Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

CRISPR/Cas9-tabanlı Xenopus Leapfrogging için ilkel Germ hücre transplantasyonu

Published: February 1, 2018 doi: 10.3791/56035
Automatic Translation
1
1Department of Developmental and Cell Biology, University of California, Irvine

Summary

Hayatta kalmak için gerekli genler mutant satırları oluşturmak için teknik engel oluşturmaktadır. Leapfrogging ölümcül germline mutasyonlar taşıyan vahşi-türü hayvanlar oluşturmak için ilkel germ hücre transplantasyonu ile düzenleme genom birleştirerek kaçınmanızı sağlar. Leapfrogging de F1 nesil homozigoz null mutantların üretimi verimli verir. Burada, nakli adım gösterilmiştir.

Abstract

Genom düzenleme mutant satırların yaratılması çoğu canlıda genetik analiz hızlanıyor. CRISPR/Cas9 yöntemleri Afrika pençeli kurbağası, Xenopus, uzun süredir devam eden model organizma biyomedikal araştırmalar için kullanmak için adapte edilmiştir. Homozigoz mutant hatları ile mutagenesis CRISPR/Cas9-hedef oluşturmak için geleneksel ıslah düzenleri çeşitli zaman alan ve zahmetli adımlar var. Özellikle embriyo için gerekli olan genlerin dışarı vurma ile ilişkili engelleri aşmak için mutant embriyo oluşturulması kolaylaştırmak için leapfrogging adlı yeni bir yöntem geliştirildi. Bu teknik Xenopus embriyo "kes ve Yapıştır" sağlamlık güçlendirir embriyoda yöntemleri. Leapfrogging primordial germ hücreleri (PGCs) transferini PGC-ablated wildtype kardeşler verimli bir şekilde mutagenized donör embriyo kullanır. Bu yöntem için temel gen mutasyon verimli chimeric hayvanları içeren bir mutant germline taşıyan wildtype somatik hücreler oluşturarak sağlar. Ne zaman iki F0 hayvan taşıyan "birdirbir nakli" (Yani, mutant germ hücreleri) intercrossed, böylece fenotipik verileri elde etmek için tam üretimi zamandan tasarruf homozigoz veya bileşik heterozigoz, null F1 embriyolar, ürettikleri. Leapfrogging de yeni bir yaklaşım CRISPR/Cas9 mutagenesis takip F0 fenotipik analiz için ateşe dayanıklı anne etkisi genler analiz etmek için sağlar. Bu el yazması PGC nakli başarıyla gerçekleştirmek nasıl üzerinde durularak leapfrogging yöntemi ayrıntıları.

Introduction

Nasıl kodladığını genotip fenotip yeniden keşfi beri Biyoloji Mendel'ın yasaları büyük bir soru olmuştur. Genler, onların yönetmelik ve etkileşimleri gen ağları içerisinde rolleri ve işlevleri açığa çıkarmak yeni Biyoloji ve hastalık durumlarında ameliorating araçları sağlamak için kodlanmış ürünleri vaatlerin bir anlayış. Yarım yüzyıl1için, Afrika pençeli kurbağası Xenopus, temel Biyoloji ve Biyomedikal geliştirme genetik kontrolü de dahil olmak üzere, çok çeşitli konular üzerinde çalışmalar için önde gelen bir model olmuştur. Tarihsel olarak, çoğu araştırma Xenopus allotetraploid kurbağa, X. laevis, kullandı ama son zamanlarda, onun diploidy nedeniyle X. tropicalis bir amfibi genetik model olarak geliştirilmiştir. Komple genom dizileri hem Xenopus türler2,3monte edilmiştir. "Kurbağa" Şimdi bir dönüm noktasında nerede temel genom değişiklik teknoloji eğitim gen işlevinin hemen hemen at will ruhsatı topluluktur. Programlanabilir CRISPR/Cas9 endonucleases gen mutagenesis yüksek verimli, biallelic mutasyon mümkün çoğu hücrelerde hayvan4,5,6,7ile yapmış, 8,9,10,11. Bu çalışmalar, Bhattacharya vd tarafından vurguladı 12 ve Shigeta vd. 13, birçok genlerin fonksiyonun F0 mozaik hayvanlarda mutagenesis tarafından okudu olabilir göstermiştir. Bu yaklaşım pek çok avantajı vardır; Ancak, Cas9-sgRNA-microinjected embriyo çoğunlukla nedeniyle eksik işlev (LOF) kaybı değişken fenotipleri görüntüler. Daha da önemlisi, mutant satırları bazı uygulamalar için son derece avantajlı olduğunu — bir anne mRNA katkı var genler okurken özellikle. Anne mRNA'ların ve proteinler ve onların etkileri epigenetik üzerinde uzun bir süre için erken gelişimsel katkıları pek çok gen işleme embriyogenez14,15,16, kalıcı Refrakter F0 analiz için. Bu nedenle, diğer LOF yaklaşımlar gereklidir.

Mutant satırları oluşturmak Aradığınız zaman, çeşitli engeller homozigoz LOF embriyo elde etmek için yolu vardır. Çünkü cinsel olgunluk, uygun bir çizgi üretimi ile müdahale için hayatta yetersizliğinde temel gen işlev sonuçlar biallelic mutasyonları üretmek için ilk, verimli mutagenesis dezavantajlı olabilir. Cas9-sgRNA teslim miktarı dikkatli titrasyon ortak bir çözümdür. Amaç da germline mutagenesis verimliliği en üst düzeye ölümcül azaltmak arasında bir denge elde etmek için burada. İkinci bir sorun nerede fenotipik analizleri F2 nesil kadar ertelenmiş standart üreme düzeninden doğar. Standart yaklaşım kullanarak, mutant gen germline aracılığıyla "hangi sonra cinsel olgunluğa yetiştirilmektedir F1 heterozigoz taşıyıcılar", üretmek için outcrossed iletimi F0 hayvanlar cinsel olgun. İki F1 heterozygotes sonra F2 mutant embriyo % 25 bir beklenen Mendel frekansta üretmek için intercrossed. Böylece, iki kuşak ıslahının mutant fenotipleri analizi için gereklidir. Mutant hayvanlar ya homozygotes ya da bileşik heterozygotes (F1 intercross içinde kullanılan ebeveyn hayvanların genotip bağlıdır içeren iki farklı mutant gen,Yani, döl) olabilir.

Hangi leapfrogging17adlı yeni bir yöntemi altında yatan programlanabilir nükleaz aracılı mutagenesis germ hücreleri, hapsetmesi tarafından bu engellerin üstesinden gelebilir. Leapfrogging iki ana bileşeni vardır: (1 mikroenjeksiyon Cas mRNA ile birlikte sgRNA veya nükleaz-sgRNA kompleksleri (veya, ilke, TALENs veya çinko parmak enzimler) embriyonik genom verimli bir şekilde mutagenize için tek hücreli aşamada takip (2) tarafından PGCs nakli içine wildtype kardeş embriyolar, nerede endojen PGCs çıkarıldı. Her iki adım mutant germ hücreleri ile verimli, tam germline replasmanı olduğunda elde edilebilir. Blackler 1960'ların başında Xenopus PGCs geç neurula, embriyo ve erken tailbud aşamaları18,19arasında nakledilen gösterdi. Leapfrogging için Blackler'ın yaklaşımı PGCs embriyo20,21bitkisel kutbunda yerelleştirilmiş zaman blastula aşamasında17, nakillerine gerçekleştirerek güncellenmiştir. Nakli gastrulasyon önce iki ana avantajı vardır. İlk olarak, nakli ve sonraki normal gelişim engraftment ekimi blastula aşamasında (yayınlanmamış gözlemler) gerçekleştirildiğinde daha verimli olmasını bulundu. İkinci olarak, kısa bir süre zygotic transkripsiyon başladıktan sonra blastula aşamasında nakillerine gerçekleştirerek, bir gelişimsel gen gastrulasyon veya bu bozabilir mutasyonlar, aksi halde hatalı biçimlendirilmiş geç neurulae için yol kaynaklanan ölümcül önleyebilirsiniz. PGC nakli taşıyan embriyolar ("başkanıkendini") için cinsel olgunluğa yetiştirilen ve intercrosses bu F0 hayvanlar arasında birçok durumda, F1 döl % 100'ünü (çoğu bileşik varlık LOF fenotip görüntülemesini göstermiştir heterozygotes), tam germline değiştirme ile hedeflenen mutasyonlar gösteren.

Bu leapfrogging Xenopusgenetik yaklaşımlar hızlanır bekleniyor. Anne etkisi genler (yayınlanmamış gözlemler) LOF analizi için alternatif "transfer ev sahipliği" yöntemi22 sağlar Ayrıca leapfrogging. Geçerli yayında özellikle PGC nakli üzerinde odaklama yöntemi, ayrıntılı bir açıklama X. tropicalis içinde ( X. laevisiçin küçük değişiklikler) sunulur. PGCs nakli burada Xenopusile çalışan diğer laboratuvarlar bu teknolojinin daha hızlı bir transfer kolaylaştırmak için gösterilmiştir. Bu yöntemin ilkeleri diğer kurbağalar (Örneğin, urodeles) başarılı olmalı ve metodoloji olarak organizma özel değişiklikleri uygulama verimli mutagenesis gerçekleştirilebilir birçok hayvan için izin vermelidir ve PGCs kolayca transplantable.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve University of California, Irvine kullanım Komitesi tarafından onaylanmış olması.

1. PGC nakli hazırlıkları

  1. Diseksiyon araçları peşin, yukarıda açıklanan23hazırlayın.
    Not: Kaş saç bıçak embriyo ameliyatları gerçekleştirirken stabilize etmek için saç döngüsü yardımı ile insizyon yapmak için kullanılır. Kaş kıllar ve saç döngüler önce bir alev içinde çizilmiştir borosilikat Pasteur Pipetler cam içine yapıştırılmış ve inceltilmiş kısmı üzerinde kırık ( şekil 1A, bkz: ok ucu) daha kısa, dar ipucu (şekil 1B) için daha fazla beceri oluşturmak için ameliyatları gerçekleştirirken.
  2. SgRNAs yordamlar yukarıda açıklanan24 kullanarak oluşturun.
    Not: Kısaca, sgRNAs için kodlama kısa DNA şablonları bir hata içermeyen, opsonins DNA polimeraz ile komplementer 5' bakteriyofaj T7 rehberleri ve "dolu" içeren örtüşen deoxyoligonucleotides kullanarak oluşturulur. Vitro sgRNA sentez reaksiyonları (kullanılan seti bağlı olarak) bir gecede birkaç saat inkübe. Tepkiler Dnaz şablonu kaldırmak için tedavi. SgRNAs fenol/kloroform çıkarma ve amonyum asetat/isopropanol bulutlu, seti üreticisinin yönergeleri24göre standart yöntemlerle saf.
  3. Kısa bir süre microinjections gerçekleştirmeden önce Cas9-sgRNA kompleksleri hazırlamak ilk denaturing ~ 250 tarafından RNAse free (diethylpyrocarbonate-tedavi) H2O 60-65 ° c 5 dk, 3 µL toplam hacmine sgRNA ng takip hızlı soğutma tarafından on Ice 5 min için. SgRNA bir kaç saniyeliğine santrifüj kapasitesi, 1 µg/µL Cas9 protein 1 µL ekleyin ve 10 dk 37 ° C'de karmaşık oluşumu teşvik etmek için kuluçkaya.
    Not: Bu kuluçka tüp buza mikroenjeksiyon için embriyo hazırlarken tutulabilir.
  4. X. Tropicalis embriyo vitro fertilizasyon standart yöntemlerle, yukarıda açıklanan25elde. 25,26 de-jöle 10 dk sonrası döllenme, embriyo.
    Not: Gübreleme zamanı kabul edilir zaman sperm süspansiyon yumurta eklenir ve çanak 1/9thX ile sular altında olduğunu sonra Marc'ın modifiye Ringers (MMR)26. X. Tropicalis25, X. laevis, aksine gerçekleştirmek için de-1/9'jellying x MMR % 3 sistein ücretsiz Bankası (değil HCl tuzu), içeren birden fazla yıkama 1/9 tarafından pH 7.8-8.0 için ayarlanmış takip x MMR. Bir özel (% 1) embriyo transferi-boyalı çanak 1/9 içeren x MMR oda sıcaklığında.
  5. Hemen içeren 1 %1 özel kaplı bir yemek için enjekte edilebilir embriyo transfer Pasteur pipet kullanarak x MMR.
  6. 1-hücre aşamada enjekte. Başvurular26,27 Xenopus mikroenjeksiyon yöntemleri ayrıntılı açıklamaları için bkz.
    1. Hayvan pole, tek bir sitede her embriyo 4 ile enjekte nL Cas9-sgRNA Kompleks (son tutar = 1 Cas9 ve sgRNA ~ 250 pg ng; bkz: tartışma)24. Enjeksiyon Makinası şifa 10-20 dakika sonra 1/9 içeren bir özel kaplı yemek için embriyo transfer x MMR ve 25 ° C'de kuluçkaya Ayrıca uninjected kardeş bir fincan greft alıcılar görev yapacak embriyo oluşturun.
  7. ~ 5 mm içeren Petri tabak (60 mm) hazırlamak-0,3 içinde yapılan % 1'özel kalın tabaka nakillerine X. tropicalisveya 1 Eğer x MMR, x MMR X. laevisiçin.
    1. Çöküntü ~ 3-4 oluşturmak mm derin bir 3 ekleyerek-x (96-şey PCR plaka kesim tarafından oluşturulan) 4-şey kalıp içine erimiş özel plakaları dökme zaman (bkz: şekil 1 c ve D). Kalıp birkaç milimetre kadar özel sertleştirilmiş bir yüzük standına bağlı bir kelepçe kullanarak Petri kabına alt yukarıda tutun.
    2. Ayrıca, bir 24-şey plaka wells ile yapılan 1/9 ' % 1'özel ince bir tabaka kaplama tarafından ev bireysel embriyolar için yapmak x MMR.
      Not: Kültür bu kuyuları için eklendi 1/9 x MMR viomisin sülfat/mL 50 µg ile desteklenmiş ortamıdır.

2. PGCs nakli

  1. Ne zaman Nieuwkoop ve Faber28 blastula aşamasında 9 (şekil 2A), ~4.5 h ulaşmak sadece embriyoların sonrası döllenme (hpf) X. tropicalisiçin 25 ° C kuluçka makinesi çıkarıp ve oda sıcaklığında ek için equilibrate izin 0,5 h.
  2. 5 nakli başlamak için hpf (şekil 2B), kullanmak Pasteur pipet (Cas9-sgRNA ile enjekte) bir PGC donör embriyo transferi (1.7. adımda oluşturduğunuz) çöküntü içinde 0,3 içeren 60 mm özel yemek için x MMR (veya 1 X. laeviskullanıyorsanız x MMR). Ayrıca bir uninjected kardeş embriyo, greft alıcıya bu çanak transfer.
    Not: Her biri bu embriyoların kimlikleri değil karışık önemlidir.
  3. El ile vitelline zarflar forseps kullanarak her embriyo kaldırmak ve böylece onların bitkisel Polonyalılar görünümünde ve ameliyat için erişilebilir her iki embriyo döndürün.
    Not: El ile de-vitellination embriyo açıklaması daha önce açıklanan26oldu.
  4. Bir kaş saç bıçak keskin ucu kullanarak, nerede blastopore işaretlemek gelecekteki şişe hücreleri oluşturacak bölge içinde alıcı embriyo bitkisel kutup bir kare şeklinde dört Sığ kesik olun. İnsizyon hemen altında yüzey ve yukarı doğru hareketleri saç döngüsü ile embriyo sabitleme Dilimleme olun embriyo içine kaş saç bıçak ucu ekleyerek olursunuz.
    Not: Yarım aralıklarla 4.5-7.0 hpf göstermek belgili tanımlık cep büyüklük ve şişe hücreleri (kesik çizgili beyaz daire) nerede oluşturacak tahmin etmek için bir kılavuz sağlamak için Şekil 2 bitkisel bir embriyo görünümlerini gösterir. Amaç kesik kesik kara kutu nerede belirtilir hale getirmektir.
  5. Bir kez kare dört tarafı kesikler tarafından belirlenen, her kesi bir derinlik, yaklaşık 1/3 1/2 mesafe blastocoel yere ulaşmak için benzer kesme hareketleri kullanarak kaş saç bıçakla derinleştirmek.
  6. Bitkisel doku explant alıcı embriyo ücretsiz (şekil 3A ve B) bir yatay (bitkisel yüzeye paralel) yaparak derin bitkisel bölgesinde cut(s).
    Not: PGC içeren bitkisel explant yaklaşık 0,4-0.45 mm yan başına ve 0,25-0.3 mm derinlemesine boyutudur. Bu bitkisel explant alıcı embriyo artık gerekli değildir ve bu nedenle bir kenara atılmak üzere ayarlanmalıdır.
  7. Hızlı bir şekilde çalışma, bu yordamı (Adım 2,4-2,6) PGC donör embriyo nakli için benzer şekilde ölçekli bitkisel doku parçası oluşturmak için yineleyin.
    Not: Bu ikinci diseksiyon onun açık yara iyileşmesi alıcı embriyo süresini en aza indirmek için küçük gecikme ile gerçekleştirmek önemlidir.
  8. Bir kez PGCs içeren doku donör embriyo kaldırılır, kaş saç bıçak ve saç döngü içine alıcı embriyo oluşturulan açılması bulunduğu bu explant taşımak için kullanın.
    Not: Alıcı embriyo iç donör greft iç yüzeyine karşı karşıya gerekir. Alıcı embriyo ile greft ventral dorsal ve sol-sağ eksen yönelimleri eşleştirmek gerekli değildir.
  9. Greft yüzeyine paralel düzenlenen kaş saç bıçak mili uzun kenarını hafifçe bastırın greft içine alıcı embriyo bitkisel yüzeyine açılış için kullanın.
  10. Greft yerleştirildi, bir hairloop veya bir kaş saç bıçak mili donör embriyo "karkas" özel yüzey üzerinde ve bir özel depresyon içine yavaşça kaydırın kılabilmesi için. Karkas açık yara toplu sıvı dönük olduğundan emin olun. Eğer değilse, bu yönlendirme ulaşmak için embriyo döndürmek için kaş saç bıçak kullanın.
  11. Yerde, bitişik bir depresyon içine şifa greft ile alıcı embriyo slayt ve aynı şekilde aşılı bitkisel pole doku toplu sıvı dönük olduğundan emin olun.
  12. Başka bir organ nakli/karkas çifti oluşturmak için başka bir çifti donör ve alıcı embriyo kullanarak bu yordamı (adımları 2.1-2.11) yineleyin; bunları boş çöküntü aktarın.
    Not: Bir karkas ve nakli taşıyan embriyolar uyumlu çiftleri izlemek için gösterimler yapar önemlidir. Donör leşleri Cas9 sgRNA bağlı mutagenesis nakli taşıyan hayvanlar cinsel olgunluğa ulaşana kadar hangi kolayca denetlesinler cant transplante PGCs içinde verimlilik için bir proxy olarak kullanılan (bkz. Adım 3.3, aşağıda ve tartışma ).
  13. Embriyo yaklaşık 6,5 yaklaşık erken gastrula etap 10, ulaşana kadar nakli yapmaya devam X. tropicalis yılında hpf (bkz. şekil 2E).

3. embriyo bakım sonrası iyileşme

Not: ~ 30 dakika içinde yerine Greftler iyileşmek ve hücre lizis embriyo (şekil 3 c) yayan yolky bazı enkazı gözlemlemek için normaldir.

  1. Sonra iyileşti, Pasteur pipet çok yavaşça transfer embriyoların çöküntü bir özel kaplamalı 24-şey plaka bireysel wells için kullanabilirsiniz. Çıktı olacak (şekil 3D) aktarım sırasında karıştırma sıvı tarafından kaldırıldı.
    1. Bunlar bitkisel kadar toplu çözüm karşı karşıya kutup yerleştirilir embriyo döndürür. Yine, donör leşleri yerleştirin ve embriyo çiftleri takip içinde yardımcı olmak için alıcılar bitişik Wells grefti; Bu bilgileri kaydeder.
  2. Gecede kültür için 25 ° C kuluçka için embriyo içeren 24-şey plaka aktarın.
    Not: Ertesi gün, embriyo tailbud aşamaları ulaşmış.
  3. Özel kaplamalı 6-şey plakaları viomisin sülfat/ml, iyi başına 1 embriyo ile 50 µg ile MMR takıma 1/9 x içeren temizlemek için greft alıcılar taşıyın. Bunlar maç donör leşleri açık bir kaydını tutmak grefti alıcılar.
  4. Mutagenesis verimliliği sıralama PCR amplicons5,17,24 ya da PCR amplicons ( tartışmabakın) kullanan diğer yöntemleri kullanarak değerlendirmek için 0.2 mL PCR şerit tüpler için bireysel leşleri taşıyın. Orta çoğunu kaldırın ve alçalarak P200 pipet kullanarak pipetting K (PK) tarafından tekrarlanan İndinavir içeren 100 µL lizis arabellek24 ' te lunaparkçı.
  5. Embriyo lizis24 PK sindirim izin vermek için bir gecede 6 h için 56 ° C'de gerçekleştirin. Bu 90-95 ° C-10 dk hızlı 4 ° C'ye soğutma tarafından takip için Isıtma tarafından PK devre dışı bırakma Lysates daha fazla temizleme adımları olmadan doğrudan Sanger DNA sıralama24için kısa amplicons elde etmek için PCR reaksiyonları tohum için kullanın. Lysates-20 ° C'de depolayın
    Not: Birkaç gün içinde Kurbağa yavrularını besleme aşamaları (yaklaşık sahne 45-46) ulaşacak ve bir süspansiyon planktonik tozu (sera Micron)-ebilmek var olmak fed.
  6. Temizlik korumak ve mikrobiyal büyüme, en aza indirmek için kültür ortamının günlük değişimleri ile ~ 1 hafta sonra damla akış ile dolaşan bir su sisteminde küçük tanklar için Kurbağa yavrularını taşımak. Sıralama veri iribaşlar Kurbağa yavrularını üzerinden son derece verimli bir şekilde mutagenized PGCs ile alt mutagenesis verimlilik ile ayırmak için kullanın. Metamorfoz tamamlandıktan sonra froglets laboratuar yetişkin su sisteminde taşıyın.
    Not: Ulusal Xenopus kaynak (deniz Biyoloji Laboratuvarı, Woods Hole, MA) tarafından geliştirilen rejimleri29 ve yetişkin kurbağa bakım30besleme kurbağa yavrusu için bir kılavuz sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ekimi, nitel CRISPR/Cas9 mutagenesis etkinliğinin belirlenmesi hayvancılık büyümek ve cinsel olgunluğa hayvanları korumak için çaba sokmaksızın önce gerçekleştirilmelidir. Birdirbir nakli taşıyan hayvan somatically wildtype ve germline doğrudan ölçülerini erişmek zordur çünkü donör embriyo mürekkep tasarrufu önemli hale gelir. Mürekkep DNA analizinden transplante germline17' oluşur mutagenesis kapsam için bir vekil olarak hizmet vermektedir.

Mutagenesis başarısını değerlendirmek için bir yaklaşım doğrudan için hedeflenen genomik bölgesi kapsayan PCR amplicons dizisidir. Bu çok sayıda tek tek klonlanmış DNA parçalarının birçok hayvan üzerinden sıralamak için özellikle pahalı ve verimsiz bir dilek olur. Bunun yerine, onlar genetik mozaik embriyo türetilmiştir gibi hedef sitede heterojen amplicons sıralama her embriyo19mutagenesis etkinliğini değerlendirmek için kullanılır. Görsel olarak chromatograms hedef sıra ve haline tepeler "şifreli" (Yani, birden çok esaslarını her nükleotit konumda görünmesini karşılık gelen doruklarına co oluşumunu) vahşi tipi kol (Pik) akıntıya karşı gösterir aşağı Cas9 katalize iki iplikçikli sonu sitesi. Böyle örnek şekil S1 Blitz ve arkiçinde bulunabilir. 17. bu şifreli tepeler tarafından temsil edilen mutagenesis ölçüde doğru Nefelometri elde edilebilir kullanarak bir dizi ayrışma algoritmasısı, GELGİT (https://tide-calculator.nki.nl/)31. Bu tekniği kullanarak tek tek embriyo eleme her embriyo düzgün enjekte ve mutagenesis için hedeflenen güven verir. Fluorescently tagged dextran gibi bir izleyici başarılı enjeksiyon24 onaylamak için kullanılan ve aynı zamanda bir kurbağa yavrusu nakledilen doku (yayınlanmamış veri) gerçekten de taşıyor oluşturmada yardımcı olabilir. Resmi olasılığını floresan dextran ile birlikte Cas9-sgRNA coinjection Cas9 mutagenesis verimliliği değiştirebilir değil araştırdı unutmamak gerekir. Herhangi bir "leapfrogged" embriyo nakli kötü veya unmutagenized bağışçılardan içeren göz ardı.

F2 nesil analizde standart genetik ıslah düzenleri, ihtiyacını leapfrogging F1 embriyo yerleştirilmesi verimli fenotipik analizleri tanıyarak kaçınmanızı sağlar. Standart yaklaşım gerekli genleri mutasyona kullanırken, Cas9-sgRNA doz dikkatli titrasyon kurucusu embriyolar, bir düşük mutagenesis verimliliği kaynaklanan canlılık sağlamak için gereklidir. F0 kalan bu standart düzen hayvanlardan sonra taşıyıcıları tanımlamak için ekranlı uygun F1 embriyo elde etmek için wildtypes ile outcrossed. Son olarak, bu F1 heterozygotes için cinsel olgunluğa büyüdü ve mutant fenotipleri görüntüleme homozigoz F2 bireyler elde etmek için intercrossed. Buna ek olarak, onların germlines tam yedek mutant gen ile var üretir hayvanlar leapfrogging çünkü, bu F0 hayvanlar ışığını mutant fenotipleri F1 üretimi üretir. Blitz vd. melanosit ve retinada pigmentasyon için gerekli olan Tirozinaz (tyr) odağı hedeflenen F0 hayvanlarının çoğu % 100 germline iletim ( ile outcrossing tarafından ölçülen gösterdi 17 bildirdi Tyr- / - albino hayvanlar) mutant genleri donör kaynaklı (bkz Şekil 4A-B ve Tablo 1). Böylece, iki hayvan leapfrogging tarafından üretilen ışığını homozigoz veya bileşik heterozigoz mutant F1 embriyo verim.

Benzer sonuçlar mutasyonlar (DNA'ya bağlanıcı homeodomain kodlama) homeobox goosecoid (gsc) gen içinde taşıyan F0 leapfrogged hayvanlar ışığını tarafından17 elde (bkz. şekil 4A, C-H). Gsc gen ön kafa32tam gelişimi için gerekli ve Cas9-sgRNA de Haritayı iribaşlar enjekte nakavtlar Gsc ifade morpholino antianlamlı oligonucleotides X. laevis içinde kullanarak önerdi Embriyonik öldürücü fenotipleri17. Ancak, kalıcı ve sağlam somatically vahşi türü, varlık leapfrogged F0 hayvanlar, ve F1 intercross üretilen embriyolar ile aynı LOF fenotipleri bu X. laevis nakavtlar17' yayınlandı. Bu sağlanan veri genetik teyit prensip bir kanıtı olarak bu leapfrogging yanı sıra morpholino fenotip, embriyonik öldürücü fenotipleri üstesinden gelmek için kullanılabilir.

Figure 1
Şekil 1: malzeme nakli için gerekli. Mikrocerrahi erken embriyo üzerinde için döngüler(a)borosilikat cam Pasteur Pipetler kaş saç bıçaklar ve saç yapmak için kullanılır. Çizim Bunsen burner kullanarak cam dışarı saç ekleme için dar bir bitiş sağlar. Kırmızı ok ucu cam ara verilecek yaklaşık konumunda işaretler. (B) bir kaş saç bıçak (üst) ve saç döngüsü (alt), hızlı kuruyan Tutkalla Pipetler sabit bir örnek. 96-şey PCR plaka (C) A bölümü kalıp katılaşmaya % 1'özel izin vererek bir özel plaka çöküntü oluşturmak için kullanılan (0.3 x veya 1 özel yapılmış olup X. tropicalis nakillerine gerçekleştiriliyor bağlı olarak x MMR, veya X. laevis, sırasıyla). Özel kalınlığı 3-4 mm ~ 5 mm olan-derin kuyu. (D) 12 ile ekimi için bir özel plaka örneği çöküntü, Cpanelinde gösterildiği gibi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: erken gastrula aşamalarında ve strateji diseksiyon için geç blastula sırasında bitkisel pole morfolojisi. (A-F) Xenopus tropicalis embriyo blastula aşamasında 9 başlangıcından itibaren yarım zaman aralıklarında bitkisel görünümünde gösterilir (4.5 hpf) erken gastrula sahne ~10.25 için (7 hpf). 5 önce hpf, blastomeres büyük ve daha kolay zarar görmüş. Beyaz, kesik çizgili daire şişe hücre oluşumu panelleri (E ve F) başlangıç (üst) dorsal tarafta şekillendirme görülebilir gastrulasyon sırasında beklenen konumunu işaretler. Leapfrogging için bir kare içinde dört insizyon yapılır, siyah Kesikli çizgilerle tasvir, bir final cut (değil resimli) doku yüzeyine yapılan paralel bitkisel explant boşaltmak için. Ölçek çubuğu 400 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: nakli. (A) bir örnek bir ~5.5 hpf embriyo bitkisel PGC içeren doku çıkarıldıktan sonra. Siyah Kesikli kutu ve beyaz çizgili daire Şekil 2' de gösterilen alanındakiyle aynı göreli boyutlar vardır. (B) bitkisel explant embriyo panelinde A, iç yüzeyi görüntüleyiciyi, karşı karşıya kaldırıldı yaklaşık 0,4-0.45 mm yan başına ve 0,25-0.3 mm derinlemesine olduğunu. (C) bir embriyo transplante bitkisel doku ile. Görüntü ~ 10 dk sonra nakli satın alınmıştır. (D) 30 dakika sonra nakli, bitkisel doku (nazik embriyo Cpanelinde görülen enkaz geçmişte kaldı bir girdap oluşturmak için kullanılan bir kaş saç bıçak ile yukarıdaki dönen) yerine iyileştirmiş görülür. 1/9 x MMR ve kuluçka 25 ° C'de transferden sonra çoğu embriyo gastrulasyon normalde tamamlayın. Ölçek çubuğu 400 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: Germline iletim F0 hayvanlardan üretilen tarafından leapfrogging. (A)leapfrogging için iki gen CRISPR/Cas9 tarafından Tirozinaz (üst) ve goosecoid (alt) hedef. Tyr gen hedeflenen4,5 kodlama sıralama (mavi gölgelendirme) içinde bir N-terminal sinyal peptid (SP, kırmızı gölgelendirme) yapıldı, gsc Gen dizisi, kodlama içinde hedeflenen17 iken homeobox (kırmızı gölgelendirme) ile başlayan, hangi arasında iki ekzonlar ayrılmıştır. Çevrilmeyen 5' ve 3' eksonik gölgesiz bölgeleridir. (B) tüm 160 F1 iribaşlar üzerinden (Ayrıca bkz: Tablo 1) bir çiftleşme leapfrogged F0 erkek (LF1) ve bir albino (tyr-/-) kadın olduğunu belirten albino leapfrogged erkek tüm germline olmuştu Tyr mutant germ hücreleri ile yerini aldı. İlave bir vahşi tipi iribaş normal retina ve melanosit pigmentasyon ile gösterir. (C-H) İki F0 arasında bir intercross türetilmiş F1 embriyolar Xenopus homeobox gen hedefleme leapfrogged gsc. Yaklaşık 2/3rds embriyoların gsciçin phenotypically mutasyona uğramış, fenotip ile değişen derecelerde ön kesme (E-H) başkanı olmak. Mutantlar yarısı ya kyklopik ya da yakından aralıklı gözleri (F), diğer yarısı ise eyeless (H) vardı. Genotipleme bunlar homozygotes veya bileşik heterozygotes olmak gösterdi. Vahşi-türü fenotip (C, D) gösteren embriyolar 1/3rd homozigoz vahşi türü veya heterozygotes vardı. İn situ hibridizasyon otx2 (ön, orta ve gözleri bir işaretleyici), egr2 (arka beyin rhombomeres 3 ve 5 ve nöral crest akışı işaretleyici) ve hoxb9 (omurilik bir işaretleyici) için Bu kaybı gösterir GSC işlevi yalnızca otx2 etki alanı ön kısmını etkiler. Bu veri Blitz vd. , çoğaltılamaz 17 biyologlar şirket izniyle. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Çapraz Erkek Erkek Albino Vahşi türü Toplam % Albino
1 LF1 Tyr-/- 160 0 160 100
2 LF2 Tyr-/- 148 0 148 100
3 Tyr-/- LF3 409 0 409 100
4 Tyr-/- LF4 0 519 519 0
5 Tyr-/- LF5 223 0 223 100
6 LF6 Tyr-/- 493 703 1196 41,2
7 Tyr-/- LF7 1 94 95 1.1
8 Tyr-/- LF8 125 0 125 100
9 Tyr-/- LF9 0 417 417 0
10 Tyr-/- LF10 252 0 252 100

Tablo 1: Verimli germline yedek tarafından birdirbir nakli mutasyonlar Tirozinaziçinde taşıyor. Tirozinazhedefleme, organ nakli taşıyan hayvanlar her iki cinsiyette elde edilmiştir. Bu hayvanları mutant gen germline iletimini ve albinizm iribaş aşamada denetlesinler gösterdi F1 embriyo yüzde verimliliğini sınamak için homozigoz tyr- / -, çoğu albino ile kesişti. "Erkek" ve "Kadın" etiketli sütunlar girişlerinde tyr- / - veya leapfrogging (LF) türetilmiş test hayvan hangi üst belirtin. Embriyo albino fenotip "% Albino" altında gösterilen bir çapraz gösteren içinde yüzde 6 / 10 hayvan birdirbir nakli ile tam (% 100) yedek mutant gen ile gösterdi unutmayın. Bu tablo Blitz ve ark. çoğaltılamaz 17, izne sahip.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu rapor, nakli PGCs PGCs. içeren bitkisel doku nakli için detaylı bir protokol genom düzenleme teknolojileri (Örneğin, CRISPR/Cas9) ile birlikte germline değiştirmek için kullanılır bir hayvan sağlar Neredeyse tüm onun somatik dokuların genetik olarak vahşi türü olarak sürdürmek. Leapfrogging için başarılı olmak için bir dizi performans gösteren nakillerine gerçekleştirmeden önce dikkat edilmesi gereken kritik faktör vardır.

Germline tam yedek mutant gen ile emin olmak için bir ilk sgRNAs in vivo verimliliğini belirler önerilir. Deneyim çoğu sgRNAs CRISPRDirect (https://crispr.dbcls.jp/) veya CRISPRScan (http://www.crisprscan.org/) tarafından tasarlanan 250 pg/embriyo kullanıldığında etkili olduğunu göstermektedir. Ancak, bazı durumlarda (örneğin, Blitz ve ark tarafından17, Yayınlanan gsc sgRNA ~ 1 ng/embriyo gerekli) daha yüksek konsantrasyonlarda kullanmak gerekli olabilir. Mutagenesis hedef sitesinin etkinliğini değerlendirmek önemlidir ve bir nicel değerlendirmesi31GELGİT kullanımına izin verir. Kullanırken vurguladı yöntemi burada doğrudan Sanger (mutant gen F0 embriyo nüfusu temsil eden), PCR amplicons sıralama çok sayıda diğer yöntemleri genom düzenleme literatürde bu amaçla kullanılmaktadır. Yaygın olarak kullanılan diğer orta maliyet için düşük teknikleri parçası uzunluk polimorfizmi analizi ya kaybı enzimleri33 veya Cas9/TALEN bölünme siteleri34, T7 endonükleaz 135 ve arazi dahil 36 deneyleri, heteroduplex hareketlilik tahlil37, yüksek çözünürlüklü eritebilir tahlil38, parçalara ayırması Kapiler Elektroforez39,40ve qPCR tabanlı yöntemleri41, göre analiz 42.

İkinci bir göz hedef site konumu hedef gen içinde seçimdir. Mutant fenotipleri verimli kurtarma F1 üretimi izin vermek için tam LOF gen için şans en üst düzeye çıkarmak önemlidir. Mutant hattı klasik yaklaşımlar kullanarak yaparken Cas9 bölünme Kodlayıcı bölgeler bölge desteği protein başlangıcında erken çeviri fesih temin için bir 5' ucu yakınında hedeflemek için ortak bir stratejidir. F1 heterozygotes frameshift mutasyonları ile tespit edilmesi ve onlar boş allelleri yürütmek için bekleniyor çünkü bu hayvanların daha fazla çalışma için seçili olması. Leapfrogging strateji F0 intercrosses kullandığı için 5' uç kodlama sırası hedefleme yaklaşım son derece verimsiz olurdu. F0 embriyo mozaik germlines var ve heterozygotes17nüfus çoğunlukla F1 mutantların ışığını sonuçlarında bileşik. Büyük ölçekli analiz ortalama, çift iplikli kırılmalara tarafından üretilen mutasyonların beklenen ~1/3rd , çerçeve43olduğunu doğrular beri bu şekilde üretilen çoğu F1 embriyo bir çerçeve ile en az bir gen olurdu mutasyon yaban türü aktivite korumak. Bu nedenle, farklı bir strateji bile bu çerçeve mutant gen boş değerlere olma olasılığı olduğundan emin olmak için gereklidir. Çift kırılmalara normal protein işlevi için gerekli olan protein katlanması etki alanlarındaki hedefleme tam LOF (null allelleri)17,44daha yüksek bir şans içinde sonuçlanması bekleniyor. Protein etki alanları, atom düzeyinde structure(s) için dikkatli bir değerlendirme ne zaman elde edilebilir, o zaman bile bir tek amino asit çerçeve silme içeren etki alanı yapısı (bozmaya beklenebilir ikincil yapılara sahip bölge teşhis etmek için yardımcı olabilir örneğin, Blitz ve ark17tarafından Yayınlanan gsc Δ3bp mutasyon). CRISPR/Cas9 hedef siteleri bu bölge içinde tanımlanan bir başarıyla null allelleri oluşturma daha yüksek bir şans varsa. Protein ikincil yapısal bileşenler arasındaki solvent maruz döngüler içinde küçük silme işlemleri daha az tercih olduklarından daha esnek bölgeleri mutasyonların hala işlevsel proteinler arasında neden olabilir.

Leapfrogging için üçüncü bir göz alıcı embriyo kaldırılması PGC verimliliği olduğunu. Bu adım tam germline yedek sağlamak için etkin olması gerekir. Burada açıklanan yöntemle üretilen tüm greft alıcı embriyo onların PGCs. bütün-mount situ hybridizations gösteri değişkenlik tümüyle kaldırılmasını yerelleştirme blastula aşamasında embriyo PGC işaretlerinin içinde olup şu anda belli değil. Birçok durumda, tamamını veya hemen hemen tüm sinyal bulunur yakınındaki embriyo çoğu bitkisel sonu ve bu nedenle burada özetlenen cerrahi tarafından kaldırıldı (vd.17 ve alıntıları orada Blitz). Ancak, bazı embriyo hücrelerinde birkaç daha yakın blastocoel yere PGC marker ifade göstermektedir. Mikrop plasm önce coalesces bitkisel Kutbu'nda sonra gübreleme ve bölünme oluklar erken kesim sırasında sonra süpürüp götürdü. Bazı mikrop plasm hücreleri bitkisel Yarımküre ortasında dağıtılabilir haline ve etkili bir şekilde blastocoel için genişletmek nakli kullanmadan kaldırılması değil. Ancak, germ hücreli işaretçileri içeren bu derin hücreler germline için katkıda değil gibi mikroRNA'lar PGC mRNA'ların somatik hücre45,46üzerinden temizlemek için bilinen unutmamak önemlidir. PGC işaretler için olumlu boyama bu derin hücreler somatik hücreler böyle izni geçiyor olabilir. Alıcı embriyo tam PGC kaldırılması emin olmak için yöntem şu anda geliştirilmekte olan.

Son olarak, kaç F0 hayvan leapfrogging tarafından oluşturmak için dikkate almak önemlidir. Hayvanlar değişken sayıda cinsel olgunluğa hayatta olmaz gibi 20'den fazla embriyo nakli içeren oluşturulan önerilir. İçin gerekli her iki cinsiyette (1) bu yeterli sayıda emin olmak için yeterince hayatta kalan hayvanlar elde edilir ve bunlar yeterince yüksek frekansta mutant gen araştırmacı tarafından planlanan analizleri için uygun olmak için iletimi (2) olacaktır.

Burada, bazı uygulama ile açıklanan protokolü kullanarak amfibi embryologists PGC nakillerine tekniği biraz pratik ile ana gerekir. Leapfrogging mümkün değil sadece diğer kurbağalar, aynı zamanda kolayca embriyogenez erken aşamalarında bireyler arasındaki transplantable PGCs içeren diğer organizmalar olacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazar ifşa etmek hiçbir şey vardır.

Acknowledgments

Bu eser bir hibe desteği ile gerçekleştirilen 5R21HD080684-02, Ulusal Enstitüsü çocuk sağlığı ve insan gelişimi. Yazar Ken Cho onun sürekli coşku ve destek için teşekkür etmek istiyor. Yazar ayrıca değerli için Bruce Blumberg kamerasını, Rebekah Charney, el yazması ve Sean McNamara ve Marcin Wlizla Ulusal Xenopus kaynak (RRID:SCR_013731), eleştirel okuma kullanımı için kabul etmek istiyorum X. tropicalis beslenme ve hayvan bakımı rejimleri ile ilgili konuşmaları.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dumont #5 forceps Fine Science Tools 11252-20 or 11252-30
Eyebrow hair knife Homemade
Hair loop Homemade
Pasteur pipettes, borosilicate glass Fisher Scientific 13-678-20A
Krazy Glue (Cyanoacrylate-based) Elmer's Products, Inc. KG581 To affix eyebrow hair and hair loops into Pasteur pipettes, other similar glues can be used.
Oligodeoxynucleotides, custom ordered Integrated DNA Technologies Custom ordered Template oligos for sgRNA synthesis, see Nakayama et al., 2014 for design details.
Megascript T7 kit Ambion/ThermoFisher AM1334 Or use Megashortscript T7 (AM1354) kit
Phenol, Tris buffered High quality distilled phenol from any commercial supplier
Chloroform High quality chloroform from any commercial supplier
Ethanol High quality ethanol from any commercial supplier
Diethylpyrocarbonate (DEPC) Sigma Chemical Co. D5758-50ML
Cas9 protein, with nuclear localization signal PNA Bio, Inc. CP01 Reconstituted using DEPC-treated water according to manufacturer's recommendations
10X Marc's Modified Ringers solution Homemade. Recipe (ref 26) for 1X MMR (lacking EDTA) is 100mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES. Solution is pH adjusted to 7.4.
Agarose Any Molecular Biology grade agarose is sufficient
60 X15 mm Petri plates Falcon 351007
24-well plates Falcon 3047
L-Cysteine Sigma Chemical Co. C7352-100G Free base, not HCl salt
Proteinase K Roche 03 115 828 001 Typically ~20mg/ml from Roche
sera Micron sera Tadpole food. Resuspend in growth medium. Can be purchased from a variety of online retailers

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gurdon, J. B., Hopwood, N. The introduction of Xenopus laevis into developmental biology: of empire, pregnancy testing and ribosomal genes. Int J Dev Biol. 44 (1), 43-50 (2000).
  2. Hellsten, U., et al. The genome of the Western clawed frog Xenopus tropicalis. Science. 328 (5978), 633-636 (2010).
  3. Session, A. M., et al. Genome evolution in the allotetraploid frog Xenopus laevis. Nature. 538 (7625), 336-343 (2016).
  4. Blitz, I. L., Biesinger, J., Xie, X., Cho, K. W. Biallelic genome modification in F(0) Xenopus tropicalis embryos using the CRISPR/Cas system. Genesis. 51 (12), 827-834 (2013).
  5. Nakayama, T., Fish, M. B., Fisher, M., Oomen-Hajagos, J., Thomsen, G. H., Grainger, R. M. Simple and efficient CRISPR/Cas9-mediated targeted mutagenesis in Xenopus tropicalis. Genesis. 51 (12), 835-843 (2013).
  6. Guo, X., et al. Efficient RNA/Cas9-mediated genome editing in Xenopus tropicalis. Development. 141 (3), 707-714 (2014).
  7. Wang, F., Shi, Z., Cui, Y., Guo, X., Shi, Y. B., Chen, Y. Targeted gene disruption in Xenopus laevis using CRISPR/Cas9. Cell Biosci. 5, 15 (2015).
  8. Jaffe, K. M., et al. c21orf59/kurly Controls Both Cilia Motility and Polarization. Cell Rep. 14 (8), 1841-1849 (2016).
  9. Liu, Z., et al. Efficient genome editing of genes involved in neural crest development using the CRISPR/Cas9 system in Xenopus embryos. Cell Biosci. 6, 22 (2016).
  10. Naert, T., et al. CRISPR/Cas9 mediated knockout of rb1 and rbl1 leads to rapid and penetrant retinoblastoma development in Xenopus tropicalis. Sci Rep. 6 (35264), (2016).
  11. Ratzan, W., Falco, R., Salanga, C., Salanga, M., Horb, M. E. Generation of a Xenopus laevis F1 albino J strain by genome editing and oocyte host-transfer. Dev Biol. 426 (2), (2016).
  12. Bhattacharya, D., Marfo, C. A., Li, D., Lane, M., Khokha, M. K. CRISPR/Cas9: An inexpensive, efficient loss of function tool to screen human disease genes in Xenopus. Dev Biol. 408 (2), 196-204 (2015).
  13. Shigeta, M., et al. Rapid and efficient analysis of gene function using CRISPR-Cas9 in Xenopus tropicalis founders. Genes Cells. 21 (7), 755-771 (2016).
  14. Hontelez, S., et al. Embryonic transcription is controlled by maternally defined chromatin state. Nat Commun. 6, 10148 (2015).
  15. Peshkin, L., et al. On the Relationship of Protein and mRNA Dynamics in Vertebrate Embryonic Development. Dev Cell. 35 (3), 383-394 (2015).
  16. Owens, N. D., et al. Measuring Absolute RNA Copy Numbers at High Temporal Resolution Reveals Transcriptome Kinetics in Development. Cell Rep. 14 (3), 632-647 (2016).
  17. Blitz, I. L., Fish, M. B., Cho, K. W. Leapfrogging: primordial germ cell transplantation permits recovery of CRISPR/Cas9-induced mutations in essential genes. Development. 143 (15), 2868-2875 (2016).
  18. Blackler, A. W. Transfer of germ-cells in Xenopus laevis. Nature. 185, 859-860 (1960).
  19. Blackler, A. W., Fischberg, M. Transfer of primordial germ-cells in Xenopus laevis. J Embryol. Exp Morph. 9, 634-641 (1961).
  20. Bounoure, L. L'origine des cellules reproductrices et le problem de la lignee germinale. , Gauthier-Villars. Paris. (1939).
  21. Nieuwkoop, P. D., Sutasurya, L. A. Primordial Germ Cells in the Chordates: Embryogenesis and phylogenesis. , Cambridge University Press. Cambridge. (1979).
  22. Heasman, J., Holwill, S., Wylie, C. C. Fertilization of cultured Xenopus oocytes and use in studies of maternally inherited molecules. Methods Cell Biol. 36, 213-230 (1991).
  23. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Embryo dissection and micromanipulation tools. CSH Protoc. , (2007).
  24. Nakayama, T., et al. Cas9-based genome editing in Xenopus tropicalis. Methods Enzymol. 546, 355-375 (2014).
  25. Ogino, H., McConnell, W. B., Grainger, R. M. High-throughput transgenesis in Xenopus using I-SceI meganuclease. Nat Protoc. 1 (4), 1703-1710 (2006).
  26. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early development of Xenopus laevis.: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2000).
  27. Kay, B. K. Injection of oocytes and embryos. Xenopus laevis: Practical Uses in Cell and Molecular Biology (Methods in Cell Biology Vol. 36). Kay, B. K., Peng, H. B. , Academic Press. San Diego. (1991).
  28. Normal Table of Xenopus laevis. (Daudin): A Systematical and Chronological Survey of the Development from the Fertilized Egg till the End of Metomorphosis. Nieuwkoop, P., Faber, J. , Garland Publishing Inc. New York. (1994).
  29. Xenopus Tadpole Feeding. , Available from: http://www.mbl.edu/xenopus/files/2016/06/Xenopus-Tadpole.pdf (2017).
  30. Xenopus tropicalis Animal Care. , Available from: http://www.mbl.edu/xenopus/files/2016/06/Xenopus-Tropicalis.pdf (2017).
  31. Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Res. 42 (22), e168- (2014).
  32. Sander, V., Reversade, B., De Robertis, E. M. The opposing homeobox genes Goosecoid and Vent1/2 self-regulate Xenopus patterning. EMBO J. 26 (12), 2955-2965 (2007).
  33. Bedell, V. M., et al. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).
  34. Kim, J. M., Kim, D., Kim, S., Kim, J. S. Genotyping with CRISPR-Cas-derived RNA-guided endonucleases. Nat Commun. 5, 3157 (2014).
  35. Kim, H. J., Lee, H. J., Kim, H., Cho, S. W., Kim, J. S. Targeted genome editing in human cells with zinc finger nucleases constructed via modular assembly. Genome Res. 19 (7), 1279-1288 (2009).
  36. Qiu, P., Shandilya, H., D'Alessio, J. M., O'Connor, K., Durocher, J., Gerard, G. F. Mutation detection using Surveyor nuclease. Biotechniques. 36 (4), 702-707 (2004).
  37. Ota, S., et al. Efficient identification of TALEN-mediated genome modifications using heteroduplex mobility assays. Genes Cells. 18 (6), 450-458 (2013).
  38. Dahlem, T. J., et al. Simple Methods for Generating and Detecting Locus- Specific Mutations Induced with TALENs in the Zebrafish Genome. PLoS Genet. 8 (8), e1002861 (2012).
  39. Ramlee, M. K., Yan, T., Cheung, A. M., Chuah, C. T., Li, S. High-throughput genotyping of CRISPR/Cas9-mediated mutants using fluorescent PCR-capillary gel electrophoresis. Sci Rep. 5, 15587 (2015).
  40. Bhattacharya, D., Marfo, C. A., Li, D., Lane, M., Khokha, M. K. CRISPR/Cas9: An inexpensive, efficient loss of function tool to screen human disease genes in Xenopus. Dev Biol. 408 (2), 196-204 (2015).
  41. Yu, C., Zhang, Y., Yao, S., Wei, Y. A PCR Based Protocol for Detecting Indel Mutations Induced by TALENs and CRISPR/Cas9 in Zebrafish. PLoS ONE. 9 (6), e98282 (2014).
  42. Mock, U., Hauber, I., Fehse, B. Digital PCR to assess gene-editing frequencies (GEF-dPCR) mediated by designer nucleases. Nat Protoc. 11 (3), 598-615 (2016).
  43. Varshney, G. K., et al. High-throughput gene targeting and phenotyping in zebrafish using CRISPR/Cas9. Genome Res. 25 (7), 1030-1042 (2015).
  44. Shi, J., Wang, E., Milazzo, J. P., Wang, Z., Kinney, J. B., Vakoc, C. R. Discovery of cancer drug targets by CRISPR-Cas9 screening of protein domains. Nat Biotechnol. 33 (6), 661-667 (2015).
  45. Koebernick, K., Loeber, J., Arthur, P. K., Tarbashevich, K., Pieler, T. Elr-type proteins protect Xenopus Dead end mRNA from miR-18-mediated clearance in the soma. Proc Natl Acad Sci USA. 107, 16148-16153 (2010).
  46. Yang, J., Aguero, T., King, M. L. The Xenopus maternal-to-zygotic transition from the perspective of the germline. Curr Top Dev Biol. 113, 271-303 (2015).

Tags

Genetik sayı 132 Xenopus genetik mutantlar CRISPR/Cas9 TALEN genom düzenleme mutagenesis fonksiyon kaybı
CRISPR/Cas9-tabanlı <em>Xenopus</em> Leapfrogging için ilkel Germ hücre transplantasyonu
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Blitz, I. L. Primordial Germ Cell… More

Blitz, I. L. Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus. J. Vis. Exp. (132), e56035, doi:10.3791/56035 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter