | tyr-/- | LF10 | 252 | 0 | 252 | 100 |
표 1: 효율적인 생식 교체 tyrosinase에서 돌연변이 들고 토끼 뜀 이주 여. Tyrosinase를 대상으로, 남녀의 이식 베어링 동물 획득 했다. 이 동물 homozygous tyr-/-, 돌연변이 체 대립 유전자, 생식 전송과 獸 올챙이 단계에서 분석은 보여주었다 F1 배아의 %의 효율성을 테스트 하는 알바 이노와 교차 했다. "남자"와 "여자" 라고 표시 된 열에서 항목을 부모 tyr-/-또는 넘기 (LF)에서 파생 된 테스트 동물 나타냅니다. 알 비 노 형 "흰둥이 %." 아래 표시 됩니다 십자가 표시 내에서 배아의 % 참고 6 leapfrog 이식 10 동물의 돌연변이 체 대립 유전자와 교체 완료 (100%)을 보였다. 이 테이블은 블리치 외 에서 재현 17, 허가입니다.
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Discussion
이 보고서에서는 PGCs. 이식의 PGCs를 포함 하는 식물 조직의 이식에 대 한 상세한 프로토콜을 수정 하는 생식을 게놈 편집 기술 (예: CRISPR/Cas9)와 함께에서 사용 하면서 동물의 거의 모든 그것의 체세포 조직 유전자 야생 유형으로 유지. 성공 하려면 leapfrogging 위해 수행 간이식을 수행 하기 전에 고려해 야 할 중요 한 요인의 수가 있다.
돌연변이 체 대립 유전자와는 생식의 완전 한 교체를 위해 하나 먼저 sgRNAs의 비보에 효율을 결정 한다는 것이 좋습니다. 경험에 따르면 대부분 sgRNAs CRISPRDirect (https://crispr.dbcls.jp/) 또는 CRISPRScan (http://www.crisprscan.org/)에 의해 설계 된 효율적인 250 pg/배아에서 사용 하는 경우는. 그러나, 어떤 경우 (예를 들어, 의해 기습 외17, gsc sgRNA 필수 ~ 1 ng/태아) 높은 농도 사용 해야 할 수 있습니다. 대상 사이트의 mutagenesis의 효율성을 평가 하는 것은 필수적 이다 고 조 수의 사용 허가는 양적 평가31. 강조 하는 메서드는 직접 생어에 여기 사용 하는 동안 (F0 배아에서 돌연변이 체 대립 유전자의 인구를 나타내는), PCR amplicons의 시퀀싱 수많은 다른 방법 사용 되었습니다 게놈 편집 문학에서이 목적을 위해. 일반적으로 사용 되는 다른 낮은-투-보통 비용 기술이 포함 제한 효소33 또는 Cas9/TALEN 분열 사이트34, T7 endonuclease 135 , 측량 의 손실을 사용 하 여 조각의 길이 다형성 분석 36 분석 실험, heteroduplex 이동성 분석 결과37, 고해상도 용 분석 결과38, 조각 분석 모 세관 전기 이동 법39,40및 정량 기반 방법41, 42.
두 번째 고려 대상 사이트 위치 대상 유전자의 선택 이다. F1 세대에서 돌연변이 고기의 효율적인 복구를 허용 하려면 완전 한 LOF 대립 유전자에 대 한 기회를 극대화 하기 위해 중요 하다. 고아 한 접근을 사용 하 여 돌연변이 라인을 만들 때 5' 끝의 가까이 지역, 지역 코딩 단백질의 시작 부분 근처에서 조 번역 종료를 유도 코딩 Cas9 분열을 대상으로 일반적인 전략 이다. F1 heterozygotes frameshift 돌연변이와 식별 될 것입니다 그리고이 동물 것 선택 추가 작업 때문에 그들은 null 대립을 수행 것으로 예상 된다. 앞서가는 전략 F0 intercrosses를 사용 하기 때문에 코딩 순서의 5' 끝을 대상으로의 접근의 고효율 없을 것 이다. F0 배아 모자이크 germlines, 그리고 주로 F1 돌연변이의 인구에 있는 intercrossing 결과 복합 heterozygotes17. 이후 대규모 분석 여부 확인, 평균, 더블-스트랜드 나누기에 의해 생산 하는 돌연변이의 예상된 ~1/3rd 에서 프레임43, 대부분 F1 배아가이 패션에서 생산 했을 적어도 1 개의 대립 유전자에-프레임 돌연변이 야생 유형 활동을 유지할 수 있습니다. 따라서, 다른 전략 프레임에 돌연변이 대립도 이러한 null 될 가능성이 되도록 필요 합니다. 일반 단백질 기능에 필수적인 단백질 접히는 도메인 내에서 이중 가닥 나누기를 대상으로 완전 한 LOF (null 대립 유전자)17,44의 더 높은 기회가 될 전망 이다. 단백질 도메인의 원자 수준 structure(s)에 주의 깊은 고려 사항 사용 가능한 경우 단일 아미노산에서 프레임 삭제를 포함 하는 경우에 도메인 구조 (방해 하 예상 될 수 있습니다. 있는 이차 구조의 영역을 식별에 지원할 수 있습니다. 예를 들어, gsc 공습 외17에 의해 출판에서 Δ3bp 돌연변이). CRISPR/Cas9 대상 사이트는이 영역에서 확인할 수 있습니다, 만약 하나는 성공적으로 null 대립을 만들기의 더 높은 기회가 있다. 단백질 2 차 구조 구성 요소 간에 솔벤트 노출 루프 내 작은 삭제는 보다 적게 바람직한 더 유연한 지역에서 돌연변이 기능 단백질 여전히 발생할 수 있습니다.
Leapfrogging에 대 한 세 번째 고려 사항은 받는 사람 배아에서 PGC 제거의 효율성입니다. 이 단계는 완전 한 생식 교체를 보장 하기 위해 효율적인 필요 합니다. 여기에 설명 된 방법에 의해 생산 모든 이식 받는 사람 배아 blastula 단계 배아에서 PGC 마커의 지역화에 그들의 PGCs. 전체 마운트 제자리에 내 쇼 다양성의 완전 한 제거를가지고 있는지 현재 명확 하지 않다. 대부분의 경우, 모두 또는 거의 모든 신호 발견 태아의 식물성 대부분 끝 고 따라서 여기에 설명 된 수술에 의해 제거 될 것 (습격 형 외.17 및 인용 거기에). 그러나, 일부 배아 blastocoel 바닥에 가까이 몇 셀에 PGC 마커 식을 표시합니다. 세균 플라스마 먼저 수정 후 식물성 극에서 병합 하 고 초기 분열 시 분열 랑을 따라 스윕된 다음. 일부 세균 플라스마 세포 식물 반구의 중간에 배포 될 수 있습니다 하 고 효과적으로 사용 하는 blastocoel에 확장 하는 이주 하지 않고 제거 되지. 그러나, 그것은 또한 중요 한 것이 깊은 세포 생식 세포 마커를 포함 하는 생식에 기여 하지 수도 microRNAs 체세포45,46에서 PGC mRNAs를 알려져 있습니다. PGC 표식에 대 한 긍정적인 얼룩이 깊은 세포 체세포 등 허가 받고 있을 수도 있습니다. 방법 받는 사람 배아에서 완전 한 PGC 제거 되도록 현재 개발 되고있다.
마지막으로, 그것은 또한 얼마나 많은 F0 동물 leapfrogging 의해 생성을 고려 하는 것이 중요입니다. 동물의 다양 한 수 성적 성숙에 살아날 것으로 20 개 이상의 배아가 식을 포함 하는 창조 하는 것이 좋습니다. 그것은 필요가 남녀의 충분 한 숫자 (1) 그를 위해 충분히 살아남은 동물 것입니다 얻을 수 및 이러한 분석 연구원에 의해 계획에 적합 하도록 충분히 높은 주파수에서 돌연변이 체 대립 유전자를 전송 (2)는 것입니다.
약간 연습으로, 여기서 설명 하는 프로토콜을 사용 하 여 수 륙 양용 embryologists PGC 이식 기법 몇 가지 연습을 마스터 수 있어야 합니다. Leapfrogging 가능, embryogenesis의 초기 단계에서 개인 간의 쉽게 transplantable는 PGCs를 포함 하는 다른 유기 체 뿐만 아니라 다른 양서류에 해야 합니다.
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Disclosures
저자는 공개 상관이 있다.
Acknowledgments
이 작품은 보조금의 지원으로 수행 되었다 5R21HD080684-02, 아동 건강의 국가 학회 및 인간 발달에서. 저자 켄 조 그의 지속적인 열정과 지원에 대 한 감사를 기원 합니다. 저자 또한 싶습니다 원고, 숀 맥 나 마라와 국가 Xenopus 자원 (RRID:SCR_013731)에 마 Wlizla의 중요 한 독서에 대 한 그의 카메라, 리브가 Charney의 사용에 대 한 브루스 블 룸 베르크를 인정 하는 가치에 대 한 X. tropicalis 수 유 및 동물 관리 식이요법에 관한 대화.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 or 11252-30 | |
| Eyebrow hair knife | Homemade | ||
| Hair loop | Homemade | ||
| Pasteur pipettes, borosilicate glass | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| Krazy Glue (Cyanoacrylate-based) | Elmer's Products, Inc. | KG581 | To affix eyebrow hair and hair loops into Pasteur pipettes, other similar glues can be used. |
| Oligodeoxynucleotides, custom ordered | Integrated DNA Technologies | Custom ordered | Template oligos for sgRNA synthesis, see Nakayama et al., 2014 for design details. |
| Megascript T7 kit | Ambion/ThermoFisher | AM1334 | Or use Megashortscript T7 (AM1354) kit |
| Phenol, Tris buffered | High quality distilled phenol from any commercial supplier | ||
| Chloroform | High quality chloroform from any commercial supplier | ||
| Ethanol | High quality ethanol from any commercial supplier | ||
| Diethylpyrocarbonate (DEPC) | Sigma Chemical Co. | D5758-50ML | |
| Cas9 protein, with nuclear localization signal | PNA Bio, Inc. | CP01 | Reconstituted using DEPC-treated water according to manufacturer's recommendations |
| 10X Marc's Modified Ringers solution | Homemade. Recipe (ref 26) for 1X MMR (lacking EDTA) is 100mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES. Solution is pH adjusted to 7.4. | ||
| Agarose | Any Molecular Biology grade agarose is sufficient | ||
| 60 X15 mm Petri plates | Falcon | 351007 | |
| 24-well plates | Falcon | 3047 | |
| L-Cysteine | Sigma Chemical Co. | C7352-100G | Free base, not HCl salt |
| Proteinase K | Roche | 03 115 828 001 | Typically ~20mg/ml from Roche |
| sera Micron | sera | Tadpole food. Resuspend in growth medium. Can be purchased from a variety of online retailers |
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