Summary
Descreveremos um protocolo para visualização de exocitose de insulina em ilhotas intactas usando pHluorin, uma proteína verde fluorescente de sensíveis ao pH. Ilhotas isoladas estão infectadas com vírus adenoide codificação pHluorin juntamente com a carga de vesículas neuropeptide Y. Isto permite a detecção de eventos de fusão de grânulo de insulina por microscopia confocal.
Abstract
A secreção de insulina desempenha um papel central na homeostase de glicose sob condições fisiológicas normais, bem como na doença. Abordagens atuais para estudar a exocitose de grânulos de insulina que ou usar eletrofisiologia ou microscopia acoplado à expressão de repórteres fluorescentes. No entanto, a maioria destas técnicas foram otimizada para linha celular clonal ou exige dissociando ilhotas pancreáticas. Em contraste, o método aqui apresentado permite a visualização em tempo real de exocitose de grânulos de insulina em ilhotas pancreáticas intactas. Neste protocolo, descrevemos primeiro a infecção viral de ilhotas pancreáticas isoladas com adenovírus que codifica uma pH sensíveis à proteína verde fluorescente (GFP), pHluorin, acoplada ao neuropeptídeo Y (NPY). Em segundo lugar, descrevemos o confocal imagens de Ilhéus cinco dias após a infecção viral e como monitorar a secreção de insulina do grânulo. Brevemente, os ilhéus infectados são colocados em uma lamela em uma câmara de imagens e fotografados sob um microscópio confocal laser de varredura vertical enquanto continuamente sendo perfundidos com solução extracelular que contém vários estímulos. Imagens confocal abrangendo 50 µm de ilhota são adquiridas como gravações de lapso de tempo usando um scanner rápido-ressonante. A fusão dos grânulos de insulina com a membrana plasmática pode ser seguida ao longo do tempo. Este procedimento também permite testar uma bateria de estímulos em uma única experiência, é compatível com mouse e ilhotas humanas e pode ser combinado com vários corantes para a imagem latente funcional (e.g., corantes de cálcio citosólico ou potencial de membrana).
Introduction
Insulina é produzida pelas células beta das ilhotas pancreáticas e é um regulador chave da glicose metabolismo1. Morte ou disfunção das células beta perturba a homeostase de glicose e leva a diabetes2. Insulina é embalada em grânulos densos núcleos que são liberados em uma Ca2 +-dependente forma3. Elucidar como exocitose de grânulos de insulina é regulada é essencial para compreender plenamente o que determina a secreção de insulina e abre novos caminhos para a identificação de novos alvos terapêuticos para o tratamento da diabetes.
Exocitose de insulina tem sido estudado extensivamente usando abordagens eletrofisiológicas, tais como medidas de capacitância de membrana e abordagens microscópicas em combinação com moléculas fluorescentes. Medidas de capacitância de membrana têm boa resolução temporal e permitam gravações de célula única. No entanto, alterações na capacitância refletem a variação líquida de superfície da célula e não capturar eventos de fusão individuais ou distinguir a fusão de grânulo de insulina de outras vesículas secretoras não insulino-3. Abordagens microscópicas, tais como a microscopia de fluorescência (TIRF) reflexão interna total ou dois fotões em combinação com sondas fluorescentes e proteínas de carga de vesículas, fornecem detalhes adicionais. Estas técnicas capturar eventos os únicos e também as fases pré e pós-os e podem ser usadas para estudar os padrões em populações de células3.
Os repórteres fluorescentes podem ser de três tipos: 1) extracelular, 2) citoplasmática ou 3) vesicular. 1) extracelulares repórteres são marcadores polares (por exemplo, dextranos, sulforhodamina B (SRB), Lúcifer amarelo, pyranine) que podem ser introduzidos através do meio extracelular4. O uso de traçadores polares permite para a investigação dos poros em uma população de células de fusão e captura várias estruturas intercelulares, tais como os vasos sanguíneos. No entanto, eles não informam sobre o comportamento de carga de vesículas. 2) citoplasmáticos repórteres são sondas fluorescentes acopladas a proteínas de membrana-associado que enfrentam o citoplasma e são envolvidos no encaixe e exocitose. Exemplos incluem membros da solúvel N- proteà sensível fator acessório proteína receptor (SNARE) família que têm sido utilizados com sucesso em neurociência para o estudo de liberação de neurotransmissor5. Essas proteínas têm múltiplos parceiros de ligação e não são insulino-grânulo específico. 3) vesiculares repórteres são sondas fluorescentes fundidas às proteínas vesiculares de carga que permitem a investigação do comportamento de carga específicos vesículas. Proteínas de carga específica de insulina-grânulo incluem insulina, peptídeo-c, polipeptídeo amiloide ilhéu e NPY entre outros6,7. NPY somente está presente em insulina contendo grânulos e co é lançado com insulina, tornando-se um excelente parceiro para um repórter fluorescente8.
A fusão de diferentes proteínas fluorescentes para NPY foi anteriormente empregada para estudar vários aspectos da exocitose em células neuroendócrinas, tais como a exigência de synaptotagmin específico isoformas9,10 e como o tempo-curso de libertação depende o citoesqueleto de actina e miosina II11,12. Neste estudo, optamos por pHluorin como o repórter fluorescente, que é um GFP modificado que é não-fluorescente em pH ácido dentro do núcleo denso grânulo mas torna-se brilhantemente fluorescente após a exposição para o neutro pH extracelular13. Grânulos de insulina madura tem um pH ácido abaixo de 5,5. Uma vez que o grânulo funde-se com a membrana plasmática e abre, sua carga é exposta ao neutro pH extracelular de 7.4, permitindo o uso da pHluorin de proteínas sensíveis ao pH como repórter7,14.
Tendo em conta a natureza sensível do pH de pHluorin e a expressão seletiva de NPY nos grânulos de insulina, a construção de fusão NPY-pHluorin pode ser usada para estudar várias propriedades de exocitose de grânulos de insulina. A entrega viral da construção de fusão garante transfeccao de alta eficiência e trabalha na primária as células beta ou linhas de células, bem como sobre ilhotas isoladas. Esse método também pode ser usado como uma diretriz para o estudo de exocitose em qualquer outro tipo de célula com vesículas contendo NPY. Ele também pode ser combinado com qualquer modelo de rato geneticamente modificado para estudar os efeitos de certas condições (knockdowns, superexpressão, etc) na exocitose. Esta técnica tem sido usada anteriormente para caracterizar os padrões espaciais e temporais da secreção de insulina grânulo em populações de células beta nas ilhotas humana15.
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Protocol
Comitê de ética animal da Universidade de Miami tem aprovado todos os experimentos.
1. viral infecção de intactos isolados humana ou ilhotas pancreáticas Mouse
- cultura ilhéu: preparar os meios de cultura de ilhota: Connaught Medical Research Laboratories (CMRL) 1066, 10% (v/v) FBS e 2 mM L-glutamina.
- Humanos ilhotas pancreáticas são obtidas a partir do programa de distribuição integrada ilhéu (NIDDK, NIH). À chegada, transfer Ilhéus (~ 500 equivalentes ilhéu) de 35mm não-cultura de tecidos tratados pratos de Petri com meios de cultura CMRL mL 2 a 37 ° C, 5% / 95% CO 2 /O 2 para 24 h antes da infecção viral.
- Mouse ilhotas pancreáticas podem ser isoladas de protocolos previamente estabelecidos 16 a seguir. Após o isolamento, cultura ~ 200 equivalentes Ilhéu em 35mm não-cultura de tecidos trataram pratos de Petri com meios de cultura CMRL mL 2 a 37 ° C, 5% / 95% CO 2 /O 2 para 24 h antes da infecção viral.
Nota: Evite usar ratos transgénicos com repórteres GFP ou YFP expressados em Ilhéus para evitar a sobreposição de fluorescência com NPY-pHluorin.
- Preparação de vírus
Nota: A fusão de NPY-pHluorin foi clonada no vetor pcDNA3 10 e subcloned em um vetor adenovírus para adenovírus produção [adenovírus serótipo 5 (DE1/E3)] por um adenovírus recombinantes empresa de fabricação. O vírus foi aliquotadas e armazenado a-80 ° C. O estoque viral é fornecido pela empresa em uma concentração de 10 a 12 para 10 partículas virais de 13 (~ 3 x 10 10 - 3 x 10 11 PFU).- Em vitro de infecção ilhéu, uso 10 6 PFU/mL, resultando em uma multiplicidade de aproximada de infecção (MOI) de cerca de 2 (veja a discussão para mais detalhes)
- Infecção viral de ilhotas pancreáticas
Atenção: Trabalhar com adenovírus requer certificação e procedimentos de biossegurança nível 2 (BSL2). Verificar com o oficial de biossegurança institucional para orientação e treinamento sobre procedimentos BSL2.- Preparar humanos/rato ilhotas, como descrito acima.
- Adicionar 5-10 µ l de vírus de estoque para cada prato de Petri 35mm contendo ilhotas humanos/rato em 2 mL de meio de cultura CMRL (com 10% FBS e 2 mM L-glutamina).
Nota: Ajuste o volume do vírus usado de acordo com o título viral, conforme fornecido pela folha de dados empresa. - Cultura dos ilhéus em vírus contendo mídia em 37 °C/5% CO 2 por 24 h.
- Após 24 h, aspirar a mídia contendo vírus e substituir com 2ml CMRL, meios de cultura (com 10% FBS e 2 mM L-glutamina).
- Cultura de Ilhéus durante 4-6 dias a 37 °C/5% CO 2, substituindo os meios de comunicação a cada 3 dias.
- Após 4 - 6 dias de cultivo, espera cerca de 30% das células das ilhotas de estarem infectados. Ilhéus podem ser usados para experiências de imagens ao vivo.
2. Imagem latente confocal de ilhotas infectado
Nota: consulte a Tabela de materiais para os materiais e equipamentos necessários para a imagem latente confocal.
- Reagente de preparação e instalação experimental
- preparam a solução extracelular: Adicionar 125 mM NaCl, 5,9 mM KCl, 2,56 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 25mm HEPES, 0,1% BSA, pH 7,4, estéril filtrada.
Nota: Esta reserva é normalmente preparada sem glicose e pode ser armazenada a 4 ° C por até 1 mês. Glicose é adicionado no dia do experimento para atingir a concentração final desejada.- Médio de glicose basal (3mm) de preparar: adicionar 75 µ l de 2 M estoque de glicose a 50 mL de solução extracelular.
- Médio Hyperglycemic (16 mM): adicionar 400 µ l de 2 M estoque de glicose a 50 mL de solução extracelular
- Diluir qualquer estímulo adicional (por exemplo, KCl ou trifosfato de adenosina (ATP)) na solução extracelular que contém glicose de 3 mM.
- Antes de iniciar um experimento, pré-tratamento de lamelas com poli-lisina-D adicionando 30 µ l de solução de poli-D-lisina (1 mg/mL) para a lamela por 1h e enxaguá-lo completamente com H 2 O.
Nota: As lamelas de poli-lisina revestido podem ser armazenadas em temperatura ambiente por até 6 meses. - Pelo menos 1 h antes do experimento, utilizando uma pipeta de 1 mL, transfere os ilhéus para um prato de Petri 35mm contendo solução extracelular com glicose de 3 mM. Manter os ilhéus a 37 ° C e 5% de CO 2.
Nota: Se necessário, a membrana de plasma podem ser etiquetada nesta etapa. Para rotular a membrana plasmática, adicione corante de di-8-ANEPP 2 µM para a solução extracelular com glicose de 3 mM. Incube as ilhotas em solução de tintura para 1 h 37 °C/5% CO 2. A tintura de membrana plasmática pode ser animada em 488 nm e detectado a 620 nm. - min antes de iniciar um experimento, anexar a lamela à câmara de imagens, selando-a com graxa de silicone de vácuo. Fixe a câmara de imagem para a plataforma de imagem. Utilizando uma pipeta, coloque 20-30 ilhotas na área poli-D-lisina-Tratado da lamela e deixe os ilhéus aderem à superfície de 20 min.
Nota: É importante não deixar a lamela secar completamente para evitar danos ilhéu. - , Enquanto que os ilhéus estão aderindo à lamela, preparar o sistema de perfusão, lavando-a cuidadosamente com água. Adicionar a cada solução para um canal diferente: glicose 3mm (canal 1), glicose de 16 mM (canal 2), glicose de 16 mM com 100 µM 3-isobutil-1-methylxanthine (IBMX) e 10 µM forskolin (canal 3), 25 mM KCl em glicose de 3mm (canal 4), 10 µM ATP em 3mm glicose ( Canal 5). Remova todas as bolhas do sistema abrindo cada canal separadamente e deixar o fluxo de solução por alguns minutos e certifique-se que o fluxo é consistente (0,5 mL/min) e o tubo não está vazando.
- Ligar o aquecedor de solução única embutido para o tubo de saída de perfusão e ajustar a temperatura do efluente buffer a 37 ° C.
- Preparar a bomba de sucção. Remova todas as bolhas do sistema e certifique-se que o fluxo é consistente e o tubo não está vazando.
- , Uma vez que os ilhéus aderem à superfície da lamela, delicadamente encher a câmara de imagem com a solução extracelular que contém glicose de 3 mM. Evite lavar os ilhéus longe da superfície da lamela.
- Coloque a plataforma de imagem com os ilhéus para o palco do microscópio e conectá-lo ao sistema de perfusão e bomba de sucção.
- Vez do fluxo e constantemente perfundir os ilhéus com a solução extracelular de 3G. O sistema está pronto para a imagem latente confocal.
- preparam a solução extracelular: Adicionar 125 mM NaCl, 5,9 mM KCl, 2,56 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 25mm HEPES, 0,1% BSA, pH 7,4, estéril filtrada.
- Imagem latente confocal
- localizar as ilhotas no campo microscópio com baixa ampliação. Uma vez focada em Ilhéus, alterne para objetivos de ampliação mais elevados (por exemplo, 63 objectivo de imersão de água X (63 X / 0.9 nd)).
- Abra a aquisição usando software (Tabela de materiais) e ative o modo de scanner ressonante.
- Selecione o modo de imagem XYZT e configurar as configurações de aquisição como segue:
- virar sobre o argônio laser e a 488 nm laser de linha e ajustar a potência do laser para 50% para a excitação de pHluorin.
- Recolher emissão 505-555 nm.
- Escolher uma resolução de 512 x 512 pixels. Imprensa o " Live " botão para iniciar a imagem e ajustar os níveis de ganho (ganho típico é de cerca de 600 V).
- Definir o início e término da z-pilha: concentre-se no topo do Ilhéu e escolha " começar " e mover para o último avião que pode ser focado e escolha " final ". Use um tamanho de passo-z de 5 µm. O software automaticamente irá calcular o número de aviões confocal.
- Definir o intervalo de tempo para aquisição de cada pilha-z perto de 1,5 a 2 s e escolha a opção " adquirir até parou de " para a imagem latente contínua.
- Imprensa o " iniciar " botão para initialize.
- Usar vários protocolos de estimulação para induzir a exocitose de grânulos por perfusing dos ilhéus com o estímulo desejado. Protocolos de estimulação podem ser personalizados para atender o propósito científico desejado (veja abaixo).
- Protocolos de estimulação
Nota: em todos os protocolos de estimulação, começar pelo menos 2 min. de atividade de segundo plano do Ilhéu de gravação durante perfusão constante com solução extracelular de glicose de 3 mM. Perfundir com um estimulante para o período desejado. A ordem dos estimulantes, duração da estimulação, bem como a duração das gravações pode ser personalizado para atender os fins científicos desejados. Certifique-se de Ilhéus lave com solução extracelular que contém glicose 3 mM antes de iniciar um novo estímulo. Abaixo encontra os protocolos de estimulação de amostra que foram usados para demonstrar as capacidades do método.- Estimulam com cloreto de amónio (NH 4 Cl) como um controle positivo para pHluorin pH sensibilidade e eficiência de infecção viral ( Figura 3): glicose 3mm (2 min) → 50mm NH 4 Cl (2 min) em glicose de 3 mM → glicose de 3mm (2 min)
Nota: em the NH 4 Cl solução, substitua o NaCl numa base equimolar. - Estimulam exocitose de grânulos de insulina, aumentando a concentração de glicose ( Figura 5 e Figura 6): glicose 3mm (2 min) → glicose de 16 mM (15-30 min) → glicose de 3 mM (2 min
Nota: Para ver vários picos de atividade, perfundir os ilhéus continuamente com a solução de 16G de pelo menos 15 min.
Nota: A fim de aumentar a coerência das respostas secretoras 17, usuários podem adicionar agentes de campo de sensibilização (IBMX de 100 µM e 10 µM forskolina) para soluções tanto o 3G e 16 G. Isso não altera os padrões temporais de secreção do grânulo. Para obter detalhes consulte 15 e discussão.
- Estimulam com cloreto de amónio (NH 4 Cl) como um controle positivo para pHluorin pH sensibilidade e eficiência de infecção viral ( Figura 3): glicose 3mm (2 min) → 50mm NH 4 Cl (2 min) em glicose de 3 mM → glicose de 3mm (2 min)
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Representative Results
O fluxo de trabalho inteiro da técnica é mostrado na Figura 1. Brevemente, o mouse ou ilhotas humanas podem ser infectadas com o vírus adenoide codificação NPY-pHluorin e fotografadas, após alguns dias na cultura, sob um microscópio confocal. Como grânulos se fundem com a membrana plasmática e aberto, um aumento na fluorescência é observado e pode ser quantificado (Figura 1). Para determinar se o NPY-pHluorin é realmente uma ferramenta apropriada para monitorar a dinâmica do grânulo de insulina, ilhotas infectadas foram immunostained com anticorpos contra GFP e a insulina de hormônios diferentes ilhéu, somatostatina ou glucagon. A maioria das células expressando NPY-pHluorin (GFP positivo) eram células beta como também expressaram insulina (~ 90%; Figura 2A, 2B). Apenas algumas células alfa glucagon-positivo ou células delta somatostatina-positivos foram rotulados de GFP (Figura 2B). Importante, em células infectadas, a fusão de NPY colocalized com insulina (coeficiente de correlação de Pearson de 0.61 ± 0,04 por GFP e insulina vs ± 0,21 0,05 para as boas práticas agrícolas e glucagon e 0,07 ± 0,01 para GFP e somatostatina).
Demonstrámos que o pHluorin é um sensor de pH eficaz, como aumentar o pH intracelular com 50mm NH4Cl resultou em um > 500% de aumento na fluorescência intracelular (Figura 3A, 3B, vídeo 1). À medida que o pH no interior do grânulo aumenta após a fusão com a membrana plasmática e a abertura dos poros fusão, grânulos contendo NPY-pHluorin se tornam visíveis a condições que estimulam a exocitose de insulina, como a despolarização da membrana com KCl (Figura 4, vídeo 2).
Único eventos secretoras em células-beta dentro de ilhotas intactas podem ser visualizados com imagem de Time-Lapse confocal de ilhotas de NPY-pHluorin infectado. Estas ocorrem em resposta à despolarização da membrana direto com KCl ou vários outros estímulos fisiológicos (Figura 4 e Figura 7, veja abaixo). A concentração de glicose extracelular basal (3 mM), observa-se pouca atividade secretora. No entanto, fusão de grânulo com a membrana plasmática é disparado em resposta à estimulação com a glicose alta (16 mM) (Figura 5A, vídeo 3). Colocando o ROIs com tamanhos diferentes e em diferentes áreas, a cinética da resposta de grânulos secretórios pode ser comparada com o de células individuais ou grupos de células nas proximidades (cluster) (Figura 5B). Este tipo de análise permitido determinar que: 1) os eventos secretoras individuais são muito sincronizado e secretado dentro de alguns segundos de resposta celular médio, e 2) as células beta nas proximidades formar grupos funcionais de atividade sincronizada.
A secreção de insulina no organismo ocorre de maneira pulsátil. Estimulando os ilhéus NPY-pHluorin-infectados com concentração elevada de glicose por períodos prolongados (15-20 min) deram origem a vários pulsos (ou explosões) de secreção (Figura 6, a-4). Durante cada pulso, grânulos individuais fundem com a membrana plasmática de forma sincronizada como mostrado antes (Figura 5). Picos de atividade secretora podem ser visto a cada 3-4 min.
Transiente aumenta em fluorescência em grânulos contendo também podem ser observados em resposta ao agonista purinérgicos ATP NPY-pHluorin (10 µM) ou a acetilcolina agonista muscarínico (ACh, 10 µM) (Figura 7), os quais são conhecidos estimuladores do secreção de insulina em ilhotas humanas. Como esperado, a despolarização da membrana com KCl (30 mM) também desencadeou exocitose de grânulos de insulina (Figura 5). Vários estímulos podem ser aplicados a mesma preparação ilhéu, enquanto os ilhéus são lavados bem entre estímulos. Certifique-se de alterar a ordem de aplicação quando repetir o experimento.
Figura 1. Um esquema ilustrando o ensaio desenvolvido. Adenovírus que codifica um GFP sensíveis ao pH (pHluorin) acoplado ao NPY foram produzidos e utilizados para infectar rato ou ilhotas pancreáticas humanas. Quatro a seis dias após a infecção, os ilhéus foram colocados em uma lamela e fotografados sob um microscópio confocal laser de varredura vertical. A construção do NPY-pHluorin é expressa em grânulos de insulina em células beta. Sua fluorescência é saciada em pH ácido de grânulos de insulina madura, mas torna-se brilhante sobre fusão de grânulo com a membrana plasmática e a exposição ao neutro pH extracelular de 7,4.
Figura 2. A fusão de NPY construir é expresso nos grânulos de insulina. (A) imagens Confocal de ilhotas humanas intactas infectado com NPY-pHluorin, immunostained de GFP (verde) e insulina (painel à esquerda, vermelho), somatostatina (médio, vermelho) ou o glucagon (direita, vermelho). Os núcleos celulares são mostrados em azul (DAPI rotulado). Barras de escala = 10 µm. (B) a quantificação da fração de células GFP-positivo que também contêm insulina (Ins), somatostatina (Soma) ou glucagon (Glu). São mostrado as média ± SEMs, n = 5 ilhotas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. NPY-pHluorin é um pH eficaz Sensor. (A) máxima projeção de imagens confocal de uma ilhota de rato infectado com NPY-pHluorin em solução extracelular que contém glicose 3 mM antes (painel superior, 3G) e na presença de 50mm NH4Cl (painel inferior). Barra de escala = 100 µm. (B) rastreamento mostrando a mudança na intensidade de fluorescência média (unidades arbitrárias) no Ilhéu do inteiro induzida por NH4CL. Dashed linha indica NH4Cl aplicativo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Grânulos contendo NPY-pHluorin se tornam visíveis, uma vez que eles se fundem com a membrana plasmática e aberta. Isletsinfected humana com adenovírus NPY-pHluorin foram incubatEd com a membrana plasmática tingir di-8-ANEPP (vermelho). Estimulação do Ilhéu com KCl (30 mM) desencadeou uma aparência repentina e transitória de grânulos fluorescentes na superfície da célula (mostrado em verde). Antes da resposta os, são mostradas imagens confocal de células dentro de uma ilhota humana (t = 0), durante (t = 3-9 s) e depois (t = 12 s). Contraste foi ajustado para remover fluorescência verde de fundo. Barra de escala = 20 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Glicose alta desencadeia NPY-pHluorin fusão com a membrana plasmática. (A) máxima projeção de imagens confocal de um intacto ilhéu humano infectado com NPY-pHluorin na concentração de glicose basal (3 G - 3 mM de glicose, deixada o painel) ou em alta glicose (glicose 16G - 16 mM, painel direito). Soluções extracelulares continham o campo levantando agentes forskolin e IBMX (Veja o protocolo para obter detalhes). Barra de escala = 10 µm. (B) traços mostrando alterações em intensidades de fluorescência média (unidades arbitrárias) no canal da mancha verde no ROIs colocados ao redor de único eventos secretoras (vermelho, grânulo), células (verdes) ou aglomerados de células (azul). Glicose alta foi aplicado por 5 min depois de ~ 2,5 min em 3G. Valores de fluorescência foram normalizados para o valor inicial da fluorescência (linha de base). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6. Eventos secretoras geram pulsos discretos de secreção com a glicose alta. Traços mostrando alterações em significa intensidade de fluorescência (unidades arbitrárias) em ROIs colocados ao redor de diferentes células dentro de um ilhéu humana intacta durante a estimulação sustentada com glicose de 16 mM. Cada cor representa uma célula individual. Explosão de atividade secretora pode ser visto a cada 3-4 min. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7. NPY-pHluorin fusão com a membrana plasmática é desencadeada por estimuladores conhecido da secreção de insulina. Traços, mostrando as alterações na intensidade de fluorescência média (unidades arbitrárias) em ROIs colocados ao redor de eventos secretoras individuais em células dentro intactas ilhotas humanas induzidas por KCl (30 mM), ATP (10 µM), glicose elevada (16G, 16 mM) e acetilcolina (Ach, 10 µM). KCl e ATP foram aplicados na concentração basal de glicose (3 mM). Linhas pretas mostram o grânulo médio e linhas cinzas refletem SEM valores. Traços de verde mostram a resposta da célula correspondente. Escala de tempo horizontal (2 min) aplica-se a todos os gráficos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Vídeo 1. PHluorin-NPY adenovírus eficientemente infectam células das ilhotas e mudanças de pH de sentido.
Ilhotas de mouse foram infectadas por 4 dias com adenovírus codificação NPY-pHluorin. Ilhéus infectados foram colocados sobre uma lamela e montados na câmara de imagens. Para aumentar o pH intracelular, os ilhéus foram perfundidos com 50mm NH4Cl adicionado à solução extracelular que contém glicose de 3 mM. Um forte e rápido aumento na fluorescência pode ser visto em cima de NH4Cl aplicativo. Barra de escala = 100 µm. velocidade filme = 5 fps. Duração total do filme é 90 s. , por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)
Vídeo 2. Grânulos contendo NPY-pHluorin tornam-se visíveis, uma vez que eles se fundem com a membrana plasmática e aberto.
Ilhotas de humanas infectadas com o vírus adenoide NPY-pHluorin foram incubadas com a membrana plasmática tintura di-8-ANEPP. Estimulação do Ilhéu com KCl (30 mM) desencadeou uma aparência repentina e transitória de grânulos fluorescentes na superfície da célula. Uma projeção máxima de aviões confocal é mostrada. Contraste foi ajustado para remover fluorescência verde de fundo. Barra de escala = 20 µm. velocidade filme = 5 fps. Duração total do filme é de 60 s. , por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)
Vídeo 3. Glicose alta disparadores exocitose de grânulos contendo NPY-pHluorin.
Fusão de grânulos contendo NPY-pHluorin é disparado em resposta à estimulação com a glicose alta (16 mM). Concentração de glicose extracelular basal (3 mM), observa-se pouca atividade secretora. No entanto, a glicose alta, grânulos de insulina transitoriamente aparecem na membrana plasmática de células diferentes em um ilhéu de forma sincronizada. Glicose alta foi aplicada depois de ~ 2,5 min em 3G (16G rótulo aparece). Uma projeção máxima de aviões confocal é mostrada. Barra de escala = 20 µm. velocidade filme = 10 fps. Duração total do filme é 7 min. por favor, clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)
Vídeo 4. Estimulação prolongada com alta glicose desencadeia várias explosões de exocitose.
Estimulação prolongada com glicose alta dá origem a vários pulsos de ilhotas de secreção, durante o qual grânulos aparecem transitoriamente. Pulsos de atividade secretora podem ser vistos todos os ~ 3-4 min. avião Confocal de uma ilhota humana é mostrada. Um esquema de pseudocolorida foi aplicado para a intensidade de fluorescência. Barra de escala = 20 µm. velocidade filme = 30 fps. Duração total do filme é 20 min. por favor, clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)
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Discussion
Este manuscrito descreve uma técnica que pode ser usada para visualizar a exocitose de grânulos de insulina em células beta dentro de ilhotas pancreáticas intactas por microscopia confocal. Ele usa NPY-pHluorin como o repórter fluorescente clonado em adenovírus para garantir uma eficiência elevada do transfection.
Embora o método fosse altamente eficiente em nossas mãos, ele pode requerer algumas modificações que dependem principalmente de dois parâmetros: 1) a qualidade da preparação do Ilhéu e 2) do título do estoque viral com otimização das condições de infecção. Antes da infecção viral de ilhotas, permitir a preparação de ilhéu de recuperar do stress de isolamento e transporte durante a noite a 37 ° C. Inspecionar a morfologia do Ilhéu sob um microscópio de luz durante todo o período de infecção/expressão e verificar sinais de diminuição da viabilidade como células salientes da superfície ilhéu ou presença de hipoxia células (mais escuro) na ilha Centro18 . Cada ação viral pode variar em eficiência de título e infecção. Certifique-se de ajustar o volume do vírus usado de acordo com o título viral e o tempo da cultura antes do ensaio de microscopia. O passo mais crítico é a otimização das condições de infecção (por exemplo, número de partículas virais, tempo de cultura antes do ensaio) para que suficiente do repórter é expresso e o ilhéu integridade e capacidade de resposta são mantidos. Ao otimizar o protocolo de infecção e com cada novo lote de viral, coletar alguns ilhéus em pontos de tempo diferentes e verificar se a exocitose pode ser provocada com KCl (30 mM) e/ou glicose alta (16 mM). Descobrimos que o ensaio funciona melhor e células das ilhotas permaneçam saudáveis e glicose responsivo quando o MOI é baixa (2) e o tempo de cultura é estendido (cerca de 5 dias) para aumentar os níveis de expressão da construção de fusão. Nossos resultados estão de acordo com um estudo anterior, mostrando que expressão eficiente de produtos de genes pode ser melhor alcançado em concentrações transfecting inferiores do vetor adenovírus preservando ilhéu função19.
A técnica tem, no entanto, algumas limitações. Uma é que usando o NPY-pHluorin como repórter, grânulos não podem ser visualizados antes de eles se fundem com a membrana plasmática e abre os poros da fusão. Para estudar a insulina grânulo tráfico em vez de exocitose, adenovírus codificação NPY-eGFP podem ser usado em vez disso. Outra limitação é que, em menor medida, NPY-pHluorin pode ser direcionada para não-insulino contendo grânulos. No entanto, a maioria das células que foram infectados com NPY-pHluorin manifestou a insulina e a menos de 10% do glucagon células expressadas ou somatostatina. Com efeito, a dependência de glicose de secreção do grânulo, seu padrão pulsátil e localização co com insulina, indicou que mais secretoras eventos representam carga liberação de grânulos de insulina. Para garantir o monitoramento de insulina exocitose está ocorrendo, o ensaio deve ser realizado sob condições que estimulam a secreção de insulina (por exemplo, glicose alta). No entanto, para melhorar a especificidade da célula beta expressão, NPY-pHluorin poderia colocar sob o controle de um promotor mais seletivo como o promotor de insulina de rato. Outra limitação da técnica é que ele requer a expressão de proteínas exógenas em grânulos de insulina, o que podem perturbar sua biogênese e/ou comportamento20. Esta deve ser considerada ao interpretar os resultados das experiências e, se possível, as conclusões devem ser validadas usando outras proteínas de carga do grânulo de insulina (por exemplo, peptídeo-C, polipeptídeo amiloide ilhéu) como repórteres.
Este protocolo recomenda também incluindo agentes de campo de sensibilização (IBMX e forskolina) para potenciar os efeitos da glicose alta na exocitose de grânulos de insulina. Este protocolo de estimulação imita a ativação de fisiologicamente relevantes vias de amplificação (desencadeada por incretins ou parácrina e moléculas de sinalização neurais) que potenciam a secreção de insulina, aumentando o acampamento nas células beta do pâncreas. No entanto, na ausência de campo levantando agentes, glicose elevada (16 mM) também provoca exocitose de grânulos mas o número de eventos secretoras observada é menor. Grânulos ainda aparecem em rajadas discretas, são sincronizados com a resposta da célula média e mostrar semelhantes períodos de ruptura: 1.4-6,6 min em glicose alta mais IBMX/forskolin vs. 1,5-10 min na alta glicose sozinho.
O ensaio descrito aqui é significativo no que diz respeito a métodos existentes, pois tem resolução espacial e temporal suficiente para Visualizar eventos de fusão única em tempo real em células-beta dentro de ilhotas intactas. Por exemplo, ele revelou a sincronização de alta com qual insulina grânulos são liberados em ilhotas humanas mediante estimulação de glicose. Além disso, se bem ilhotas são anexadas a lamela, eles podem ser fotografados por períodos prolongados (pelo menos 15-20 min). Isto foi usado para mostrar que em ilhotas humanas exocitose ocorre em rajadas distintas que aparecem em períodos semelhantes do pulsátil na vivo a secreção de insulina. O ensaio também permite testar o efeito de vários estímulos na exocitose de insulina usando ilhotas murino ou humanas. Além disso, porque não exige dissociação de célula ilhéu como outros métodos, pode ser aplicado para estudar o comportamento das populações de células beta dentro de um ilhéu. Com efeito, observamos que vizinhos células beta formam aglomerados de ~ 5-10 células em que a atividade é sincronizada. As células beta do mesmo cluster provavelmente são acopladas por canais de junção de lacuna de connexin 3621. Sua resposta sincronizada ilustra a conectividade de célula beta que é essencial para a secreção de insulina adequada22.
No futuro, esta técnica pode ser combinada com outros corantes fluorescentes para funcional de imagens para visualizar em tempo real, como alterações no cálcio citosólico ou potencial de membrana, por exemplo, correlacionam com a exocitose de grânulos nas células beta. Em particular, como novo pH sensível vermelho proteínas fluorescentes estão se tornando disponíveis14,23 e podem ser fundidas para NPY ou outras proteínas de carga do grânulo de insulina, podem ser utilizados corantes verdes para a imagem latente funcional. Além disso, esta técnica pode ser combinada com um modelo do rato para a imagem latente na vivo de ilhotas vascularizadas transplantado para a câmara anterior do olho do rato24. Ilhéus podem estar infectados com adenovírus 48-72 h antes do transplante no olho. Imunes camundongos deficientes devem ser usados se ilhotas humanas são transplantadas. Usando este modelo, o padrão espacial subcellular da secreção de insulina grânulo pode ser correlacionado com arranjos vascular25.
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Disclosures
Os autores declaram que têm sem interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Os autores graças a Marcia Boulina partir da DRI facilidade do núcleo para ajuda com os microscópios de imagem. Este trabalho foi financiado pelo NIH bolsas 1K01DK111757-01 (JA), F31668418 (MM), R01 DK111538, R33 ES025673 e DK084321 R56 (AC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Upright laser-scanning confocal microscope | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | TCS-SP5 | includes LAS AF, the image acquisition software |
| Imaging chamber | Warner instruments | RC-26 | |
| Imaging chamber platform | Warner instruments | PH-1 | |
| 22 x 40 glass coverslips | Daiggerbrand | G15972H | |
| Vacuum silicone grease | Sigma | Z273554-1EA | |
| Multichannel perfusion system | Warner instruments | VC-8 | |
| Single inline solution heater | Warner instruments | SH-27B | |
| Temperature controller | Warner instruments | TC-324C | |
| Peristaltic Suction pump | Pharmacia | P-1 | |
| 35 mm Petri dish, non-tissue culture treated | VWR | 10861-586 | |
| CMRL Medium, no glutamine | ThermoFisher | 11530037 | |
| FBS, heat inactivated | ThermoFisher | 16140071 | |
| L-Glutamine 200 mM | ThermoFisher | 25030081 | |
| 5 M NaCl solution | Sigma | S5150 | |
| 3 M KCl solution | Sigma | 60135 | |
| 1 M CaCl2 solution | Sigma | 21115 | |
| 1 M MgCl2 solution | Sigma | M1028 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| 1 M HEPES solution | Sigma | H0887 | |
| Vacuum filter | VWR | 431098 | |
| D-Glucose | Sigma | G8270 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-aldrich | P6407 | |
| Di-8-ANNEP | ThermoFisher | D3167 | |
| 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma | I5879 | |
| Forskolin | Sigma | F3917 |
References
- Roder, P. V., Wong, X., Hong, W., Han, W. Molecular regulation of insulin granule biogenesis and exocytosis. Biochem J. 473 (18), 2737-2756 (2016).
- Rutter, G. A., Pullen, T. J., Hodson, D. J., Martinez-Sanchez, A. Pancreatic beta-cell identity, glucose sensing and the control of insulin secretion. Biochem J. 466 (2), 203-218 (2015).
- Rorsman, P., Renstrom, E. Insulin granule dynamics in pancreatic beta cells. Diabetologia. 46 (8), 1029-1045 (2003).
- Takahashi, N., Kishimoto, T., Nemoto, T., Kadowaki, T., Kasai, H. Fusion pore dynamics and insulin granule exocytosis in the pancreatic islet. Science. 297 (5585), 1349-1352 (2002).
- Ramirez, D. M., Khvotchev, M., Trauterman, B., Kavalali, E. T. Vti1a identifies a vesicle pool that preferentially recycles at rest and maintains spontaneous neurotransmission. Neuron. 73 (1), 121-134 (2012).
- Michael, D. J., Xiong, W., Geng, X., Drain, P., Chow, R. H. Human insulin vesicle dynamics during pulsatile secretion. Diabetes. 56 (5), 1277-1288 (2007).
- Ohara-Imaizumi, M., et al. Monitoring of exocytosis and endocytosis of insulin secretory granules in the pancreatic beta-cell line MIN6 using pH-sensitive green fluorescent protein (pHluorin) and confocal laser microscopy. Biochem J. 363 (Pt 1), 73-80 (2002).
- Whim, M. D. Pancreatic beta cells synthesize neuropeptide Y and can rapidly release peptide co-transmitters. PLoS One. 6 (4), e19478 (2011).
- Tsuboi, T., Rutter, G. A. Multiple forms of "kiss-and-run" exocytosis revealed by evanescent wave microscopy. Curr Biol. 13 (7), 563-567 (2003).
- Zhu, D., et al. Synaptotagmin I and IX function redundantly in controlling fusion pore of large dense core vesicles. Biochem Biophys Res Commun. 361 (4), 922-927 (2007).
- Aoki, R., et al. Duration of fusion pore opening and the amount of hormone released are regulated by myosin II during kiss-and-run exocytosis. Biochem J. 429 (3), 497-504 (2010).
- Felmy, F. Modulation of cargo release from dense core granules by size and actin network. Traffic. 8 (8), 983-997 (2007).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Gandasi, N. R., et al. Survey of Red Fluorescence Proteins as Markers for Secretory Granule Exocytosis. PLoS One. 10 (6), e0127801 (2015).
- Almaca, J., et al. Spatial and temporal coordination of insulin granule exocytosis in intact human pancreatic islets. Diabetologia. 58 (12), 2810-2818 (2015).
- Do, O. H., Low, J. T., Thorn, P. Lepr(db) mouse model of type 2 diabetes: pancreatic islet isolation and live-cell 2-photon imaging of intact islets. J Vis Exp. (99), e52632 (2015).
- Hanna, S. T., et al. Kiss-and-run exocytosis and fusion pores of secretory vesicles in human beta-cells. Pflugers Arch. 457 (6), 1343-1350 (2009).
- Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. A practical guide to rodent islet isolation and assessment. Biol Proced Online. 11, 3-31 (2009).
- Weber, M., et al. Adenoviral transfection of isolated pancreatic islets: a study of programmed cell death (apoptosis) and islet function. J Surg Res. 69 (1), 23-32 (1997).
- Michael, D. J., et al. Fluorescent cargo proteins in pancreatic beta-cells: design determines secretion kinetics at exocytosis. Biophys J. 87 (6), L03-L05 (2004).
- Serre-Beinier, V., et al. Cx36 makes channels coupling human pancreatic beta-cells, and correlates with insulin expression. Hum Mol Genet. 18 (3), 428-439 (2009).
- Rutter, G. A., Hodson, D. J. Beta cell connectivity in pancreatic islets: a type 2 diabetes target? Cell Mol Life Sci. 72 (3), 453-467 (2015).
- Shen, Y., Rosendale, M., Campbell, R. E., Perrais, D. pHuji, a pH-sensitive red fluorescent protein for imaging of exo- and endocytosis. J Cell Biol. 207 (3), 419-432 (2014).
- Speier, S., et al. Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology. Nat Med. 14 (5), 574-578 (2008).
- Low, J. T., et al. Insulin secretion from beta cells in intact mouse islets is targeted towards the vasculature. Diabetologia. 57 (8), 1655-1663 (2014).
