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Genetics

Transplantation de cellules germinales primordiales pour base CRISPR/Cas9 saute-mouton chez Xenopus

Published: February 1, 2018 doi: 10.3791/56035
Automatic Translation
1
1Department of Developmental and Cell Biology, University of California, Irvine

Summary

Gènes essentiels à la survie posent des obstacles techniques pour créer des lignées mutantes. Saute-mouton contourne la létalité en combinant génome édition avec la transplantation de cellules germinales primordiales pour créer des animaux sauvage porteurs de mutations germinales. Brûler les étapes permet également la génération efficace des homozygotes mutants null dans la génération de1 F. Ici, l’étape de la transplantation est démontrée.

Abstract

La création de lignées mutantes en éditant de génome s’accélère l’analyse génétique chez de nombreux organismes. Méthodes CRISPR/Cas9 ont été adaptés à l’africaine Xenopus laevis, Xenopus, un organisme modèle de longue date pour la recherche biomédicale. Régimes de reproduction traditionnelle pour la création de lignées mutantes homozygotes avec mutagénèse CRISPR/Cas9-ciblés ont plusieurs étapes longues et laborieuses. Pour faciliter la création d’embryons mutants, notamment pour surmonter les obstacles associés à assommer les gènes qui sont essentiels pour l’embryogénèse, une nouvelle méthode appelée Bond a été développée. Cette technique s’appuie sur la robustesse des embryons de Xenopus à « copier / coller » méthodes embryologiques. Saute-mouton utilise le transfert de cellules germinales primordiales (PGC) provenant d’embryons de donneurs efficacement-mutagénisées tant en frères et sœurs PGC-ablation de type sauvage. Cette méthode permet une mutation efficace de gènes essentiels en créant des animaux chimériques avec cellules somatiques de type sauvage qui transportent un mutant germline. Lorsque deux animaux de0 F porteurs « leapfrog greffes » (c'est-à-dire, les cellules germinales mutant) sont intercroisées, ils produisent des homozygotes, ou hétérozygotes, null F1 embryons, sauvant ainsi un temps de génération complet pour obtenir des données phénotypiques. Saute-mouton fournit également une nouvelle approche pour l’analyse des gènes effet maternel qui sont réfractaires à l’analyse phénotypique0 F suite CRISPR/Cas9 mutagenèse. Ce manuscrit détaille la méthode de brûler les étapes, avec un accent particulier sur la façon de réaliser avec succès la transplantation du PGC.

Introduction

Comment le génotype encode phénotype a été une question majeure en biologie depuis la redécouverte des lois de Mendel. Comprendre les rôles des gènes, leur régulation et interactions au sein des réseaux de gènes et les fonctions des promesses de produits codés de fournir des outils pour découvrir nouvelle biologie et amélioration des états pathologiques. Pour plus d’un demi siècle1, l’africaine Xenopus laevis, Xenopus, a été un modèle pour les études sur un large éventail de sujets en biologie fondamentale et de la biomédecine, y compris le contrôle génétique du développement. Historiquement, la plupart des recherches sur Xenopus a utilisé la grenouille allotétraploïde, X. laevis, mais plus récemment, en raison de la diploïdie, X. tropicalis a été conçu comme un modèle génétique amphibie. Séquences de génomes complets ont été assemblés entre les deux espèces de Xenopus 2,3. La « communauté de la grenouille » est maintenant à un moment charnière où la technologie de modification du génome de base permet l’étude de la fonction des gènes, pratiquement à volonté. Programmable CRISPR/Cas9 endonucléases ont fait la mutagénèse de gènes très efficace, avec mutations bialléliques possible dans la plupart des cellules de l’animal4,5,6,7, 8,9,10,11. Ces études, mise en évidence par Blais et al. 12 et Shigeta et al. 13, ont montré que la fonction de plusieurs gènes peut être étudiée par mutagenèse chez les animaux de mosaïque de0 F. Cette approche présente de nombreux avantages ; Cependant, embryons Cas9-sgRNA-micro affichent souvent des phénotypes variables en raison de la perte incomplète de la fonction (LOF). Plus important encore, la génération des lignées mutantes est très avantageuse pour certaines applications, en particulier lorsque l'on étudie les gènes qui ont une contribution d’ARNm maternels. ARNm maternels et protéines et leurs influences sur l’épigénétique, persistent pendant une longue période dans l’embryogenèse14,15,16, rendant les contributions du développement précoces de plusieurs gènes réfractaire aux analyses de0 F. Par conséquent, les autres approches LOF sont nécessaires.

Lorsqu’on cherche à créer des lignées mutantes, le chemin d’accès à l’obtention d’embryons homozygotes de LOF a plusieurs obstacles. Mutagenèse tout d’abord, efficace pour produire des mutations bialléliques peut être désavantageux car perte des fonctions des gènes essentiels se traduit par l’incapacité à survivre à la maturité sexuelle, interférant avec la production d’une ligne viable. Une solution commune est le titrage minutieux d’un montant de Cas9-sgRNA envoyée. Ici, l’objectif est d’atteindre un équilibre entre réduction de létalité tout en optimisant également l’efficacité de la lignée germinale mutagenèse. Un autre problème se pose du schéma standard d’élevage, où les analyses phénotypiques sont différés jusqu'à la génération de2 F. À l’aide de l’approche standard, sexuellement matures animaux de0 F qui transmettent mutant allèles par le biais de la lignée germinale sont croisées pour produire des F1 hétérozygote « entreprises », qui sont ensuite cultivées à la maturité sexuelle. Deux hétérozygotes de1 F sont ensuite intercroisées pour produire des embryons mutants, F2 à une fréquence mendélienne prévue de 25 %. Ainsi, deux générations d’élevage sont nécessaires pour l’analyse des phénotypes mutants. Animaux mutants pourrait être homozygotes ou hétérozygotes (c.-à-d. descendants contenant deux allèles mutants différents, qui dépend des génotypes des parents animaux utilisés dans la population de1 F).

Ces obstacles peuvent être surmontés en limitant programmable mutagenèse induite par la nucléase de cellules germinales, qui sous-tend une nouvelle méthode appelée former17. Saute-mouton possède deux composantes principales : (1) la microinjection des ARNm de Cas ainsi que sgRNA ou nucléase-sgRNA complexes (ou, en principe, TALENs ou zinc nucléases de doigt) au stade unicellulaire de mutagenize efficacement les génomes embryonnaires, suivie (2) la transplantation de PGC dans des embryons de frère de type sauvage, où le PGC endogènes ont été supprimés. Quand les deux étapes sont le remplacement de germline efficace, complète avec les cellules germinales mutantes peut être obtenue. Blackler démontré dans les années 1960 que Xenopus PGC pourrait être transplanté entre embryons à la neurula fin et18,de stades précoces tailbud19. Pour brûler les étapes, l’approche de Blackler modification en effectuant les transplantations d’organes au stade blastula17, lorsque PGC est localisées dans le pôle végétal de l’embryon20,21. Transplantation avant la gastrulation a deux principaux avantages. Tout d’abord, la prise de greffe des greffes et le développement subséquent de normal s’est avéré plus efficace lorsque la greffe est réalisée au stade blastula (inédites). Deuxièmement, en effectuant des transplantations d’organes stade blastula peu après que transcription zygotique a commencé, on peut éviter la létalité découlant du développement génétique mutations qui perturbent la gastrulation, ou qui autrement mener à neurula fin malformé. PGC transplantation portant les embryons (« leapfrogged ») sont cultivés à la maturité sexuelle, et les croisements entre ces animaux de0 F ont démontré que, dans bien des cas, 100 % de la progéniture de1 F afficher le phénotype LOF (la plupart étant composé hétérozygotes), indiquant la lignée germinale complète de remplacement avec les mutations ciblées.

Il est prévu que Bond s’accélérera les approches génétiques chez Xenopus. Brûler les étapes prévoit également une alternative à la méthode de « transfert d’accueil »22 pour l’analyse LOF des gènes effet maternel (inédites). Dans la présente publication, une description détaillée de la méthode, en focalisant sur la transplantation de PGC, est présentée dans X. tropicalis (avec des modifications mineures pour X. laevis). La transplantation du PGC est démontrée ici, pour faciliter un transfert plus rapid de cette technologie à d’autres laboratoires qui travaillent avec Xenopus. Les principes de cette méthode doivent être réussies chez les autres amphibiens (p. ex., urodèles), et modifications de l’organisme-spécifiques dans la méthodologie devraient permettre pour application à de nombreux autres animaux dont mutagénèse efficace peut être accompli et PGC est facilement transplantables.

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Protocol

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par le Comité de l’urbanisme de l’Université de Californie, Irvine et d’institutionnels animalier.

1. les préparations destinés à la Transplantation de PGC

  1. Préparer des outils de dissection à l’avance, comme décrit précédemment23.
    NOTE : Couteaux de cheveux sourcil servent à faire des incisions avec l’aide d’une boucle de cheveux pour stabiliser l’embryon tout en effectuant les chirurgies. Poils des sourcils et des boucles de cheveux sont collés en verre borosilicaté, pipettes Pasteur qui ont d’abord été attiré dans une flamme et cassés sur la partie amincie (voir Figure 1 a, pointe de flèche) pour créer une pointe plus courte et plus étroite (Figure 1 b) pour une plus grande dextérité Lorsque vous effectuez des interventions chirurgicales.
  2. Générer des sgRNAs à l’aide des procédures décrites précédemment24 .
    NOTE : Brièvement, courts matrices d’ADN codant pour sgRNAs sont créés à l’aide de deoxyoligonucleotides qui se chevauchent, contenant 5' instigateurs du bactériophage T7, qui sont recuits et « rempli » par une ADN polymérase thermostable, exempt d’erreurs. Réactions de synthèse in vitro sgRNA sont incubées pendant plusieurs heures à la nuit (selon le kit utilisé). Les réactions sont traitées pour supprimer le modèle de la DNAse. Les sgRNAs sont purifiés par les méthodes usuelles de phénol/chloroforme extraction et ammonium acétate/isopropanol précipitations, selon instructions24 du fabricant kit.
  3. Peu de temps avant d’effectuer des microinjections, préparer des complexes de Cas9-sgRNA par la première dénaturation ~ 250 ng de sgRNA dans un volume total de 3 µL de RNAse-libre (traités diéthylpyrocarbonate) H2O à 60-65 ° C pendant 5 min, suivie par refroidissement rapide sur la glace pendant 5 min. Centrifuger le sgRNA pendant quelques secondes, ajouter 1 µL de 1 protéine de Cas9 µg/µL et incuber pendant 10 min à 37 ° C, pour promouvoir la formation d’un complexe.
    Remarque : Après l’incubation, le tube peut être gardé sur glace tout en préparant les embryons microinjection.
  4. Obtenir X. tropicalis embryons par fécondation in vitro à l’aide de méthodes normalisées, comme décrit précédemment25. Gelée de25,26 les embryons à 10 min après la fécondation.
    NOTE : Temps de la fécondation est considéré comme le temps après la suspension de sperme est ajoutée aux oeufs et le plat est inondé de 1/9thX modifiée sonneries (MMR)26 de Marc. X. tropicalis25, contrairement à X. laevis, effectuer la radiation gelante dans le 1/9 x MMR contenant 3 % base cystéine libre (pas le sel HCl), pH ajusté à 7,8-8.0, suivie par plusieurs lavages dans le 1/9 x MMR. Transférer les embryons dans un gel d’agarose (1 %)-enduit plat contenant 1/9 x MMR à température ambiante.
  5. Transférer immédiatement les embryons pour être injecté dans un plat enduit de gel d’agarose à 1 % contenant 1 x MMR à l’aide d’une pipette Pasteur.
  6. Injecter à l’étape 1-cellule. Voir références26,27 pour une description détaillée des méthodes de micro-injection de Xenopus .
    1. Injecter chaque embryon sur un seul site au pôle animal, avec 4 nL du complexe Cas9-sgRNA (montant final = 1 ng de Cas9 et ~ 250 pg de sgRNA ; Voir la Discussion)24. Après 10 à 20 min d’injection site guérison, transférer les embryons dans un plat recouvert d’agarose contenant 1/9 x MMR et incuber à 25 ° C. Également créer un plat de jumelle non des embryons qui serviront de receveurs de greffe.
  7. Préparer des plats de Pétri (60 mm) qui contiennent un ~ 5 mm-couche épaisse de 1 % d’agarose dans 0,3 x MMR, si faire des transplantations d’organes à X. tropicalis, ou 1 x MMR pour X. laevis.
    1. Créer des dépressions ~ 3-4 mm de profondeur en insérant un 3-x 4 puits moule (créée en coupant une plaque à 96 puits PCR) dans l’agarose fondu lorsque vous versez les plaques (voir Figure 1 et D). Maintenez le moule quelques millimètres au-dessus du fond de la boîte de Pétri à l’aide d’une pince fixée à un support de bague jusqu'à ce que l’agarose a durci.
    2. En outre, faire une plaque 24 puits à des embryons de maison individuelle en enduisant les puits avec une fine couche d’agarose à 1 % en 1/9 x MMR.
      Remarque : Le milieu de culture a ajouté à ces puits est de 1/9 x que ROR additionné de 50 µg de gentamycine sulfate/mL.

2. transplantation du PGC

  1. Quand les embryons atteignent seulement Nieuwkoop et Faber28 stade blastula 9 (Figure 2 a), ~4.5 h après la fécondation (hpf) pour X. tropicalis, retirez-les de l’incubateur de 25 ° C et laissez-les s’équilibrer à la température de la pièce pour une autre 0,5 h.
  2. Pour commencer la transplantation à 5 hpf (Figure 2 b), utiliser une pipette Pasteur pour transférer un embryon de donneur PGC (injecté avec Cas9-sgRNA) au plat 60 mm d’agarose contenant des dépressions (créées à l’étape 1.7) dans 0,3 x MMR (ou 1 x MMR si vous utilisez X. laevis). Également transférer un embryon non frère, le bénéficiaire de la greffe, de ce plat.
    Remarque : Il est essentiel que les identités de chacun de ces embryons ne sont pas confondues.
  3. Retirez l’enveloppe vitelline de chaque embryon avec une pincette et faire pivoter les deux embryons afin que leurs mâts vegetal sont en vue et accessible pour la chirurgie manuellement.
    NOTE : Une description du manuel de-vitellination des embryons a été précédemment décrit26.
  4. En utilisant le bout pointu d’un couteau de cheveux sourcil, faire des incisions peu profondes quatre sous la forme d’un carré sur le pôle végétal de l’embryon du destinataire, à l’intérieur de la zone où les cellules bouteille futurs qui jalonnent le blastopore formeront. Faire des incisions en insérant la pointe du couteau cheveux sourcil dans l’embryon, juste en dessous de la surface, puis les faire trancher vers le haut des mouvements tout en stabilisant l’embryon avec la boucle de cheveux.
    Remarque : La Figure 2 illustre végétales vues d’un embryon à moyennes sur une demi-heure d’intervalle de 4,5 à 7,0 hpf pour montrer la taille des cellules et de fournir un guide pour l’estimation où les bouteilles de cellules formeront (cercle en pointillés blanc). Le but est de faire des incisions où la boîte noire pointillée est indiquée.
  5. Une fois que les quatre côtés du carré sont délimitées par des incisions, approfondir chaque incision avec un couteau de cheveux sourcil à l’aide des requêtes similaires de coupe pour atteindre une profondeur d’environ 1/3 à 1/2 de la distance au sol blastocèle.
  6. Libérer l’explant végétal tissus de l’embryon destinataire (Figure 3 a et B) en faisant une horizontale (parallèle à la surface végétale) cliché (s) dans la région profonde végétale.
    Remarque : La taille de l’explant végétal contenant du PGC est d’environ 0,4 à 0,45 mm par côté et 0,25 à 0,3 mm de profondeur. Cette explant végétal de l’embryon du bénéficiaire n’est plus nécessaire et devrait donc être mis de côté pour être mis au rebut.
  7. Travailler rapidement, répétez cette procédure (étapes 2,4-2,6) sur l’embryon donneur PGC pour créer un fragment de tissu végétal de même taille pour une transplantation.
    Remarque : Il est important d’effectuer cette deuxième dissection avec peu de retard pour minimiser le temps de l’embryon bénéficiaire guérir sa blessure ouverte.
  8. Une fois le tissu contenant le PGC est retiré de l’embryon donneur, utiliser la boucle de couteau et de cheveux de cheveux sourcil pour déplacer cette explant dans une position dans l’ouverture créée dans l’embryon de destinataire.
    Remarque : La surface intérieure de la greffe donneur doit être orienté vers l’intérieur de l’embryon du destinataire. Il n’est pas nécessaire faire correspondre les orientations des axes dorsale-ventral et gauche-droite de la prothèse avec l’embryon destinataire.
  9. Le côté long de la tige du couteau cheveux sourcil, qui s’est tenue parallèlement à la surface de la prothèse, permet d’appuyer doucement le greffon dans l’ouverture dans la surface végétale de l’embryon destinataire.
  10. Une fois la prothèse a été placée, utiliser un hairloop ou l’arbre d’un couteau de cheveux sourcil doucement glisser la « carcasse » de l’embryon donneur sur toute la surface du gel d’agarose et dans une dépression d’agarose. Assurez-vous que la plaie ouverte de la carcasse fait face le liquide en vrac. Si ce n’est pas le cas, utilisez le couteau de cheveux sourcil pour faire pivoter l’embryon pour parvenir à cette orientation.
  11. Glissez l’embryon bénéficiaire, avec le greffon guérison en place, dans une dépression adjacente et de même s’assurer que le tissu greffé pole vegetal fait face le liquide en vrac.
  12. Répétez cette procédure (étapes 2.1-2.11) en utilisant une autre paire de donateur et bénéficiaires embryons pour créer une autre paire de transplantation/carcasse ; transférer ces dépressions vide.
    Remarque : Il est essentiel qu’on fait des notations pour garder une trace des paires appariées des carcasses et des embryons de transplantation-roulement. Les carcasses de donateurs seront utilisés comme un proxy pour l’efficacité de la mutagénèse induite par Cas9-sgRNA dans le PGC transplanté, qui ne peuvent pas être facilement dosés jusqu'à ce que les animaux porteurs de transplantation atteignent la maturité sexuelle (Voir l’étape 3.3, ci-dessous et la Discussion de ).
  13. Continuer à faire des greffes les embryons jusqu'à environ début gastrulation 10, qui est d’environ 6,5 hpf dans X. tropicalis (voir la Figure 2E).

3. après guérison soin d’embryons

NOTE : Greffes guérissent en place au sein de ~ 30 min, et il est normal d’observer quelques débris vitellus de lyse cellulaire exsudant de l’embryon (Figure 3).

  1. Une fois guéri, utiliser une pipette Pasteur pour très doucement transfert embryons de dépressions à chaque puits d’une plaque de 24 puits recouvert d’agarose. L’exsudat sera retiré (Figure 3D) par mélange durant le transfert des fluides.
    1. Faites pivoter les embryons qu’ils sont placés végétale pôles vers le haut, face à la solution en vrac. Encore une fois, placez les carcasses de donateur et greffer des destinataires dans des puits adjacents afin d’aider à garder la trace des paires de l’embryon ; enregistrer ces informations.
  2. Transférer la plaque 24 puits contenant des embryons à un incubateur de 25 ° C pour la culture au jour le jour.
    Remarque : Le jour suivant, les embryons auront atteint tailbud étapes.
  3. Déplacez les destinataires de greffe pour nettoyer les plaques de 6 puits recouvert d’agarose contenant x 1/9 que RRO additionné de 50 µg de gentamycine sulfate/mL, avec 1 embryon / puits. Tenir un registre clair des carcasses de donateurs qui correspondent à ces receveurs de greffe.
  4. Afin d’évaluer l’efficacité de la mutagénèse par séquençage PCR amplicons5,17,24 ou à l’aide d’autres méthodes qui s’appuient sur les amplimères PCR (voir la Discussion), déplacer des carcasses aux tubes de bande PCR 0,2 mL. Enlever la plupart du milieu et homogénéiser dans 100 µL lyse tampon24 contenant la protéinase K (PK) par répété pipetage va-et-vient à l’aide d’une pipette de P200.
  5. Effectuer l’embryon lyse24 à 56 ° C pendant 6 h à la nuit pour permettre la digestion PK. Inactiver PK en le chauffant à 90-95 ° C pendant 10 min, suivie d’un refroidissement rapide à 4 ° C. Utilisez les lysats sans autres étapes de nettoyage pour amorcer les réactions de PCR pour obtenir des amplicons courts pour direct de séquençage ADN Sanger24. Stocker les lysats à-20 ° C.
    NOTE : Quelques jours après, les têtards atteindront alimentation stades (environ étape 45-46) et peuvent être nourris avec une suspension de poudre planctonique (sérums Micron).
  6. Après environ 1 semaine, avec des variations quotidiennes de milieu de culture pour maintenir la propreté et de minimiser la prolifération microbienne, déplacer les têtards à petits réservoirs dans un circuit aquatique avec écoulement goutte à goutte. Les données de séquençage permet de séparer les têtards avec fortement efficacement mutagénisé PGC de têtards avec une efficacité moindre mutagenèse. Une fois la métamorphose terminée, déplacez les petites grenouilles au système aquatique adult dans le laboratoire.
    NOTE : Les schémas développés par la ressource nationale de Xenopus (laboratoire de Biologie Marine, Woods Hole, MA) fournissent un guide pour têtard alimentation29 et grenouille adulte maintenance30.

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Representative Results

Après la transplantation, la détermination qualitative de l’efficacité de la mutagénèse CRISPR/Cas9 doit être effectuée avant de dépenser de l’effort dans l’élevage pour développer et maintenir les animaux à la maturité sexuelle. Parce que les animaux porteurs de leapfrog greffes est somatiquement type sauvage et la lignée germinale est difficile d’accès pour des mesures directes, il devient important de sauver les carcasses d’embryons de donneurs. Analyse de l’ADN de la carcasse fait office de proxy pour la mesure de la mutagénèse qui survient chez les greffés de cellules germinales17.

Une approche pour évaluer le succès de la mutagénèse est directement la séquence amplimères PCR couvrant la région génomique ciblée. Cela devient particulièrement coûteux et inefficace si l'on souhaite séquence de nombreux fragments d’ADN clonés individuellement de nombreux animaux. Au lieu de cela, séquençage des amplicons hétérogènes sur le site cible, car ils sont issus d’embryons génétiquement de mosaïque, est utilisé pour évaluer l’efficacité de la mutagenèse dans chaque embryon19. Visualisation des chromatogrammes montre la séquence de type sauvage (pics) en amont de la cible de séquence et les pics devenus « codé » (c'est-à-dire, la cooccurrence des pics correspondant aux multiples bases apparaissant à chaque position de nucléotides) en aval de le site de la pause de double brin catalysée par Cas9. On trouvera des exemples de ces profils en S1 de la Figure du Blitz et al. 17. quantification précise de l’étendue de la mutagenèse représentée par ces pics brouillés peut être obtenue à l’aide d’un algorithme de décomposition de séquence, la marée (https://tide-calculator.nki.nl/)31. Dépistage des embryons individuels à l’aide de cette technique donne de la confiance que chaque embryon a été correctement injecté et ciblée pour la mutagénèse. Un traceur, comme un dextran fluorescent étiqueté, peut être utilisé pour confirmer la réussite injection24 et peut également aider à établir qu’un têtard procède en effet le tissu greffé (données non publiées). Il est important de noter que la possibilité formelle que la co-injection d’un dextran fluorescent avec Cas9-sgRNA seraient susceptibles de modifier l’efficacité Cas9 mutagénèse n’a pas été explorée. Les embryons « leapfrogged » contenant des greffes de donneurs mal ou unmutagenized peuvent être mis au rebut.

Saute-mouton contourne la nécessité pour l’analyse de génération2 F dans les mécanismes de reproduction génétique standard, afin de permettre des analyses phénotypiques efficaces chez les embryons de1 F. Lorsque vous utilisez l’approche standard pour muter les gènes essentiels, prudente titration de dose Cas9-sgRNA est nécessaire pour assurer la viabilité des embryons de fondateur, ayant pour résultat une efficacité réduite de mutagénèse. Survivant F0 animaux de ce régime standard est alors croisées avec wildtypes afin d’obtenir des embryons viables1 F, qui sont projetés pour identifier les porteurs. Enfin, ces hétérozygotes de1 F sont cultivés à la maturité sexuelle et intercroisées pour obtenir des homozygotes F2 affichage des phénotypes mutants. En revanche, parce que Bond produit des animaux possédant le remplacement complet de leur germlines avec allèles mutants, intercrossing ces animaux de0 F produit des phénotypes mutants dans la génération de1 F. Blitz et al. 17 a signalé qu’une majorité des F0 animaux ciblés au locus de la tyrosinase (tyr), qui est requis pour la pigmentation des mélanocytes et de la rétine, a montré 100 % lignée germinale transmission (mesurée par pollinisation croisée avec Tyr- / - animaux albinos) des génomes mutants dérivé donneur (voir Figure 4 a-B et tableau 1). Ainsi, on donnerait intercrossing deux animaux produites par Bond homozygotes ou hétérozygotes mutant F1 embryons.

Des résultats similaires ont été obtenus17 d’intercrossing F0 devancé animaux porteurs de mutations dans la boîte homéotique (codant l’homéodomaine de liaison à l’ADN) du gène goosecoid (CGC) (voir la Figure 4 a, C-H). Faute d’expression CGC utilisant des oligonucléotides antisens morpholino dans X. laevis suggère que le gène de la CGC est nécessaire pour le développement complet de la tête antérieure32, et Cas9-sgRNA injecté têtards également voir la phénotypes de létalité embryonnaire17. Toutefois, les animaux de0 F leapfrogged, étant somatiquement type sauvage, sont viables et robuste et l’inter-crosse de1 F produite des embryons avec des phénotypes LOF identiques à ceux publiés dans X. laevis passes rabattues17. Ces données fournies de corroboration génétique du phénotype morpholino, ainsi qu’une preuve de principe que brûler les étapes permet de surmonter les phénotypes létalités embryonnaires.

Figure 1
Figure 1 : matériaux nécessaires à la transplantation. Verre de Borosilicate (A) pipettes Pasteur servent à fabriquer des couteaux de poils des sourcils et des cheveux boucles pour microchirurgie sur embryons au stade précoces. Dessin sur le verre à l’aide d’un bec Bunsen permet pour une fin plus étroite pour l’insertion des cheveux. La flèche rouge indique la position approximative à laquelle doit briser le verre. (B) un exemple d’un couteau de cheveux sourcil (en haut) et la boucle de cheveux (en bas), fixé en pipettes avec de la colle à séchage rapide. (C), une portion d’une plaque PCR 96 puits sert à créer des dépressions dans une plaque de gel d’agarose en permettant l’agarose à 1 % se solidifier autour du moule (agarose faite aux 0,3 x 1 x MMR, selon que les transplantations d’organes sont effectuées en X. tropicalis ou X. laevis, respectivement). L’épaisseur de l’agarose est ~ 5 mm, avec 3-4 mm-puits profonds. (D) un exemple d’une plaque de gel d’agarose à la transplantation, avec 12 dépressions, comme indiqué dans le tableau C. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : morphologie du pôle végétal au cours de la fin de la blastula aux premiers stades de la gastrula et la stratégie pour la dissection. (A-F) Les embryons de Xenopus tropicalis sont affichent dans une vue végétale à intervalles de temps moyennes sur une demi-heure, depuis le début du stade blastula 9 (4.5 hpf) à début gastrula stade ~10.25 (7 hpf). Avant 5 hpf, blastomères sont grandes et plus facilement endommagées. Le blanc, le cercle en pointillés marque la position attendue de la formation des cellules bouteille au cours de la gastrulation, ce qui peut être vu en formant le début sur la face dorsale (en haut) dans les séries (E et F). Pour brûler les étapes, les quatre incisions sont faites dans un carré, représentée par des pointillés noirs, avec une finale coupe fait parallèlement à la surface du tissu (non illustré) pour libérer l’explant végétal. Echelle = 400 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Transplantation. (A) un exemple d’un embryon de hpf ~5.5 après l’ablation du tissu végétal contenant du PGC. La zone en pointillés noir et blanc cercle en pointillés sont les mêmes dimensions relatives que celles indiquées dans la Figure 2. (B) le végétal explant prélevé de l’embryon dans la paroi A, surface intérieure face au spectateur, est d’environ 0,4 à 0,45 mm par côté et 0,25 à 0,3 mm de profondeur. (C) un embryon avec le tissu végétal transplanté. L’image a été acquise ~ 10 min après la transplantation. Tissu (D) 30 min après la transplantation, le végétale est vu pour avoir guéri en place (tourbillonnant douce avec un couteau de cheveux sourcil qui précède que l’embryon a été utilisé pour créer un vortex qui a balayé les débris dans le groupe C). Après le transfert au 1/9 x ROR et d’incubation à 25 ° C, la plupart des embryons toutes gastrulation normalement. Echelle = 400 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Transmission de la lignée germinale de l’animal de0 F produites par saute-mouton. (A) de brûler les étapes, deux gènes ont été ciblés par CRISPR/Cas9, tyrosinase (en haut) et goosecoid (en bas). Le gène tyr était ciblée4,,5 , au sein de la séquence codante (trame bleue) pour un peptide signal de N-terminal (ombrage SP, rouge), tandis que le gène de la CGC a été ciblé17 au sein de codage séquence à la début de la boîte homéotique (ombrage rouge), qui est partagé entre deux exons. Des régions silenceur 5' et 3' non traduites sont sans ombrage. (B) têtards1 tous les 160 F de (voir également tableau 1) un accouplement d’un mâle de0 F leapfrogged (LF1) et un albinos (tyr-/-) femelle étaient albinos, indiquant que l’ensemble germinale de la male leapfrogged avait été remplacées par des cellules germinales mutantes de tyr . L’encart montre un têtard sauvage avec la pigmentation rétinienne et mélanocytes normaux. (C-H) Les embryons de1 F dérivés d’une population entre deux F0 devancé Xenopus ciblant le gène homéotique CGC. Environ 2/3rds des embryons étaient phénotype mutant pour la CGC, le phénotype étant plus ou moins de troncature antérieure de la tête (E-H). La moitié des mutants ont été soit cyclopic ou avaient les yeux rapprochés (F), tandis que l’autre moitié ont été eyeless (H). Génotypage a montré ce sont homozygotes ou hétérozygotes. Le 1/3rd d’embryons présentant le phénotype sauvage (C, D) ont été soit sauvage homozygote ou hétérozygotes. Hybridation in situ pour otx2 (un marqueur du prosencéphale, mésencéphale et yeux), egr2 (un marqueur du rhombencéphale rhombomeres 3 et 5 et un courant de crête neurale) et hoxb9 (un marqueur de la moelle épinière) montre que la perte de CGC fonction affecte uniquement la portion antérieure du domaine otx2 . Ces données sont reproduites de Blitz et al. 17 avec la permission de la compagnie des biologistes. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Croix Mâle Femelle Albino Type sauvage Total Albino %
1 LF1 Tyr-/- 160 0 160 100
2 LF2 Tyr-/- 148 0 148 100
3 Tyr-/- OFP 409 0 409 100
4 Tyr-/- LF4 0 519 519 0
5 Tyr-/- LF5 223 0 223 100
6 LF6 Tyr-/- 493 703 1196 41,2
7 Tyr-/- LF7 1 94 95 1.1
8 Tyr-/- LF8 125 0 125 100
9 Tyr-/- LF9 0 417 417 0
10 Tyr-/- LF10 252 0 252 100

Tableau 1 : Remplacement de germline efficace par leapfrog greffes porteuses de mutations dans la tyrosinase. Ciblant la tyrosinase, transplantation-animaux des deux sexes ont été obtenus. Ces animaux ont été croisés avec des albinos, qui sont homozygotes tyr- / -, pour tester l’efficacité de la transmission de la lignée germinale des allèles mutants et le pourcentage des embryons1 F qui a montré l’albinisme a été mesurée à l’étape de tadpole. Entrées dans les colonnes intitulées « Masculin » et « Féminins » indiquent quel parent est tyr- / - ou l’animal dérivé de former (LF). Le pourcentage d’embryons dans une croisée montrant le phénotype albinos sont indiqués sous « % albinos. » Notez que 6 des 10 animaux avec leapfrog greffes ont montré complète (100 %) remplacement avec allèles mutants. Ce tableau est tiré de Blitz et al. 17, avec permission.

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Discussion

Ce rapport fournit un protocole détaillé pour la transplantation de tissu végétal contenant PGC. Transplantation de PGC est utilisé en conjonction avec les technologies de modification du génome (p. ex., CRISPR/Cas9) pour modifier les cellules germinales d’un animal tout en maintien de la quasi-totalité de ses tissus somatiques comme génétiquement le type sauvage. Pour brûler les étapes pour réussir, il y a un certain nombre de facteurs critiques à considérer avant d’effectuer des transplantations d’organes.

Afin d’assurer le remplacement complet de la lignée germinale avec allèles mutants, il est recommandé qu’on détermine d’abord l’efficacité in vivo des sgRNAs. L’expérience suggère que la plupart sgRNAs conçus par CRISPRDirect (https://crispr.dbcls.jp/) ou CRISPRScan (http://www.crisprscan.org/) sont efficaces lorsqu’il est utilisé à 250 pg/embryon. Toutefois, dans certains cas, il peut être nécessaire d’utiliser des concentrations plus élevées (p. ex., la CGC sgRNA publié par Blitz et coll.17, requis 1 ~ ng/embryon). Est essentiel d’évaluer l’efficacité de la mutagénèse du site cible, et l’utilisation de marée permet une évaluation quantitative31. Tandis que la méthode a souligné ici utilise le Sanger direct séquençage des amplicons PCR (représentant la population d’allèles mutants chez les embryons de0 F), nombreuses autres méthodes ont été utilisées dans la littérature de l’édition de génome à cet effet. Autres techniques de faible à modéré-coût qui sont couramment utilisés incluent analyse RFLP en utilisant soit la perte d’enzymes de restriction33 ou Cas9/TALEN clivage sites34, le T7 endonucléase 135 et arpenteur 36 tests, l’hétéroduplex mobility assay37, le dosage de fonte à haute résolution38, fragment analyse par électrophorèse capillaire39,40et les méthodes axées sur le qPCR41, 42.

Une deuxième considération est le choix de l’emplacement du site cible du gène cible. Afin de permettre la récupération efficace des phénotypes mutants dans la génération de1 F, il est important de maximiser les chances des allèles LOF complet. Lors des lignées mutantes en utilisant des approches classiques c’est une stratégie commune afin de cibler un clivage Cas9 près de l’extrémité 5' du codage des régions, afin d’obtenir la résiliation prématurée translation vers le début de la protéine région codante. Hétérozygotes1 F seraient identifiés avec les mutations de déphasage, et ces animaux serait sélectionnés pour poursuivre les travaux parce qu’ils sont censés porter des allèles nuls. Étant donné que la stratégie de former utilise F0 croisements, l’approche de l’extrémité 5' de la séquence codante de ciblage serait très inefficace. F0 embryons ont germlines de mosaïque, et résultats de croisements chez les populations de mutants de1 F qui sont pour la plupart composés hétérozygotes17. Étant donné que l’analyse à grande échelle vérifie que, en moyenne, les attendus ~1/3rd de mutations produites par des cassures double brin sont dans leur cadre43, la plupart embryons1 F de cette façon aurait au moins un allèle avec une image en mutation qui peut-être conserver l’activité type sauvage. Par conséquent, une stratégie différente est nécessaire pour faire en sorte que même ces allèles mutants dans leur cadre sont susceptibles d’être des valeurs NULL. Ciblage des doubles brins dans des domaines le repliement des protéines qui sont essentielles pour la fonction de la protéine normale devrait se traduire par une plus grande chance de complet LOF (allèles nuls)17,44. Un examen attentif de la structure atomique des domaines protéiques, lorsqu’elle est disponible, peut aider à identifier les régions de structure secondaire qui, même lorsqu’elle contient une délétion dans le cadre du seul acide aminé, pourrait perturber (structure) domaine par exemple, la mutation de Δ3bp en CGC publié par Blitz et al.17). Si les sites cibles CRISPR/Cas9 peuvent être identifiés au sein de ces régions, on a plus de chance de créer avec succès des allèles nuls. Petites délétions au sein de boucles exposés au solvant entre composants structurels secondaires de protéine sont moins souhaitables parce que les mutations dans des régions plus souples pourraient encore aboutir à protéines fonctionnelles.

Une troisième considération pour brûler les étapes est l’efficacité de la suppression de PGC de l’embryon du destinataire. Cette étape doit être efficace afin d’assurer le remplacement complet de cellules germinales. On ignore actuellement si tous les embryons destinataire de greffe produites par la méthode décrite ici ont le retrait complet de leur PGC. entier-montent en situ hybridations Voir la variabilité dans la localisation des marqueurs PGC chez les embryons au stade blastula. Dans de nombreux cas, tous ou presque tous le signal se trouve près de l’extrémité la plus végétal de l’embryon et serait donc supprimée par la chirurgie décrite ici (Blitz et coll.17 et les citations qui y sont). Toutefois, certains embryons montrent expression marqueur PGC dans quelques cellules au plus près au sol blastocèle. Germinal fusionne tout d’abord au pôle végétal après la fécondation et puis est balayé le long des sillons de clivage au cours des premiers clivages. Certains germinal peut devenir distribué dans les cellules au milieu de l’hémisphère végétal et ne pas être effectivement retiré sans utiliser les transplantations qui atteignent le blastocèle. Toutefois, il est également important de noter que ces cellules profondes contenant des marqueurs de cellules germinales ne pourraient pas contribuer à la lignée germinale, comme microARN sont connus pour effacer les PGC ARNm de cellules somatiques45,46. Ces cellules profondes coloration positifs pour les marqueurs de PGC peut-être les cellules somatiques subissant cette autorisation. Méthodes pour assurer l’enlèvement complet de PGC d’embryons bénéficiaires sont en cours d’élaboration.

Enfin, il est également important de considérer combien animaux de0 F à générer en sautant. Comme un nombre variable d’animaux ne survivra pas à la maturité sexuelle, il est recommandé que plus de 20 embryons contenant des greffes sont créés. Il sera nécessaire d’avoir des animaux assez de survivants pour s’assurer (1) qu’un nombre suffisant des deux sexes seront obtenues et (2) que ceux-ci transmettent des allèles mutants à une fréquence suffisamment élevée pour être utilisés pour les analyses prévues par le chercheur.

En utilisant le protocole décrit ici, avec une certaine pratique, embryologistes gymnophiones devraient être en mesure de maîtriser la technique de la transplantation de PGC avec une certaine pratique. Brûler les étapes devraient être possible, non seulement dans les autres amphibiens, mais également d’autres organismes contenant des PGC qui sont facilement transplantable entre les individus à des stades précoces de l’embryogenèse.

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Disclosures

L’auteur n’a rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été réalisé avec le soutien d’une subvention, 5R21HD080684-02, de l’Institut National de santé de l’enfant et le développement humain. L’auteur tient à remercier Ken Cho pour son enthousiasme et le soutien continus. L’auteur tiens également à remercier Bruce Blumberg utilisation de sa caméra, Rébecca Charney, à la lecture critique du manuscrit et Sean McNamara et Marcin Wlizla à la ressource nationale de Xenopus (RRID:SCR_013731), pour le précieux conversations au sujet de X. tropicalis d’alimentation et de régimes de protection des animaux.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dumont #5 forceps Fine Science Tools 11252-20 or 11252-30
Eyebrow hair knife Homemade
Hair loop Homemade
Pasteur pipettes, borosilicate glass Fisher Scientific 13-678-20A
Krazy Glue (Cyanoacrylate-based) Elmer's Products, Inc. KG581 To affix eyebrow hair and hair loops into Pasteur pipettes, other similar glues can be used.
Oligodeoxynucleotides, custom ordered Integrated DNA Technologies Custom ordered Template oligos for sgRNA synthesis, see Nakayama et al., 2014 for design details.
Megascript T7 kit Ambion/ThermoFisher AM1334 Or use Megashortscript T7 (AM1354) kit
Phenol, Tris buffered High quality distilled phenol from any commercial supplier
Chloroform High quality chloroform from any commercial supplier
Ethanol High quality ethanol from any commercial supplier
Diethylpyrocarbonate (DEPC) Sigma Chemical Co. D5758-50ML
Cas9 protein, with nuclear localization signal PNA Bio, Inc. CP01 Reconstituted using DEPC-treated water according to manufacturer's recommendations
10X Marc's Modified Ringers solution Homemade. Recipe (ref 26) for 1X MMR (lacking EDTA) is 100mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES. Solution is pH adjusted to 7.4.
Agarose Any Molecular Biology grade agarose is sufficient
60 X15 mm Petri plates Falcon 351007
24-well plates Falcon 3047
L-Cysteine Sigma Chemical Co. C7352-100G Free base, not HCl salt
Proteinase K Roche 03 115 828 001 Typically ~20mg/ml from Roche
sera Micron sera Tadpole food. Resuspend in growth medium. Can be purchased from a variety of online retailers

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