Summary
Мы описываем протокол для визуализации экзоцитоз инсулина в нетронутыми островами с помощью pHluorin, рН чувствительных Зеленый флуоресцирующий белок. Изолированные островки заражены аденовирус кодирования pHluorin, в сочетании с везикул грузов нейропептида Y. Это позволяет для обнаружения инсулина гранул фьюжн событий confocal микроскопии.
Abstract
Секреции инсулина играет центральную роль в гомеостаз глюкозы при нормальных физиологических условиях, а также болезни. Нынешние подходы для изучения инсулина гранул экзоцитоз, либо использовать электрофизиологии или микроскопия, в сочетании с выражением флуоресцентные репортеры. Однако большинство из этих методов были оптимизированы для клоновых клеточных линий или требовать отделения панкреатических островков. В отличие от этого метод, представленные здесь позволяет для визуализации реального времени экзоцитоз гранул инсулина в нетронутыми панкреатических островков. В этом протоколе мы сначала описать вирусной инфекции изолированы панкреатических островков с аденовирус, который кодирует рН чувствительных Зеленый флуоресцентный белок (КГВ), pHluorin, в сочетании с нейропептида Y (NPY). Во-вторых мы описываем, конфокальная изображений из островков пять дней после вирусной инфекции и как контролировать гранул секреция инсулина. Кратко зараженных островков размещаются на coverslip на тепловизионные камеры и образы под вертикальное сканирование лазерного конфокального микроскопа при будучи постоянно увлажненную с внеклеточного раствор, содержащий различные стимулы. Конфокальный изображения, охватывающих 50 мкм островок приобретаются как покадровой записи с помощью быстро резонансный сканер. Синтез инсулина гранул с плазматической мембраны может следовать со временем. Эта процедура также позволяет для тестирования аккумулятора раздражителей в одном эксперименте, совместим с мыши и человеческих островках и могут быть объединены с различные красители для функциональных изображений (например, мембранный потенциал или цитозольной кальция красители).
Introduction
Инсулин вырабатывается бета-клетки поджелудочной островок и это ключевым регулятором метаболизма глюкозы1. Смерть или дисфункции бета-клеток нарушает гомеостаз глюкозы и приводит к диабета2. Инсулин, Упакованные в плотной ядра гранул, которые выпускаются в Ca2 +-3зависимым образом. Разъяснение, как регулируется экзоцитоз гранул инсулина необходимо полностью понять, что определяет секреции инсулина и открывает новые возможности для определения новых терапевтических целей для лечения диабета.
Инсулин экзоцитоз широко изучен, с помощью электрофизиологических подходы, такие как измерения емкости мембраны и микроскопических подходов в сочетании с флуоресцентных молекул. Измерения емкости мембраны имеют хорошие временное разрешение и позволяют одну ячейку записи. Однако изменения в емкость отражают чистое изменение поверхности клетки и не захватывать события отдельных фьюжн или отличить инсулина гранул фьюжн от других инсулиннезависимым секреторные пузырьки3. Микроскопический подходы, такие как два фотона или полного внутреннего отражения микроскопии флуоресцирования (TIRF) в сочетании с флуоресцентных зондов и везикул грузов белков, предоставляют дополнительные подробности. Эти методы захвата одного-exocytotic событий, а также этапов до и после exocytotic и может быть использован для изучения exocytotic моделей в популяциях клеток3.
Флуоресцентный Репортеры могут быть трех типов: 1) внеклеточная, 2) цитоплазмы или 3) пузырчатка. 1) внеклеточной журналисты являются полярные Трейсеры (например, декстраны, sulforhodamine B (SRB), Люцифер жёлтый, pyranine), которые могут быть введены через внеклеточных среды4. Использование полярного Трейсеры позволяет для расследования фьюжн поры в популяции клеток и захватывает различные межклеточных структур, таких как кровеносные сосуды. Однако они не сообщают о везикул грузов поведение. 2) цитоплазматической журналисты являются флуоресцентных зондов, в сочетании с связанный мембранами перст-белки, которые сталкиваются с цитоплазмой и участвуют в док и экзоцитоз. Примеры включают членов растворимых N- ethylmaleimide-чувствительных фактор вложений белка рецептора (SNARE) семьи, которые были успешно использованы в неврологии для изучения нейромедиатора релиз5. Такие белки имеют несколько партнеров привязки и не инсулин блок конкретных. 3) пузырчатка журналисты являются флуоресцентных зондов, сливается с везикулярного грузов белки, которые позволяют для расследования конкретных грузов везикул поведения. Белки инсулин блок конкретных грузов включают в себя инсулин и с пептида, полипептид амилоида островка, NPY среди прочих6,7. NPY присутствует только в инсулине, содержащие гранул и совместно выпустили с инсулина, что делает его отличным партнером для флуоресцентных репортер8.
Слияние различных флуоресцентных белков NPY ранее использовалась для изучения различных аспектов экзоцитоз в нейроэндокринные клетки, например требование о конкретных Синаптотагмин изоформы9,10 и как время курс релиза зависит на Цитоскелет актина и миозина II11,12. В этом исследовании, мы выбрали pHluorin как флуоресцентные репортер, который является изменение GFP, это не флуоресцентные в кислой рН внутри плотные ядра гранул но становится ярко люминесцентные под воздействием нейтральный внеклеточного pH13. Зрелые инсулина гранулы имеют кислый рН ниже 5.5. Как только Блок предохранителей с плазматической мембраны и открывается, его груз подвергается нейтральных внеклеточного pH 7,4, позволяя использовать pHluorin рН чувствительных белки как репортер7,14.
Учитывая деликатный характер pHluorin рН и селективного выражение NPY в гранулы инсулина конструкция фьюжн NPY-pHluorin может использоваться для изучить различные свойства инсулина гранул экзоцитоз. Вирусных доставки фьюжн конструкция обеспечивает высокий трансфекции эффективность и работает на основной бета-клеток и клеточных линий, а также на изолированных островков. Этот метод также может использоваться в качестве ориентира для изучения экзоцитоз в любой другой тип клеток с NPY-содержащих везикулы. Он может также сочетаться с любой трансгенные мыши модель для изучения последствий определенных условий (нокдаунов, гиперэкспрессия и т.д.) на экзоцитоз. Эта техника ранее не использовался для описания пространственных и временных моделей гранул секреции инсулина в бета клеточных популяций в человеческих островках15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Комитет по этике животных из университета Майами одобрил все эксперименты.
1. вирусные инфекции нетронутыми изолированных человека или мыши панкреатических островков
- островок культуры: подготовить островок культуры СМИ: Connaught медицинских исследовательских лабораторий (CMRL) 1066, 10% (v/v) FBS и 2 мм L-глютамина.
- Человека панкреатических островков получаются из комплексной программы распределения островок (NIDDK, низ). По прибытии, Трансфер островков (~ 500 островок эквиваленты) для 35-мм не культуры ткани лечение Петри с 2 мл CMRL Культура СМИ при 37 ° C, 5/95% CO 2/o 2 за 24 ч до вирусной инфекции. Панкреатических островков
- мыши могут быть изолированы после ранее установленными протоколами 16. После изоляции, культура ~ 200 островок эквиваленты в культуре ткани 35-мм лечение Петри с 2 мл CMRL Культура СМИ при 37 ° C, 5/95% CO 2/o 2 за 24 ч до вирусной инфекции.
Примечание: Избегайте использования трансгенных мышей с GFP или рекламы ЯФП журналистами выразил на островках во избежание дублирования флуоресценции с NPY-pHluorin.
- Вирус подготовки
Примечание: NPY pHluorin fusion был клонирован в pcDNA3 вектор 10 и subcloned в аденовирусных вектор для аденовирусных производства [аденовирус серотип 5 (ДЭ1/E3)] по рекомбинантным аденовирус производственная компания. Вирус был aliquoted и хранятся при температуре-80 ° C. Вирусные акции предоставляется компанией на титры 10 12-10 13 вирусных частиц (~ 3 x 10 10 - 3 х 10 11 ОРП).- В vitro островок инфекции, использование 10 6 ОРП/мл, возникающих в приблизительные количества инфекции (МВД) около 2 (см. обсуждение за подробности)
- Вирусная инфекция панкреатических островков
Предупреждение: Работа с аденовирусов требует процедуры 2-го уровня биобезопасности (BSL2) и сертификации. Проверьте с институциональных биобезопасности сотрудника для руководства и обучения на BSL2 процедур.- Подготовить человека и мыши островков, как описано выше.
- Добавить 5-10 мкл запасов вируса к каждому блюду Петри 35-мм, содержащих островки человека и мыши в 2 мл CMRL культуры средств массовой информации (с 10% FBS и 2 мм L-глютамин).
Примечание: Громкость этого вируса, используется согласно вирусной титр, как это предусмотрено в описании компании. - Культура островков в вирус содержащих СМИ на 37 °C/5% CO 2 за 24 ч.
- После 24 ч, аспирационная вирус содержащих СМИ и заменить с 2 мл CMRL Культура СМИ (с 10% FBS и 2 мм L-глютамин).
- Культура островки для 4-6 дней на 37 °C/5% CO 2, заменив СМИ каждые 3 дня.
- После 4 - 6 дней культивирования, ожидать около 30% островковых клеток, чтобы быть заражены. Островки может затем использоваться для живых изображений экспериментов.
2. Конфокальный изображений из инфицированных островки
Примечание: обратитесь к Таблице материалов для материалов и оборудования, необходимых для конфокальная томография.
Подготовка- реагента и экспериментальной установки
- подготовить внеклеточного решение: добавить 125 мм NaCl, 5,9 мм KCl, 2.56 мм CaCl 2, 1 мм MgCl 2, 25 мм HEPES, 0.1% BSA, рН 7,4, стерильной фильтрации.
Примечание: Этот буфер обычно готовится без глюкозы и может храниться при температуре 4 ° C до 1 месяца. Глюкоза добавляется в день эксперимента, чтобы достичь желаемой конечной концентрации.- Подготовить базальной глюкозы (3 мм) средний: 75 мкл запасов глюкозы 2 М до 50 мл раствора внеклеточные.
- Среднего Hyperglycemic (16 мм): 400 мкл запасов глюкозы 2 М до 50 мл раствора внеклеточные
- Ослабить любые дополнительные стимулы (например, хлористого калия или аденозинтрифосфатом (АТФ)) в внеклеточной раствор, содержащий 3 мм глюкозы.
- Перед началом эксперимента, предварительной обработки coverslips с поли D-лизин, добавив 30 мкл раствора (1 мг/мл) поли D-лизин coverslip за 1 час и тщательно полоскать с H 2 O.
Примечание: Поли лизин с покрытием coverslips может храниться при комнатной температуре до 6 месяцев. - По крайней мере за 1 ч до эксперимент, используя 1 мл пипетки, передачи островки для 35-мм Петри, содержащие внеклеточного решение с 3 мм глюкозы. Держите островков при 37 ° C и 5% CO 2.
Примечание: При необходимости плазматической мембраны могут быть помечены в этом шаге. Чтобы пометить плазматической мембраны, добавьте 2 мкм ди-8-ANEPP краситель внеклеточного решение с 3 мм глюкозы. Инкубируйте островков в раствор красителя для 1 ч при 37 °C/5% CO 2. Краситель плазматической мембраны могут быть возбуждены в 488 нм и обнаружен в 620 Нм. - мин перед началом эксперимента, придают coverslip тепловизионные камеры путем герметизации с вакуумной силиконовой смазкой. Исправьте тепловизионные камеры для изображений платформы. С помощью пипетки, место 20-30 островков на поли D-лизин лечение области coverslip и пусть островки присоединиться к поверхности на 20 мин
Примечание: Важно, чтобы не позволить высохнуть, чтобы избежать повреждения островок coverslip. - В то время как островки придерживаясь coverslip, подготовить перфузии системы тщательно ополоснуть водой. Добавьте каждое решение на другой канал: 3 мм глюкозы (канал 1), глюкозы (канал 2), 16 мм 16 мм глюкозы с 100 мкм 3-изобутил-1-метилксантина (IBMX) и 25 мм KCl в 3 мм глюкозы (channel 4), 10 мкм АТФ в 3 мм глюкозы (10 мкм форсколин (канал 3), 5 канал). Удалить все пузырьки из системы, открыв для каждого канала отдельно и давая решение поток на несколько минут и убедитесь, что поток является последовательным (0,5 мл/мин) и трубку не протекает.
- Подключите один встроенный нагреватель решение к отводной трубки перфузии и отрегулировать температуру выходящего буфера до 37 ° C.
- Подготовить всасывающий насос. Удалить все пузырьки из системы и убедитесь, что поток является последовательной и трубки не протекает.
- После того, как островки придерживаться coverslip поверхности, аккуратно заполнить тепловизионные камеры с внеклеточного раствор, содержащий 3 мм глюкозы. Избегать мытья островков от поверхности coverslip.
- Место изображений платформы с островками на сцену микроскоп и подключить его к системе перфузии и всасывания насоса.
- Поворот на поток и постоянно perfuse островков с внеклеточного решения 3G. Теперь система готова для конфокальная томография.
- подготовить внеклеточного решение: добавить 125 мм NaCl, 5,9 мм KCl, 2.56 мм CaCl 2, 1 мм MgCl 2, 25 мм HEPES, 0.1% BSA, рН 7,4, стерильной фильтрации.
- Конфокальная томография
- обнаружения островков в поле микроскоп с увеличением ниже. После сосредоточены на островки, переключитесь в цели более высокого масштаба (например, цель погружения воды 63 X (63 X / 0.9 NA)).
- Открыть приобретение с помощью программного обеспечения (Таблица материалов) и активировать режим резонансный сканер.
- Выберите режим визуализации XYZT и настройте параметры приобретения следующим:
- повернуть на аргон лазера и 488 нм лазер линии и отрегулировать мощность лазера до 50% для возбуждения pHluorin.
- Собирать выбросов 505-555 Нм.
- Выбрать разрешение 512 x 512 пикселей. Пресс " Live " кнопку, чтобы начать изображений и отрегулировать уровни усиления (типичный прирост составляет около 600 V).
- Установить начало и конец z стека: фокус на вершине островка и выбрать " начать " и перейти к последнему плоскость, которая может быть направлена и выбрать " конец ". Используйте размер z шаг 5 мкм. Программное обеспечение автоматически рассчитает количество конфокальный плоскостей.
- Задать временной интервал для приобретения каждого z-стека недалеко от 1,5-2 сек и выбрать опцию " приобрести до остановки " для непрерывной обработки изображений.
- Пресс " начало " кнопку чтобы initialize.
- Используют различные протоколы стимуляции побудить гранул экзоцитоз, perfusing островков с желаемой раздражителей. Протоколы стимуляции могут быть настроены с учетом желаемой научной целью (см. ниже).
- Протоколы стимуляции
Примечание: В протоколе каждый стимуляции, начните с записи по крайней мере 2 мин островок фоновой активности во время постоянной перфузии с внеклеточного раствор, содержащий 3 мм глюкозы. Perfuse с стимулятором за желаемый период времени. Порядок стимуляторов, длительность стимуляции, а также продолжительность записи могут настраиваться с учетом желаемого научных целей. Убедитесь в том вымыть островков с внеклеточного раствор, содержащий 3 мм глюкозы перед началом нового стимуляции. Ниже найдете протоколы стимуляции выборки, которые использовались для демонстрации возможностей метода.- Стимулировать с аммония хлорид (NH 4 Cl) как позитивный элемент управления для pHluorin рН чувствительность и вирусной инфекции эффективность ( рис. 3): 3 мм глюкозы (2 мин) → 50 мм NH 4 Cl (2 мин) в 3 мм глюкозы → глюкозы (2 мин) 3 мм
Примечание: В NH 4 Cl решение, заменить NaCl на основе эквимолярных. - Экзоцитоз гранул инсулина стимулировать путем увеличения концентрации глюкозы ( Рисунок 5 и Рисунок 6): 3 мм глюкозы (2 мин) → 16 мм глюкозы (15-30 мин) → 3 мм глюкозы (2 мин
Примечание: Чтобы увидеть несколько всплесков активности, perfuse островков непрерывно с 16 G решение для по крайней мере 15 мин
Примечание: В целях повышения согласованности секреторной ответы 17, пользователи могут добавлять лагерь просветительских агентов (100 мкм IBMX и 10 мкм форсколин) для 3 G и 16 G решений. Это не изменяет временной структуры гранул секреция. Подробную информацию см. 15 и обсуждения.
- Стимулировать с аммония хлорид (NH 4 Cl) как позитивный элемент управления для pHluorin рН чувствительность и вирусной инфекции эффективность ( рис. 3): 3 мм глюкозы (2 мин) → 50 мм NH 4 Cl (2 мин) в 3 мм глюкозы → глюкозы (2 мин) 3 мм
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Весь процесс техника показано на рисунке 1. Кратко мыши или человека островков можно инфицированных аденовирус кодирования NPY-pHluorin и образы, после нескольких дней в культуре, под конфокального микроскопа. Как гранулы сливаются с плазматической мембраны и открытым, увеличение флуоресценции наблюдается и может быть квантифицировано (рис. 1). Чтобы определить, если NPY pHluorin действительно является подходящим инструментом для мониторинга инсулина гранул динамика, зараженных островков были immunostained с антителами против GFP и различных островок гормоны инсулин, соматостатина или глюкагон. Большинство клеток, выражая NPY-pHluorin (GFP положительным) были бета-клетки, как они выразили также инсулина (~ 90%; Рисунок 2A, 2B). Только несколько глюкагона позитивных альфа-клетки или Дельта соматостатина положительных клеток были помечены GFP (рис. 2B). Важно отметить, что в инфицированных клетках, сплавливание NPY colocalized с инсулином (коэффициент корреляции Пирсона 0,61 ± 0.04 GFP и инсулина против 0,21 ± 0,05 GFP и глюкагон и 0.07 ± 0,01 GFP и соматостатина).
Мы показали, что pHluorin является эффективным рН датчик, как увеличение внутриклеточный pH с 50 мм NH4Cl привело к > 500% увеличение внутриклеточных флюоресценция (Рисунок 3А, 3Б, 1 видео). С увеличением рН внутри зерна после сплавливания с плазматической мембраны и открытия пор фьюжн, гранулы, содержащие NPY pHluorin становятся видимыми на условиях, которые стимулируют инсулина экзоцитоз например деполяризации мембраны с KCl (Рисунок 4, видео 2).
Одиночные секреторной события в бета-клеток в пределах нетронутыми островков могут быть визуализированы с конфокальный покадровой изображений NPY-pHluorin инфицированных островков. Эти события происходят в ответ на деполяризации мембраны прямого с KCl или несколько других физиологических раздражителей (рис. 4 и рис. 7, см. ниже). В базальной внеклеточного глюкозы (3 мм) наблюдается мало секреторную активность. Однако гранулированных синтеза с плазматической мембраны запускается в ответ на стимуляцию с высоким глюкозы (16 мм) (Рисунок 5A, 3 видео). Размещая ROIs с разных размеров и в различных областях кинетики реакции секреторных гранул можно сравнить с в отдельные ячейки или группы ячеек в непосредственной близости (кластеров) (Рисунок 5B). Этот тип анализа позволили определить, что: 1) отдельных секреторной события являются очень синхронизированы и выделяется в течение нескольких секунд от средний клеток ответ, и 2) бета-клеток в непосредственной близости от формируют функциональные кластеры синхронизированной активности.
Секреции инсулина в организме происходит в пульсирующего манере. Стимулирование NPY-pHluorin инфицированных островков с повышенными глюкозы для длительных периодов (15-20 мин) породило несколько импульсов (или очередей) секреции (рис. 6, видео 4). Во время каждого импульса отдельные гранулы предохранитель с плазматической мембраны в синхронизированном моды, как показано выше (Рисунок 5). Всплесков секреторной активности может быть видно каждые 3-4 мин.
Преходящее увеличение флуоресценции в NPY-pHluorin, содержащие гранул наблюдалась также в ответ на purinergic агонист АТФ (10 мкм) или мускариновых агонист ацетилхолина (ACh, 10 мкм) (рис. 7), оба из которых известны стимуляторы секреции инсулина в человеческих островках. Как и ожидалось, деполяризации мембраны с KCl (30 мм) также вызвало инсулина гранул экзоцитоз (рис. 5). Несколько раздражителей может применяться же островок подготовку как островки моются хорошо между раздражителей. Убедитесь в том изменить порядок применения, когда повторение эксперимента.
Рисунок 1. Разработана схема, иллюстрирующая Assay. Аденовирусы, который кодирует рН чувствительных GFP (pHluorin), в сочетании с NPY выпускались и используется для заражения мыши или человека панкреатических островков. Четыре-шесть дней после инфицирования, островки были размещены на coverslip и образы под вертикальное сканирование лазерного конфокального микроскопа. Конструкция NPY pHluorin выражается в гранулы инсулина в бета-клеток. Его флуоресценции закаленных в кислой рН зрелых инсулина гранул, но становится яркой на слияние гранул с плазматической мембраны и подверженности нейтральных внеклеточного pH 7,4.
Рисунок 2. NPY сплавливания построить выражается в гранулы инсулина. (A) конфокальный изображения нетронутыми человеческих островках инфицированных NPY-pHluorin, immunostained для GFP (зеленый) и инсулина (левая панель, красный), соматостатин (средний, красный) или глюкагон (справа, красный). Клеточных ядер отображаются синим цветом (DAPI помечены). Масштаб баров = 10 мкм. (B) количественной оценки доли GFP-положительных клеток, которые также содержат инсулин (СИН), соматостатин (Soma) или глюкагон (Glu). Показаны являются среднее ± SEMs, n = 5 островков. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. NPY-pHluorin является эффективной рН датчика. (A) максимальная проекции конфокальный изображений островок мыши, инфицированных NPY-pHluorin в внеклеточной раствор, содержащий 3 мм глюкозы до (Верхняя панель, 3 G) и в присутствии 50 мм NH4Cl (Нижняя панель). Шкалы бар = 100 µm. (B) трассировки, показывающая изменения в интенсивности (условные единицы) означает флуоресценции в целом островок, вызванных NH4Cl. пунктирная линия указывает NH4Cl приложения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. Гранулы, содержащие NPY pHluorin становятся видимыми после того, как они сливаются с плазматической мембраны и открытым. Человеческого isletsinfected с аденовирус NPY pHluorin были incubatЭд с плазматической мембраны красителя ди-8-ANEPP (красный). Островок стимуляции с KCl (30 мм) вызвало внезапное и переходных внешний вид флуоресцентные гранул на поверхности клеток (показано зеленым). Конфокальный изображения клеток внутри человека островок отображаются перед exocytotic ответ (t = 0), во время (t = 3-9 s) и после (t = 12 s). Контраст был скорректирован для удаления фона зеленый флуоресценции. Шкалы бар = 20 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5. Высокая глюкозы вызывает NPY pHluorin Fusion с плазматической мембраны. (A) максимальная проекция конфокальный изображений островок нетронутой человека, инфицированных NPY-pHluorin в базальной глюкозы (глюкозы в 3 G - 3 мм, левая панель) или высокой глюкозы (глюкозы 16 G - 16 мм, правая панель). Внеклеточные решения содержал лагерь, форсколин агентов и IBMX (подробную информацию см. в протокол). Шкалы бар = 10 мкм. (B) показаны изменения в интенсивности (условные единицы) означает флуоресценции в зелёном канале в ROIs следы размещены вокруг одного секреторной события (красный, гранула), клетки (зеленый) или кластеры клеток (синий). Высокая глюкозы был применен для 5 мин после ~ 2,5 мин в 3G. Флуоресценции значения были нормализованы к значению первоначального флуоресцирования (базовый уровень). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6. Секреторный события создают дискретные импульсы секреции на высокие глюкоза. Следы показаны изменения в означают интенсивности флуоресценции (условные единицы) в ROI, расположенных вокруг различных ячейках островок нетронутой человеческой во время постоянной стимуляции с 16 мм глюкозы. Каждый цвет представляет отдельную ячейку. Всплеск секреторной активности может быть видно каждые 3-4 мин пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 7. NPY pHluorin Fusion с плазматической мембраны инициируется известных стимуляторов секреции инсулина. Следы показаны изменения интенсивности (условные единицы) означает флуоресценции в ROIs размещены вокруг отдельных секреторной события в ячейках нетронутым человеческие островков, индуцированных KCl (30 мм), АТФ (10 мкм), высокие глюкоза (16G, 16 мм) и ацетилхолин (Ach, 10 мкм). KCl и СПС были применены в базальной глюкозы (3 мм). Черные линии показывают среднее зерно и серые линии отражают SEM ценности. Зеленые следы показывают соответствующий ответ клетки. Горизонтальные время шкала (2 мин) применяется для всех графиков. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Видео 1. NPY pHluorin аденовирус эффективно заразить островковых клеток и смысл рН изменения.
Островки мыши были инфицированы за 4 дня аденовирус кодирования NPY-pHluorin. Зараженных островков были размещены на coverslip и монтируется на тепловизионные камеры. Чтобы увеличить внутриклеточного рН, островки были увлажненную с 50 мм NH4Cl добавляется внеклеточного раствор, содержащий 3 мм глюкозы. Быстрое и сильное увеличение флуоресцирования можно увидеть на NH4Cl приложения. Шкалы бар = 100 µm. фильм скорость = 5 fps. Общая продолжительность фильма составляет 90 s. пожалуйста нажмите здесь для просмотра этого видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)
Видео 2. Гранулы, содержащие NPY pHluorin становятся видимыми после того, как они сливаются с плазматической мембраны и открытым.
Человека островков, инфицированных NPY pHluorin аденовирус инкубировали с плазматической мембраны краситель ди-8-ANEPP. Островок стимуляции с KCl (30 мм) вызвало внезапное и переходных внешний вид флуоресцентные гранул на поверхности клеток. Показана максимальная проекции конфокальный самолетов. Контраст был скорректирован для удаления фона зеленый флуоресценции. Шкалы бар = 20 мкм. фильм скорость = 5 fps. Общая продолжительность фильма составляет 60 s. пожалуйста нажмите здесь для просмотра этого видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)
Видео 3. Высокая глюкозы триггеры экзоцитоз гранулы, содержащие NPY-pHluorin.
Фьюжн содержащие гранул NPY pHluorin запускается в ответ на стимуляцию с высоким глюкозы (16 мм). В базальной внеклеточного глюкозы (3 мм) наблюдается мало секреторную активность. Однако после высоких глюкозы, инсулина гранулы временно появляются на плазматической мембране различных клеток в островок в синхронизированном моды. Высокая глюкозы была применена после ~ 2,5 мин в 3G (16G метка появляется). Показана максимальная проекции конфокальный самолетов. Шкалы бар = 20 мкм. фильм скорость = 10 fps. Общая продолжительность фильма составляет 7 минут пожалуйста, нажмите здесь для просмотра этого видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)
Видео 4. Пролонгированной стимуляции с высоким глюкозы вызывает несколько очередей экзоцитоз.
Несколько импульсов секрецию островков, во время которых временно появляются гранулы рождает пролонгированной стимуляции с высоким глюкозы. Импульсы секреторную деятельность может рассматриваться каждые ~ 3-4 мин конфокальный плоскости человеческой островок показано. Псевдоцветном схема применялась для интенсивности флуоресценции. Шкалы бар = 20 мкм. фильм скорость = 30 fps. Общая продолжительность фильма составляет 20 мин пожалуйста, нажмите здесь для просмотра этого видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Эта рукопись описывает технику, которая может использоваться для визуализации экзоцитоз инсулина гранул в бета-клеток в пределах нетронутыми панкреатических островков confocal микроскопии. Он использует NPY-pHluorin как флуоресцентные репортер, клонированные в аденовирус обеспечить эффективность трансфекции высокий.
Хотя метод был очень эффективным в наших руках, это может потребовать некоторых изменений, которые главным образом зависит от двух параметров: 1) качество подготовки островок и 2 титр вирусных акций с оптимизации условий инфекции. До вирусной инфекции островков позволяют островок подготовки, чтобы оправиться от изоляции и транспортировки стресса ночь в 37 ° C. Осмотрите островок морфология под микроскопом света на протяжении всего периода инфекции/выражение и проверить на наличие признаков снижение жизнеспособности таких клеток, выступающие от островка поверхности или наличие гипоксии клетки (темнее) в центр островок18 . Каждой вирусные акции может варьироваться в эффективности титр и инфекции. Убедитесь, что громкость вируса, согласно титр вирусных и время культуры до микроскопии assay. Наиболее важным этапом является оптимизация условий инфекции (например, количество вирусных частиц, время культуры до анализа), так что достаточно репортер выражается и поддерживаются островок целостности и отзывчивость. При оптимизации протокола инфекции с каждой новой вирусной партии, собирать несколько островков в разное время точках и проверить ли экзоцитоз можно собрать с KCl (30 мм) и/или высокие глюкоза (16 мм). Мы обнаружили, что пробу работает лучше и островковых клеток остаются здоровыми и глюкозы при МВД является низкой (около 2) и культура время продлевается (около 5 дней) для повышения уровня выражения фьюжн конструкции. Наши результаты согласуются с предыдущего исследования, показаны, что эффективное выражение гена продуктов лучше достигается при более низких концентрациях transfecting аденовирусных вектора при сохранении островок функции19.
Техника, однако, имеет некоторые ограничения. То, что с помощью NPY-pHluorin как репортер, гранулы не могут быть визуализированы прежде чем они сливаются с плазматической мембраны и открывает поры фьюжн. Для изучения инсулина гранул людьми вместо экзоцитоз, вместо него может использоваться аденовирус кодирования NPY-eGFP. Еще одним ограничением является, что, в меньше степени, NPY-pHluorin могут быть предназначены для non инсулин содержащие гранул. Однако большинство клеток, которые были заражены NPY-pHluorin также выразил инсулина и менее 10% ячеек выражена глюкагона или соматостатин. Действительно глюкозы зависимость гранул секреция, пульсирующего шаблон и Сопредседатель локализации с инсулином, указали, что наиболее секреторных события представляют собой выдачи груза от инсулина гранул. Чтобы гарантировать мониторинг инсулина происходит экзоцитоз, assay должны выполняться в условиях, которые стимулируют секрецию инсулина (например, высокие глюкоза). Тем не менее чтобы улучшить специфика бета клеток выражения, NPY-pHluorin может быть поставлена под контролем промотора более избирательно как промоутер инсулина крыса. Еще одним ограничением методики является, что она требует выражения экзогенных белков в инсулин гранул, которые могут нарушить их биогенеза и/или поведение20. Это необходимо учитывать при интерпретации полученных результатов экспериментов и, если возможно, выводы должны проверяться с помощью других инсулина гранулированных грузов белков (например, C-пептида, полипептид амилоида островка) как журналисты.
Этот протокол также рекомендует, включая лагерь просветительских агентов (IBMX и форсколин) усиливать воздействие высокой глюкозы на инсулин гранул экзоцитоз. Этот протокол стимуляции имитирует активации физиологически соответствующих усилительных пути (вызвано incretins или паракринными и нейронных сигнальных молекул), которые усиливать секрецию инсулина путем увеличения лагерь в бета-клеток поджелудочной железы. Тем не менее в отсутствие лагеря, привлечение агентов, высокие глюкоза (16 мм) также вызывает блок экзоцитоз, но количество секреторных событий отмечено ниже. Гранулы по-прежнему появляются в дискретных очередей, синхронизированы с средний клеток ответ и показывают аналогичные периоды всплеска: 1.4-6.6 мин в высокой глюкозы плюс IBMX/форсколин против 1,5-10 мин в высокой глюкозы в одиночку.
Assay, описанные здесь значительным в отношении существующих методов, как он имеет достаточно пространственного и временного разрешения для визуализации одного сплавливание события в режиме реального времени в бета-клеток в пределах нетронутыми островков. Например он показал высокий синхронизации, с которой инсулина гранулы выпускаются в человеческих островках после стимуляции глюкозы. Кроме того если островков хорошо прикреплены к coverslip, они могут imaged на длительный срок (по крайней мере 15-20 мин). Это было использовано для показать, что в человеческих островках экзоцитоз происходит в различных очередей, которые появляются в периоды аналогичны пульсирующего в vivo секреции инсулина. Assay также позволяет для тестирования эффект несколько раздражителей на инсулин экзоцитоз, используя мышиных или человеческих островках. Кроме того потому что она не требует островковых клеток диссоциации как другими методами, может применяться для изучения поведения бета клеточных популяций в островок. Действительно, мы наблюдали, что соседних бета-клетки образуют скопления ~ 5-10 клеток, в которых синхронизируется активность. Бета-клетки из того же кластера соединены вероятно разрыв соединения каналы из connexin 3621. Их синхронизированные ответ показывает подключения бета ячейки, которая необходима для надлежащего инсулина секрецию22.
В будущем этот метод может сочетаться с другими флуоресцентных красителей для функциональных imaging для визуализации в режиме реального времени, как изменения в цитозольной кальция или мембранный потенциал, например, коррелируют с экзоцитоз гранул в бета-клеток. В частности как новых рН чувствительных красных флуоресцентных белков становятся доступны14,23 и может быть сливается с NPY или других инсулина гранулированных грузов белков, зеленые красители для функциональных изображений может использоваться. Кроме того этот метод может сочетаться с мыши модель для обработки изображений в vivo васкуляризированной островков, пересаженные в переднюю камеру глаза мыши24. Островки могут быть заражены аденовирусов 48-72 ч до пересадки в глаз. Иммунные несовершенным мышей должны использоваться если человеческих островках пересаживают. С помощью этой модели, субцеллюлярные пространственной структуры гранул секреция инсулина может быть соотнесена с сосудистой механизмов25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Авторы благодарят Марсия Boulina от DRI изображений ядра фонда за помощь с микроскопов. Эта работа была поддержана NIH грантов 1K01DK111757-01 (JA), F31668418 (мм), R01 DK111538, R33 ES025673 и R56 DK084321 (AC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Upright laser-scanning confocal microscope | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | TCS-SP5 | includes LAS AF, the image acquisition software |
| Imaging chamber | Warner instruments | RC-26 | |
| Imaging chamber platform | Warner instruments | PH-1 | |
| 22 x 40 glass coverslips | Daiggerbrand | G15972H | |
| Vacuum silicone grease | Sigma | Z273554-1EA | |
| Multichannel perfusion system | Warner instruments | VC-8 | |
| Single inline solution heater | Warner instruments | SH-27B | |
| Temperature controller | Warner instruments | TC-324C | |
| Peristaltic Suction pump | Pharmacia | P-1 | |
| 35 mm Petri dish, non-tissue culture treated | VWR | 10861-586 | |
| CMRL Medium, no glutamine | ThermoFisher | 11530037 | |
| FBS, heat inactivated | ThermoFisher | 16140071 | |
| L-Glutamine 200 mM | ThermoFisher | 25030081 | |
| 5 M NaCl solution | Sigma | S5150 | |
| 3 M KCl solution | Sigma | 60135 | |
| 1 M CaCl2 solution | Sigma | 21115 | |
| 1 M MgCl2 solution | Sigma | M1028 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| 1 M HEPES solution | Sigma | H0887 | |
| Vacuum filter | VWR | 431098 | |
| D-Glucose | Sigma | G8270 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-aldrich | P6407 | |
| Di-8-ANNEP | ThermoFisher | D3167 | |
| 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma | I5879 | |
| Forskolin | Sigma | F3917 |
References
- Roder, P. V., Wong, X., Hong, W., Han, W. Molecular regulation of insulin granule biogenesis and exocytosis. Biochem J. 473 (18), 2737-2756 (2016).
- Rutter, G. A., Pullen, T. J., Hodson, D. J., Martinez-Sanchez, A. Pancreatic beta-cell identity, glucose sensing and the control of insulin secretion. Biochem J. 466 (2), 203-218 (2015).
- Rorsman, P., Renstrom, E. Insulin granule dynamics in pancreatic beta cells. Diabetologia. 46 (8), 1029-1045 (2003).
- Takahashi, N., Kishimoto, T., Nemoto, T., Kadowaki, T., Kasai, H. Fusion pore dynamics and insulin granule exocytosis in the pancreatic islet. Science. 297 (5585), 1349-1352 (2002).
- Ramirez, D. M., Khvotchev, M., Trauterman, B., Kavalali, E. T. Vti1a identifies a vesicle pool that preferentially recycles at rest and maintains spontaneous neurotransmission. Neuron. 73 (1), 121-134 (2012).
- Michael, D. J., Xiong, W., Geng, X., Drain, P., Chow, R. H. Human insulin vesicle dynamics during pulsatile secretion. Diabetes. 56 (5), 1277-1288 (2007).
- Ohara-Imaizumi, M., et al. Monitoring of exocytosis and endocytosis of insulin secretory granules in the pancreatic beta-cell line MIN6 using pH-sensitive green fluorescent protein (pHluorin) and confocal laser microscopy. Biochem J. 363 (Pt 1), 73-80 (2002).
- Whim, M. D. Pancreatic beta cells synthesize neuropeptide Y and can rapidly release peptide co-transmitters. PLoS One. 6 (4), e19478 (2011).
- Tsuboi, T., Rutter, G. A. Multiple forms of "kiss-and-run" exocytosis revealed by evanescent wave microscopy. Curr Biol. 13 (7), 563-567 (2003).
- Zhu, D., et al. Synaptotagmin I and IX function redundantly in controlling fusion pore of large dense core vesicles. Biochem Biophys Res Commun. 361 (4), 922-927 (2007).
- Aoki, R., et al. Duration of fusion pore opening and the amount of hormone released are regulated by myosin II during kiss-and-run exocytosis. Biochem J. 429 (3), 497-504 (2010).
- Felmy, F. Modulation of cargo release from dense core granules by size and actin network. Traffic. 8 (8), 983-997 (2007).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Gandasi, N. R., et al. Survey of Red Fluorescence Proteins as Markers for Secretory Granule Exocytosis. PLoS One. 10 (6), e0127801 (2015).
- Almaca, J., et al. Spatial and temporal coordination of insulin granule exocytosis in intact human pancreatic islets. Diabetologia. 58 (12), 2810-2818 (2015).
- Do, O. H., Low, J. T., Thorn, P. Lepr(db) mouse model of type 2 diabetes: pancreatic islet isolation and live-cell 2-photon imaging of intact islets. J Vis Exp. (99), e52632 (2015).
- Hanna, S. T., et al. Kiss-and-run exocytosis and fusion pores of secretory vesicles in human beta-cells. Pflugers Arch. 457 (6), 1343-1350 (2009).
- Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. A practical guide to rodent islet isolation and assessment. Biol Proced Online. 11, 3-31 (2009).
- Weber, M., et al. Adenoviral transfection of isolated pancreatic islets: a study of programmed cell death (apoptosis) and islet function. J Surg Res. 69 (1), 23-32 (1997).
- Michael, D. J., et al. Fluorescent cargo proteins in pancreatic beta-cells: design determines secretion kinetics at exocytosis. Biophys J. 87 (6), L03-L05 (2004).
- Serre-Beinier, V., et al. Cx36 makes channels coupling human pancreatic beta-cells, and correlates with insulin expression. Hum Mol Genet. 18 (3), 428-439 (2009).
- Rutter, G. A., Hodson, D. J. Beta cell connectivity in pancreatic islets: a type 2 diabetes target? Cell Mol Life Sci. 72 (3), 453-467 (2015).
- Shen, Y., Rosendale, M., Campbell, R. E., Perrais, D. pHuji, a pH-sensitive red fluorescent protein for imaging of exo- and endocytosis. J Cell Biol. 207 (3), 419-432 (2014).
- Speier, S., et al. Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology. Nat Med. 14 (5), 574-578 (2008).
- Low, J. T., et al. Insulin secretion from beta cells in intact mouse islets is targeted towards the vasculature. Diabetologia. 57 (8), 1655-1663 (2014).
