Summary
Geni essenziali per la sopravvivenza pongono ostacoli tecnici per la creazione di linee mutanti. Rincorsa aggira la letalità combinando genoma editing con trapianto di cellule germinali primordiali per creare animali portatori di mutazioni di germline. Rincorsa consente anche la generazione efficiente di omozigoti mutanti nella generazione1 F. Qui, il passo di trapianto è dimostrato.
Abstract
La creazione di linee mutanti di editing genomico sta accelerando l'analisi genetica in molti organismi. Metodi CRISPR/Cas9 sono stati adattati per uso in Rana artigliata africana, Xenopus, un organismo di modello di vecchia data per la ricerca biomedica. Sistemi di allevamento tradizionali per la creazione di linee mutanti omozigoti con mutagenesi CRISPR/Cas9-mirate hanno diversi passaggi che richiede tempo e laboriosi. Per facilitare la creazione di embrioni mutanti, in particolare per superare gli ostacoli associati buttando giù geni che sono essenziali per l'embriogenesi, è stato sviluppato un nuovo metodo chiamato rincorsa. Questa tecnica sfrutta la robustezza degli embrioni di Xenopus di "taglia e incolla" Metodi embriologiche. Rincorsa utilizza il trasferimento di cellule primordiali germinali (PGC) da embrioni donati mutagenizzato efficientemente in fratelli germani PGC-ablazione wildtype. Questo metodo permette l'efficiente mutazione di geni essenziali creando animali chimerici con cellule somatiche wildtype che trasportano una mutante di germline. Quando due animali di0 F che trasportano "leapfrog trapianti" (cioè, mutante cellule germinali) sono incrociate, producono composti o omozigoti, eterozigoti, null F1 embrioni, risparmiando così un tempo di generazione completo per ottenere dati fenotipici. Rincorsa fornisce anche un nuovo approccio per l'analisi dei geni di effetto materno, che sono refrattari ad analisi fenotipica di F0 dopo mutagenesi CRISPR/Cas9. Questo manoscritto descrive in dettaglio il metodo di rincorsa, con speciale enfasi su come effettuare con successo il trapianto di PGC.
Introduction
Come genotipo Codifichi il fenotipo è stata una domanda importante nella biologia dato che la riscoperta delle leggi di Mendel. Una comprensione dei ruoli dei geni, la loro regolazione e interazioni all'interno di reti geniche e le funzioni delle promesse di prodotti codificati per fornire strumenti per scoprire nuova biologia e miglioramento degli Stati di malattia. Per oltre mezzo secolo1, la Rana artigliata africana, Xenopus, è stato un modello di punta per gli studi su una vasta gamma di argomenti in biologia di base e la biomedicina, compreso il controllo genetico dello sviluppo. Storicamente, la maggior parte della ricerca su Xenopus ha utilizzato la rana allotetraploide, X. laevis, ma più recentemente, a causa della sua diploidia, X. tropicalis è stato sviluppato come un modello genetico di anfibio. Sequenze di genoma completo sono stati assemblati da entrambi Xenopus specie2,3. La "comunità di rana" è ora a un punto di svolta dove tecnologia modifica base genoma permette lo studio della funzione genica, praticamente a volontà. Programmabile CRISPR/Cas9 endonucleasi hanno reso la mutagenesi di geni altamente efficiente, con mutazione biallelica possibile nella maggior parte delle cellule di animali4,5,6,7, 8,9,10,11. Questi studi, sottolineati dalla Bhattacharya et al. 12 e Shigeta et al. 13, hanno dimostrato che la funzione di molti geni possa essere studiata mediante mutagenesi in animali di mosaico0 F. Questo approccio ha molti vantaggi; Tuttavia, gli embrioni Cas9-sgRNA-microiniettati visualizzano spesso fenotipi variabili a causa di incompleta perdita di funzione (LOF). Più significativamente, la generazione di linee mutanti è estremamente vantaggiosa per alcune applicazioni — in particolare quando lo studio di geni che hanno un contributo di mRNA materno. Materna mRNA e proteine e le loro influenze su epigenetica, persistono per un periodo prolungato nell'embriogenesi14,15,16, rendendo i primi contributi inerenti allo sviluppo di molti geni refrattario alle analisi0 F. Pertanto, sono necessari altri approcci LOF.
Quando si cerca di creare linee mutanti, il percorso per ottenere embrioni LOF omozigotici ha diversi ostacoli. Mutagenesi in primo luogo, efficiente per produrre mutazioni bialleliche può essere svantaggiosa perché perdita delle funzioni dei geni essenziali esito negativo per sopravvivere alla maturità sessuale, interferendo con la produzione di una linea vitale. Una soluzione comune è la titolazione attenta della quantità di Cas9-sgRNA consegnato. Qui, l'obiettivo è raggiungere un equilibrio tra la riduzione di mortalità anche massimizzando l'efficienza di mutagenesi di germline. Un secondo problema nasce dallo schema standard di allevamento, dove analisi fenotipiche vengono posticipate fino alla generazione2 F. Utilizzando l'approccio standard, sessualmente maturi animali0 F che trasmettono mutante alleli attraverso la linea germinale sono esogamico per produrre F1 "eterozigoti", che poi sono cresciute alla maturità sessuale. Due heterozygotes di1 F sono poi incrociate per produrre embrioni mutanti di F2 a una frequenza di Mendelian prevista del 25%. Due generazioni di allevamento sono quindi necessari per l'analisi dei fenotipi mutanti. Animali mutanti potrebbero essere omozigoti o eterozigoti composti (cioè, progenie contenente due alleli differenti del mutante, che dipende i genotipi di animali parentali utilizzati per il re di1 F).
Questi ostacoli possono essere superati da confinare programmabile mutagenesi nucleasi-mediata delle cellule di germe, che è alla base di un nuovo metodo denominato rincorsa17. Rincorsa ha due componenti principali: (1) la microiniezione di mRNA Cas insieme sgRNA o nucleasi-sgRNA complessi (o, in linea di principio, TALENs o zinco nucleasi a dita) allo stadio unicellulare da mutagenizzare efficientemente genoma embrionale, seguito da (2) il trapianto di PGC negli embrioni di pari livello wildtype, dove sono stati rimossi il PGC endogeno. Quando entrambi i passaggi sono la sostituzione di germline efficiente, completo con le cellule germinali mutante può essere ottenuta. Blackler dimostrata nei primi anni 1960 che Xenopus PGC potrebbe essere trapiantati tra embrioni alla neurula ritardato e presto tailbud fasi18,19. Per salto, approccio di Blackler modifica eseguendo i trapianti blastula fase17, quando PGC sono localizzati nel palo vegetal del embrione20,21. Il trapianto prima gastrulazione ha due vantaggi principali. In primo luogo, l'attecchimento di trapianti e il successivo sviluppo normale è stato trovato per essere più efficiente quando il trapianto viene effettuato nella fase di blastula (osservazioni non pubblicate). In secondo luogo, eseguendo trapianti blastula-fase poco dopo trascrizione zygotic è iniziata, si può evitare la letalità derivanti dal gene inerente allo sviluppo mutazioni che interrompono la gastrulazione o che altrimenti portano a neurulae fine non valido. PGC trapianto-cuscinetto ("scavalcati") gli embrioni sono cresciuti alla maturità sessuale, e intercrosses tra questi animali0 F hanno dimostrato che, in molti casi, il 100% della prole F1 Visualizza il fenotipo LOF (la maggior parte essendo composto eterozigoti), che indica di germline completa sostituzione con le mutazioni mirate.
Si prevede che la rincorsa accelererà approcci genetici in Xenopus. Anche scavalcando fornisce un'alternativa al metodo "ospitare trasferimento"22 per l'analisi LOF di geni effetto materno (osservazioni non pubblicate). Nella pubblicazione corrente, una descrizione dettagliata del metodo, concentrandosi soprattutto sul trapianto di PGC, è presentata in X. tropicalis (con modifiche minori per X. laevis). Il trapianto di PGC è dimostrato qui per facilitare un più rapido trasferimento di questa tecnologia ad altri laboratori lavorando con Xenopus. I principi di questo metodo dovrebbero essere successo in altri anfibi (ad es., urodeli), e le modifiche di organismo-specific nella metodologia dovrebbero consentire per applicazione a molti altri animali in cui è possibile mutagenesi efficiente e PGC sono prontamente transplantable.
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Protocol
Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal comitato di uso dell'Università di California, Irvine e istituzionali Animal Care.
1. preparati per il trapianto di PGC
- Preparare strumenti di dissezione in anticipo, come descritto in precedenza23.
Nota: Coltelli capelli sopracciglio vengono utilizzati per fare delle incisioni con l'assistenza di un ciclo di capelli per stabilizzare l'embrione durante gli interventi chirurgici. Peli delle sopracciglia e capelli cicli sono incollati in pipette Pasteur in vetro borosilicato che prima sono stati disegnati in una fiamma e rotti sulla parte assottigliata (Vedi Figura 1A, punta di freccia) per creare una punta più corta, più ristretto (Figura 1B) per una maggiore destrezza Quando si eseguono interventi chirurgici. - Generare sgRNAs utilizzando le procedure precedentemente descritte24 .
Nota: Brevemente, brevi modelli di DNA codificante per sgRNAs vengono creati utilizzando sovrapposti deoxyoligonucleotides contenente 5' promotori del batteriofago T7, che vengono ricotti e "riempito" di una DNA polimerasi termostabile, privo di errori. Reazioni di sintesi in vitro sgRNA vengono incubate per diverse ore a tutta la notte (a seconda del kit utilizzato). Le reazioni sono dnasi-trattata per rimuovere il modello. I sgRNAs sono purificati mediante le normali tecniche di estrazione e ammonio precipitazioni acetato/isopropanolo fenolo/cloroformio, secondo istruzioni24 del produttore kit. - Poco prima di eseguire microiniezioni, preparare Cas9-sgRNA complessi di primo denaturante ~ 250 ng di sgRNA in un volume totale di 3 µ l di RNAsi-libera (Dietilpirocarbonato-trattati) H2O a 60-65 ° C per 5 min, seguita da un raffreddamento rapido in ghiaccio per 5 min. Centrifugare il sgRNA per pochi secondi, aggiungere 1 µ l di proteina di Cas9 1 µ g / µ l e incubare per 10 min a 37 ° C per promuovere la formazione del complesso.
Nota: al termine dell'incubazione, il tubo può essere tenuto su ghiaccio durante la preparazione degli embrioni per il microinjection. - Fecondazione in vitro usando i metodi standard, come descritto in precedenza25per ottenere embrioni X. tropicalis . De-gelatina25,26 gli embrioni fertilizzazione post-10 min.
Nota: Tempo di fertilizzazione è considerato il tempo dopo la sospensione di sperma viene aggiunto alle uova e il piatto è invaso da 1/9thX Modified Ringers (MMR)26 di Marc. Per X. tropicalis25, a differenza di X. laevis, eseguire il de-gelatine in 1/9 x MMR che contiene 3% cisteina libera base (non il sale HCl), pH regolato a 7,8-8.0, seguito da diversi lavaggi in 1/9 x MMR. Trasferire gli embrioni per un'agarosi (1%)-piatto rivestito contenente 1/9 x MMR a temperatura ambiente. - Trasferire immediatamente gli embrioni deve essere iniettato per un piatto di rivestite su agarosio 1% contenente 1 x MMR utilizzando una pipetta Pasteur.
-
Iniettare nella fase 1-cell. Vedere riferimenti26,27 per una descrizione dettagliata dei metodi di microiniezione di Xenopus .
- Iniettare ogni embrione in un unico sito nel polo animale, con 4 nL del complesso Cas9-sgRNA (importo finale = 1 ng di Cas9 e ~ 250 pg di sgRNA; si veda la discussione)24. Dopo 10-20 min di iniezione sito guarigione, trasferire gli embrioni per un piatto rivestite su agarosio contenente 1/9 x MMR e incubare a 25 ° C. Anche creare un piatto di pari livello uninjected embrioni che serviranno come destinatari dell'innesto.
-
Preparare piastre di Petri (60 mm) che contengono un ~ 5 mm-spessa strato di agarosio all'1% fatto in 0.3 x MMR, se facendo trapianti in X. tropicalis, o 1 x MMR per X. laevis.
- Creare depressioni ~ 3-4 mm profondità inserendo un 3-x 4 pozzetti muffa (creato dal taglio di una piastra PCR a 96 pozzetti) nell'agarosio fuso quando si versa le piastre (vedere Figura 1 e D). Tenere lo stampo parecchi millimetri sopra il fondo del piatto Petri utilizzando un morsetto fissato ad un anello in fino a quando l'agarosio ha indurito.
- Inoltre, fare una piastra a 24 pozzetti agli embrioni singoli casa rivestendo i pozzetti con un sottile strato di agarosio all'1% fatto in 1/9 x MMR.
Nota: Il terreno di coltura aggiunto a questi pozzi è 1/9 x che MMR completati con 50 µ g di gentamicina solfato/mL.
2. trapianto di PGC
- Quando gli embrioni raggiungono solo Nieuwkoop and Faber28 blastula fase 9 (Figura 2A), ~4.5 h post-fertilizzazione (hpf) per X. tropicalis, rimuoverli dall'incubatrice 25 ° C e consentire loro di stabilizzare a temperatura ambiente per un ulteriore 0,5 h.
- Per iniziare il trapianto a 5 hpf (Figura 2B), utilizzare una pipetta Pasteur per trasferire un embrione donatore PGC (iniettato con Cas9-sgRNA) per il piatto di agarosio 60 mm contenente depressioni (create nel passaggio 1.7) in 0.3 x MMR (o 1 x MMR se si utilizza X. laevis). Anche trasferire un embrione di pari livello uninjected, destinatario dell'innesto, per questo piatto.
Nota: È fondamentale che le identità di ciascuno di questi embrioni non sono confusi. - Manualmente rimuovere le buste vitellina da ogni embrione usando il forcipe e ruotare entrambi gli embrioni, in modo che i loro pali vegetal sono in vista e accessibile per la chirurgia.
Nota: Una descrizione del manuale de-vitellination di embrioni precedentemente è stato descritto26. - Utilizzando la punta tagliente di un coltello di capelli sopracciglio, fare quattro incisioni poco profonde a forma di un quadrato sul palo vegetal dell'embrione destinatario, all'interno della zona dove si formerà futuri bottiglia cellule che segnano il blastoporo. Rendere le incisioni inserendo la punta del coltello capelli sopracciglio in embrione, appena sotto la superficie e fanno affettare verso l'alto movimenti mentre stabilizzando l'embrione con il ciclo dei capelli.
Nota: La figura 2 Mostra vegetal visualizzazioni di un embrione a intervalli di mezz'ora da 4.5-7.0 hpf per mostrare le dimensioni della cella e di fornire una guida per la stima di cui le cellule di bottiglie formeranno (cerchio con tratteggio bianco). L'obiettivo è quello di fare delle incisioni dove la scatola nera tratteggiata è indicata. - Una volta che i quattro lati della piazza sono delineati dalle incisioni, approfondire ogni incisione con il coltello di capelli sopracciglio usando simili movimenti di taglio per raggiungere una profondità di circa 1/3 a 1/2 della distanza al piano Blastocele.
- Gratis l'espianto di tessuto vegetale dall'embrione destinatario (Figura 3A e B) facendo un'orizzontale (parallela alla superficie vegetale) cut(s) nella regione profonda vegetale.
Nota: La dimensione del explant vegetali contenenti PGC è circa 0,4-0.45 mm per lato e 0.25-0.3 mm di profondità. Questo vegetale espianto dell'embrione destinatario non è più necessario e pertanto dovrebbe essere accantonata per essere scartato. - Lavorare rapidamente, ripetere questa procedura (procedura 2.4-2.6) sull'embrione donatore PGC per creare un frammento di tessuto vegetale dimensioni simili per trapianto.
Nota: È importante effettuare questa seconda dissezione con poco ritardo per ridurre al minimo il tempo per l'embrione destinatario guarire la sua ferita aperta. - Una volta che il tessuto contenente PGC è rimosso dall'embrione donatore, è possibile utilizzare il ciclo di capelli sopracciglio coltello e capelli per spostare questo espianto in posizione nell'apertura creata nell'embrione destinatario.
Nota: La superficie interna dell'innesto erogatore deve essere rivolto verso l'interno dell'embrione destinatario. Non è necessario abbinare gli orientamenti degli assi dorso-ventrale e sinistra-destra dell'innesto con l'embrione destinatario. - Utilizzare il lato lungo dell'albero del coltello capelli sopracciglio, tenuto parallelo alla superficie dell'innesto, premere delicatamente l'innesto nell'apertura la superficie vegetale dell'embrione destinatario.
- Una volta che l'innesto è stato inserito, è possibile utilizzare un hairloop o l'albero di un coltello di capelli sopracciglio per scivolare delicatamente la "carcassa" dell'embrione donatore su tutta la superficie di agarosio e in una depressione di agarosio. Assicurarsi che la ferita aperta della carcassa è rivolto il liquido di massa. In caso contrario, utilizzare il coltello di capelli sopracciglio per ruotare l'embrione per ottenere questo orientamento.
- Far scorrere l'embrione destinatario, con l'innesto di guarigione nel posto, in una depressione adiacente e similarmente assicurarsi che il tessuto innestato vegetal palo sia rivolto verso il liquido di massa.
- Ripetere questa procedura (procedura 2.1-2.11) utilizzando un altro paio di donatore e destinatari embrioni per creare un'altra coppia di trapianto/carcassa; trasferire questi alle depressioni vuote.
Nota: È fondamentale che uno fa notazioni per tenere traccia delle coppie corrispondenti di carcasse e di trapianto-cuscinetto embrioni. Le carcasse di donatore verranno utilizzate come un proxy per l'efficienza di mutagenesi indotta da Cas9-sgRNA nel PGC trapiantato, che non può essere analizzato facilmente fino a quando gli animali di trapianto-cuscinetto raggiungono la maturità sessuale (vedi passo 3.3, sotto e la discussione ). - Continuare a fare i trapianti gli embrioni fino a Stadio di gastrula circa precoce 10, che è di circa 6,5 hpf in X. tropicalis (Vedi Figura 2E).
3. post-guarigione cura di embrioni
Nota: Gli innesti guariscono in posto all'interno di ~ 30 min, ed è normale osservare alcuni detriti yolky da lisi cellulare che trasuda dall'embrione (Figura 3).
-
Una volta guarito, è possibile utilizzare una pipetta Pasteur per molto delicatamente trasferimento embrioni dalle depressioni per singoli pozzetti di una piastra di 24 pozzetti rivestite su agarosio. L'essudato sarà rimosso (figura 3D) di liquido di miscelazione durante il trasferimento.
- Ruotare gli embrioni in modo che vengono inseriti vegetali poli fino, rivolto verso la soluzione di massa. Ancora una volta, posizionare le carcasse del donatore e dell'innesto di destinatari in pozzetti adiacenti per aiutare a tenere traccia delle coppie di embrione; registrare queste informazioni.
- Trasferire la piastra 24 pozzetti contenenti embrioni per un incubatore di 25 ° C per la coltura durante la notte.
Nota: Il giorno successivo, gli embrioni hanno raggiunto fasi tailbud. - Spostare i destinatari dell'innesto per pulire piastre di 6 pozzetti rivestite su agarosio contenente x 1/9 che MMR completati con 50 µ g di gentamicina solfato/mL, con 1 embrione per pozzetto. Mantenere un record chiaro delle carcasse di donatore che corrispondono a questi destinatari del trapianto.
- Per valutare l'efficienza di mutagenesi sequenziamento PCR ampliconi5,17,24 o utilizzando altri metodi che si basano su ampliconi PCR (Vedi la discussione), è possibile spostare singole carcasse per provette da 0,2 mL PCR striscia. Rimuovere la maggior parte del mezzo e omogeneizzare in 100 µ l di tampone Lisi24 contenente proteinasi K (PK) da ripetuti altalenante pipettaggio utilizzando una pipetta P200.
- Eseguire embrione Lisi24 a 56 ° C per 6 h a tutta la notte per consentire la digestione PK. Inattivare PK riscaldandolo a 90-95 ° C per 10 min, seguito da un rapido raffreddamento a 4 ° C. Utilizzare lisati senza ulteriori operazioni di disinfezione per le reazioni di PCR per ottenere brevi sequenze amplificate per diretto di sequenziamento Sanger DNA24del seme. Memorizzare i lisati a-20 ° C.
Nota: All'interno di diversi giorni, i girini raggiungeranno fasi di alimentazione (circa 45-46 di fase) e possono essere alimentati una sospensione di polvere planctonica (sieri Micron). - Dopo ~ 1 settimana, con variazioni giornaliere di terreno di coltura per mantenere la pulizia e ridurre al minimo la crescita eccessiva batterica, è necessario spostare girini in piccoli serbatoi in un sistema di ricircolo acquatico con flusso gocciolare. Utilizzare i dati di sequenziamento per segregare i girini con altamente efficiente mutagenized PGC da girini con minore efficienza di mutagenesi. Una volta completata la metamorfosi, spostare le ranocchiette adulto sistema acquatico in laboratorio.
Nota: Regimi sviluppati dalla risorsa nazionale di Xenopus (Marine Biology Laboratory, Woods Hole, MA) forniscono una guida per girino alimentazione29 e adulto rana manutenzione30.
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Representative Results
A seguito di trapianto, la determinazione qualitativa dell'efficacia di mutagenesi CRISPR/Cas9 deve essere eseguita prima di spendere lo sforzo in zootecnia per crescere e mantenere gli animali alla maturità sessuale. Poiché gli animali che trasportano leapfrog trapianti sono somaticamente wildtype e germinale è di difficile accesso per misure dirette, salvando le carcasse degli embrioni donati diventa importante. L'analisi del DNA dalle carcasse funge da proxy per il limite di mutagenesi che si verifica nel germline trapiantati17.
Un approccio per valutare il successo di mutagenesi è direttamente sequenza ampliconi PCR che attraversa la regione genomica presi di mira. Ciò diventa particolarmente costoso e inefficiente se uno desidera sequenza numerosi frammenti di DNA clonato individualmente da molti animali. Invece, sequenziamento ampliconi eterogenei presso il sito di destinazione, come sono derivati da geneticamente gli embrioni di mosaico, viene utilizzato per valutare l'efficienza di mutagenesi in ogni embrione19. Visualizzazione dei cromatogrammi Mostra la sequenza wild-type (picchi) a Monte della destinazione di sequenza e cime diventati "criptato" (vale a dire, la co-occorrenza dei picchi corrispondenti a basi multiple che compaiono in ogni posizione del nucleotide) a valle del il sito delle rotture a doppio filamento Cas9-catalizzata. Esempi di tali profili possono essere trovati a figura S1 di Blitz et al. 17. Quantificazione accurata della portata della mutagenesi rappresentata da questi picchi strapazzati può essere ottenuta utilizzando un algoritmo di decomposizione di sequenza, la marea (https://tide-calculator.nki.nl/)31. Embrioni singoli usando questa tecnica di screening dà fiducia che ogni embrione correttamente è stato iniettato e mirata per mutagenesi. Un tracciante, ad esempio un destrano fluorescente contrassegnato, può essere utilizzato per confermare il successo iniezione24 e può anche aiutare a stabilire che un girino infatti sta portando il tessuto trapiantato (dati non pubblicati). È importante notare che non è stata esplorata la possibilità formale che la co-iniezione di un destrano fluorescente insieme a Cas9-sgRNA potrebbe alterare l'efficienza di mutagenesi Cas9. Eventuali embrioni "leapfrogged" contenente i trapianti da donatori poco o unmutagenized possono essere scartati.
Rincorsa aggira la necessità per l'analisi di F2 generazione nei regimi standard di selezione genetica, consentendo analisi fenotipiche efficiente negli embrioni1 F. Quando si utilizza l'approccio standard per mutare i geni essenziali, un'attenta titolazione della dose di Cas9-sgRNA è necessaria per garantire la vitalità degli embrioni fondatore, risultante in un'efficienza ridotta mutagenesi. Sopravvivendo F0 animali da questo schema standard sono quindi esogamico con wildtypes per ottenere embrioni vitali di F1 , che sono sottoposti a screening per identificare i vettori. Infine, questi heterozygotes di1 F sono cresciuto alla maturità sessuale e incrociate per ottenere individui omozigoti di2 F visualizzazione fenotipi mutanti. Al contrario, perché scavalcamento produce animali che hanno la sostituzione completa del loro germlines con gli alleli del mutante, incrociando questi animali0 F produce fenotipi mutanti nella generazione1 F. Blitz et al. 17 riferito che una maggioranza degli animali0 F mirati presso il locus di tirosinasi (tyr), che è necessario per la pigmentazione di melanociti e retina, ha mostrato 100% trasmissione nella linea germinale (misurata da esogamici con Tyr- / - animali albini) donatore-derivati dei genoma del mutante (Vedi Figura 4A-B e tabella 1). Così, incrociando due animali prodotti dalla rincorsa produrrebbe omozigoti o eterozigoti mutante F1 embrioni.
Risultati simili sono stati ottenuti17 incrociando F0 scavalcato animali portatori di mutazioni nel omeobox (codifica homeodomain DNA-binding) del gene goosecoid (gsc) (Vedi Figura 4A, C-H). Atterramenti di espressione di Gsc utilizzando oligonucleotidi antisenso morpholino in X. laevis ha suggerito che il gene di gsc è necessario per lo sviluppo completo della testa anteriore32, e Cas9-sgRNA iniettato girini anche Visualizza fenotipi letale embrionale17. Tuttavia, i leapfrogged F0 animali, essendo somaticamente wild-type, sono vitali e robusto, e il re di1 F embrioni con i fenotipi LOF identici a quelle pubblicate in X. laevis atterramenti17prodotti. Questi dati della genetica corroborazione del fenotipo morpholino, così come una prova di principio quella rincorsa può essere utilizzato per superare i fenotipi letali embrionali.
Figura 1: materiali necessari per il trapianto. Vetro borosilicato (A) pipette Pasteur sono usate per fare i capelli e sopracciglia capelli coltelli loop per microchirurgia su embrioni in anticipo. Disegno su vetro utilizzando un bruciatore di Bunsen permette per un fine più stretto per l'inserimento dei capelli. La punta della freccia rossa segna la posizione approssimativa in cui rompere il vetro. (B) un esempio di un sopracciglio capelli coltello (in alto) e il ciclo dei capelli (in basso), fissato in pipette con colla a presa rapida. (C), A parte di una piastra PCR a 96 pozzetti è utilizzata per creare depressioni in una piastra di agarosio consentendo l'agarosio 1% a solidificare intorno allo stampo (agarosio fatta in 0,3 x o 1 x MMR, a seconda se i trapianti eseguiti in X. tropicalis o X. laevis, rispettivamente). Lo spessore di agarosio è di ~ 5 mm, con 3-4 mm-pozzi profondi. (D) un esempio di un piatto di agarosio per trapianto, con 12 depressioni, come mostrato nel pannello C. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: morfologia del palo vegetal durante il tardo blastula a stadi precoci di gastrula e la strategia per dissezione. (A-F) Embrioni di Xenopus tropicalis vengono visualizzati nella vista vegetale a intervalli di tempo ogni mezz'ora, da inizio della blastula fase 9 (4.5 hpf) a presto gastrula fase ~10.25 (7 hpf). Prima 5 hpf, blastomeri sono grandi e più facilmente danneggiabili. Il bianco, cerchio con tratteggio contrassegna la posizione prevista di formazione delle cellule della bottiglia durante la gastrulazione, che può essere visto formando inizio dal lato dorsale (superiore) nei pannelli (E e F). Per salto, quattro incisioni sono fatte all'interno di un quadrato, raffigurato da linee nere tratteggiate, con un finale tagliato fatto parallelo alla superficie del tessuto (non illustrato) gratuita explant vegetale. Barra della scala = 400 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: trapianto. (A) un esempio di un embrione di hpf ~5.5 dopo la rimozione del tessuto vegetale contenenti PGC. La casella tratteggiata nera e il cerchio con tratteggio bianco sono le stesse dimensioni relative come quelli mostrati nella Figura 2. (B) i vegetali explant rimosso dall'embrione nel pannello A, superficie interna rivolto verso lo spettatore, è di circa 0,4-0.45 mm per lato e 0.25-0.3 mm di profondità. (C) un embrione con il tessuto vegetale trapiantato. L'immagine è stata acquisita ~ 10 min dopo trapianto. Tessuto (D), 30 min dopo il trapianto, il vegetale è visto hanno guarito in posto (agitando delicatamente con un coltello di capelli sopracciglio sopra che l'embrione è stato utilizzato per creare un vortice che spazzò via i detriti visto nel pannello C). Dopo il trasferimento al 1/9 x MMR e incubazione a 25 ° C, più embrioni completano normalmente gastrulazione. Barra della scala = 400 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Trasmissione di Germline aninali0 F prodotta di scavalcamento. (A) per rincorsa, due geni sono stati presi di mira da CRISPR/Cas9, tirosinasi (in alto) e goosecoid (in basso). Il gene di tyr era mirata4,5 entro il sequenziamento di codifica (ombreggiatura blu) per un peptide di segnale N-terminale (ombreggiatura SP, rosso), mentre il gene di gsc è stato mirato17 all'interno di sequenza di codifica il all'inizio del homeobox (sfondo rosso), che è diviso tra due esoni. Le regioni exonic 5' e 3' non tradotte sono non ombreggiate. (B) girini1 tutti i 160 F da (Vedi anche tabella 1) un accoppiamento di un maschio di0 F leapfrogged (LF1) e un albino (tyr-/-) erano albino, che indica che femmina intera linea germinale dal maschio leapfrogged era stato sostituito con tyr mutante cellule germinali. L'inserto mostra un girino di selvaggio-tipo con la normale pigmentazione retinica e melanociti. (C-H) F1 embrioni derivati da un re tra due F0 scavalcato Xenopus targeting del gene homeobox gsc. Circa 2/3rds degli embrioni erano fenotipico mutante per SGC, con il fenotipo di vari gradi di troncamento anteriore della testa (E-H). Metà dei mutanti erano entrambi ciclopiche o aveva occhi ravvicinati (F), mentre l'altra metà erano eyeless (H). Genotipizzazione ha mostrato questi ad essere omozigoti o eterozigoti composti. Il 1/3rd di embrioni risultati fenotipo selvaggio-tipo (C, D) erano omozigoti wild-type o eterozigoti. Ibridazione in situ per otx2 (un indicatore del proencefalo, mesencefalo e occhi), egr2 (un indicatore del hindbrain rhombomeres 3 e 5 e un flusso di cresta neurale) e hoxb9 (un indicatore del midollo spinale) dimostra che la perdita di GSC funzione riguarda solo la porzione anteriore del dominio otx2 . Questi dati sono riportati da Blitz et al. 17 con il permesso della società dei biologi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Croce | Uomo | Donna | Albino | Wild-type | Totale | Albino % |
| 1 | LF1 | Tyr-/- | 160 | 0 | 160 | 100 |
| 2 | LF2 | Tyr-/- | 148 | 0 | 148 | 100 |
| 3 | Tyr-/- | LF3 | 409 | 0 | 409 | 100 |
| 4 | Tyr-/- | LF4 | 0 | 519 | 519 | 0 |
| 5 | Tyr-/- | LF5 | 223 | 0 | 223 | 100 |
| 6 | LF6 | Tyr-/- | 493 | 703 | 1196 | 41,2 |
| 7 | Tyr-/- | LF7 | 1 | 94 | 95 | 1.1 |
| 8 | Tyr-/- | LF8 | 125 | 0 | 125 | 100 |
| 9 | Tyr-/- | LF9 | 0 | 417 | 417 | 0 |
| 10 | Tyr-/- | LF10 | 252 | 0 | 252 | 100 |
Tabella 1: Sostituzione di germline efficiente da leapfrog trapianti che trasportano le mutazioni in tirosinasi. Targeting tirosinasi, animali di trapianto-cuscinetto di entrambi i sessi sono stati ottenuti. Questi animali sono stati incrociati con gli albini, che sono omozigotici tyr- / -, per verificare l'efficienza della trasmissione germinale di alleli del mutante e la percentuale di embrioni1 F che ha mostrato l'albinismo è stata analizzata nella fase di girino. Le voci nelle colonne "Maschio" e "Femmina" indicano quale genitore è tyr- / - o l'animale prova derivata dalla rincorsa (LF). La percentuale degli embrioni all'interno una croce che mostra il fenotipo albino sono indicati sotto "% Albino." Si noti che 6 dei 10 animali con i trapianti leapfrog ha mostrato la sostituzione completa (100%) con gli alleli del mutante. Questa tabella è riprodotto dal Blitz et al. 17, con il permesso.
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Discussion
Questo rapporto fornisce un protocollo dettagliato per il trapianto del tessuto vegetale contenente PGC. trapianto di PGC viene utilizzato in combinazione con tecnologie di editing genomico (ad es., CRISPR/Cas9) per modificare la linea germinale di un animale mentre mantenendo quasi tutti i suoi tessuti somatici come geneticamente wild-type. Per la rincorsa per avere successo, ci sono un numero di fattori critici da considerare prima di eseguire trapianti performanti.
Per garantire la completa sostituzione della linea germinale, con gli alleli del mutante, è consigliabile che si determina in primo luogo l'efficienza in vivo di sgRNAs. L'esperienza suggerisce che la maggior parte sgRNAs progettato da CRISPRDirect (https://crispr.dbcls.jp/) o CRISPRScan (http://www.crisprscan.org/) sono efficienti quando usato a 250 pg/embrione. Tuttavia, in alcuni casi, potrebbe essere necessario utilizzare concentrazioni più elevate (ad es., il gsc sgRNA pubblicato da Blitz et al17, richiesto ~ 1 ng/embrione). Valutare l'efficienza di mutagenesi del sito di destinazione è essenziale e l'utilizzo di marea permette una valutazione quantitativa31. Mentre il metodo sottolineato qui utilizza il Sanger diretto sequenziamento degli ampliconi PCR (che rappresentano la popolazione di alleli del mutante in embrioni di0 F), numerosi altri metodi sono stati utilizzati nella letteratura editing genomico per questo scopo. Altre tecniche di basso-moderato-costo che sono comunemente usati includono analisi di polimorfismo di lunghezza di frammento utilizzando sia la perdita di enzimi di restrizione33 o Cas9/TALEN clivaggio siti34, T7 endonucleasi 135 e Surveyor 36 saggi, la mobilità dell'eteroduplex dosaggio37, il dosaggio della fusione ad alta risoluzione38, frammentano analisi mediante elettroforesi capillare39,40e metodi basati su qPCR41, 42.
Una seconda considerazione è la scelta della posizione del sito di destinazione all'interno del gene bersaglio. Per consentire il recupero efficiente dei fenotipi mutanti nella generazione1 F, è importante massimizzare le possibilità per gli alleli LOF completi. Quando si effettuano linee mutanti utilizzando approcci classici è una strategia comune per clivaggio Cas9 vicino l'estremità 5' di regioni, per suscitare la cessazione prematura traduzione vicino all'inizio della regione di codificazione della proteina di codifica di destinazione. Gli eterozigoti F1 sarebbero identificati con le mutazioni frameshift, e questi animali dovrebbe essere selezionati per ulteriore lavoro, perché essi sono tenuti a portare alleli null. Poiché la strategia di rincorsa utilizza F0 intercrosses, l'approccio di targeting 5' conclusione della sequenza di codificazione sarebbe altamente inefficiente. F0 embrioni hanno mosaico germlines, e incrociatesi risultati in popolazioni di mutanti di1 F che sono per lo più composti heterozygotes17. Poiché analisi su larga scala ha verificato che, in media, il previsto ~1/3rd delle mutazioni prodotto da rotture a doppio filamento sono in-struttura43, più embrioni di1 F prodotti in questo modo avrebbero avuto almeno un allele con un a-frame mutazione che potrebbe mantenere attività di tipo selvaggio. Pertanto, una strategia diversa è necessario per garantire che anche questi alleli del mutante in-frame sono suscettibili di essere valori null. Rotture del doppio filo all'interno dei domini di ripiegamento delle proteine che sono essenziali per la funzione normale della proteina di targeting dovrebbe comportare una maggiore probabilità di completa LOF (null alleli)17,44. Un'attenta considerazione per il livello atomico espletati di domini proteici, quando disponibile, può aiutare a identificare regioni della struttura secondaria che, anche quando contenente un'omissione in-struttura di singolo amminoacido, potrebbe essere previsto per perturbare la struttura di dominio ( ad esempio, la mutazione di Δ3bp in gsc pubblicato da Blitz et al.17). Se CRISPR/Cas9 siti di destinazione possono essere identificati all'interno di queste regioni, uno ha una maggiore probabilità di creare con successo gli alleli null. Piccole omissioni all'interno di cicli esposte al solvente tra componenti strutturali secondari di proteine sono meno desiderabile perché le mutazioni nelle regioni più flessibile potrebbero ancora provocare proteine funzionali.
Una terza considerazione per scavalcamento è l'efficienza di rimozione di PGC dall'embrione destinatario. Questo passaggio deve essere efficiente al fine di garantire la sostituzione completa di germline. Non è attualmente chiaro se tutti gli embrioni destinatario dell'innesto prodotti con il metodo descritto qui hanno la rimozione completa del loro PGC. intero-monta in situ ibridazioni Visualizza variabilità nella localizzazione di marcatori PGC in embrioni blastula-fase. In molti casi, tutti o quasi tutti il segnale si trova verso la fine di vegetale-la maggior parte dell'embrione e quindi sarebbe stato rimosso dalla chirurgia qui delineata (Blitz et al.17 e citazioni ivi). Tuttavia, alcuni embrioni mostrano espressione di marcatori PGC in alcune cellule più vicino al pavimento Blastocele. Germinativo prima assegna al palo vegetal dopo la fecondazione e quindi viene sagomata lungo solchi di clivaggio durante fenditure. Alcuni plasma germinativo può diventare distribuito in cellule nel mezzo dell'emisfero vegetale e non possono essere efficacemente senza l'utilizzo di trapianti che si estendono verso il Blastocele. Tuttavia, è anche importante notare che queste cellule profonde contenente gli indicatori delle cellule di germe non potrebbero contribuire alla linea germinale, come i microRNA sono noti per cancellare PGC mRNA da cellule somatiche45,46. Queste cellule profonde macchiatura positiva per gli indicatori PGC potrebbero essere cellule somatiche che subiscono tale liquidazione. Metodi per garantire la completa rimozione di PGC da destinatari embrioni sono attualmente in fase di sviluppo.
Infine, è anche importante considerare quanti animali di0 F per generare di rincorsa. Come un numero variabile di animali non sopravviverà alla maturità sessuale, è consigliabile che vengano creati più di 20 embrioni contenente i trapianti. Sarà necessario avere animali abbastanza sopravvissuti per garantire (1) che un numero sufficiente di entrambi i sessi saranno ottenuti e (2) che questi trasmettono alleli mutanti ad una frequenza sufficientemente alta per essere adatto per le analisi previste dal ricercatore.
Mediante il protocollo descritto qui, con una certa pratica, embriologi anfibio dovrebbero essere in grado di padroneggiare la tecnica di trapianti PGC con una certa pratica. Rincorsa dovrebbe essere possibile, non solo in altri anfibi, ma anche altri organismi contenente PGC che sono prontamente transplantable tra individui alle prime fasi dell'embriogenesi.
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Disclosures
L'autore non ha nulla di divulgare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato effettuato con il supporto di una sovvenzione, 5R21HD080684-02, dal National Institute of Child Health and Human Development. L'autore desidera ringraziare Ken Cho per il suo continuo entusiasmo e sostegno. L'autore desidera inoltre ringraziare Bruce Blumberg per uso della sua macchina fotografica, Rebekah Charney, per la lettura critica del manoscritto e Sean McNamara e Marcin Wlizla presso la risorsa nazionale di Xenopus (RRID:SCR_013731), per le preziose conversazioni per quanto riguarda X. tropicalis alimentazione e regimi di cura degli animali.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 or 11252-30 | |
| Eyebrow hair knife | Homemade | ||
| Hair loop | Homemade | ||
| Pasteur pipettes, borosilicate glass | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| Krazy Glue (Cyanoacrylate-based) | Elmer's Products, Inc. | KG581 | To affix eyebrow hair and hair loops into Pasteur pipettes, other similar glues can be used. |
| Oligodeoxynucleotides, custom ordered | Integrated DNA Technologies | Custom ordered | Template oligos for sgRNA synthesis, see Nakayama et al., 2014 for design details. |
| Megascript T7 kit | Ambion/ThermoFisher | AM1334 | Or use Megashortscript T7 (AM1354) kit |
| Phenol, Tris buffered | High quality distilled phenol from any commercial supplier | ||
| Chloroform | High quality chloroform from any commercial supplier | ||
| Ethanol | High quality ethanol from any commercial supplier | ||
| Diethylpyrocarbonate (DEPC) | Sigma Chemical Co. | D5758-50ML | |
| Cas9 protein, with nuclear localization signal | PNA Bio, Inc. | CP01 | Reconstituted using DEPC-treated water according to manufacturer's recommendations |
| 10X Marc's Modified Ringers solution | Homemade. Recipe (ref 26) for 1X MMR (lacking EDTA) is 100mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES. Solution is pH adjusted to 7.4. | ||
| Agarose | Any Molecular Biology grade agarose is sufficient | ||
| 60 X15 mm Petri plates | Falcon | 351007 | |
| 24-well plates | Falcon | 3047 | |
| L-Cysteine | Sigma Chemical Co. | C7352-100G | Free base, not HCl salt |
| Proteinase K | Roche | 03 115 828 001 | Typically ~20mg/ml from Roche |
| sera Micron | sera | Tadpole food. Resuspend in growth medium. Can be purchased from a variety of online retailers |
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