Summary
Genes esenciales para la supervivencia de plantean obstáculos técnicos para la creación de líneas mutantes. Leapfrogging evita mortalidad combinando genoma corrige con el trasplante de células de germen primordiales para crear tipo de salvaje animales portadores de mutaciones del germline. Evitamos también permite la generación eficiente de homocigotos mutantes nulos en la generación de1 F. Aquí, se demuestra el paso del trasplante.
Abstract
La creación de líneas mutantes por la edición del genoma está acelerando el análisis genético de muchos organismos. CRISPR/Cas9 métodos han sido adaptados para su uso en la rana con garras africana, Xenopus, un organismo modelo de larga data para investigación biomédica. Esquemas tradicionales para la creación de líneas homocigóticas mutantes con mutagénesis CRISPR/Cas9-objetivo tienen varios pasos lentos y laboriosos. Para facilitar la creación de embriones mutantes, particularmente para superar los obstáculos asociados a la anulación de los genes que son esenciales para la embriogénesis, se desarrolló un nuevo método llamado leapfrogging. Esta técnica aprovecha la solidez de Xenopus embriones para "cortar y pegar" métodos embriológicos. Leapfrogging utiliza a la transferencia de células de germen primordiales (PGCs) de embriones de donante mutagenized eficientemente en ablación de PGC wildtype hermanos. Este método permite la eficiente mutación de genes esenciales creando animales quiméricos con células somáticas de tipo salvaje que llevan un mutante del germline. Cuando dos animales de0 F portadores de "saltarse los trasplantes" (es decir, células de germen mutante) se cruzan, producen homocigóticos o compuestos heterozigóticos, nulos F1 embriones, ahorrando así un tiempo de toda una generación para obtener datos fenotípicos. Evitamos también proporciona un nuevo enfoque para el análisis de genes de efecto materno, que son refractarios a F0 fenotípica análisis CRISPR/Cas9 mutagénesis. Este manuscrito detalla el método de leapfrogging, con especial énfasis en cómo realizar con éxito trasplantes de PGC.
Introduction
Genotipo codifica el fenotipo ha sido una cuestión importante en la biología desde el redescubrimiento de las leyes de Mendel. Una comprensión de las funciones de los genes, su Reglamento y las interacciones en las redes de genes y las funciones de las promesas de productos codificados para proporcionar herramientas para descubrir nueva biología y mejorando Estados de enfermedad. Para más de la mitad del siglo1, la rana africana con garras, Xenopus, ha sido un líder modelo para estudios sobre una amplia variedad de temas en biología fundamental y biomedicina, incluyendo el control genético del desarrollo. Históricamente, la investigación en Xenopus ha utilizado la rana tetraploide, X. laevis, pero más recientemente, debido a su Diploidia, X. tropicalis ha sido desarrollado como un modelo genético de anfibios. Se han reunido las secuencias completas del genoma de ambas especies de Xenopus 2,3. La "comunidad de rana" está ahora en un punto de inflexión donde tecnología de la modificación básica del genoma permite el estudio de la función del gene, prácticamente a voluntad. Endonucleasas CRISPR/Cas9 programables han hecho que la mutagénesis de genes altamente eficientes, con mutación de biallelic posible en la mayoría de las células de los animales4,5,6,7, 8,9,10,11. Estos estudios, puesto de relieve por Bhattacharya et al. 12 y Shigeta et al. 13, han demostrado que la función de muchos genes puede estudiarse mediante mutagénesis en animales de mosaico F0 . Este enfoque tiene muchas ventajas; sin embargo, los embriones microinyectados Cas9-sgRNA a menudo Mostrar fenotipos variables debido a la incompleta pérdida de la función (LOF). Más significativamente, la generación de líneas mutantes es altamente ventajosa para algunas aplicaciones, en particular, al estudiar los genes que tienen una contribución materna del mRNA. Materna mRNAs y proteínas y sus influencias en la epigenética, persisten durante un período prolongado en embriogénesis14,15,16, haciendo las aportaciones del desarrollo tempranas de muchos genes refractario a los análisis de0 F. Por lo tanto, se necesitan otros enfoques LOF.
A la hora crear líneas mutantes, el camino a la obtención de embriones homocigóticos de LOF tiene varios obstáculos. Mutagénesis en primer lugar, eficiente para producir mutaciones biallelic puede ser una desventaja debido a pérdida de las funciones del gen esencial en el fracaso para sobrevivir hasta la madurez sexual, interfiriendo con la producción de una línea viable. Una solución común es la valoración cuidadosa de la cantidad de Cas9-sgRNA entregado. Aquí, el objetivo es lograr un equilibrio entre la reducción de la mortalidad mientras que también maximiza la eficiencia de mutagénesis del germline. Un segundo problema surge a partir del esquema de cría estándar, donde análisis fenotípicos se difieren hasta la generación de2 F. Utilizando el enfoque estándar, maduran sexualmente animales de0 F que transmiten a mutante alleles a través de la línea germinal son cruzadas para producir F1 heterocigoto "portadores", que luego crecen hasta la madurez sexual. Dos heterocigotos1 de F entonces se entrecruzan para producir embriones mutantes de F2 a una frecuencia mendeliana esperada del 25%. Así, dos generaciones de cría son necesarias para el análisis de los fenotipos mutantes. Animales mutantes podrían ser homocigotos o heterocigotos compuestos (es decir, progenie que contiene dos diferentes alelos del mutante, que depende de los genotipos de los padres animales utilizados en los intercross de1 F).
Estos obstáculos pueden superarse por confinamiento programable mutagénesis mediada por la nucleasa a las células de germen, que es la base de un nuevo método llamado saltar17. Leapfrogging tiene dos componentes principales: (1) la microinyección de mRNA Cas junto con sgRNA o nucleasa-sgRNA complejos (o de las nucleasas de dedos de principio, TALENs o zinc) en la etapa unicelular a eficientemente mutagenize genoma embrionario, seguido por (2) el trasplante de PGCs en embriones de tipo salvaje hermano, donde se eliminaron las PGCs endógenas. Puede obtenerse cuando ambos pasos son reemplazo del germline eficiente, completo con las células de germen mutantes. Blackler demostró en la década de 1960 que Xenopus PGCs podrían trasplantarse entre embriones con la neurula tarde y temprano tailbud etapas18,19. Para leapfrogging, enfoque de Blackler fue modificada mediante la realización de los trasplantes en el blastula etapa17, cuando PGCs se localizan en el polo vegetal del embrión20,21. Trasplante antes de la gastrulación tiene dos ventajas principales. En primer lugar, el engraftment de trasplantes y el posterior desarrollo normal fue encontrado para ser más eficiente cuando el trasplante se realiza en la fase de blástula (observaciones no publicadas). En segundo lugar, realizando trasplantes de blastula etapa poco después transcripción cigóticos ha comenzado, uno puede evitar la letalidad resultantes del desarrollo gene mutaciones que afecten la gastrulación u originar malformaciones neurulae finales. PGC trasplante-cojinete ("saltaba") embriones son cultivados a la madurez sexual, y intercrosses entre estos F0 de animales han demostrado que, en muchos casos, 100% de la progenie de1 F muestran el fenotipo LOF (la mayoría siendo compuesto los heterocigotos), indicando la sustitución completa del germline con mutaciones específicas.
Se espera que evitamos acelerará enfoques genéticos en Xenopus. Evitamos también proporciona una alternativa al método de "transferencia de acogida"22 para el análisis de genes de efecto materno (observaciones no publicadas) de LOF. En la publicación actual, se presenta una descripción detallada del método, centrándose especialmente en el trasplante del PGC, en X. tropicalis (con pequeñas modificaciones para X. laevis). El trasplante de PGCs se demuestra aquí para facilitar a una transferencia más rápida de esta tecnología a otros laboratorios que trabajan con Xenopus. Los principios de este método deben ser exitosos en otros anfibios (e.g., tritones), y específicas del organismo modificaciones en la metodología deben permitir para el uso de muchos otros animales en el que se puede lograr eficiente mutagénesis y PGCs son fácilmente transplantables.
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Protocol
Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el cuidado de Animal institucional y Comité de uso de la Universidad de California, Irvine.
1. preparación para el trasplante del PGC
- Prepara con antelación, herramientas de disección como se describió anteriormente23.
Nota: Cuchillos de pelo de la ceja se utilizan para hacer incisiones con la ayuda de un lazo del pelo para estabilizar el embrión mientras se realizan las cirugías. Pelos de la ceja y bucles de cabello pegados en el vidrio de borosilicate Pipetas Pasteur primero dibujadas en una llama y rotos en la porción adelgazada (vea la figura 1A, punta de flecha) para crear una punta más corta y más estrecha (figura 1B) para una mayor destreza Cuando se realizan cirugías. - Generar sgRNAs con procedimientos previamente descritos24 .
Nota: Brevemente, corta plantillas de la DNA que codifica para sgRNAs se crean utilizando deoxyoligonucleotides superpuestos que contienen 5' promotores de bacteriófago T7, que se recuecen y "rellena" por una ADN polimerasa termoestable, libre de errores. Se incuban in vitro reacciones síntesis sgRNA durante varias horas hasta toda la noche (según el kit utilizado). Las reacciones son tratados con DNasa para quitar la plantilla. Los sgRNAs son purificados por métodos estándar de fenol/cloroformo extracción y amonio acetato/isopropanol precipitación, según instrucciones24 del fabricante kit. - Poco antes de la realización de microinyecciones, preparar Cas9 sgRNA complejos por primera desnaturalización ~ 250 ng de sgRNA en un volumen total de 3 μl de Rnasa-libre (Tratado diethylpyrocarbonate) H2O a 60-65 ° C por 5 min, seguido de un enfriamiento rápido con hielo durante 5 minutos. Centrifugue el sgRNA durante unos segundos, añadir 1 μl de proteína de Cas9 de 1 μg/μl e incubar 10 min a 37 ° C para promover la formación de complejos.
Nota: Después de la incubación, el tubo puede conservarse en hielo mientras se preparan los embriones para microinyección. - Obtener X. tropicalis de embriones por fertilización in vitro usando métodos estándar, como se describió anteriormente25. La jalea25,26 los embriones en fertilización después de 10 minutos.
Nota: El tiempo de fertilización se considera el tiempo después de la suspensión de esperma se agrega a los huevos y el plato se inunda de 1/9thX modificado timbres (MMR)26 de Marc. Para X. tropicalis25, a diferencia de X. laevis, realizar la-jellying en 1/9 x MMR que contiene 3% cisteína libre base (no la sal del ácido clorhídrico), pH ajustado a 7,8-8,0, seguida de múltiples lavados en 1/9 x MMR. Transfiera los embriones a una agarosa (1%)-plato recubierto que contiene 1/9 x MMR a temperatura ambiente. - Inmediatamente transferir los embriones que se inyecta a un plato cubierto de agarosa 1%, que contiene 1 x MMR con una pipeta Pasteur.
-
Inyectar en la etapa de 1 célula. Ver referencias26,27 para descripciones detalladas de los métodos de microinyección de Xenopus .
- Inyectar cada embrión en un solo lugar en el polo animal, con 4 nL Cas9 sgRNA complejo (cantidad final = 1 ng de Cas9 y ~ 250 pg de sgRNA; véase la discusión)24. Después de 10-20 min de la curación de sitio de inyección, transferir los embriones a un plato cubierto de agarosa que contiene 1/9 x MMR e incubar a 25 ° C. También crear un plato de uninjected hermano embriones que servirán como receptoras de injerto.
-
Preparar placas de Petri (60 mm) que contienen un ~ 5 mm-capa de agarosa al 1% en 0.3 x MMR, si haciendo trasplantes en X. tropicaliso 1 x MMR para X. laevis.
- Crear depresiones ~ 3-4 mm profundidad insertando un 3-x 4-well molde (creado por cortar una placa de PCR de 96 pocillos) en la agarosa fundida al verter a las placas (ver figura 1 y D). Sujete el molde varios milímetros por encima de la parte inferior de la caja Petri con una pinza unida a un soporte de anillo hasta que la agarosa se ha endurecido.
- Además, hacer una placa de 24 pocillos a los embriones individuales casa cubriendo los pozos con una fina capa de agarosa al 1% en 1/9 x MMR.
Nota: El medio de cultivo a estos pozos es de 1/9 x que MMR suplementado con 50 μg de sulfato de gentamicina/mL.
2. trasplante de PGCs
- Cuando los embriones alcanzan sólo Nieuwkoop y Faber28 blastula etapa 9 (figura 2A), ~4.5 h después fertilización (hpf) de X. tropicalis, quite de la incubadora de 25 ° C y permite que se equilibren a temperatura ambiente durante 0.5 h.
- Para comenzar el trasplante en 5 hpf (figura 2B), utilice una pipeta Pasteur transferir un embrión de donante PGC (inyectado con Cas9 sgRNA) al plato de agarosa de 60 mm que contiene depresiones (creadas en el paso 1.7) en 0.3 x MMR (o 1 x MMR si utiliza X. laevis). También transferir un embrión de uninjected hermano, el receptor del injerto, para este plato.
Nota: Es crítico que las identidades de cada uno de esos embriones no se confunden. - Manualmente quitar el vitelinas sobres de cada embrión con unas pinzas y girar ambos embriones de forma que su polo vegetal esté en la vista y accesible para la cirugía.
Nota: Una descripción de manual de-vitellination de embriones ha sido previamente descrito26. - Con la punta afilada de un cuchillo de pelo de la ceja, hacer cuatro incisiones poco profundas en la forma de un cuadrado en el polo vegetal del embrión receptor, dentro de la zona donde se forman células botella futuro que marcan el blastopore. Hacer las incisiones insertando la punta de la cuchilla de pelo de la ceja en el embrión, justo debajo de la superficie y hacer cortar hacia arriba los movimientos mientras se estabiliza el embrión con el lazo del pelo.
Nota: La figura 2 muestra un embrión vegetales vistas en intervalos de media hora de 4.5-7.0 hpf para mostrar el tamaño de celda y proporcionar una guía para estimar donde las células de botellas que forman (círculo blanco discontinua). El objetivo es hacer incisiones donde se indica la caja negra punteada. - Una vez que los cuatro lados de la Plaza están delineados por incisiones, profundizar cada incisión con el cuchillo de pelo de cejas usando movimientos de corte similar para llegar a una profundidad de aproximadamente 1/3 a 1/2 de la distancia al suelo del blastocoel.
- Libre de los explantes de tejido vegetal del embrión receptor (Figura 3A y B) haciendo una horizontal (paralela a la superficie vegetal) cut(s) en la región vegetal profundo.
Nota: El tamaño de explante vegetal que contiene el PGC es aproximadamente 0.4 0.45 mm por lado y 0.25-0.3 mm de profundidad. Este explante vegetal del embrión receptor ya no es necesario y por lo tanto debe ser apartar a ser desechada. - Trabajando rápidamente, repita este procedimiento (pasos 2.4-2.6) en el embrión de donante PGC para crear un fragmento de tejido vegetal de tamaño similar para el trasplante.
Nota: Es importante llevar a cabo esta segunda disección con poco retraso para minimizar el tiempo para el embrión receptor sanar su herida abierta. - Una vez que se extirpa el tejido que contiene PGCs del embrión donante, utilice el lazo de cuchillo y pelo de ceja pelo para mover este explante en posición en la abertura que se crea en el embrión de la receptora.
Nota: La superficie interior del injerto donante debe estar hacia el interior del embrión receptor. No es necesario para que coincida con las orientaciones de los ejes del injerto con el embrión receptor dorsal-ventral y de izquierda a derecha. - Utilice el borde largo del eje de la cuchilla de cejas cabello, cabo paralelo a la superficie del injerto, para presionar suavemente el injerto en la abertura de la superficie vegetal del embrión receptor.
- Una vez que se ha colocado el injerto, use un hairloop o el mango de un cuchillo de pelo de la ceja se deslice suavemente el "cadáver" del embrión donante a través de la superficie de agarosa y en una depresión de agarosa. Asegúrese de que la herida abierta de la carcasa encuentra en el líquido a granel. Si no es así, utilice el cuchillo de pelo de la ceja para girar el embrión para conseguir esta orientación.
- Deslice el embrión receptor, con el injerto de curación en el lugar, en una depresión adyacente y además Asegúrese de que el tejido injertado poste vegetal encuentra en el líquido a granel.
- Repita este procedimiento (pasos 2.1-2.11) con otro par de donantes y receptores embriones para crear otro par de trasplante/canal; la transferencia de éstos a las depresiones vacías.
Nota: Es crítico que se hacen anotaciones para el seguimiento de los pares coincidentes de canales y rodamiento de trasplante de embriones. Los cadáveres de donantes se utilizará como un proxy para la eficiencia de mutagénesis inducida por sgRNA Cas9 en las PGCs trasplantadas, que no pueden ensayarse fácilmente hasta los animales del cojinete de trasplante alcanzan la madurez sexual (vea el paso 3.3, a continuación y la discusión ). - Seguir haciendo trasplantes hasta que los embriones alcancen la etapa de gástrula temprana aproximadamente 10, que es aproximadamente 6.5 hpf en X. tropicalis (ver Figura 2E).
3. la cura cuidado de embriones
Nota: Injertos de sanan en su lugar dentro de ~ 30 min, y es normal observar algunos restos yolky de lisis celular lleno del embrión (figura 3).
-
Una vez curado, utilice una pipeta Pasteur a los embriones de transferencia muy suavemente de las depresiones en los pocillos de una placa de 24 pocillos recubiertos de agarosa. El exudado sea eliminado (Figura 3D) por el líquido de mezcla durante la transferencia.
- Gire los embriones que se encuentran vegetales poste hacia arriba, hacia la solución a granel. Otra vez, coloque los cadáveres donantes e injerto destinatarios en pozos adyacentes para ayudar a mantener un registro de parejas de embrión; registrar esta información.
- La transferencia de la placa de 24 pocillos que contienen embriones en una incubadora de 25 ° C para la cultura durante la noche.
Nota: Al día siguiente, los embriones habrán alcanzado las etapas tailbud. - Mueva los recipientes del injerto para limpiar placas de 6 pozos recubiertos de agarosa que contiene 1/9 x que MMR suplementado con 50 μg de sulfato de gentamicina/mL, con 1 embrión por pozo. Mantener un registro claro de cadáveres donantes que coincidan con estos receptores de injerto.
- Evaluar la eficiencia de mutagénesis por secuenciación PCR amplicones5,17,24 o mediante otros métodos que dependen de amplicones de PCR (ver discusión), hacia canales individuales tubos de tira PCR de 0,2 mL. Eliminar la mayor parte del medio y homogeneizar en 100 μl de buffer de lisis24 con proteinasa K (PK) por repetidos altibajos el pipeteo con una pipeta de P200.
- Realizar el embrión lisis24 a 56 ° C por 6 horas hasta toda la noche para permitir la digestión de PK. PK de inactivar por calentamiento a 90-95 ° C durante 10 min, seguido de un enfriamiento rápido a 4 º C. Utilizar lisados sin más pasos de limpieza para las reacciones de PCR para obtener amplicones corto directo ADN Sanger secuenciación24la semilla. Tienda los lisados a-20 ° C.
Nota: Dentro de varios días, los renacuajos alcanzarán alimentación etapas (etapa aproximadamente de 45-46) y se pueden alimentar una suspensión de polvo planctónico (sera Micron). - Después de ~ 1 semana, con cambios diarios del medio de cultivo para mantener la limpieza y minimizar la proliferación microbiana, hacia los renacuajos pequeños tanques en un sistema acuático circulando con flujo de goteo. Utilizar los datos de secuenciación para segregar los renacuajos con altamente eficiente mutagenized PGCs de renacuajos con más baja eficiencia de mutagénesis. Una vez completada la metamorfosis, hacia las ranitas del sistema acuático adultos en el laboratorio.
Nota: Los regímenes desarrollados por el recurso nacional de Xenopus (Marine Biology Laboratory, Woods Hole, MA) proporcionan a una guía de alimentación29 y rana adulto mantenimiento30de renacuajos.
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Representative Results
Después del trasplante, la determinación cualitativa de la eficacia de la mutagénesis CRISPR/Cas9 debe realizarse antes de gastar el esfuerzo en la cría de animales para crecer y mantener los animales a la madurez sexual. Porque animales portadores de trasplantes de leapfrog son somáticamente wildtype y la línea germinal es de difícil acceso para la medición directa, guardar los cadáveres de embriones de donante se convierte en importante. Análisis de ADN de los cadáveres actúa como un proxy para la medida de mutagénesis que se produce en la línea germinal trasplantado17.
Un enfoque para evaluar el éxito de la mutagénesis es directamente secuencia amplicones de PCR que abarca la región genomic blanco. Esto se convierte en especialmente costoso e ineficiente si uno desea secuenciar fragmentos de ADN clonados individualmente numerosos de muchos animales. En cambio, secuenciación de amplicones heterogénea en el sitio de destino, como ellos se derivan genéticamente embriones de mosaico, se utiliza para evaluar la eficiencia de mutagénesis en cada embrión19. Visualización de cromatogramas muestra la secuencia de tipo salvaje (picos) aguas arriba de la meta secuencia y picos se convierten en "revuelto" (es decir, la co-ocurrencia de los picos correspondientes a bases múltiples que aparecen en la posición de cada nucleótido) aguas abajo de el sitio de la rotura del doble-filamento Cas9-catalizada. Ejemplos de tales perfiles pueden encontrarse en la figura S1 de Blitz et al. 17. cuantificación precisa del grado de mutagénesis representada por estos picos revueltos puede obtenerse utilizando un algoritmo de descomposición de secuencia, marea (https://tide-calculator.nki.nl/)31. Los embriones con esta técnica de detección da confianza de que cada embrión fue correctamente inyectado y destinado a la mutagénesis. Un trazador, como una fluorescencia etiquetada dextrano, puede utilizarse para confirmar éxito inyección24 y también puede ayudar a establecer que un renacuajo de hecho lleva el tejido trasplantado (datos no publicados). Es importante tener en cuenta que no se ha explorado la posibilidad formal de que la co-inyección de un dextrano fluorescente junto con Cas9 sgRNA podría alterar la eficiencia de mutagénesis Cas9. Pueden descartarse cualquier embriones "leapfrogged" que contiene los trasplantes de donantes mal o unmutagenized.
Leapfrogging evita la necesidad de análisis de generación de2 F en programas de mejoramiento genético estándar, permitiendo eficientes análisis fenotípicos en los embriones de F1 . Cuando se usa el enfoque estándar para mutar genes esenciales, cuidadosa titulación de Cas9 sgRNA dosis es necesaria para asegurar la viabilidad de embriones fundador, dando como resultado una eficiencia reducida de mutagénesis. Sobrevivir F0 animales de este esquema estándar son luego cruzados con wildtypes para obtener embriones de1 F viables, que son evaluados para identificar portadores. Por último, estos heterocigotos de1 F crecidos a la madurez sexual y entrecruzados para obtener a individuos homocigóticos de la2 de F Mostrar fenotipos mutantes. Por el contrario, porque evitamos produce animales que tienen el reemplazo completo de su germlines con alelos del mutante, entrecruzar estos animales0 de F produce fenotipos mutantes en la generación de1 F. Blitz et al. 17 informó que una mayoría de F0 animales destinados al tirosinasa (tyr) lugar geométrico, que es necesario para la pigmentación de los melanocitos y la retina, mostró 100% de transmisión de línea germinal (medido por exogamia con Tyr- / - animales albinos) de genomas mutantes derivados de donantes (ver Figura 4A-B y tabla 1). Por lo tanto, presentamos dos animales producidos por leapfrogging rendiría homocigóticos o compuestos heterozigótico mutante F1 embriones.
Resultados similares se obtuvieron17 por entrecruzar F0 subió animales portadores de mutaciones en la caja homeo (codificación el homeodomain de ADN) del gen goosecoid (gsc) (ver Figura 4A, C-H). Caídas de la expresión de Gsc utilizando oligonucleótidos antisentido morfolino X. laevis sugirieron que el gen de SGC es necesario para el desarrollo completo de la cabeza anterior32y Cas9 sgRNA inyecta los renacuajos también Mostrar fenotipos letal embrionario17. Sin embargo, los leapfrogged F0 los animales, siendo somáticamente tipo silvestre, viable y robusto, y la cruzan de1 F produce embriones con fenotipos LOF idénticos a los publicados en X. laevis caídas17. Estos datos genéticos corroboración del fenotipo morfolino, así como una prueba del principio evitamos puede utilizarse para superar fenotipos letales embrionarios.
Figura 1: materiales necesarios para el trasplante. (A) vidrio de borosilicato se utilizan pipetas Pasteur para hacer cuchillos de pelo ceja y cabello lazos para microcirugía en embriones tempranos. Dibujar hacia fuera el vidrio utilizando un quemador Bunsen permite un extremo más estrecho para la inserción del cabello. La flecha roja marca la posición aproximada en la que al romper el vidrio. (B) un ejemplo de un cuchillo de pelo de la ceja (parte superior) y lazo del pelo (parte inferior), fijado en pipetas con pegamento de secado rápido. (C) A parte de una placa PCR de 96 pocillos se utiliza crear depresiones en una placa de agarosa, permitiendo la agarosa al 1% solidificar en el molde (agarosa se hace en x 0,3 o 1 x MMR, dependiendo de si los trasplantes se realizan en X. tropicalis o X. laevis, respectivamente). El grueso de la agarosa es ~ 5 m m, con 3-4 mm-pozos profundos. (D) un ejemplo de una placa de agarosa para trasplante, con 12 depresiones, como se muestra en el panel C. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: morfología del polo vegetal durante la blástula tardía a los estadios de gástrula y la estrategia para la disección de. (A-F) Embriones de Xenopus tropicalis se muestran en vista vegetal a intervalos de tiempo cada media hora, desde el inicio de la etapa del blastula 9 (4.5 hpf) a temprano gástrula fase ~10.25 (7 hpf). Antes 5 hpf, blastómeros son grandes y más fácilmente dañadas. Blanco, círculo discontinua marca la posición esperada de formación de la célula de botella durante la gastrulación, que puede ser visto formando comenzando en el lado dorsal (superior) en los paneles (E y F). Para leapfrogging, cuatro incisiones se hacen dentro de un cuadrado, representado por líneas discontinuas negras, con un final cortado hecho paralelo a la superficie del tejido (no ilustrado) para liberar el explante vegetal. Barra de escala = 400 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: trasplante de. (A) un ejemplo de un embrión de hpf ~5.5 después del retiro del tejido vegetal que contiene el PGC. La caja punteada negra y blanco círculo discontinua son las mismas dimensiones relativa como se muestra en la figura 2. (B) el vegetal explante extraído el embrión en el panel A, superficie interna hacia el espectador, es aproximadamente de 0.4 0.45 mm por lado y 0.25-0.3 mm de profundidad. (C) un embrión con el trasplantado tejido vegetal. La imagen fue adquirida ~ 10 min después del trasplante. Tejido (D) 30 min después del trasplante, el vegetal se considera que han curado en su lugar (el remolino suave con un ceja pelo cuchillo arriba que el embrión fue utilizado para crear un vórtice que barrido escombros en panel C). Después de transferencia de hasta 1/9 x MMR e incubación a 25 ° C, la mayoría de embriones completan gastrulación normalmente. Barra de escala = 400 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Transmisión de línea germinal de animales de0 F producida por leapfrogging. (A) de leapfrogging, dos genes fueron dirigidos por CRISPR/Cas9, tirosinasa (arriba) y goosecoid (abajo). El gen tyr fue dirigida4,5 dentro de la secuencia de codificación (sombra azul) para un péptido de señal N-terminal (sombreado de SP, rojo), mientras que el gen gsc fue dirigida17 dentro de codificación secuencia en el el principio de la caja homeo (sombreado rojo), que se divide entre dos exones. Regiones no traducidas 5' y 3' exonic son sin sombrear. (B) los renacuajos de1 todos 160 F de (véase también cuadro 1) un apareamiento de un macho de0 F leapfrogged (LF1) y un albino (tyr-/-) femenino fueron albino, lo que indica que el entero germline del varón leapfrogged hubiera reemplazada por las células de germen mutante de tyr . El recuadro muestra un renacuajo de tipo salvaje con pigmentación normal de la retina y melanocitos. (C-H) Embriones de1 F derivados un cruzan entre dos F0 subió Xenopus contra el gene caja homeo SGC. Aproximadamente 2/3rds de los embriones fueron fenotípicamente mutante para el SGC, siendo el fenotipo diversos grados de truncamiento anterior de la cabeza (E H). La mitad de los mutantes eran bien gigantescas o tenían ojos de espaciamiento (F), mientras que la otra mitad eran eyeless (H). Genotipificación mostró a ser homocigotos o heterocigotos compuestos. 1/3rd de embriones con fenotipo tipo silvestre (C, D) eran de tipo salvaje homocigótico o heterocigotos. Hibridación in situ de otx2 (un marcador de forebrain, midbrain y los ojos), egr2 (un marcador del hindbrain rhombomeres 3 y 5 y una corriente de cresta neural) y hoxb9 (un marcador de la médula espinal) muestra que la pérdida de SGC función afecta sólo la porción anterior del dominio otx2 . Estos datos se reproducen de Blitz et al. 17 con el permiso de la compañía de biólogos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Cruz | Hombre | Mujer | Albino | Tipo salvaje | Total | % Albino |
| 1 | LF1 | Tyr-/- | 160 | 0 | 160 | 100 |
| 2 | LF2 | Tyr-/- | 148 | 0 | 148 | 100 |
| 3 | Tyr-/- | LF3 | 409 | 0 | 409 | 100 |
| 4 | Tyr-/- | LF4 | 0 | 519 | 519 | 0 |
| 5 | Tyr-/- | LF5 | 223 | 0 | 223 | 100 |
| 6 | LF6 | Tyr-/- | 493 | 703 | 1196 | 41.2 |
| 7 | Tyr-/- | LF7 | 1 | 94 | 95 | 1.1 |
| 8 | Tyr-/- | LF8 | 125 | 0 | 125 | 100 |
| 9 | Tyr-/- | LF9 | 0 | 417 | 417 | 0 |
| 10 | Tyr-/- | LF10 | 252 | 0 | 252 | 100 |
Tabla 1: Reemplazo del germline eficiente por leapfrog trasplantes llevan mutaciones en tirosinasa. Dirigidos a tirosinasa, trasplante teniendo animales de ambos sexos fueron obtenidos. Estos animales fueron cruzados con los albinos, que son homocigóticos tyr- / -, para probar la eficacia de la transmisión del germline de alelos del mutante y el porcentaje de los embriones de F1 que mostró albinismo fue analizado en la etapa de renacuajo. Entradas en las columnas con la etiqueta "Masculinos" y "Femeninos" indican que padres es tyr- / - o el animal de prueba derivados de saltar (LF). El porcentaje de embriones dentro de una cruz que muestra el fenotipo albino se indican con "% Albino." Tenga en cuenta que 6 de los 10 animales con trasplante de leapfrog demostró reemplazo total (100%) con alelos del mutante. Esta tabla se reproduce de Blitz et al. 17, con permiso.
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Discussion
Este informe proporciona un protocolo detallado para el trasplante de tejido vegetal que contiene PGCs. trasplante de PGCs se utiliza en conjunción con las tecnologías de la edición del genoma (por ejemplo, CRISPR/Cas9) para modificar la línea germinal de un animal mientras mantenimiento de casi todos los tejidos somáticos como genéticamente tipo salvaje. Para evitamos para tener éxito, hay una serie de factores críticos a tener en cuenta antes de realizar realizar trasplantes.
Para garantizar la sustitución completa de la línea germinal con alelos del mutante, se recomienda que uno primero determina la eficacia en vivo de sgRNAs. Experiencia sugiere que la mayoría sgRNAs diseñados por CRISPRDirect (https://crispr.dbcls.jp/) o CRISPRScan (http://www.crisprscan.org/) son eficientes cuando se usa a 250 pg/embrión. Sin embargo, en algunos casos, puede ser necesario utilizar concentraciones más altas (p. ej., lo sgRNA SGC publicado por Blitz et al17, se requiere ~ 1 ng/embrión). Evaluación de la eficiencia de mutagénesis de sitio de destino es esencial y el uso de la marea permite una evaluación cuantitativa31. Mientras que el método destacado aquí utiliza al directo Sanger secuenciación de amplicones de PCR (que representa la población de alelos del mutante en embriones de0 F), numerosos otros métodos se han utilizado en la literatura la edición del genoma para este propósito. Otras técnicas de bajo a moderado costo que se utilizan incluyen el análisis del polimorfismo de longitud de fragmento utilizando ya sea la pérdida de enzimas de restricción33 o Cas9/TALEN escote sitios34, la T7 endonuclease 135 y topógrafo 36 ensayos, el ensayo de movilidad de heterodúplex de37, el derretimiento de alta resolución ensayo38, fragmentan de análisis por electroforesis capilar39,40y los métodos basados en qPCR41, 42.
Una segunda consideración es la elección de la ubicación de destino dentro del gene de la blanco. Para permitir la recuperación eficiente de fenotipos mutantes en la generación de1 F, es importante maximizar la posibilidad de que alelos LOF completadas. Cuando las líneas mutantes usando el enfoque clásico es una estrategia común para escote Cas9 cerca del extremo 5' de las regiones, para provocar la terminación prematura de la traducción cerca del comienzo de la proteína codificación región de codificación de destino. Los heterocigotos1 F se identificarían con mutaciones del mutágeno ' frameshift ', y estos animales serán seleccionados para seguir trabajando porque se espera que llevan alelos nulos. Dado que la estrategia de saltar utiliza F0 intercrosses, el enfoque de focalización el extremo 5' de la secuencia de codificación sería altamente ineficiente. F0 embriones tienen mosaico germlines y resultados transversales en poblaciones de mutantes de1 F que son en su mayoría compuestos heterocigotos17. Puesto que el análisis a gran escala verifica que, en promedio, ~1/3 esperadord de mutaciones producidas por las roturas de doble cadena en el cuadro43, más embriones de1 F producidos de esta manera tendría al menos un alelo con un marco mutación que podría retener actividad de tipo salvaje. Por lo tanto, se necesita una estrategia diferente para asegurarse de que incluso, estos alelos mutantes en el marco suelen ser valores nulos. Objetivo doble filamento se rompe dentro de dominios de plegamiento de proteínas que son esenciales para la función normal de la proteína es que resulte en una mayor probabilidad de completa LOF (alelos nulos)17,44. Cuidadosa consideración a las previsiones de nivel atómico de los dominios de la proteína, cuando está disponible, puede ayudar a identificar regiones de estructura secundaria que, aún cuando contiene una canceladura en-marco solo aminoácido, puede esperar que los interrumpen (estructura) dominio por ejemplo, la mutación Δ3bp en SGC publicado por Blitz et al17). Si CRISPR/Cas9 sitios de destino pueden ser identificados dentro de estas regiones, se tiene una mayor probabilidad de éxito crear alelos nulos. Pequeñas canceladuras dentro de lazos expuestos al solvente entre componentes estructurales secundarios de la proteína son menos deseables porque las mutaciones en las regiones más flexibles aún podrían dar lugar a proteínas funcionales.
Una tercera consideración para leapfrogging es la eficiencia de remoción del PGC del embrión receptor. Este paso debe ser eficiente con el fin de garantizar la sustitución completa del germline. Es actualmente confuso si todos los embriones del injerto receptor producidos por el método descrito aquí tienen una eliminación completa de su PGCs. Whole-mount en situ hibridaciones Mostrar variabilidad en la localización de los marcadores PGC en embriones en fase de blástula. En muchos casos, toda o casi toda la señal se encuentra cerca del extremo más vegetal del embrión y por lo tanto se eliminaría por la cirugía se indica aquí (Blitz et al.17 y referencias en esto). Sin embargo, algunos embriones muestran expresión de marcadores PGC en algunas células más cerca al piso del blastocoel. Germoplasma se une primero en el polo vegetal después de la fertilización y luego se barre a lo largo de surcos escote durante las primeras divisiones. Algunos germoplasma puede ser distribuido en las células en el medio del hemisferio vegetal y no efectiva quitarse sin utilizar trasplantes que se extienden hasta el blastocoel. Sin embargo, también es importante tener en cuenta que estas células profundas que contienen marcadores de células germinales no podrían contribuir a la línea germinal, como microRNAs son conocidos para borrar PGC mRNAs de45,de las células somáticas46. Estas células profundas tinción positiva para marcadores PGC pueden ser células somáticas sometidos a tal separación. Actualmente se están desarrollando métodos para asegurar la completa eliminación de PGC de embriones receptores.
Por último, también es importante considerar cómo muchos animales de0 F generar leapfrogging. Como un número variable de animales no sobrevivirá a la madurez sexual, se recomienda que se crean embriones más de 20 que contienen trasplantes. Será necesario disponer de animales supervivientes lo suficientemente para asegurar (1) que un número suficiente de ambos sexos se obtendrá y (2) que estos transmitan alelos del mutante en una frecuencia lo suficientemente alta para ser conveniente para el análisis planificado por el investigador.
Utilizando el protocolo descrito aquí, con alguna práctica, embriólogos anfibios deben ser capaces de dominar la técnica de trasplantes de la PGC con algo de práctica. Leapfrogging debería ser posible, no sólo en otros anfibios, sino también otros organismos que contiene PGCs que son fácilmente transplantables entre individuos en las primeras etapas de la embriogénesis.
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Disclosures
El autor no tiene nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue realizado con el apoyo de una beca, 5R21HD080684-02, del Instituto Nacional de salud infantil y desarrollo humano. El autor desea dar las gracias a Ken Cho por su constante entusiasmo y apoyo. El autor agradece también a Bruce Blumberg para uso de su cámara, Rebeca Charney, para la lectura crítica del manuscrito y Sean McNamara y Marcin Wlizla en el recurso nacional de Xenopus (RRID:SCR_013731), por la valiosa conversaciones sobre X. tropicalis de alimentación y los regímenes de cuidado de los animales.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-20 or 11252-30 | |
| Eyebrow hair knife | Homemade | ||
| Hair loop | Homemade | ||
| Pasteur pipettes, borosilicate glass | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| Krazy Glue (Cyanoacrylate-based) | Elmer's Products, Inc. | KG581 | To affix eyebrow hair and hair loops into Pasteur pipettes, other similar glues can be used. |
| Oligodeoxynucleotides, custom ordered | Integrated DNA Technologies | Custom ordered | Template oligos for sgRNA synthesis, see Nakayama et al., 2014 for design details. |
| Megascript T7 kit | Ambion/ThermoFisher | AM1334 | Or use Megashortscript T7 (AM1354) kit |
| Phenol, Tris buffered | High quality distilled phenol from any commercial supplier | ||
| Chloroform | High quality chloroform from any commercial supplier | ||
| Ethanol | High quality ethanol from any commercial supplier | ||
| Diethylpyrocarbonate (DEPC) | Sigma Chemical Co. | D5758-50ML | |
| Cas9 protein, with nuclear localization signal | PNA Bio, Inc. | CP01 | Reconstituted using DEPC-treated water according to manufacturer's recommendations |
| 10X Marc's Modified Ringers solution | Homemade. Recipe (ref 26) for 1X MMR (lacking EDTA) is 100mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 5 mM HEPES. Solution is pH adjusted to 7.4. | ||
| Agarose | Any Molecular Biology grade agarose is sufficient | ||
| 60 X15 mm Petri plates | Falcon | 351007 | |
| 24-well plates | Falcon | 3047 | |
| L-Cysteine | Sigma Chemical Co. | C7352-100G | Free base, not HCl salt |
| Proteinase K | Roche | 03 115 828 001 | Typically ~20mg/ml from Roche |
| sera Micron | sera | Tadpole food. Resuspend in growth medium. Can be purchased from a variety of online retailers |
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